KR19980018395A - 변형된 열안정성 디엔에이 폴리머라아제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아미노산 서열 SerGlnIleXaaLeuArgXaa(서열 식별 번호: 1)을 포함하고, 이때 상기 서열의 4위치에서 Xaa는 글루탐산 잔기(Glu) 이외의 모든 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 글리신 잔기이고, 상기 서열의 7위치에서 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)인 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소를 제공한다. 본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라아제는 리보뉴클레오티드 등의 비전형적인(unconventional) 뉴클레오티드를 DNA 생성물내로 혼입하는 향상된 효능을 갖고, 이는 많은 생체내 합성 분야에 유용하다. 상기 효소는 특히 핵산 서열화 프로토콜에서 사용하기에 유용하고, 비용 및 효능의 이점을 갖고 DNA 서열 분석을 위한 신규한 수단을 제공한다. 또한, 상기 폴리머라아제를 암호화하는 핵산, 상기 핵산들을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 뿐만아니라 DNA 서열화 반응에 사용하기 위한 조성물, 상기 폴리머라아제를 포함하는 서열화를 위한 키트 및 방법이 청구되어 있다.
Description
본 발명은 삼인산 리보뉴클레오시드를 혼입하기 위해 향상된 효능을 갖는 열안정성 DNA 폴리머라아제에 관한 것이다. 본 발명은 상기 폴리머라아제를 단리하는 방법 및 수단을 제공한다. 본 발명의 효소는 많은 분햐, 특히 핵산 서열화 분야에 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 핵산 서열 분석을 위한 개선된 방법을 제공한다.
DNA 서열화는 하나의 한정된 말단 및 하나의 가변적 말단을 갖는 단일가닥 DNA 단편의 4개 집단의 생성을 포함한다. 가변적 말단은 일반적으로 특정 뉴클레오티드 염기(구아닌(G), 아데닌(A), 티미딘(T) 또는 시토신(C))에서 종결된다. 단편의 4가지 상이한 집합은 각각 이들의 길이를 근거로 분리된다. 상기 과정에서, 고 분해 폴리아크릴아미드 겔을 사용한다. 상기 겔상에서 각각의 밴드는 DNA 서열중 특정 뉴클레오티드에 상응하므로, 서열에서 위치를 식별한다.
종종 사용되는 DNA 서열화 방법은 디데옥시 또는 쇄-종결 서열화 방법이고, 이는 DNA 가닥의 효소적 합성을 포함한다(Sanger 등, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463). 4가지 별도의 합성을 일반적으로 수행하고, 디데옥시뉴클레오티드 등의 적절한 쇄-종결 뉴클레오티드의 혼입을 통해 특정 염기(G, A, T 또는 C)에서 종결되도록 각각의 반응을 일으킨다. 반응 생성물은 각각의 래인이 G, A, T 또는 C에 상응하므로 해석하기 쉽다.
디데옥시 쇄-종결 방법에서, 짧은 단일가닥 프라이머를 단일가닥 주형으로 어니일링(annealing)한다. 프라이머는 디데옥시뉴클레오티드(ddNTP)가 혼입될 때까지 데옥시뉴클레오티드(dNTP)의 혼입에 의해 이의 3' 말단에서 연신한다. ddNTP가 혼입될 때, 연신은 그 염기에서 중단한다. 그러나, DNA 복제의 정확성을 확실히 하기 위해, DNA 폴리머라아제는 비전형적인 뉴클레오티드로 지칭되는 뉴클레노티드 유사체의 혼입을 억제하고 이의 일반적 기질, 즉 dNTP의 혼입에 대해 매우 강한 편향을 나타낸다. DNA 합성의 경우, 리보뉴클레오티드(rNTP)는 비전형적인 뉴클레오티드로서 고려되는데, 이는 ddNTP 등의 rNTP가 DNA 폴리머라아제의 정상적인 생체외 기질이 아니기 때문이다. 세포에서, 이러한 특성은 성장하는 DNA 가닥에 삼인산 데옥시노신(dITP) 또는 rNTP등의 비정상적 염기가 혼입되는 것을 약화시킨다.
종종 사용되는 두가지 자동 서열화 방법론은 염료-프라이머 및 염료-종결제 서열화이다. 이들 방법은 형광물질 표지된 잔기에 의해 사용하기 적합하다. 비록 서열화가 방사능 표지된 잔기를 사용하여 실행될 수 있지만, 형광물질-기본 서열화가 매우 바람직하다. 간단히, 염료-프라이머 서열화에서, 형광물질이 표지된 프라이머를 비표지된 dDNTP와 조합하여 사용한다. 절차는 서열화를 위해 4가지 합성 반응 및 각각의 주형에 대한 겔상의 4개 이하의 래인을 필요로한다(염기-특이적 종결 생성물의 각각에 상응). 프라이머를 신장시킨 후, 디데옥시뉴클레오티드-혼입된 종결 생성물을 함유하는 서열화 반응 혼합물을 DNA 서열화 겔상에서 전기영동에 의해 관례적으로 분석한다. 전기영동에 의해 분석한 후, 형광물질-표지된 생성물을 겔의 하부에서 레이저로 여기시키고, 형광물질을 적절한 감지기를 사용해 검출한다. 자동화된 시스템에서, 검출기는 전기영동 동안 겔의 하부를 주사하여, 반응 혼합물이 겔 매트릭스를 통과할 때 어떤 표지 잔기가 사용되었는지 검출한다(Smith 등, 1986, Nature 321: 674-679. 상기 방법의 변형에서, 4개의 프라이머를 상이한 형광물질 마커로 표지한다. 4개의 분리된 서열화 반응을 완료한 후, 반응 혼합물을 배합하고, 배합된 반응 혼합물을 단일 래인에서 겔 분석하고, 이로써 상이한 형광물질 표식(tag)(4개의 상이한 염기-특이적 종결 생성물 각각에 상응)을 개별적으로 검출한다.
다르게는, 염료-종결제 서열화 방법을 사용한다. 이 방법에서, DNA 폴리머라아제를 사용하여 dNTP 및 형광물질 표지된 ddNTP를 DNA 프라이머의 성장하는 말단상에 혼입한다(Lee 등, 1992, Nucleic Acid Research 20: 2471). 이 공정은 염료-표지된 프라이머를 합성하지 않는다는 이점을 제공한다. 추가로, 염료-종결제 반응은, 모든 4가지 반응이 동일한 튜브에서 수행될 수 있다는 점에서 보다 편리하다. ddNTP에 대한 억제가 감소된 변형된 열안정성 DNA 폴리머라아제가 기술되어 있다(유럽 특허출원 공보 제 EP-A-655,506호 및 미국 특허출원 일련번호 제08/448,223호 참조). 변형된 열안정성 DNA 폴리머라아제의 예는 티로신 잔사를(페닐알라닌 잔기 대신) 667위치에 갖는 티. 아쿠아티쿠스(T. aquaticus)로부터의 DNA 폴리머라아제의 돌연변이된 형태이고, 즉 Tag DNA 폴리머라아제의 돌연변이 형태 F667Y로 지칭된다. 호프만 라 롯슈가 제작하고 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)를 통해 시판되는 앰플리태크(AmpliTaq)FS는 목표물의 효과적인 핵산 서열화에 요구되는 ddNTP의 양을 수백 내지 수천배 감소시킨다. 앰플리태크FS는 F667Y 돌연변이 및 추가로 46 위치에서 아스파르트산 잔기(글리신 잔기 대신; G46D 돌연변이)를 갖는 티. 아쿠아티쿠스로부터의 DNA 폴리머라아제의 돌연변이된 형태이다.
정확하고 비용이 저렴한 핵산 DNA 서열 분석을 위한 대안의 핵산 합성 방법을 가능하게 하는 열안정성 DNA 폴리머라아제가 요구된다. 디데옥시뉴클레오티드의 사용을 필요로하지 않는 형광물질-기본 방법이 바람직하다. 본 발명은 이러한 요구에 대해 설명한다.
본 발명은 아미노산 서열 모티프(motif) SerGlnIleXaaLeuArgXaa(서열 식별 번호: 1)을 포함하고, 이때 상기 서열의 4위치에서 Xaa는 글루탐산 잔기(Glu) 이외의 모든 아미노산 잔기이고, 상기 서열의 7위치에서 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)인 주형-의존적 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소를 제공한다. 아미노산에 대한 단일 문자 유전정보로 표현될 경우, 이 서열 모티프는 S Q I X L R V/I로서 표시될 수 있고, 상기 서열 모티프의 4위치에서 X은 글루탐산 잔기 이외의 모든 아미노산 잔기이다. 상기 서열의 4위치에서 X가 글루탐산 잔기가 아닌 상기 서열 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 열안정성 DNA 폴리머라아제는 이미 공지된 열안정성 폴리머라아제에 비해 리보뉴클레오티드의 혼입에 대한 억제가 감소된다. 성장하는 DNA 가닥에서, 리보뉴클레오티드는 비전형적인 뉴클레오티드이다. 따라서 제 1 관점에서, 본 발명의 신규한 효소는 리보뉴클레오티드 등의 비전형적인 염기 유사체를 이미 식별화된 열안정성 DNA 합성 효소에 비해 몇배나 효과적으로 성장하는 DNA 가닥내로 혼입한다. 이들 효소를 암호화하는 유전자 뿐만 아니라 제조합 발현 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주세포도 본 발명에 의해 제공된다. 상기 형질전환된 숙주 세포에 의해 정제된 다량의 열안정성 폴리머라아제 효소가 제공될 수 있다.
본 발명에 의해, 열안정성 DNA 폴리머라아제의 아미노산 서열내의 영역 또는 서열 모티프는 데옥시리보뉴클레오티드를 충실히 혼입하는 능력을 보유하면서 리보뉴클레오티드를 혼입하는 폴리머라아제의 능력에 대한 효능을 향상시키는 것으로 식별되었다. 상기 영역의 변경, 즉 하나 이상의 아미노산의 교환(예: 자리 특이적 돌연변이 유발에 의한 도입)은 RNA 또는 RNA/DNA 키메라 또는 하이브리드 가닥을 DNA 주형상에 합성할 수 있는 열안정성 폴리머라아제 효소를 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 목표 핵산의 서열을 결정하기 위한 개선된 방법 및 조성물을 제공하고, 이때 쇄-종결 ddNTP에 대한 요구가 제거된다. 본원에 제공된 개선된 방법에 의해, 리보뉴클레오티드(rNTP)는 프라이머 신장 생성물내로 혼입된다. 주제 효소가 정확하고 효과적으로 rNTP 또는 dNTP를 혼입하므로, 서열화 반응은 상기 두가지 모두의 뉴클레오티드의 혼합물을 사용할 수 있다. 프라이머의 신장후, 신규하게 합성된 올리고뉴클레오티드 생성물을 당해분야에 공지된 방법(예; 가수분해)에 의해 혼입된 rNTP에서 분열시킬 수 있고, 이로써 통상의 수단(예; 겔 전기영동)에 의해 분별 및 서열 분석에 적합한 단편의 집단을 제공한다. 이들 방법은 본원에 제공된 신규한 열안정성 폴리머라아제 효소를 사용한다. 따라서 상기 관점에 있어서, 본 발명은 폴리머라아제가 임계 모티프 SerGlnIleXaaLeuArgXaa(서열 식별 번호: 1)을 포함하고, 이때 상기 서열의 4위치에서 Xaa는 글루탐산 잔기(Glu) 이외의 모든 아미노산 잔기이고, 상기 서열의 7위치에서 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)임을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소를 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에 있어서, 본원에 기술된 변형된 폴리머라아제는, 비교할 경우 전형적인(conventioanl) 데옥시리보뉴클레오티드에는 존재하지 않는, 2위치에서 하이드록실 그룹 또는 다른 치환체를 함유하는 리보뉴클레오티드 또는 유사체를 혼입하기 위한 수단을 제공한다. 이들 뉴클레오티드를 차별적으로 표지화 하여, DNA 서열화 적용을 위해 디데옥시뉴클레오티드의 통상적인 사용에 대한 대안을 제공할 수 있다.
본 발명의 돌연변이체 열안정성 폴리머라아제 효소는 비전형적인 뉴클레오티드, 특히 리보뉴클레오티드를 상응하는 야생형 효소에 비해 보다 효과적으로 혼입하는 능력을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 혼입되는 비전형적인 뉴클레오티드는 쇄-종결 염기 유사체, 예로써 2'-하이드록시-3'-데옥시 ATP(삼인산 코르디세핀), ATP의 리보종결제 유사체, 또는 rNTP 등의 비-쇄-종결 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 또다른 관점에서, 돌연변이체 열안정성 폴리머라아제 효소는 비전 형적인 뉴클레오티드, 특히 리보뉴클레오티드를 상응하는 야생형 효소에 비해 보다 효과적으로 혼입할 수 있는 능력을 특징으로 한다. 따라서 상기 관점에 있어서, 본 발명은 (a) 폴리머라아제가 천연 형태에서 아미노산 서열 SerGlnIleGluLeuArgXaa(서열 식벽 번호: 2)을 포함하고, 이때 상기 서열의 7위치에서 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)이고; (b) 아미노산 서열이 재조합 효소, 바람직하게는 이의 서열 4위치에서 돌연변이되어 4위치의 글루탐산 잔기가 또다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 글리신 잔기가 되고; 및 (c) 제조합 효소는 상기 효소의 천연 형태에 비해 리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 유사체의 혼입 억제가 감소됨을 각각 특징으로 하는 재조합 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소를 제공한다.
본 발명의 또다른 관점에 있어서, 본 발명의 폴리머라아제는 증폭 생성물 및 프라이머 신장 생성물을 단편화하는 편리한 수단을 제공하고, 상기 단편화된 생성물은 하이브리드화-기본 방법론 및 다양한 서열 검출 전략에 유용할 수 있다.
본 발명의 효소 및 이를 암호화하는 유전자는 정형화 뉴클레오티드 및 하나 이상의 리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 유사체의 혼합물을 포함하는 DNA 서열화 반응에 유용한 조성물을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 비전형적인 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이고, 리보뉴클레오티드 농도는 상응하는 데옥시리보뉴클레오티드의 농도 미만이고, 즉 rNTP:dNTP 비는 1:1 또는 그 미만이다. 본 발명의 효소는 또한 키트형으로 시판하기에 적합하고, 이러한 키트는 또한 핵산 서열화 반응에 필수적인 다음의 추가의 요소, 예로써 dNTP, rNTP, 완충액 및/또는 프라이머 모두를 포함할 수 있다.
본 발명은 첨부된 특허청구 범위에서 정의된 바와 같은 신규하고 개선된 변형된 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소, 조성물 및 키트를 제공한다. 본 발명의 효소는 이미 공지된 폴리머라아제 또는 이들 신규한 폴리머라아제가 유도되는 상응하는 야생형 폴리머라아제 효소에 비해 보다 효과적으로 비전형적인 삼인산 뉴클레오시드를 혼입한다. 변형된 효소를 암호화하는 DNA 서열, 변형된 효소를 발현하기 위한 벡터 및 상기 벡터로 형질감염된 세포가 또한 제공된다. 본 발명의 효소는 선행 분야로부터 공지된 DNA 서열화 절차보다 유용한 신규한 DNA 서열화 방법의 실행을 가능하게 한다.
본 발명에 대한 이해를 돕기 위해, 다수의 용어들을 하기에 설명한다.
핵산 염기, 삼인산 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 대해 언급될 경우 전형적인란 용어는 상술된 폴리뉴클레오티드에서 천연으로 발생하는 것을 지칭한다(즉, DNA의 경우 이들은 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP이다.) 추가로, c7dGTP 및 dITP는 생체내 DNA 합성 반응, 예로써 서열화시 종종 dGTP대신(비록 낮은 효율로 혼입 되지만)사용된다. 집합적으로 이들은 삼인산 데옥시리보뉴클레오시드(dNTP)로 지칭될 수 있다.
발현 시스템이란 용어는 원하는 유전정보 서열 및 조작가능한 결합중 조절 서열을 함유하여 이들 서열에 의해 형질전환된 숙주가 암호화된 단백질을 생산할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 형질전환을 수행하기 위해, 발현 시스템은 벡터에 포함될 수 있지만, 관련된 DNA는 숙주 염색체내로 통합될 수도 있다.
유전자란 용어는 회수가능한 생물활성 폴리펩타이드 또는 전구체의 생산에 필수적인 조절 및 유전정보 서열을 포함하는 DNA 서열을 지칭한다. 폴리펩타이드는 전체 길이의 유전자 서열에 의해 또는 효소 활성이 보유되는 한 유전정보 서열의 임의의 부분에 의해 암호화될 수 있다.
숙주 세로(들)란 용어는 박테리아, 효모 및 방선균 등의 단일 세포성 원핵 및 진핵 유기체, 및 세포 배양에서 성장될 경우 보다 고등 식물 또는 동물로부터의 단일 세포 모두를 지칭한다.
분문에서, DNA 서열화 반응 혼합물이란 용어는 DNA 서열화 반응에 필수적인 요소를 포함하는 반응 혼합물을 지칭한다. 따라서, DNA 서열화 반응 혼합물은, 반응 혼합물이 초기에 불완전할 수도 있지만, 목표물의 핵산 서열을 측정하는 DNA 서열화 방법에 사용하기에 적합하여, 서열화 반응의 개시가 사용자에 의해 조절될 수 있다. 이러한 방식에서, 반응은 일단 최종 요소, 예로써 효소가 첨가됨으로써 개시되어 완전한 DNA 서열화 반응 혼합물을 제공할 수 있다. 통상적으로, DNA 서열화 반응물은 중합 활성에 적합한 완충액, 삼인산 뉴클레오시드 및 하나 이상의 비전형적인 뉴클레오티드를 함유한다. 반응 혼합물은 폴리머라아제 효소에 의해 목표물 상에서 신장하기에 적합한 프라이머, 폴리머라아제 및 목표 핵산을 함유할 수도 있다. 프라이머 또는 뉴클레오티드중 하나는 일반적으로 형광물질 표지 등의 검출가능한 잔사로 표지한다. 일반적으로, 반응물은 4개의 전형적인 뉴클레오티드 및 하나 이상의 비전형적인 뉴클레오티드를 포함하는 혼합물이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 폴리머라아제는 열안정성 DNA 폴리머라아제이고 비전형적인 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이다.
본문에서 올리고뉴클레오티드란 용어는 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 일반적으로는 10개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 분자로서 정의된다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는 올리고뉴클레오티드의 최종 기능 또는 용도를 포함한 많은 인자에 따라 좌우된다.
적절한 서열의 클로닝과 제한, 및 나랑(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법(Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979). 브라운(Brown) 등의 포스포디에스테르 방법(Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979), 뷰케이지(Beaucage) 등의 디에틸포스포르아미다이트 방법(Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981), 매튜씨(Matteucci) 등의 트리에스테르 방법(J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981) 등의 방법에 의한 직접 화학 합성; 자동화된 합성 방법 또는 미국 특허 제 4,458,066호의 고형 지지 방법을 포함하는 모든 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본문에서 프라이머란 용어는, 천연 또는 합성인 것과 무관하게 프라이머 신장이 개시되는 조건하에 놓일 경우 합성의 개시 시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머는 바람직하게 단일-가닥 올리고데옥시리보 뉴클레오티드이다. 프라이머의 적절한 길이는 프라이머의 의도되는 용도에 따라 좌우되지만, 통상적으로는 15 내지 35개의 뉴클레오티드의 범위이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정한 하이브리드 복합체를 형성하기 위해 보다 낮은 온도가 요구된다. 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만, 프라이머 신장을 일으키기 위해 주형과 하이브리드를 형성하기에 충분히 상보적이어야 한다.
경우에 따라, 프라이머는 현미경적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 표지를 혼입함으로써 표지화될 수 있다. 예를 들면, 유용한 표지로는32P, 형광물질 염료, 전자-밀집 시약, 효소(통상적으로 ELISA에서 사용됨), 비오틴, 또는 하프텐, 및 항혈청 또는 단클론성 항체로 유용한 단백질이 있다.
열안정성 폴리머라아제란 용어는 열 저항성이고 충분한 활성을 보유하여 이중가닥 핵산의 변성에 효과를 주기에 충분한 시간 동안 상승된 온도에 처한 경우 후속적인 프라이머 신장 반응을 수행하는 열에 안정한 효소를 지칭한다. 본원에서, 열안정성 폴리머라아제는 폴리머라아제 쇄 반응(PCR) 등의 온도 순환 반응에 사용하기에 적합하다. 열안정성 폴리머라아제의 경우, 효소 활성은 주형 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물을 형성하는 적절한 방식의 뉴클레오티드 조합의 촉매를 지칭한다.
핵산 변성에 필수적인 가열 조건은, 예를 들면 완충액 염 농도 및 변성된 핵산의 조성물과 길이에 따라 좌우되지만, 통상적으로는 온도 및 핵산 길이에 주로 좌우되는 시간 동안, 통상적으로 수초 내지 수분 동안 통상적으로 약 90℃ 내지 약 105℃, 바람직하게는 90℃ 내지 100℃의 범위이다.
핵산 염기, 삼인산 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 지칭할 경우 비전형적인 또는 변형된이란 용어는 전형적인 염기, 또는 DNA에서 천연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 변형체, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 보다 특별히, 본문에서 비전형적인 뉴클레오티드는, 전형적인 dNTP와 비교하여 라이보스 당의 2'위치에서 변형된다. 따라서, RNA의 경우라도, 천연 발생되는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드(즉, ATP, GTP, CTP, UTP는 집합적으로 rNTP)인데, 이들 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드가 비전형적인 뉴클레오티드인 본원의 dNTP에 존재하지 않는 당의 2'위치에서 하이드록실 그룹을 갖기 때문이다. 2'-플로오로-또는2'-아미노 치환된 유사체의 경우 2'위치에서 치환체를 함유하는 리보뉴클레오티드 유사체는 본 발명의 범주에 속한다. 추가로, 리보뉴클레오티드 유사체는 예를 들면 수소 기에 의한 정상적인 하이드록실 기의 치환에 의해 3' 위치에서 변형되어(3' 데옥시) 리보뉴클레오티드 유사 종결제를 제공할 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 또한 비전형적인 뉴클레오티드란 용어의 범주내에 포함된다.
DNA는 전형적으로 dNTP로 구성되므로, rNTP의 혼입은 비전형적이고, 이에 따라 rNTP는 비전형적인 염기이다. 결과적으로, 본 발명의 바람직한 양태에서 DNA서열화 방법을 포함하는 DNA 프라이머 신장 방법의 경우, 핵산 생성물은 전형적 및 비정형적인 뉴클레오티드 둘다를 함유하고, dNTP인 전형적인 뉴클레오티드를 우세하게 포함한다.
비전형적인 염기는, 예를 들면 형광물질 또는 로다민으로 형광물질 표지되거나; 예를 들면 비오틴 등으로 비-형광물질 표지되거나, 예를 들면32P,33P 또는35S에 의해 동위원소 표지되거나, 또는 비표지화될 수 있다.
본 발명에 대한 이해를 돕기 위해, 특이적 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소를 명세서 전반에 걸쳐 본 발명을 예시하기 위해 언급하지만, 이들 사항은 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 열안정성 효소는, 본문에 기술된 신규한 열안정성 폴리머라아제가 상기 효소 활성이 필수적이거나 요구될 경우 임의의 목적을 위해 사용될 수 있을지라도, 다양한 핵산 서열화 방법에 의해 사용된다. 효소는 PCR등의 증폭 반응에 사용될 수도 있다.
본 발명의 열안정성 폴리머라아제는 임계 모티프 SerGlnIleXaaLeuArgXaa(서열 식별 번호: 1)을 포함하고, 이때 상기 서열의 4위치에서 Xaa는 글루탐산 잔기(Glu) 이외의 모든 아미노산 잔기이고, 상기 서열의 7위치에서 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)임을 특징으로 한다. 상기 모티프의 4위치에서 글루탐산 잔기를 갖는 열안정성 폴리머라아제를 암호화하는 유전자는 본원에 기술된 바와 같이 변형되어 적절히 변형된 폴리머라아제 효소를 제공한다. 상기 변형된 열안정성 폴리머라아제 효소는 상응하는 천연 또는 야생형 효소와 비교시 아미노산 서열 모티프 SerGlnIleGluLeuArgXaa(서열 식별 번호: 2)로 변형되고, 이때 7위치에서 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)이고, 즉, 상기 모티프는 또다른 아미노산 잔기에 의해 4위치에서 글루탐산 잔기를 치환함으로써 변형됨을 특징으로 한다. 본 발명에 의해 제공된 열안정한 DNA 폴리머라아제의 임계 모티프는 전형적인 단일-문자 아미노산 유전정보를 사용하여 하기와 같이 제시된다(Lehninger, Biochemistry, New York, New York, Worht Publishers Inc., 1970, 67page).
서열 식별 번호: 1 SerGlnIleXaaLeuArgXaa
여기서, 4위치의 Xaa는 글루탐산 잔기(Glu) 이외의 모든 아미노산 잔기이고, 7위치의 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)이다.
4위치에서 Xaa가 글루탐산 잔기(Glu)가 아닌 상기 임계 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 서열 및 이를 함유하는 단백질 모두 rNTP에 대한 억제가 감소되고, 본 발명의 범주에 속한다. 임계 모티프내에서, 추가의 변형은 상기 임계 포티프에서 다른 아미노산 잔기에 대하여 이루어 질 수 있고, 바람직하게는 글루타민(Gln 또는 Q), 류신(Leu 또는 L), 또는 아르기닌(Arg 또는 R)으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 대하여 이루어 질 수 있다.
본 발명은 열안정성 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 유전자 서열의 특정 변형에 의해 유용한 특성을 갖는 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소를 제조하기 위해 적합하다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 유전자 서열 및 암호화된 효소는 써무스(Thermus) 속의 한 종으로부터 유도되지만, 비-써무스 진정세균류는 후술되는 바와 같이 본 발명의 범주내에 포함된다. 유사하게, 이제 식별화된 임계 모티프의 매우 보존된 특성의 견해에서, 신규한 열안정성 DNA 폴리머라아제는 예를 들면 Taq 폴리머라아제에 대한 이의 상동성을 근거로 식별화될 수 있다. 상기 열안정성 폴리머라아제는, X가 글루탐산 잔기 이외의 모든 아미노산 잔기인 S Q I X L R V/I 모티프를 아미노산 서열이 포함하고, 이 아미노산 서열이 상기 천연 Taq 폴리머라아제의 아미노산 서열과 비교하여 약 39%이상, 바람직하게는 약 60%이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상의 전체 상동성(서열 식별)을 나타내는 한 본 발명의 범주내에 속한다. 상기 Taq 폴리머라아제의 전체 길이 서열은 WO 제 89/06691호에 제공되어 있고, GENESEQ 특허 서열 자료 은행에서 목록 번호 P90556호 하에, 또는 EMBL 서열 자료 은행에서 목록 번호 M26480호 하에, 및 PIR 서열 자료 은행에서 목록 번호 A33530호 하에 입수가능하다.
본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라아제의 예는 하기 표 1에 나타난 유기체로 부터의 천연 폴리머라아제의 재조합 유도체이다. 표 1은 임계 포티프의 특정 서열 및 이들 천연 폴리머라아제 각각에 대한 X 잔기의 위치를 나타낸다. 각각의 열안정성 DNA 폴리머라아제가 독특하므로, 임계 모티프의 아미노산 위치는 각각의 효소에 대해 구별된다. 하기 목록화된 폴리머라아제의 경우, 임계 S Q I X L R V/I 모티프의 X 위치에서 아미노산 서열은 글루탐산이다. 본 발명의 바람직한 폴리머라아제는 85,000 내지 105,000, 보다 바람직하게는 90,000 내지 95,000 범위의 분자량을 갖는다. 상기 폴리머라아제의 아미노산 서열은 약 750 내지 950개, 바람직하게는 800 내지 850개의 아미노산 잔기로 구성된다. 본 발명의 폴리머라아제는 또한 약 540개 이상의 아미노산으로 구성되고, 3' 내지 5' 액소뉴클레아제 분역에 상응하는 하나 이상의 폴리머라아제 분역 및 부분(생성된 폴리머라아제는 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지거나 갖지 않을 수 있다), 및 많은 전체 길이의 열안정성 폴리머라아제 효소의 아미노산 서열의 처음 1/3 상에 함유된 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제 분역의 가능한 부분을 포함할 수도 있다.
표 1에 제시되지 않은 열안정성 DNA 폴리머라아제의 경우, 변형하기에 적절한 글루탐산을 식별하는 것은 아미노산 서열에서 임계 모티프 또는 일치(consensus) 모티프가 식별되기만 하면 간단하다.
열안정성 DNA 폴리머라아제내에 정확한 위치와 무관하게, 서열의 7위치에서 Xaa가 폴리머라아제 분역의 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)인 서열 모티프 SerGlnIleGluLeuArgXaa(서열 식별 번호: 2)내에서 또다른 아미노산에 의한 글루탐산(Glu) 잔기의 치환은 효과적으로 비전형적인 뉴클레오티드를 혼입하는 능력을 갖는 열안정성 폴리머라아제를 제공한다. 바람직한 양태에서, 글루탐산은 글리신, 세린, 시스테인, 트레오닌 등의 비하전된 극성 R 그룹을 갖는 아미노산에 의해, 또는 알라닌 등의 작은 극성 R그룹을 갖는 아미노산에 의해 대체된다. 가장 바람직한 양태에서, 글루탐산 잔기는 글리신 잔기(G)에 의해 대체된다. 아미노산 및 핵산 서열 정렬 프로그램은 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Compter Group)으로부터 쉽게 입수할 수 있다. 본원에 식별화된 특정 모티프가 제공되면, 예로써 GAP, BESTFIT 및 PILEUP를 포함하는 상기 프로그램은 변형될 정확한 서열 영역의 식별에 도움을 준다.
하기 표 1로부터 증명된 바와 같이, 호열성 유기체로부터의 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소의 폴리머라아제 분역내에 보존된 서열 모티프 SerGlnIleGluLeuArgXaa (서열 식별 번호: 2)의 두가지 형태가 본질적으로 존재한다. 서열 모티프 SerGlnIleGluLeuArgVal(서열 식별 번호: 3)은 써무스 아쿠아티쿠스, 써무스 칼도필루스(Thermus caldophilus), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 써무스 플라부스(Thermus flavus) 및 써무스 필리포미스(Thermus filiformis)뿐만 아니라 써무스종 sps 17 및 Z05 등으로부터의 천연 열안정성 폴리머라아제에 존재한다. 또한, 서열 모티프 SerGlnIleGluLeuArgVal(서열 식별 번호: 3)은 써모스피로 아프리카누스(Thermospiro africanus), 및 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax) 및 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)와 같은 다양한 바실러스 균주 등으로부터의 다른 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소의 폴리머라아제 분역에 존재한다. 서열 모티프 SerGlnIleGluLeuArgIle(서열 식별 번호: 4)는, 예로써 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 및 아나에로셀륨 써모필륨(Anaerocellum thermopilum)으로부터의 천연 열안정성 폴리머라아제에 존재한다.
[표 1]
각각의 Taq, Tth, Z05, sps17, Tma 및 Taf 폴리머라아제에 대한 전체 핵산 및 아미노산 서열은 미국 특허 제 5,466,591호에 공개되어 있고, 본원에 참고로 인용되어 있다. Tca, Tfl, Tne, Bca 및 Bst로부터의 DNA 폴리머라아제에 대한 서열은 각각 하기와 같이, 즉 Tca는 EMBL 서열 자료 은행에서 목록 번호 U62584호(Kwon, 1997, Mol. Cells 7(2): 264-271 참조)하에; Tf1은 문헌[Akhmetzjanov 및 Vakhitov, 1992, Nucleic Acids Research 20(21):5839)에; Tne는 WO 제 97/09451호 및 WO 제 96/41014호에; Atn은 EMBL 서열 자료 은행에서 목록 번호 X98575호(보다 상세히), Atn 균주는 라이네이 등의 문헌 1993, J. Bacteriol. 175(15): 4772-2779 참조)하에; Bst는 문헌[Uemori 등, 1993, J. Biochem. 113:401-410] 및 EMBL 서열 자료 은행 목록 번호 U23149호 하에(또한, 문헌 Phang 등, 1995, Gene 163:65-68 참조) 공개되어 있다. 658위치에서 임계 모티프에 E를 포함하는 Bst 폴리머라아제 아미노산 서열은 또한 일본 특허 공보 JP 06/304 964A, 유럽 특허 공보제 EP-A-699,760호, 및 문헌[Aliotta 등, 1996, Genet. Anal. 12: 185-195]에 제공되어 있고; 서열은 또한 EMBL 서열 자료 은행으로부터 목록 번호 U33536호 하에 입수할 수 있다. 문헌[Gene 163: 65-68, (1995)]에 공개된 바와 같은 서열은 잔기 번호 661호에서 임계 모티프의 E를 함유한다. 문헌[Uemori 등, 1993, J. Biochem. 113:401-410] 및 EMBL 서열 자료 은행 목록 번호 D12982호 하에 Bca이 기술되어 있다. 써무스 피리포미스(FEMS Microbiol. Lett. 22: 149-153, 1994 참조; 또한 ATCC 기탁 번호 43280호로 입수용이)로부터의 열안정성 DNA 폴리머라아제는 미국 특허 제 4,889,818에서 제공된 방법을 사용하고 표1에 제공된 서열 정보를 근거로 회수될 수 있다. 상기 서열 및 문헌은 각각 본원에 참고로 인용되어 있다. WO 제 89/06691호에 제시된 바와 같은 Taq 폴리머라아제 및 상술된 Tfl 폴리머라아제의 천연 형태의 아미노산 서열간의 서열 상동성(서열 식별)은 87.4%이다. Tth 폴리머라아제에 대한 상응하는 상동성은 87.4%이고, Tca 폴리머라아제에 대한 상동성은 86.6%이고, Tca 폴리머라아제에 대한 상동성은 86.6%이고, Bst 폴리머라아제(목록 번호 U23149호)에 대한 상동성은 42.0%이고, Bca 폴리머라아제에 대한 상동성은 42.6%이고, Ath 폴리머라아제에 대한 상동성은 39.7%이다.
표 1에서 입증된 바와 같이, 임계 모티프는 열안정성 DNA 폴리머라아제 사이에 현저하게 보존된다. X가 글루탐산 잔기인 경우, 폴리머라아제를 암호화하는 유전자의 변경은 본 발명의 효소를 제공하고, 이는 예를 들면 임계 모티프가 변형되지 않은 Taq 폴리머라아제에 비해 쉽게 rNTP를 혼입한다. 결과적으로 본 발명은, 예를 들면 써무스 오시마이(Thermus oshimai)(Williams 등, 1996, Int. J. Syst. Bacteriol. 46(2): 403-408); 써무스 실바누스(Thermus silvanus) 및 써무스 킬라로필루스(Thermus chilarophilus)(Tenreiro 등, 1995, Int. J. Syst. Bacteriol. 45(4) 633-639); 써무스 스코토덕투스(Thermus scotoductus)(Tenreiro 등, 1995, Res, Microbiol. 146(4): 315-324); 써무스 브로키아누스(Thermus brokianus)(Munster, 1986, Gen. Microbiol. 132:1677) 및 써무스 루버(Thermus ruber)(Loginov 등, 1984, Int. J. Syst. Bacteriol. 34:498-499); 또한 ATCC 기탁 번호 35948호로 입수가능함)로부터의 열안정성 DNA 폴리머라아제, 및 상응하는 유전자 및 발현 벡터를 포함하는 부류의 효소에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 예를 들면 써모토가 엘피(Thermotoga elfii)(Ravot 등, 1995, Int. J. Syst. Bacteriol. 45: 312; DSM 기탁 번호 9442호로 입수가능함) 및 써모토가 써마룸(Thermotoga thermarum)(Windberger 등, 1992, Int. J. Syst. Bacteriol, 42: 327; DSM 기탁 번호 5069호로 입수가능함)로부터의 열안정성 DNA 폴리머라아제, 및 상응하는 유전자 및 발현 벡터의 변형된 형태를 포함한다. 상기 서열 및 문헌 각각은 본원에 참고로 인용되어 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 변형된 임계 모티프는 아미노산 서열 LeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer(서열 식별 번호: 5)내에 있다. 따라서, 본 발명의 한 관점은 비전형적인 뉴클레오티드를 주형-의존성 방식으로 혼입하기 위한 효능이 크게 증가된 열안정성 DNA 폴리머라아제 돌연변이체의 생성을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 폴리머라아제 서열은 LeuAspTyrSerGlnIleGlyLeuArgValLeuAlaHisLeuSer(서열 식별 번호: 6)를 포함한다.
상기 열안정성 DNA 폴리머라아제는 DNA 서열화, DNA 지시된 RNA 합성 및 rNTP 치환된 DNA의 생체내 합성 등의 공정에 특히 적합하다.
비전형적인 염기를 혼입하기 위한 효능이 향상된 열안정성 DNA 폴리머라아제의 생성은 자리-지시된 돌연변이유발 등의 공정에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면 샘브룩 등의 문헌[Molecular Clonig: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, 제2판, 15장 51, Oligonucleotide-Mediated Mutagenesis](본원에 참고로 인용됨)을 참조한다. 예를 들면, 써무스 아쿠아티쿠스(Taq) DNA 폴리머라아제 유전자 서열(서열 식별 번호 : 7)중 잔기 615에서 글루탐산을 암호화하는 코돈의 제 2 위치내에서 A에서 G로의 돌연변이는 전형적인 뉴클레오티드, 즉 dNTP의 존재하에 PCR을 중재하는 효소의 능력을 보유하면서 본원에 정의된 바와 같은 비전형적인 뉴클레오티드를 혼입하는 효과를 500배 이상 증가시킨다. Taq DNA 폴리머라아제에서, 상기 특정 돌연변이는 E(글루탐산)에서 G(글리신)로 아미노산을 변화시킨다. 이러한 특정 아미노산의 변화가 비전형적인 뉴클레오티드를 혼입하는 효소의 능력을 크게 변화시키지만, 세린, 시스테인, 트레오닌, 알라닌, 발린 또는 류신 잔기 등의 다른 모든 아미노산 잔기에 의해 글루탐산을 치환하는 것은 동일한 효과를 가질것으로 예상된다. E615G는 바람직한 양태를 나타내지만, E615를 대체 하는 다른 아미노산 치환은 본 발명에 속한다. 따라서, 본 발명의 중요한 관점은 서열 식별 번호: 1의 모티프에서 제 4 아미노산 잔기는 글루탐산 잔기가 아니라는 것이다.
자리-지시된 돌연변이유발은 또한 자리-특이적 프라이머-지시된 돌연변이 유발에 의해 달성될 수도 있다. 이 기법은 이제 당해분야에서 표준적인 것으로, 제한된 부정짝이 원하는 돌연변이를 나타내는 것을 제외하고 돌연변이되는 단일-가닥 파아지 DNA에 상보적인 합성 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행된다.
간단히, 합성 올리고뉴클레오티드는 플라스미드 또는 파아지에 상보적인 가닥의 직접 합성에 프라이머로서 사용되고, 생성된 이중가닥 DNA는 파아지-지지 숙주 박테리아로 형질전환된다. 생성된 박테리아는 원하는 돌연변이된 유전자 서열을 수반하는 플라크를 식별하기 위해, 예를 들면 DNA 서열 분석 또는 프로브 하이브리드형성에 의해 검정될 수 있다. 다르게는, 재조합 PCR 방법이 사용될 수 있고, 이는 히구치(Higuchi)에 의한 재조합 PCR이란 명칭의 문헌[PCR Protocols, San Diego, Academic Press, Innis 등, 편집, 1990, 22장, 177-183p]에 기술되어 있다.
표 1에 입증된 바와 같이, Taq 폴리머라아제의 임계 모티프내의 글루탐산은 다른 열안정성 DNA 폴리머라아제에서 보존되지만, 아미노산 서열에서 상이하지만 이의 부근의 위치에 자리잡을 수 있다. 써무스 종 열안정성 DNA 폴리머라아제 및 관련된 써모토가, 써모시포 및 아나에로셀륨 종 DNA 폴리머라아제의 서열 식별 번호: 2내에 보존된 글루탐산의 돌연변이는, 서열 식별 번호: 2를 포함하는 Taq 폴리머라아제에 비교하여 비전형적인 뉴클레오티드를 효과적으로 혼입하는 폴리머라아제의 능력에 대해 유사한 증진 효과를 갖는다. 다른 열안정성 DNA 폴리머라아제 중임계 모티프내의 글루탐산 잔기의 돌연변이는 자기-지시된 돌연변이유발을 위해 사용된 원리 및 기법을 이용하여 달성될 수 있다. 유전자은행 또는 스위스프로트(SwissProt)/PIR 데이터베이스에 바실러스 스테아로써모필루스 DNA 폴리머라아제에 대한 몇몇 서열 기탁물이 존재한다. 서열들은 매우 연관되고 서로 어느정도 상이 하지만, 각각은 동일한 임계 모티프 서열 SerGlnIleGluLeuArgXaa(서열 식별 번호: 2)을 서열중 상이한 위치에서 포함하고, 이때 상기 서열의 7위치에서 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)이다.
본원에 기술된 열안정성 DNA 폴리머라아제에 대한 공개적으로 이용가능한 아미노산 및 핵산 서열 정보를 근거로, 전형적인 재조합 방법론에 의해 상이한 열안정성 DNA 폴리머라아제로부터 유도된 분역으로 구성된 키메라 폴리머라아제를 작성 할 수 있다. 미국 특허 제 5,466,591호 및 제 5,374,553호는 열안정성 폴리머라아제의 다양한 작용성 분절, 예로써 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제 분역, 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 분역 및 폴리머라아제 분역을 교환하여 신규한 효소를 제공하는 방법이 기술되어 있다. 바람직한 키메라 열안정성 폴리머라아제 효소는 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제 분역, 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제 분역 및 폴리머라아제 분역을 포함하고, 이로써 하나의 분역이 상이한 폴리머라아제로부터 유도되고, 폴리머라아제 분역이 임계 모티프 서열 SerGlnIleXaaLeuArgXaa(서열 식별 번호: 1)을 포함하고, 이때 상기 서열의 4위치에서 Xaa는 글루탐산 잔기(Glu) 이외의 모든 아미노산 잔기이고, 상기 서열의 7위치에서 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)이다. 상기 키메라 분자에 대한 예는 표 2에 특정화된 바와 같이 구성된 Taq/Tma 키메라 효소이다. 표에 지시된 바와 같이, Taq/Tma 키메라 효소의 폴리머라아제 분역은 상기 특정화된 임계 모티프에서 돌연변이를 함유한다.
[표 2]
플라스미드 pC1은 1996년 7월 17일자로 ATCC에 의해 부다페스트 조약하에 기탁되었고, 목록 번호 98107호가 주어졌다. 플라스미드 pC1은 천연 Taq 폴리머라아제의 아미노산 서열의 615 위치에서 글루탐산 잔기를 암호화하는 코돈에서 돌연변이되어 글리신 잔기를 615 위치에서 갖는 Taq 폴리머라아제의 돌연변이된 형태(E615G 돌연변이 Taq 폴리머라아제)를 생성하는 열안정성 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 유전자를 함유한다. 이러한 기탁물은 비전형적인 뉴클레오티드 유사체를 혼입하는 향상된 효능을 갖는 열안정성 DNA 폴리머라아제를 제공하는 대안의 수단을 제공한다. 실시예 I은 다른 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소를 창출하기 위해 E615G 돌연변이를 서브클로닝하기에 적합한 측면에 접한 제한 자리의 용도를 예시한다. 다수의 열안정성 DNA 폴리머라아제에 대한 완전한 유전자 서열이 공지되어 있으므로, 제한 소화 및 단편 치환 또는 자리 특이적 생체외 돌연변이 유발 등에 의해 E 615를 암호화하는 코돈에서 돌연변이를 도입하는 다른 수단은, 본원에 제공된 임계 모티프상에 서열 정보를 근거로 당해분야의 전문가에게 쉽게 이용가능하다.
자리 특이적 돌연변이 유발에 의해 제조된 변형된 유전자 또는 유전자 단편은 플라스미드 또는 파아지로부터 통상의 수단에 의해 회수되어, 생성된 효소의 후속적 배양 및 정제를 위해 발현 벡터내로 결찰될 수 있다. 포유동물 및 박테리아 시스템을 포함하는 다수의 클로닝 및 발현 벡터가 본 발명의 실행에 적합하고, 예를 들면 샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor, 1989]에 기술되어 있다. 편리하게, 람다 유도된 PL 프로모터를 사용하여 본 발명을 예시한다(Shimatake 등, 1981, Nature 292:128). 상기 프로모터의 용도는 미국 특허 제 4,711,845호 및 제 5,079,352호에 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라아제는 일반적으로 야생형 또는 변형된 열안정성 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 유전자에 조작하여 결합된 발현 벡터에 의해 형질전환된 이. 콜라이(E. Coli) 등의 미생물로부터 정제된다. 적합한 숙주 미생물의 예는 로이어(Lawyer) 등의 문헌[PCR Methods and Applications 2:275-287, 1993]에 기술된 이. 콜라이 균주 DG116이고, 이 균주는 목록 번호 ATCC 53601호하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수할 수도 있다. 열안정성 폴리머라아제를 정제하기 위한 방법도 예를 들면 로이어 등의 문헌[PCR Methods and Applications 2:275-287, 1993]에 기술되어 있다.
당해분야의 숙련가라면 비전형적인 뉴클레오티드를 혼입하기 위한 향상된 효능을 갖는 상기 열안정성 DNA 폴리머라아제는 재조합 DNA 기술의 방법을 사용하여 가장 쉽게 제조됨을 인식할 것이다. 본 발명의 효소중 하나 또는 이들 효소의 유도체 또는 상동체를 생산하고자 할 경우, 효소의 재조합 형태의 생산은 통상적으로 발현 벡터의 작성, 벡터에 의한 숙주 세포의 형질전환 및 발현이 발생할 수 있는 조건하에서 형질전환된 숙주 세포의 배양을 포함한다. 발현 벡터를 제조하고, 형질전환하고 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 수단은 공지되어 있고, 예로써 상술된 1989년 샘브룩 등의 문헌에 상세히 기술되어 있다.
본 발명은 핵산 증폭, 검출 및 DNA 서열화 방법을 포함하는 다양한 분야를 위해 삼인산 리보뉴클레오시드를 사용하기에 적합한 열안정성 DNA 폴리머라아제를 제공한다. 서열화시 리보뉴클레오티드를 사용하면 ddNTP 등의 쇄-종결 유사체의 높은 비용을 방지하고, 중요하게는, 후속적인 DNA 서열화 반응을 수행할 필요없이 DNA 서열 분석 뿐만 아니라 전기영동 또는 하이브리드형성 등의 다른 유형의 분석에 적합한 신규한 증폭 생성물의 제조를 용이하게 한다.
피로포스파타아제는 신장 생성물이 축척됨에 따라 피로인산분해의 양을 감소시킴으로써 호중온성 폴리머라아제 및 열안정성 DNA 폴리머라아제를 사용하여 서열화 결과를 증진시키는 것으로 제시되어 왔다. 사실, 선행 순환 서열화 방법은, 추가의 효소가 서열화 반응에 포함될 필요가 있다. 그러나 본 발명의 매우 유용하고 유익한 관점은 피로포스파타아제가 DNA 서열화에 요구되지 않는다는 것이다. 따라서, 본원에 제공된 신규한 효소의 사용으로 인해 제 2 효소를 서열화 반응 혼합물에 첨가하는 추가의 비용이 제거된다.
본 발명의 효소를 사용함으로써 증폭 및 서열화 반응을 조합하여 시간 및 재료에 드는 비용을 줄일 뿐만 아니라 전체 분석을 간소화한다. 이러한 이점 및 이외의 이점은, 비전형적 뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드 유사체 모두를 프라이머 신장 생성물내로 혼입함으로써 RNA의 가수분해를 받기 쉬운 RNA/DNA 키메라 가닥을 제공하므로 일차적으로 유용하다. 이 처리는 DNA 주쇄에 영향을 주지 않고, 리보뉴클레오티드를 상응하는 dNTP 대신 삽입하는 위치에서 각각 종결하는 핵산 단편의 집단을 제공한다. 가수분해는 알칼리(예: 하기 실시예 VI에서 제시된 바와 같이 0.2M의 최종 농도로 NaOH를 사용한 처리), RNase와 함께 가열 또는 효소 처리(Vogel 등, 편집, Informational Macromolecular, New York, Academic Press, 1963, Berg등의 The Synthesis of Mixed Polynucleotides Containing Ribo- and Deoxyribonucleotide by Purified Prepararion of DNA Polymerase from E. Coli, 467-483p)함을 포함하는 다양한 수단에 의해 쉽게 달성 될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 DNA 서열화 방법에 특히 유용한 신규한 개선된 조성물을 제공한다. 본원에 기술된 신규한 효소는 염료-종결제 또는 염료-프라이머를 사용한 핵산 서열화 방법, 뿐만 아니라 다른 서열화 방법에 유용하다. 이전에 기술된 바와 같이, 쇄 종결 방법은 일반적으로 쇄-종결 뉴클레오티드의 존재하에 주형-의존성 프라이머 신장을 요구하고, 이에 따라 크기에 의해 후속적으로 분리되는 부분적인 단편의 분포가 생성된다. 표준 디데옥시 서열화는 쇄 종결을 위해 삼인산 디데옥시뉴클레오시드 및 이 콜라이 Pol I(상기의 Sanger 등의 문헌 참조)의 클레노우(Klenow) 단편 등의 DNA 폴리머라아제를 사용한다.
이에 따라, 염기성 디데옥시 서열화 절차는 (i) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 주형으로 어니일링하고; (ii) 4가지 분리된 반응에서 DNA 폴리머라아제에 의해 프라이머를 신장하고, 이들 각각은 하나의 표지된 뉴클레오티드 또는 표지된 프라이머, 비표지된 dNTP의 혼합물, 및 하나의 쇄-종결 ddNTP를 함유하고; (iii) 예를 들면, 고-분해 변성 폴리아크릴아미드/우레아 겔 전기영동, 모세관 분리 등의 수단 또는 다른 분해 수단에 의해 반응 생성물의 4가지 집합을 분해하고; (iv) 서열을 추론하기 위해 검사될 수 있는 겔의 자동방사선 영상을 생성함을 포함한다. 다르게는, 질량 분광계 방법 또는 형광물질 표지된 프라이머 또는 뉴클레오티드를 사용한 하이브리드형성-기본 방법은 DNA 서열 정보를 유도하기 위해 사용될 수 있다.
Taq 폴리머라아제 등의 열저항성 폴리머라아제의 유용성은 서열화에 대한 개선된 방법(미국 특허 제 5,075,216호) 및 순환 서열화으로 지칭되는 이의 변형을 제공한다. 순환 서열화시, 가열 및 냉각의 순환이 반복되어 다수의 신장 생성물이 각각의 목표 분자로부터 생성되는 것을 허용한다(Murray, 1989, Nucleic acids Research 17: 8889). 디데옥시 쇄 종결제의 존재하에 주형 서열에 상보적인 목표서열의 비대칭 증폭으로 모든 가능한 길이의 신장 생성물의 집합체가 생성된다.
DNA 주형으로부터 신장 반응 생성물을 변성시킨 후, 프라이머 어니일링 및 프라이머 신장의 다중 순환은 디데옥시 종결제의 존재하에 일어난다. 열안정성 DNA 폴리머라아제는 순환 서열화시 몇몇 이점을 갖는다: 이들은 핵산 목표물에 대한 프라이머의 특이적 하이브리드형성에 요구되는 엄격한 어니일링 온도에 내인성이고, 각각의 순환시 일어나는 고온, 즉 90내지 95℃ 변성의 다중 순환에 내인성이다. 이러한 이유로, 다양한 형태의 앰플리태크DNA 폴리머라아제는 코넥티컷주 노르워크 소재의 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)에 의해 시판되는 Taq 순환 서열화 키트에 포함되어 왔다.
그럼에도 불구하고, 비전혀적인 뉴클레오티드(예: ddNTP)의 혼입에 대해 억제하는 Taq DNA 폴리머라아제의 특성은 순환 서열화를 위해 사용될 경우 한가지 문제점을 나타내고, 이때 ddNTP 또는 형광물질 표시된 ddNTP는 쇄 종결제로서 혼입되어야 한다. 일반적으로, 본 발명의 이전에, 열안정성 DNA 폴리머라아제는 신장 생성물의 집단이 수백개 염기의 거리를 넘는 모든 가능한 단편 길이를 나타내며 생성 될 수 있도록 하기 위해 쇄-종결 뉴클레오티드의 혼합물을 높은 농도로 필요로 하였다. 종종, 이러한 비용 문제를 해결하기 위해, 프로토콜은 매우 저농도의 전형적인 dNTP를 사용하였는데, 이는 반응을 불충분하게 하였다. 저농도의 dNTP 및 고 농도의 ddNTP를 갖는 이들 반응 혼합물은, 열안정성 폴리머라아제가 본질적으로 뉴클레오티드 기질에 대해 고갈되는 환경을 만들어 낸다.
dNTP의 농도가 보다 최적 수준으로 증가하도록 허용하는 앰플리태크DNA 폴리머라아제 FS 등의 변형된 효소의 출현에도 불구하고, 선행 효소는 DNA 서열화를 위해 고가의 ddNTP의 존재에 좌우된다. 이와 반대로, 본 발명은 dNTP의 농도가 증가되는 것을 허용할 뿐만 아니라 성장하는 가닥내로 혼입하기 위해 rNTP를 사용함으로써 고가의 ddNTP의 사용을 방지한다. 부분적 리보뉴클레오티드 치환을 효과적으로 수행하는 신규한 효소의 능력은 종결 뉴클레오티드를 혼입하기 위한 분리된 반응의 부재하에 DNA 서열화 사다리의 생성을 용이하게 한다.
DNA 서열화 방법에 사용하게에 적합한 비전형적인 뉴클레오티드 유사체는 상기 유사체를 혼입하는 열안정성 DNA 폴리머라아제의 능력에 의해 먼저 선택된다. 불행하게도, 상기 뉴클레오티드 유사체는 보다 비용이 높다. 예를 들면, ddNTP의 가격은 rNTP 또는 dNTP에 비해 약 25배를 초과한다. 이전의 열안정성 DNA 폴리머라아제는 성장하는 DNA 가닥내로 주형 지시된 방식으로 rNTP를 효과적으로 혼입할 수 없으므로, 쉽게 이용할 수 있고, 저렴한 상기 리보뉴클레오티드는 열안정성 DNA 폴리머라아제에 의해 DNA 서열화에 사용하기 위한 선택사항이 아니었다. 본 발명은 DNA 서열화 반응에 ddNTP에 대한 요구를 제거한다. 따라서, 한 관점에서 본 발명은 이전의 쇄 종결 방법에 비해 보다 상당히 저렴한 DNA 서열화 분석을 위한 방법을 제공한다.
프라이머 신장 반응에서 망간의 존재는 정확한 염기쌍 뉴클레오티드를 정확하게 삽입하는 폴리머라아제의 능력에 영향을 줄 수 있다. 망간은 부정확한 염기쌍을 교정하거나 뉴클레오티드 유사체의 삽입에 대한 억제를 용이하게 할 수 있다. DNA 복제 또는 증폭 절차에서 돌연변이 유발을 유도하기 위해 연구자들은 망간을 사용해 왔다. 이에 따라, 망간은 중합 반응의 신뢰도 및 반응의 수율에 영향을 준다. 생성된 서열은 DNA 서열화 방법에서 부정확하거나, 또는 생성된 정보는 모호 할 수 있다. 본 발명의 방법은, 망간이 서열화 반응 혼합물중 이가 양이온으로서 포함되어 폴리머라아제가 비전형적인 뉴클레오티드를 삽입하도록 하는 것을 필요로 하지 않는다. 선행 DNA 폴리머라아제와 반대로, 본 발명은 임계 모티프를 효소 능력을 조절하기 위한 폴리머라아제 분역내에서 식별화하여 망간을 사용하지 않고 2' 치환되고 비치환된 뉴클레오티드를 구별한다.
본 발명의 효소는 서열화를 위해 고농도의 비전형적인 염기 유사체를 요구하지 않는다. 본 발명에 앞서, 비전형적인 염기 유사체 및 상응하는 전형적인 염기는 쇄 종결 DNA 서열화 방법을 위해 일반적으로 약 1.3:1 내지 24:1의 범위의 비율(ddATP:dATP)로 존재하였다[이니스(Innis) 등의 미국 특허 제 5,075,216호]. 비교하면, 본 발명에 의해 제공된 열안정성 폴리머라아제는 비전형적인 염기 유사체 대 전형적인 염기의 비율이 백 내지 수천배 감소하는 것을 허용한다. 본원에 제공된 신규한 효소와의 배합물에서 1:1이하의 rNTP:dNTP 비는 DNA 서열 분석을 위해 충분하다. 본 발명의 바람직한 양태에서, rNTP:dNTP 비는 1:8미만으로 감소한다. 상응하는 천연 dNTP에 대한 2'치환된 뉴클레오티드의 비는, 특정 실험 고안 및 단편의 원하는 길이에 따라 1:80 또는 1:200으로 낮을 수 있다.
본 발명의 효소가 쉽게 비전형적인 뉴클레오티드, 예로써 2' 치환된 뉴클레오티드를 혼입하기 때문에, 고농도의 rNTP 및 제한된 농도의 상응하는 dNTP를 사용함으로써 rNTP의 혼입을 강요할 필요가 없다. 따라서, 본 발명의 방법은 소량의 rNTP와의 배합물에서 dNTP의 최적 농도의 사용을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 변형된 폴리머라아제 효소는 적합한 서열화 방법. 예로써 염료-프라이머 서열화에서 사용될 경우, 양호한 DNA 서열화 결과는 각각의 dNTP의 50내지 500㎛ 범위의 dNTP 농도에 의해 수득된다. 바람직하게, dNTP 농도는 100 내지 300㎛이다. 이 범위에서, 상응하는 rNTP는 dNTP와 거의 동일하거나 이보다 적은 농도로 존재할 수 있다. 바람직하게, rNTP는 약 0.1㎛ 내지 100㎛, 가장 바람직하게는 rNTP는 약 2.5㎛내지 25㎛로 존재한다.
본 발명의 변형된 효소와 함께 사용하기에 적합한 rNTP의 농도는 당해분야의 숙련가에 의해 적정 및 최적화 실험에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 요구되는 rNTP 또는 유사체의 양은 실험의 유형에 의해 영향받을 것이고, 이는 목표물 크기 및 순도 뿐만 아니라 선택된 완충액의 종류 및 효소의 특정한 종류에 영향받을 수 있다.
rNTP:dNTP의 비는, rNTP가 성장하는 올리고뉴클레오티드내로 삽입되는 빈도를 결정한다. 각각의 혼입된 rNTP에서 가수분해가 일어나므로, rNTP:dNTP의 비는 생성된 단편의 크기를 증가하거나 감소키기는 유연성을 사용자에게 제공하기 위해 조정 될 수 있다.
이해되는 바와 같이, DNA는 dNTP로부터 합성되는 중합체이다. 각각의 삼인산 데옥시뉴클레오시드는 3' 위치에 하이드록실 그룹을 함유하고 2' 위치에 수소를 함유하는 리보스 당을 포함한다. 리보뉴클레오티드는 또한 당의 3' 위치에 하이드록실 그룹을 함유한다. 그러나, rNTP는 당의 2' 위치에서 dNTP와 구별되는데, 이 때 제 2 하드록실 그룹은 수소 원자로 대체된다. 본문에서, rNTP는 2' 치환된 뉴클레오티드를 정확히 혼입하는 본 발명의 효소의 능력을 예시화한다. 그러나, 본 발명의 화합물은 리보뉴클레오티드인 비전형적인 뉴클레오티드의 사용에 제한되지 않는다. 본원에 식별화된 임계 분역에서 열안정성 폴리머라아제 서열의 변형은 대안의 2' 치환된 뉴클레오티드, 예로써 2'-하이드록실, 3'-데옥시 뉴클레오티드 및 치환된 2'-플루오로 또는 아미노 뉴클레오티드 등의 주형 지시된 혼입을 가능하게 한다.
본 실시예에 기술된 바와 같이, 본원에서 삼인산 코르디세핀으로서 지칭된 3'-데옥시, 2'-하이드록시 ATP의 혼입은 리보스의 3' 위치에서 데옥시를 함유하는 뉴클레오티드의 혼입에 대한 억제를 감소시키는 열안정성 폴리머라아제에서 제 2 돌연변이의 존재에 의해 조장된다. 상기 효소는 예로써 EP-A-655506호 및 1995년 5월 23일자로 출원된 미국 일련 번호 제 08/448,223호(본원에 참고로 인용됨)에 이미 기술되어 있다. 1995년 5월 10일자로 부다페스트 조약하에 기탁된 ATCC 기탁 번호 69820호는 ddNTP 등의 유사체의 혼입 억제를 감소시키는 써무스 아쿠아티쿠스의 변형된 열안정성 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 유전자를 제공한다. 전형적인 dNTP에 비해 디데옥시뉴클레오티드는 치환된 3' 위치를 갖는다. 이에 따라, 본 발명의 조합물에서 E615G, F667Y Taq 폴리머라아제 돌연변이체에 의해 예시된 이중 돌연변이는 dNTP에 비해 리보스의 3' 및 2' 위치에서 치환된 뉴클레오티드 유사체를 사용하는 수단을 제공한다(실시예 III 및 V 참조).
본 발명의 특정 분야는 rNTP 서열화 방법이고, 서열화 프라이머는 구별가능한 형광물질 또는 방사능 표식으로 검출가능하게 표지된다. ddNTP와는 달리, 변형되지 않는 rNTP의 혼입으로 쇄 종결이 제공되지 않는다. 본 발명의 효소와의 배합물에서 rNTP 및 dNTP 둘다를 포함하는 DNA 서열화 반응은 리보 및 인접한 데옥시리보뉴클레오티드 간의 3'-5' 포스포디에스테르 결합에서 균열하기 쉬운 무작위 치환된 프라이머 신장 생성물의 혼합물을 생성한다. 예를 들면, PCR 증폭 또는 순환 서열화에서 프라이머 신장후, 및 예를 들면 전기영동에 의한 프라이머 신장 생성물을 분석하기 전, 반응 혼합물을 알칼리, 열, 리보뉴클레아제 또는 리보뉴클레오티드의 각각의 발생시 신장 생성물을 가수분해하기 위한 다른 수단으로 처리한다. 각각의 표지된 프라이머 신장 생성물의 경우, 표지된 프라이머의 직접적인 신장 생성물인 대부분의 5' 단편만이 서열화 겔상에서 검출가능하다. 제공된 목표물의 경우, 생성된 서열화 겔을 분석하면 서열 사다리, 즉 목표물의 핵산 서열에 상응하는 G, A, T 및 C 래인에서 식별가능한 일련의 신호가 제공된다. 생성된 서열화 사다리는, 이 방법이 통상적인 수단에 의한 ddNTP, 또는 rNTP 및 본원에 기술된 신규한 열안정성 폴리머라아제를 사용하는 것과 무관하게 동일한 정보를 제공한다. 이에 따라, 본 발명을 사용함으로써 고가의 dNTP는 더이상 DNA 서열화에 요구되지 않는다(실시예 VI 참조).
대안의 서열화 방법에서, 쇄-종결 리보뉴클레오티드를 사용한다. 본 발명의 상기 양태에서, 2'-하이드록시, 3'-데옥시 뉴클레오티드(예: 삼인산 코르디세핀)가 종결제로서 사용된다. rNTP 유사체는 형광물질로 표지될 수 있고, DNA 서열화에 사용될 수 있다. 리(Lee) 등은(상술됨) 염료-종결제 ddNTP의 용도를 기술하고 있다. EP-A-655,506호 및 1995년 5월 23일자로 출원된 미국 특허원 일련번호 제 08/448,223호는 ddNTP와 사용하기위해 변경된 효소를 기술하고 있다. 앰플리태크DNA 폴리머라아제 FS(상기 참조)에 존재하는 변형 및 서열 식별 번호: 1(이때 X는 기술된 바와 같이 글루탐산(E)이 아니다)로 특정화된 변형 모두를 포함하는 열안정성 DNA 폴리머라아제는 쇄 종결 서열화 반응에서 표지된 rNTP 유사체를 효과적으로 혼입하기 위해 사용될 수 있다. 이 공정은 자동화될 수 있고, 염료 표지된 프라이머의 합성을 필요로하지 않는다. 게다가, 염료-종결제 반응은 모든 4가지 반응이 동일한 튜브에서 수행될 수 있도록 허용하므로, 이는 염료-프라이머 방법에 비해 보다 편리하다. 2'-하이드록시, 3'-데옥시 뉴클레오티드는 상업적으로 시판하는 3' 뉴클레오티드(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼 코포레이션으로부터 입수가능한 3' dA, 3' dC, 3' dG 3' 및 dT)로 부터 합성될 수 있고, 루드윅(Ludwig)의 문헌[Biophosphates and Their Synthesis Structure, Metabolism and Activity, 편집자 Bruzik 및 Stec, Amsterdam, Elsevier Science Publishers, 1987, 201-204p)에 기술된 바와 같이 5'-삼임산염을 첨가할 수 있다.
신규한 서열화 방법에서 본 발명의 효소를 이용하는 이외에, 본원에 기술된 변형된 효소는 다수의 분자 생물학 분야에 유용하다. 한 양태에서, 변형된 효소는 전형적 및 비전형적 뉴클레오티드(예: dNTP) 및 하나 이상의 검출가능하게 표지된 rNTP(이 표지는 예를 들면 형광물질 표지 또는 방사성 동위원소를 포함한다) 모두를 포함하는 증폭 반응 혼합물에 사용된다. 상보적 가닥의 주형 지시된 합성은 이의 길이를 따라 다양한 위치에서 일인산 리보뉴클레오시드를 함유하는 DNA 생성물을 제공한다. 열 및/또는 알칼리 처리는 각각의 리보뉴클레오티드에서 핵산 신장 생성물을 가수분해한다. 이에 따라, DNA 분절의 집합체가 제공되고, 이때 각각의 단편은 이의 3' 말단에서 하나의 표지 잔기를 함유한다. 생성된 핵산 단편의 크기는 반응물에 포함된 rNTP의 비율 및 양을 조정함으로써 변형될 수 있다.
rNTP를 사용한 목표물의 증폭 및 본 발명의 효소는 특정 분야에 따라 좌우된다. 표지된 rNTP를 사용하는 상기 기술된 방법에서, 생성된 단편의 집합체는 동일한 강도로, 즉 올리고뉴클레오티드 단편당 하나의 표지로 모두 표지화된다. 규소 칩에 고착된 올리고뉴클레오티드 프로브 배열을 사용한 상기 핵산 검출 등의 절차는, 증폭된 목표물이 하이브리드형성 동력학을 조절하기 위해 2차 구조의 형성을 제한하는 고정된 재생성 크기 범위내로 무작위하게 단편화되는 것을 최적으로 요구한다. 추가로, 칩상에서 수천개 프로브의 배열에 대한 하이브리드 형성을 검출하기 위해, 핵산단편이 동일한 강도로 표지되는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명은 이의 규격을 충족시키기 위해 단편의 집합체를 생산하는 수단을 제공하고, 이로써 크로닌(Cronin) 등의 문헌[Human Mutation 7: 244-255] 등에 기술된 칩-기본 방법등의 대안의 검출 형식의 사용을 용이하게 한다.
또다른 양태에서, 본 발명의 열안정성 폴리머라아제 및 rNTP와 dNTP 모두를 포함하는 증폭 반응물에 표지된 프라이머 및 비표지된 프라이머를 사용하면 증폭 및 서열화 반응을 동시에 수행하는 수단이 제공된다. 이 방법은 각각의 rTNP에 대해 한가지씩 4가지 분리된 증폭 반응이 수행될 필요가 있다. 이에 따라, 예를 들면 본 발명의 효소는 PCR 또는 다른 증폭 수단에 의해 목표물 증폭에 적합하므로, 존재할 경우 생성물은 겔 전기영동 또는 프로브 하이브리드 형성 등의 통상의 방법에 의해 반응 생성물의 일부를 사용하여 검출될 수 있다. 이들 검출 방법은 혼입된 리보뉴클레오티드를 가수분해 하지 않고, RNA/DNA 키메라 가닥은 전형적인 핵산 증폭 생성물에 대해 예상된 바와 같이 작용할 것이다. 원하는 생성물이 검출될 경우, 동일한 반응 혼합물의 나머지 부분을 알칼리로 처리하고 핵산 서열 결정을 위해 겔 전기영동에 의해 분석한다. 생성물을 검출한 후, 후속적인 서열화 반응은 불필요하다. 이러한 단순한 절차는 시간 및 재료를 아끼고, 제거된 단계에 의해 정확성이 증가한다: 검출된 생성물은 서열화된 생성물이다.
4개의 표지된 rNTP 및 하나의 비오틴화된 프라이머에 의한 유사한 절차가 사용될 수도 있다. 증폭후, 생성물을 알카리로 분열시키고, 프라이머 결합된 생성물은 스트레파비딘 피복된 비드를 사용하여 반응물에서 제거한다. 포획된 생성물은 후속적으로 서열화 겔상에서 분석한다. 이러한 변형으로 인해 서열화 반응은 하나의 튜브에서 수행되고, 이에 따라 4개의 분리된 증폭에 대한 요구가 제거된다.
본 발명의 또다른 관점에서, 본원에 기술된 효소는 DNA 주형으로부터 RNA를 제조하거나, 국제 특허 공보 WO 제 92/01814호에 기술된 바와 같은 우라실-N-글리코실라아제(UNG) 등의 통상의 살균제를 사용하지 않고 알칼리 중재된 살균을 위해 치환된 DNA를 제조하는데에 유용하다.
예시된 양태에서, 열안정성 폴리머라아제는 상기 엑소뉴클레아제 활성을 크게 약화시키는 작용을 하는 5'-3' 엑소뉴클레아제 분역에서 돌연변이를 함유하기도 한다. Taq 폴리머라아제의 변형된 형태는 미국 특허 제 5,466,591호에 기술되어 있다. 본 발명의 한 양태에서, 아미노산 46위치에서 글리신(G) 잔기를 암호화하는 코돈은 아스파르트산(D)을 암호화하는 코돈에 의해 대체되었다. 생성된 효소는 감소된 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 기인하여 순환 서열화 방법에서 향상된 유용성을 갖고, 이는 본 발명에 의해 사용하기 위한 바람직한 배경이다. 폴리머라아제 분역의 아미노산 서열 및 폴리머라아제 활성은 야생형 효소와 비교할 경우 (G46D) 돌연변이체의 존재에 의해 영향받지 않는다.
본 발명의 상업적 양태에서, 본 발명에 따른 열안정성 폴리머라아제를 포함하는 핵산 서열화를 위한 키트는 본 발명의 상업적 양태를 나타낸다. 이러한 키트는 통상적으로 rNTP, dNTP 및 적절한 완충액 등의 DNA 서열화를 위한 추가의 시약을 포함한다. rNTP가 비표지된 경우, 표지된 프라이머가 포함될 수도 있다.
하기 실시예는 단지 예시하기 위해 제시된 것으로 어떤 식으로든 청구된 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 I
비전형적인 뉴클레오티드에 대한 억제를 감소시키는 변형된 Taq 폴리머라아제 유전자의 발현
Taq DNA 폴리머라아제의 C-말단 아미노산 부분은 폴리머라아제 활성 자리 분역을 암호화한다(로이어 등, PCR Methods and Applications 2:275-287, 1993; 본원에 참고로 인용됨). 이 분역을 함유하는 DNA 단편을 전체 길이의 Taq 유전자로부터 단리하고, 망간의 존재하에 PCR 증폭에 의해 돌연변이를 유발하였다(Leung 등, Technique 1(1): 11-15). 상기 예의 경우, 모든 제한 효소는 매사추세츠주 비버리소재의 뉴 잉글래드 바이오랩스로부터 구입하였다. 돌연변이 유발된 단편을 PstI 및 BglII로 소화시키고, Taq 발현 플라스미드(PstI 및 BglII에 의해 소화된 플라스미드 pLK102)내로 클로닝하였다. 플라스미드 pLK102는 Taq 발현 플라스미드 pSYC 1578의 변형된 형태이다(로이어 등, 상술됨). 폴리머라아제 유전정보 영역에 대해 3' 위치된 HincII/EcoRV 단편을 결실하여 플라스미드 pLK101을 생성하였다. 898개 염기쌍 PstI-BglII 단편을 후속적으로 pLK101로부터 결실하고, 짧은 PstI-EcoRV-BglII 올리고뉴클레오티드 이중물로 대체하여 플라스미드 pLK102를 생성하였다. 이에 따라, 상기 결실은 900개 염기쌍을 Taq DNA 폴리머라아제 유전자의 3' 말단으로부터 제거하고 이를 DNA의 짧은 조각으로 대체한다.
생성된 발현 플라스미드를 이. 콜라이 균주 N1624(Gottesman, J. Mol. Biol 77:531, 1973; 또한 균주 번호 CGSC #5066하에 예일 유니버서티의 이. 콜라이 유전자 보관 센터(Genetic Stock Center)에서 입수가능)내로 형질전환시키고, 야생형 효소에 비해 효과적으로 rNTP를 혼입하는 능력에 대해 생성된 형질전환체를 선별하였다. 이 과정을 사용하여, 보다 효과적으로 rNTP를 혼입하는 능력을 갖는 것으로 돌연변이체 C1을 식별하였다.
Taq 폴리머라아제 유전자의 어떤 부분이 변경된 표현형에 책임이 있는지를 결정하기 위해, 돌연변이체 C1으로부터 단리된 pC1이란 명칭의 돌연변이 유발된 Taq 발현 플라스미드를 여러가지 제한 효소로 소화시키고, 생성된 제한 단편을 pLK101의 야생형 Taq DNA 폴리머라아제 유전자내로 서브클로닝하여 돌연변이되지 않은 제한 단편을 대체하였다. 생성된 서브클론의 분석에 따르면, 표현형을 결정하는 돌연변이는 265개 염기쌍의 NheI 내지 BamHI 제한 단편내에 함유되었다.
앰플리태크DNA 폴리머라아제 FS에 의한 ABIPRISM염료 종결제 순환 서열화 코어 키트(Dye Terminator Cycle Seqencing Core Kit)(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem) 제품) 및 어플라이드 바이오시스템 모델 373A DNA 서열화 시스템을 사용하여 DNA 서열 분석을 수행하였다. 서열 분석은 NheI 및 BamHI 자리 사이의 Taq 폴리머라아제 유전자에서 두개의 불협(missense) 돌연변이를 식별하였다. 아미노산 615 위치에서의 돌연변이는 글루탐산 잔기(E)가 글리신 잔기(G)에 의해 대체되도록 하고, 653 위치에서의 또다른 돌연변이는 알라닌(A) 잔기를 트레오닌(T) 잔기로 대체하였다. 미국 특허 제 5,079,352호에서와 같이 성숙 단백질의 제1 메티오닌 잔기를 암호화하는 코돈에서 번호붙이기를 시작하였다. E615G 돌연변이는 코돈 615중 GAG에서 GGG의 변화에 의해 일어났다. A653T 돌연변이는 코돈 653중 GCC에서 ACC의 변화에 의해 일어났다. 이. 콜라이 균주 N1624에서 플라스미드 C1은 1996년 7월 17일자로 ATCC에 의해 부다페스트 조약하에 기탁되었고, 목록 번호 98107호를 수여받았다.
두 지점의 돌연변이는 재조합 PCR(Innis 등, 편집자, PCR Protocols, San Diego, Academic Press, 1990, 22장, Recombinant PCR, Higuchi, 177-183p)을 사용하여 각각 개별적으로 야생형 Taq 폴리머라아제 유전자내로 서브클로닝함으로써 개별적으로 분석하였다. 발현 생성물을 분석하여 E615G 또는 A653T 또는 이들 두 돌연변이 모두가 리보뉴클레오티드 혼입 표현형에 책임이 있는지의 여부를 결정하였다. 이 실험의 결과로부터, E615G 돌연변이만이 돌연변이체의 표현형에 책임이 있음을 알 수 있었다.
뉴클레오티드 유사체의 혼입 효능에 대한 추가의 분석 및 정량화를 위해, E615G를 함유하는 265개 염기쌍 BamHI-NheI PCR 단편을 Taq 발현 벡터, pRDA3-2내로 클로닝하였다. 발현 벡터 pRDA3-2는 파아지 람다 PL 프로모터에 조작하여 결합된 전체 길이 Taq 유전자를 함유한다. 벡터내의 Taq 유전자의 엑소뉴클레아제 분역은 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키는 글리신, 아미노산 잔기 46을 암호화하는 코돈에서의 지점 돌연변이를 함유한다. 그러나, 발현 벡터 pRDA3-2의 폴리머라아제 분역내의 유전자 서열은 야생형 Taq 유전자 서열과 동일하다. 플라스미드 RDA3-2는 미국 특허 제 5,446,591호(본원에 참고로 인용됨)에 자세히 기술되어 있고, 여기서 플라스미드는 클론 3-2로 지칭된다. 플라스미드 pRDA3-2를 BamHI 및 NheI로 소화시키고, 265개 염기쌍 PCR 단편을 통상의 수단에 의해 벡터내로 결찰시켰다.
생성된 플라스미드, pLK108을 이. 콜라이 균주 DG116(로이어 등의 상기 문헌, 1993 참조; ATCC 번호 53606호 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수 가능)내로 형질전환하였다. 플라스미드 pLK108은 G46D, E615G Taq로 지칭되는 열안정성 DNA 폴리머라아제를 암호화한다. 돌연변이, G46D, E615G, F667Y Taq는 E615G 및 F667Y 돌연변이를 재조합 PCR에 의해 BamHI-NheI 단편내로 합함으로써 생성된다. 이 단편을 플라스미드 pRDA3-2내로 클로닝하여 플라스미드 pLK109를 생성하였다. 플라스미드 pLK108 및 pLK109로부터 발현된 열안정성 DNA 폴리머라아제 단백질은 크로마토그래피 단계가 생략된 로이어 등(1993, 상기 기술)의 방법에 따라 제조되었다. 삽입물의 서열은 DNA 서열 분석에 의해 확인되었다. 사열에서 추가의 돌연변이는 pLK108 삽입물에서 검출되었지만, 이 돌연변이는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않았다.
부분적인 정제후, 변형된 효소의 활성을 로이어 등(1989, J. Biol. Chem. 264:6427-6437; 본원에 참고로 인용됨)에 의해 기술된 활성 검정에 의해 측정하였다. 변형된 효소의 활성은 하기와 같이 계산되었다. 30분 동안 합성된 생성물의 10nmol에 상응하는 효소의 1유닛, 야생형 효소의 DNA 폴리머라아제 활성은 80 내지 100pmole의 혼입된 dCMP까지 효소 농도(반응물당 0.12 내지 0.15 유닛으로 회석된 효소)에 선형으로 비례한다. E615G, G46D 및 E615G, F667Y, G46D 돌연변이체의 활성은 0.25 내지 3pmole 까지의 혼입된 dCMP 효소 농도(반응물당 6×10-4내지 5×10-3유닛으로 희석된 효소)에 선형으로 비례한다. 상기 효소 제제는 실시예 III-V에 기술된 혼입 및 서열화 반응에 이용되었다. 실시예 II 및 VI의 경우, 효소는 로이어 등(상술됨)에 기술된 바와 같이 정제되었다.
실시예 II
혼입의 효능을 비교하기 위한 검정
rNTP를 혼입하는 G46D 및 G46D, E615G Taq의 상대 능력은, 각각의 효소가 활성화된 연어 정액 DNA 주형내로 제한된 효소 농도에서 [α-32P]rNTP를 혼입할 수 있는 양을 측정함으로써 결정되었다. rATP의 혼입을 측정하기 위해, 반응 혼합물은 50㎕ 반응물중 최종 농도가 다음과 같도록 제조되었다: 12.5㎍의 활성화된 연어정액 DNA(후술되는 바와 같이 제조됨), 200㎛의 각각의 dCTP, dGTP 및 dTTP(코넥티컷주 노르워크 소재의 퍼킨 엘머 제품), 100㎛[α-32P]rATP, 1mM의 β-머캅토에탄올, 25mM N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노-프로판설폰산(TAPS) pH 9.5, 20℃, 50mM KCI 및 2.25mM MgCl2.
rCTP, rGTP 및 rUTP의 혼입을 측정하기 위해 유사한 검정 혼합물을 제조하였다. 각각의 경우, rNTP를 방사능표지하고, 100㎛로 제공하도록 하고, 남은 세가지 dNTP(rCTP에 대해 dATP, dGTP 및 dTTP, rGTP에 대해 dATP, dCTP 및 dTTP, 및 rUTP에 대해 dATP, dCTP 및 dGTP)를 각각 200㎛로 제공하였다. 표준으로서, 상응하는 [α-32P]dNTP의 혼입을 측정하였다. 이들 검정을 위한 검정 혼합물은 각각의 [α-32P]rNTP가 100㎛의 상응하는 [α-32P]dNTP에 의해 대체되었다는 것을 제외하고 상기의 rNTP 혼입 검정과 유사하였다. 조야한 연어 정액 DNA(뉴저지주 프리홀드 소재의 워싱턴 바이오케미칼 제품) 1g/ℓ을 2내지 8℃에서 96시간 동안 10mM트리스-HCl, pH 7.2, 5mM NgCl2에서 활성화시켰다. EDTA 및 NaCl을 12.5mM 및 0.1M로 각각 첨가하였다. DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전시키고, 10mM트리스, 1mM EDTA, pH 7.5에 재현탁시켰다. 활성화된 DNA 제제를 동일한 완충액에 대해 투석하였다.
45㎕의 각각의 반응 혼합물을 5'-표지된 뉴클레오티드 전구체 각각에 대해 0.5㎖ 튜브(예: 에펜도르프) 내로 분취하였다. 각각의 G46D Taq 및 G46D Taq를 음성적 대조를 위해 남은 하나의 튜브와 함께 2중 검정하였다. 각각의 검정 혼합물의 두 튜브내의 중합 반응은 5㎕의 G46D Taq 폴리머라아제(0.02유닛) 또는 G46D, E615G Taq(0.002유닛)으로 개시되었다. 배경 수준에 대한 대조군으로서, 효소 대신 5㎕의 효소 희석 완충액을 음성적 대조 반응에 첨가하였다.
각각의 반응을 간단히 와동시키고, 10분동안 75℃에서 배양하였다. 10㎕의 60mM EDTA를 첨가하여 반응을 정지시키고, 얼음상에서 저장하였다. 각각의 시료에 대해, 60㎕ 반응물중 50㎕ 분취량을 1㎖의 2mM EDTA, 50㎍/㎖의 전단된 연어 정액DNA로 희석하였다. DNA를 표준 절차에 따라 TCA로 침전시키고, GF/C 필터 디스크(영국 켄트 소재의 와트만 제품)상에 수집하였다. [α-32P] 표지된 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 혼입된 양을 액체 신틸레이션 분광계로 정량화하고, 혼입된 pmole 수를 계산하였다. 각각의 효소에 의해 혼입된 각각의 rNTP의 pmole 수는 각각의 효소에 의해 혼입된 상응하는 [α-32P]dNTP의 pmole 수로 규정화하였다. 결과는 하기 표 3에 제시하였다.
[표 3]
G46D 및 G46D, E615G Taq에 대한 rNTP 대 dNTP의 혼입 비율
상기 결과는 G46D, E615G가 G46D에 비해 500배 이상 더 효과적으로 리보뉴클레오티드를 혼입하는 것으로 나타낸다(즉, rGTP의 경우 181:0.36 = 502배, rCTP의 경우 198:0.22 = 859배 및 rATP의 경우 210:0:0.18 = 1166배 더 효과적임). 이에 따라 코돈 615에서 폴리머라아제 유전자내의 불협 돌연변이는 신규한 표현형, 즉 데옥시리 보뉴클레오티드 뿐만 아니라 리보뉴클레오티드를 효과적으로 혼입할 수 있는 열안정성 DNA 폴리머라아제를 제공하였다.
실시예 III
3' 데옥시 ATP(코르디세핀)의 혼입에 대한 효능을 비교하기 위한 검정
3'-데옥시 아데노신 5'-트리포스페이트(코프디세핀 트리포스페이트)를 혼입 하는 G46D; G46D, E615G; G46D, E615G, F667Y 및 G46D, F667Y Taq의 상대 능력은 각각의 효소가 제한된 효소 농도에서 활성화된 연어 정액 DNA 주형에 혼입할 수 있는 [α-32P] 삼인산 코르디세핀의 양을 측정함으로써 결정되었다. [α-32P] 삼인산 코르디세핀의 혼입을 측정하기 위해, 검정물은 50㎕의 반응물중 다음과 같은 최종 농도로 구성되어야 한다: 12.5㎍의 활성화된 연어 정자 DNA, 200㎛의 각각의 dCTP, dGTP 및 dTTP, 50㎛ dATP(퍼킨 엘머 제품), 50㎛의 [α-32P]-3'dATP/3'dATP(뉴 잉글랜드 뉴킬리어, 시그마), 1mM β-머캅토에탄올, 25mM N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노-프로판설폰산(TAPS)pH 9.5, 20℃, 55mM KCl 및 2.25mM MgCl2.
45㎕의 각각의 반응 혼합물을 9개의 0.5㎖ 튜브 내로 분취하고, 각각의 반응을 G46D; G46D, E615G; G46D, E615G, F667Y 또는 G46D, F667Y Taq를 사용하고 효소가 없는 대조용으로 남은 하나의 튜브와 함께 이중으로 수행하였다. 각각의 검정 혼합물의 두 튜브내의 중합 반응은 5㎕의 G46D Taq 폴리머라아제(0.058유닛)으로 개시되었다. G46D, E615G Taq(0.0025유닛), G46D, E615G, F667Y Taq(0.0034 유닛) 또는 G46D, F667Y Taq(0.083유닛)에 대해 동일하게 수행하였다. 배경 수준에 대한 대조군으로서, 하나의 나머지 튜브를 효소 대신 희석 완충액으로 개시하였다.
각각의 반응을 간단히 와동시키고, 10분동안 75℃에서 배양하였다. 10㎕의 60mM EDTA를 첨가하여 반응을 정지시키고, 얼음상에서 저장하였다. 각각의 시료에 대해, 60㎕반응물중 50㎕ 분취량을 1㎖의 2mM EDTA, 50㎍/㎖의 전단된 연어 정액 DNA로 희석하였다. DNA를 표준 절차에 따라 TCA로 침전시키고, GF/C 필터 디스크(영국 켄트 소재의 와트만 제품)상에 수집하였다. [α-32P]표지된 뉴클레오티드의 혼입된 양을 액체 신틸레이션 분광계로 정량화하고, 혼입된 pmole 수를 계산하였다. 효소 1유닛당 혼입된 pmole을 제공하기 위해 각각의 효소에 의해 혼입된 [α-32P] 삼인산 코르디세핀을 검정에 사용된 각각의 효소 유닛수로 나누었다. 상기 자료의 차트를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
G46D; G46D, E615G; G46D, E615G, F667Y 또는 G46D, F667Y Taq에 의한 [α-32P] 코르디세핀의 혼입
상기 결과에 따르면 E615G 및 F667Y 돌연변이 둘다 코르디세핀 분자를 DNA내로 효과적으로 혼입하기 위해 요구되는 것으로 나타났다.
실시예 IV
G46D, E615G Taq DNA 폴리머라아제를 사용한 알칼리 분열 DNA 서열화
본 실시예는 부분적으로 rNTP 치환된 DNA를 사용하여 본 발명의 변형된 폴리머라아제를 알카리 분열 서열화에 적용함을 입증한다. 반응 혼합물에서 rNTP 대 dNTP의 비율은 1:80 내지 1:8이었다. 프라이머 신장 반응은 50mM 비신(N,N-비스(2-하이드록시-에틸)글리신;pH 8.3), 25mM KOAc, 및 2.5mM MgCl2로 구성된 완충액에서 수행되었다. 4가지 rNTP 각각에 대한 4개의 개별적인 반응을 수행하였다. 각각의 반응물(50㎕)은 200㎛의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(퍼킨-엘머 제품)를 함유하였고 0.09pmole M13mp18 단일 가닥 DNA 주형(퍼킨-엘머 제품)을 5'-[32P] 표지된 DG48로 어니일링하였다(로이어 등, 1993, PCR Methods and Applications 2:275-287). 반응물은 또한 2.5, 2.5, 2.5 또는 25㎛의 rATP, rCTP, rGTP 또는 rUTP 각각을 함유하였다.
각각의 4개의 반응은 7유닛의 G46D E615G Taq DNA 폴리머라아제를 첨가하여 개시하였고, 10분동안 75℃에서 배양하였다. 10㎕의 60mM EDTA를 첨가하여 반응을 정지시키고, 얼음상에서 저장하였다. 각각 20㎕의 반응물을 80㎕의 50mM 비신(pH 8.3), 25mM KOAc, 및 2.5mM MgCl2에 첨가하였다. 7㎕의 1N NaOH를 첨가하고 15분 동안 98℃에서 배양하여 분열 생성물을 생산하였다. 7㎕의 1N HCl을 첨가하여 반응물을 중성화시켰다. 312㎕의 95% 에탄올 및 10㎕의 3M 아세트산나트륨(pH 4.8)을 첨가하여 각각의 반응물을 침전시켰다. 반응물을 15분 동안 미세원심분리하여 침전물을 수집하고, 상징액을 제거하고, 침전물을 500㎕의 70% 에탄올로 세척하고 건조시켰다. 각각의 펠렛을 5㎕의 0.5X 정지 완충액(Stop Buffer)(코넥티컷주 노르워크 소재의 퍼킨 엘머 제품, 95% 포름아미드, 20mM EDTA 및 0.05% 브롬페놀 블루를 함유한다)에 재현탁하고 3분 동안 98℃에서 가열하고, 미리 전기영동된 6% 폴리아크릴아미드/8M 우레아 DNA 서열화 겔에 직접 장전하고, 전기영동하였다. 겔을 건조시키고, X-선 필름에 노출시켰다. 생성된 필름은 100개를 초과하는 염기의 정확한 서열로 제공된 명백한 서열화 사다리를 보여주었다.
실시예 V
G46D, F615G, F667Y Taq DNA 폴리머라아제 및3' 데옥시 삼인산 뉴클레오티드를 사용한 DNA 서열화
본 실시예는 3' 데옥시 삼인산 뉴클레오티드를 사용하여 G46D, E615G, F667Y Taq의 변형된 폴리머라아제를 DNA 서열화에 적용함을 입증한다. 이 실험은 3' 데옥시 ATP를 사용하여 수행하지만, 다른 3' 데옥시 뉴클레오티드에 의한 사용으로 범위가 확장될 수 있다. 프라이머 신장 반응은 50mM 비신(pH 8.3), 25mM KOAc, 및 2.5mM MgCl2를 함유하는 완충액에서 수행하였다. 각각의 반응물(50㎕)은 각각 200㎛의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(퍼킨 엘머 제품)를 함유하고 0.09pomle M13mp18 단일-가닥 DNA 주형(퍼킨-엘머 제품)을 5'[32P] 표지된 DG48로 어니일링하였다(로이어 등, 1993, PCR Metods and Applications 2:275-287). 반응물은 또한 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1 또는 5㎛3' 데옥시ATP를 함유하였다.
각각의 반응물은 7유닛의 G46D, E615G, F667Y Taq DNA 폴리머라아제를 첨가 하여 개시하였고, 75℃에서 10분 동안 배양하였다. 10㎕의 60mM EDTA를 첨가하여 반응을 종결하고, 이를 얼음상에 위치시켰다. 30㎕의 각각의 반응물을 에탄올 침전시키고, 종결 완충액에 재현탁하고, 3분 동안 98℃에서 가열하고, 미리 전기영동된 6% 폴리아크릴아미드/8M 우레아 DNA 서열화 겔상에 직접 장전하고, 전기영동하였다. 겔을 건조시키고, X-선 필름에 노출시켰다. 코르디세핀의 존재하에 수행된 반응물을 함유한 래인은 명백히 분별할 수 있는 종결 사다리를 포함한다. 대부분의 코르디세핀, 즉 5㎛을 함유하는 래인은 종결 사다리를 나타내고, 여기서, 평균적으로 밴드는 코르디세핀 수준이 보다 낮은 래인에 비해 길이가 짧았다. 코르디세핀의 부재하에 수행된 반응물을 함유한 래인은 거의 전체 길이의 생성물을 나타내었고, 종결 사다리는 없었다. 이러한 결과로부터 돌연변이체 효소는 코르디세핀을 혼합할 수 있고, 프라이머 신장 생성물내로 상기 분자가 혼입되면 종결됨을 알수 있었다. 상기 방법은 또한 3' 데옥시 CTP, 3' 데옥시 GTP 및 3' 데옥시 UTP에 의해 DNA 서열화 사다리를 생성하기 위해 사용될 수 있었다.
실시예 VI
G46D E615G Taq DNA 폴리머라아제에 의한 염료 프라이머 PCR 서열화
본 실시예는 PCR에서 1:30이하의 rNTP:dNTP의 비로 삼인산 리보뉴클레오시드(rNTP)를 사용하여 염료 프라이머 서열화에 본 발명의 변형된 폴리머라아제를 적용함을 입증한다. 각각의 rNTP의 대한 4개의 개별적 반응을 수행하였다. PCR 서열화 반응을 25mM 트리스-HCl(pH 9), 5.0mM MgCl2, 및 10% 글리세롤(v/v)로 구성된 완충액에서 수행되었다. 각각의 반응물은 또한 500㎛의 각각의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP(퍼킨 엘머 제품), XmnI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 선형화된 5×106개 카피/㎕ pBSM13+플라스미드(스타라타젠 제품) 주형, 및 0.05유닛/㎕의 G46D E615G Taq DNA 폴리머라아제를 함유하였다. 리보-ATP 반응물(10㎕)은 2.5㎛ ATP(파마시아 바이오테크 제품), 0.1㎛ JOE M 13 역전 염료 프라이머(퍼킨 엘머 제품), 및 0.1㎛ 프라이머 ASC46(5'-CGCCATTCGCCATTCAG)를 함유하였다. 리보-CTP 반응물(10㎕)은 2.5㎛ CTP(파마시아 바이오테크), 0.1㎛ FAM M13역전 염표 프라이머(퍼킨 엘머 제품), 및 0.1㎛프라이머 ASC46을 함유하였다. 리보-GTP 반응물(20㎕)은 2.5㎛ CTP(파마시아 바이오테크), 0.1㎛ TAMRA M13 역전 염료 프라이머(퍼킨 엘머 제품), 및 0.1㎛ 프라이머 ASC46을 함유하였다. 리보-UTP 반응물(20㎕)은 16㎛ UTP(파마시아 바이오테크), 0.1㎛ ROX M13 역전 염료 프라이머(퍼킨 엘머 제품), 및 0.1㎛ 프라이머 ASC46을 함유하였다.
각각의 4개의 반응물을 예비가열된(75℃) 퍼킨 엘머 진엠프(GeneAmp)PCR 시스템 9600 열순환기에 놓고, 10초 동안 95℃, 10초 동안 55℃로 30회 순환시키고, 1분간 65℃로, 5분간 65℃로 램핑(ramp) 시켰다. rATP 및 rCTP 반응물은 각각 염료-표지된 증폭된 300개 염기쌍 생성물의 6×1011개 카피를 생성하였고, rGTP 및 UTP 반응물은 각각 염료-표지된 증폭된 300개 염기쌍 생성물의 1.2×1012개 카피를 생성하였다.
분리된 효소적 DNA 서열화 반응을 요구하지 않고 증폭된 PCR 생성물의 DNA 서열을 측정하기 위해, 반응물을 합하여 염기 및 열로 처리하고, 중화시키고, 하기와 같이 침전시켰다. 4㎕ 각각의 ATP 및 CTP 반응물 및 8㎕ 각각의 GTP 및 UTP 반응물을 합하였다. 2㎕의 0.25M EDTA(pH 8.0)(최종 10mM), 10㎕ 1M NaOH(최종 200mM) 및 14㎕의 H2O를 합한 반응물에 첨가하고, 이를 진앰프PCR 시스템 9600 열순환기에서 5분 동안 95℃에서 배양하고, 10㎕ 1M HCl로 중화시켰다. 합한 반응물을 150㎕의 95% 에탄올을 첨가하여 침전시키고 이어서 4℃에서 15분동안 배양하였다. 그 다음, 15분 동안 4℃에서 미세원심분리하고, 상징액을 흡기하여 제거하였다. 펠렛을 300㎕의 70% 에탄올로 세척하고, 5분 동안 미세원심분리하고, 흡기하여 상징액을 제거하고, 펠렛을 건조시켰다. 펠렛을 6㎕ 포름아미드 50mg/㎖ 블루 덱스트란(25mM EDTA중) 5:1(v/v)에 재현탁시키고, 90℃에서 3분 동안 가열하였다. 재현탁된 펠렛의 1.5㎕를 직접 미리 전기영동된 5% 롱 랜거(Long Ranger)(FMC 바이오프로덕츠 제품) 6M 우레아 서열화 겔상에 직접 장전시켰다. 이어서, 전기영동하고 제조자의 지시에 따라 퍼킨 엘머 ABI 프리즘TM377 DNA 서열화기상에서 분석하였다. 퍼킨 엘머 ABI 프리즘TM377 DNA 서열화 분석 소프트웨어에 의해 자동화된 염기-콜링(calling)으로 PCR 증폭된 300개 염기쌍 생성물의 DNA 서열 결정에 대하여 99%를 넘는 정확도가 수득되었다.
서열 목록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 에프. 호프만-라 롯슈 아크티엔게젤샤프트
(B) 거리 : 그렌짜헤르스트라세 124
(C) 도시 : 바즐
(D) 주 : BS
(E) 국가 : 스위스
(F) 우편번호(ZIP) : 체하-4070
(G) 전화 : (0) 61 688 24 03
(H) 팩스 : (0) 61 688 13 95
(I) 텔렉스 : 962292/965512 hlr ch
(ii) 발명의 명칭 : 변형된 열안정성 DNA 폴리머라아제
(iii) 서열 수 : 8
(iv) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30(EPO)
(v) 선행 출원 데이터 :
(A) 출원 번호 : 미국 제 60/023,376호
(B) 출원일 : 1996년 8월 6일
(2) 서열 식별 번호 : 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 7개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 위상학 : 선형
(ii) 분자 유형 : 펩타이드
(ix) 형태
(A) 명칭/검색표 : 펩타이드
(B) 위치 : 4
(C) 기타 정보 : /표지 = Xaa
/주 = Xaa는 Glu이외의 모든 아미노산이다.
(ix) 형태 :
(A) 명칭/검색표 : 펩타이드
(B) 위치 : 7
(D) 기타 정보 : /표지 = Xaa
/주 = Xaa는 Ile 또는 Val이다
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 1
[서열1]
(2) 서열 식별 번호 : 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 7개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 위상학 : 선형
(ii) 분자 유형 : 펩타이드
(ix) 형태 :
(A) 명칭/검색표 : 펩타이드
(B) 위치 : 7
(D) 기타 정보 : /표지 = Xaa
/주 = Xaa는 Ile 또는 Val이다
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 2
[서열2]
(2) 서열 식별 번호 : 3에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 7개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 위상학 : 선형
(ii) 분자 유형 : 펩타이드
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 3
[서열3]
(2) 서열 식별 번호 : 4에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 7개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 위상학 : 선형
(ii) 분자 유형 : 펩타이드
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 4
[서열4]
(2) 서열 식별 번호 : 5에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 위상학 : 선형
(ii) 분자 유형 : 펩타이드
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 5
[서열5]
(2) 서열 식별 번호 : 6에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 위상학 : 선형
(ii) 분자 유형 : 펩타이드
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 6
[서열6]
(2) 서열 식별 번호 : 7에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 2626개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 유형 : DNA(지놈성)
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-센서 : 없음
(vi) 근원 :
(A) 유기체 : 써무스 아쿠아티쿠스
(ix) 형태 :
(A) 명칭/검색표 : CDS
(B) 위치 : 121 . . 2616
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 7
[서열7]
(2) 서열 식별 번호 : 8에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 832개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 위상학 : 선형
(ii) 분자 유형 : 단백질
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 8
[서열8]
본 발명에 의해 리보뉴클레오티드 등의 비전형적인 뉴클레오티드를 DNA 생성물내로 혼입하는 향상된 효능을 갖는 열안정성 DNA 폴리머라아제가 제공되었다. 이는 특히 핵산 사열화 프로토콜에 사용하기에 유용하고, 비용 및 효능의 이점을 갖고 DNA 서열 분석을 위한 신규한 수단을 제공하였다. 또한 본 발명에 의해 핵산 서열 분석을 위한 개선된 방법이 제공되었다.
Claims (22)
- 아미노산 서열 SerGlnIleXaaLeuArgXaa(서열 식별 번호 : 1)을 포함하고, 이때 상기 서열의 4위치에서 Xaa는 글루탐산 잔기(Glu) 이외의 모든 아미노산 잔기이고, 상기 서열의 7위치에서 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)인 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소.
- 제 1 항에 있어서,천연적으로 발생하는 열안정성 DNA 폴리머라아제의 재조합 유도체이고, 이때 상기 천연적으로 발생하는 열안정성 DNA 폴리머라아제가 아미노산 서열 SerGlnIleGluLeuArgXaa(서열 식별 번호 : 2)을 포함하고, 이때 상기 서열의 7위치에서 Xaa는 발린 잔기(Val) 또는 이소류신 잔기(Ile)임을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소.
- 제 2 항에 있어서,상기 천연적으로 발생하는 열안정성 DNA 폴리머라아제에 비해 비전형적인 뉴클레오티드의 혼입에 대한 억제를 감소시킴을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소.
- 제 3 항에 있어서,비전형적인 뉴클레오티드를 혼입하는 상기 폴리머라아제의 능력이 상기 비전형적인 뉴클레오티드를 혼입하는 폴리머라아제의 상기 상응하는 천연 형태의 능력에 비해 20배 이상으로 증가함을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라아제.
- 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,상기 폴리머라아제가 비전형적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 삼인산 리보뉴클레오시드 및 상응하는 1:1이하 비율의 전형적인 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열화 반응물에 사용되기 위해 충분한 활성을 가짐을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라아제.
- 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한항에 있어서,상기 폴리머라아제가 약 100㎛이하의 농도로 존재하는 삼인산 리보뉴클레오시드인 비전형적인 뉴클레오티드, 및 약 100㎛이상의 농도로 존재하는 상응하는 전형적인 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열화 반응물에 사용되기 위해 충분한 활성을 가짐을 특징으로 하는 열안정성 DNA 폴리머라아제.
- 제 2 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,써무스 아쿠아티쿠스, 써무스 칼도필루스, 써무스 클리아로필루스, 써무스 필리포미스, 써무스 플라부스, 써무스 오시마이, 써무스 루버, 써무스 스코토덕투스, 써무스 실바누스, 써무스 종 Z05, 써무스 종 sps17, 써무스 써모필루스, 써모토가 마리티마, 써모토가 네오폴리타나, 써모시포 아프리카누스, 아나에로셀륨 써모필륨, 바실러스 칼도테낙스 및 바실러스 스테아로써모필루스로 구성된 그룹으로부터 선택된 유기체로부터 천연적으로 발생하는 DNA 폴리머라아제 효소의 재조합 유도체인 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소.
- 제 2 항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서,천연적으로 발생하는 열안정성 써무스 종 DNA 폴리머라아제, 바람직하게는 Taq DNA 폴리머라아제 또는 이의 상동성 폴리머라아제, 가장 바람직하게는 아미노산 서열 LeuAspTyrSerGlnIleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer(서열 식벽 번호: 5)를 포함하는 열안정성 DNA 폴리머라아제의 재조합 유도체인 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소.
- 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,Taq DNA 폴리머라아제(서열 식별 번호 : 7)의 아미노산 서열에 대해 약 39%이상, 바람직하게는 약 60%이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소.
- 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소를 암호화하는 핵산 서열.
- 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 열안정성 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 열안정성 DNA 폴리머라아제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포.
- (a) 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소의 발현을 촉진하는 조건하에 제 12 항의 숙주 세포를 배양하고; 및(b) 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소를 단리함을 포함하는, 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소를 제조하기 위한 방법.
- 제 13 항에 따른 방법에 의해 제조된 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소.
- 핵산 증폭 또는 서열화 반응에서 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 열안정성 DNA 폴리머라아제 효소의 용도.
- 핵산 주형, 상기 주형에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머; 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 열안정성 DNA 폴리머라아제, 전형적인 dNTP 및 상기 상응하는 전형적 뉴클레오티드에 대해 1:1 이하의 비율로 존재하는 하나 이상의 비전 형적인 뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는, DNA 서열화 반응에 사용하기 위한 조성물.
- 제 16 항에 있어서,상기 비전형적인 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드이고, 상기 리보뉴클레오티드는 바람직하게 약 100㎛미만의 농도로 존재하고, 상응하는 전형적인 뉴클레오티드는 약 100㎛이상의 농도로 존재하는 조성물.
- 제 17 항에 있어서,상기 비전형적인 뉴클레오티드가 비표지화됨을 추가로 특징으로 하는 조성물.
- (a) DNA 서열화 반응물에 비전형적인 뉴클레오티드 및 상응하는 전형적인 뉴클레오티드를 제공하고, 이때 상기 비전형적인 뉴클레오티드 및 상응하는 전형적인 뉴클레오티드가 약 1:1 미만의 비율로 존재하고;(b) 프라이머 신장을 위한 조건하에 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 열안정성 DNA 폴리머라아제의 존재하에 단계(a)의 반응물을 처리하여 상기 비전형적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 신장 생성물을 제공하고;(c) 상기 프라이머 신장 생성물을 가수분해하기 위한 조건하에 단계(b)의 프라이머 신장 생성물을 처리하고;(d) 단계 (c)로부터의 반응 생성물을 분해하고; 및(e) 핵산 목표물의 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 핵산 목표물을 서열화하기 위한 방법.
- 제 19 항에 있어서,상기 비전형적인 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드이고, 바람직하게는 약 0.1㎛내지 100㎛의 농도로 존재하는 서열화 방법.
- 제 19 항에 있어서,상기 상응하는 전형적인 뉴클레오티드가 약 50㎛내지 500㎛의 농도로 존재하는 서열화 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 열안정성 DNA 폴리머라아제, 및 임의로 하나 이상의 올리고뉴크레오티드 프라이머, 전형적인 dNTP 및 상기 상응하는 전형적 뉴클레오티드에 대해 1:1 미만의 비율로 존재하는 하나 이상의 비전형적인 뉴클레오티드의 혼합물등의 상기 서열화 절차에 유용한 추가의 시료를 포함하는 핵산 서열화용 키트.
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