WO2012146260A1 - Herstellung und verwendung von proteinen in der molekularbiologie - Google Patents

Herstellung und verwendung von proteinen in der molekularbiologie Download PDF

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Adrian HÄRRI
Ralf Seyfarth
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Definitions

  • the present invention describes
  • the highly sensitive analytical detection of bacteria or fungi has become indispensable, especially in medicine, hygiene and product control.
  • the detection at the DNA or RNA level is based on molecular biological and usually on real-time PCR methods.
  • the detection of bacteria and fungi is increasingly being carried out molecular biologically and no longer classical microbiological.
  • One reason for this is the increased speed of the test or the greatly reduced waiting time until the result.
  • thermostable Thermus aquaticus DNA polymerase Production and purification of thermostable Thermus aquaticus DNA polymerase.
  • EP 0395736 B2 describes the purification and preparation of a thermostable DNA polymerase from a Thermus species.
  • EP 0823479 B1 describes thermostable DNA polymerase enzymes which are useful for incorporation of an unconventional nucleotide, e.g. Ribonucleoside triphosphate are suitable.
  • EP 0832976 Bl describes the preparation of a thermostable DNA polymerase from Bacillus pallidus.
  • EP 1507002 Bl describes the preparation of thermostable Taq polypeptides with DNA polymerase activity.
  • US Pat. Nos. 5,310,652, 5,614,402 Al, 5,968,799, US Pat. No. 6,630,319, US 2005/006490 and WO 2007076461 each describe the preparation of various thermostable DNA polymerase derivatives from prokaryotes.
  • proteins relevant to molecular biology and molecular biology diagnostics have been expressed in various eukaryotic systems, and subsequently their suitability in diagnostics for the detection or exclusion of microorganism DNA or RNA and their quantification has been demonstrated.
  • a DNA Taq polymerase was produced without residual contamination with bacterial DNA.
  • the DNA polymerase of the bacterium Thermits aquaticus was produced in eukaryotic systems.
  • the DNA polymerase was produced as a test in fungi and animal cells and then purified using a simple protein extraction method.
  • the enzymes produced in the present invention are particularly useful for sterility detection because of their high purity properties (i.e., they have no residual microbial DNA or RNA production strengths).
  • Tab. 1 PCR test for functional testing of the eTaq polymerase enzymes produced in animal cells - Use as a DNA polymerase for the detection of DNA from E. coli
  • Figure 1 clearly shows the signal intensity with which residual E. coli content in the polymerase enzyme can interfere with a PCR assay for £ .co // detection in an analytical sample.
  • a detection system for E. coli the absence of test system-specific E.coli- ⁇ is therefore absolutely necessary for a reliable diagnosis, as shown in the PCR approaches 5 and 6; no PCR interfering signals were detected here; s. also Tab. 2).
  • yeasts Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae were selected, both belonging to the family of Saccharomycetaceae.
  • the coding DNA sequence of the DNA polymerase of Thermus aquaticus was amplified by means of PCR and in each case cloned behind an inducible promoter.
  • the DNA construct was then integrated into the genome of Pichia pastoris or Saccharomyces cerevisiae by means of transformation. Thereafter, the Taq DNA polymerases produced by the yeasts were purified on an HPLC column.
  • the Taq polymerase was selected as the protein of molecular diagnostics.
  • the "Eu-Taq Pol" produced in the two yeasts were then also tested for their enzymatic activity in the context of PCR investigations.

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt die in Eukaryonten durchgeführte Herstellung von Proteinen mit Relevanz in der Molekularbiologie und deren Verwendungsmöglichkeiten. Mittels der hier beschriebenen Erfindung können Proteine zum Einsatz in der molekularbiologischen Diagnostik effizient, kostengünstig und vor allem zeitsparend produziert werden.

Description

Herstellung und Verwendung von Proteinen in der Molekularbiologie
Beschreibung:
Die vorliegende Erfindung beschreibt
- die in Eukaryonten durchgeführte Herstellung von Proteinen mit Relevanz in der
Molekularbiologie
- und deren dadurch besondere Verwendungsmöglichkeit in der Molekularbiologie
Die Molekularbiologie ist inzwischen in sehr vielen Lebensbereichen erforderlich. Die Entwicklung von Proteinen mit besonderen und hochspezifischen Eigenschaften ermöglicht auch in der Analytik ein wachsendes Anwendungspotential. So hat beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion die Arbeiten im Bereich der Molekularbiologie revolutioniert. Die Entwicklung der real-time PCR ermöglichte darauf aufbauend eine zusätzliche Weiterentwicklung der Quantifizierung von DNA oder RNA aus unterschiedlichsten Matrices.
Der hochsensitive analytische Nachweis von Bakterien oder Pilzen ist vor allem in der Medizin, Hygiene und in der Produktkontrolle unverzichtbar geworden. Der Nachweis auf DNA- oder RNA-Ebene beruht auf molekularbiologischen und dabei in der Regel auf real- time PCR-Methoden. So wird auch der Nachweis von Bakterien und Pilzen inzwischen immer häufiger molekularbiologisch und nicht mehr klassisch mikrobiologisch durchgeführt. Ein Grund dafür liegt in der erhöhten Geschwindigkeit des Tests bzw. in der stark verkürzten Wartezeit bis zum Resultat.
Ein Problem entsteht jedoch beispielsweise, wenn prokaryotische DNA oder RNA im Spurenbereich nachgewiesen bzw. ausgeschlossen werden soll oder wenn nachgewiesene DNA oder RNA quantifiziert werden soll, da die für die Untersuchung erforderlichen, herkömmlichen und kommerziell erhältlichen Polymerasen aus Bakterien häufig noch Restmengen an bakterieller DNA aus den produzierenden Mikroorganismen enthalten. In Abhängigkeit des Aufreinigungsgrades der eingesetzten Polymerasen kann z. B. in der Kontrolle von Biopharmazeutika oder Nahrungsmitteln oder in der Krankenhaushygiene die Sensitivität der molekularbiologischen Analytik beeinträchtigt werden oder schlimmstenfalls sogar zu einer falschen Resultatsbewertung des Probenmaterials führen.
Stand der Technik:
Viele Publikationen haben in die molekulare Diagnostik involvierte Enzyme und deren Herstellung in Prokaryonten beschrieben:
Beispielsweise beschäftigt sich EP 0258017 B2 von H.A. Ehrlich et al. insbesondere mit der
Herstellung und Reinigung thermostabiler Thermus aquaticus DNA-Polymerase.
In analoger Weise wird in der EP 0395736 B2 die Reinigung und Herstellung einer thermostabilen DNA-Polymerase aus einer Thermus-Spezies beschrieben.
In der EP 0823479 Bl werden thermostabile DNA-Polymeraseenzyme beschrieben, welche zum Einbau eines unkonventionellen Nucleotides, wie z.B. Ribonucleosid Triphosphat geeignet sind.
Die EP 0832976 Bl beschreibt die Herstellung einer thermostabilen DNA-Polymerase aus Bacillus pallidus.
Desgleichen wird in der EP 1507002 Bl die Herstellung von thermostabilen Taq- Polypeptiden mit DNA-Polymeraseaktivität beschrieben. Desgleichen werden in den US 5310652 AI, US 5614402 AI, US 5968799, US 66303198, US 2005/006490 und WO 2007076461 jeweils die Herstellung verschiedener thermostabiler DNA-Polymerasederivate aus Prokaryonten beschrieben.
Trotz der vielfältigen analytischen Möglichkeiten mit PCR- Verfahren sind die Einsatzmöglichkeiten dieser Verfahren je nach Fragestellung zum Nachweis mikrobieller (bakterieller und oder pilzlicher) DNA oder RNA unter Umständen limitiert, wenn beispielsweise die im Nachweissystem verwendeten Enzyme in Bakterien oder Pilzen produziert wurden und noch Rest-Gehalte von DNA dieser Stämme enthalten. So liefert beispielsweise eine Polymerase mit bakterieller Rest-DNA im PCR-Ansatz in Abhängigkeit des gewählten Nachweissystems ungewollte, zusätzlich gemessene Zielmoleküle und beeinträchtigt dadurch die Analytik. Ein aufgrund einer Kontamination der eingesetzten Biochemikalien detektiertes PCR-Signal vermindert signifikant die Sensitivität des Tests und kann schlimmstenfalls zu falsch positiven Bewertungen führen.
Es ist sehr aufwändig und kostenintensiv, in Prokaryonten produzierte DNA-Polymerasen beispielsweise vollständig von der Bakterien-DNA zu befreien.
In der Publikation von Babara S. Mroczkoski et al., Journal of Biological Chemistry, Vol 269, No 18, pp 13522 - 13528, 1994 wird die Verwendung von Gast-Insekten-ZeÜen für die Sekretion von rekombinierten Proteinen beschrieben.
Die Herstellung von Proteinen in eukaryontischen Zellen (Zellinien aus Insektenzellen) ist ebenfalls in PCT/EP2004/013381(MultiBac) und PCT/EP2006/010608 (PolyBAc) dargestellt und zusätzlich in folgender Publikation beschrieben: DJ. Fitzgerald, P. Berger, C. Schaffitzel, K. Yamada, T.J. Richmond, I. Berger (2006): Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors, Nature Methods 12, ppl021-1032.
In keiner der aufgezählten Publikationen wird jedoch die hier dargestellte Herstellung von Proteinen mit Relevanz in der Molekularbiologie (molekularbiologischen Diagnostik) beschrieben und kombiniert mit den sich für diese Proteine daraus ergebenden neuartigen und besonderen analytischen Anwendungsmöglichkeiten.
Mit der hier beschriebenen Erfindung können Proteine zum Einsatz in der Molekularbiologie und molekularbiologischen Diagnostik effizient, kostengünstig und zeitsparend produziert werden, da der Schritt der aufwendigen Entfernung bakterieller Rest-DNA des Herstellungsorganismus entfallen kann, ohne die Sensitivität des PCR-Nachweissystems zu beeinträchtigen. Daraus ergeben sich letztlich auch neuartige Verwendungsmöglichkeiten in der mikrobiologischen Diagnostik von Mikroorganismen.
In der vorliegenden Erfindung wurden für die Molekularbiologie und molekularbiologische Diagnostik relevante Proteine in verschiedenen eukaryotischen Systemen exprimiert und anschliessend deren Eignung in der Diagnostik zum Nachweis bzw. Ausschluss von Mikroorganismen-DNA oder -RNA sowie zu deren Quantifizierung gezeigt.
Man produzierte dazu beispielhaft eine DNA-Taq-Polymerase ohne eine Rest-Kontamination mit bakterieller DNA. Um dies zu erreichen, wurde die DNA-Polymerase des Bakteriums Thermits aquaticus in eukaryotischen Systemen produziert.
Die DNA-Polymerase wurde testweise in Pilzen und tierischen Zellen produziert und anschliessend mit einer einfachen Proteinextraktionsmethode auf gereinigt.
Diese beispielhaft in Eukaryonten hergestellten Proteine, die in diesem Falle produzierten Taq DNA-Polymerasen, werden im Folgenden als Eu-Taq Pol bezeichnet.
Die produzierten Eu-Taq Pol-Varianten wurden im Anschluss in der oben erwähnten Diagnostik eingesetzt. Bei Einsatz der im Rahmen der Erfindung beispielsweise in Insektenzellen hergestellten DNA-Polymerase ist es sogar möglich, sowohl einen universalen Nachweis bzw. Ausschluss von Pilzen als auch von Bakterien in einem einzigen PCR-Lauf zu ermitteln.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten Enzyme eignen sich aufgrund ihrer hochreinen Eigenschaften (d.h. sie weisen keine Gehalte an mikrobieller Rest-DNA oder RNA ihrer Produktionsstärnme auf) besonders für Sterilitätsnachweise.
Des Weiteren könnte diese erfinderische Methode dazu verwendet werden:
Zur Prüfung der mikrobiellen Keimfreiheit bzw. der Keimgehalte in der Lebensmittel- und Futtermittelbranche :
-Sterilitätsprüfung von sterilisierten Lebensmitteln (z.B. Konserven)
-Sterilitätsprüfungen von sterilisiertem Futter für SPF (Spezifisch pathogenfreie) und steril gehaltene Versuchstiere
-Prüfung der Keimfreiheit in Trinkwasser und Getränken
Zur Sterilitätsprüfung in der Medizinaltechnik:
- zur Qualitätsprüfung von sterilisierten Teilen (z.B. Knochenplatten, Schrauben) und von Instrumentarien und Geräten in Operationssälen
- zur Qualitätsprüfung von Einwegmaterialien wie Dialysenschläuchen, Vorratsbeuteln für Blutkonserven, Transfusionsmaterialien und -Lösungen etc.
Zur Bakteriendiagnostik in der Medizin:
- z.B. zur schnellen quantitativen Bestimmung des Bakteriengehalts im Blut von Patienten mit Sepsisverdacht
In der Umweltanalytik:
- zum Nachweis oder Ausschluss von Bakterien und Pilzen unter extremen Lebensbedingungen auf der Erde (Vulkane, Tiefsee, Poole), innerhalb oder außerhalb der Erdatmosphäre sowie auf anderen Planeten
- zum Nachweis oder Ausschluss von biologische Kampfstoffen (Bakterien und Pilzen) in der Umwelt und im Trinkwasser
Zur Produktkontrolle z.B. in der Molekularbiologie oder Herstellung von Lebensmitteln/ Futtermitteln oder pharmazeutischen Produkten:
- zur Reinheitsprüfung von Biochemikalien und Produkten, die aus Mikroorganismen hergestellt wurden, auf Kontamination von Gehalten aus Rest-DNA oder RNA aus Mikroorganismen
Herstellung von Proteinen mit Relevanz in der Molekularbiologie in Eukarvonten-Zellen
Beispiel 1 : Protein-Herstellung in tierischen Zellen:
In diesem Teil der vorliegenden Arbeit wurde beispielhaft ein Protein, welches Relevanz in der Molekularbiologie hat, in Zelllinien aus Insektenzellen (SF21 Zellen) mit der MultiBac Methode hergestellt.
Die Methode sowie die eingesetzten Vektoren und Bacmide stammten aus folgenden Patenten: PCT/EP2004/013381 (MultiBac) und PCT/EP2006/010608 (PolyBAc). Die Methode ist zusätzlich in folgender Publikation beschrieben: DJ. Fitzgerald, P. Berger, C. Schaffitzel, K. Yamada, T.J. Richmond, I. Berger (2006): Protein complex expression by using multigene baculo viral vectors, Nature Methods 12, 1021-1032. Als für die molekulare Diagnostik relevantes Protein wurde die Taq-Polymerase ausgewählt und in den SF21 -Insektenzellen produziert. Die so produzierte „Eu-Taq Pol" wurde anschliessend auf ihre enzymatische Aktivität und ihre Reinheit von E. coli-DNA im Rahmen von PCR-Untersuchungen getestet (s. Tab. 1).
Tab. 1 : PCR-Test zur Funktionsprüfung der in Tierzellen hergestellten eTaq-Polymerase-Enzyme - Einsatz als DNA-Polymerase zum Nachweis von DNA aus E. coli -
(Ct=cycle threshold; zeigt den PCR-Zyklus an, ab dem eine Amplifikation messbar wird; ct=50: keine Amplifikation bis zum letzten PCR-Zyklus der Untersuchung messbar; Rep. Ct= Ct-Mittelwert aus zwei unabhängigen parallelen PCR-Ansätzen; Mastermix: Biochemikalien zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion: Puffer mit Nukleotiden; hier: ohne Polymerase)
Figure imgf000005_0001
In einem weiteren PCR-Testlauf wurde die Reinheit einer herkömmlichen DNA-Polymerase bezüglich DNA von E. coli mit der der euTaq-Polymerase aus Tierzellen verglichen: In dieser Untersuchung wurde das Vorhandensein von Rest-DNA von E. coli in der getesteten herkömmlichen Polymerase aus E. coli nachgewiesen (s. Tab. 2 und Abb. 1): Tab. 2: PCR-Test zur Prüfung von Taq-Polymerasen auf Reinheit von £.co//'-DNA - Vergleich von herkömmlicher Taq-Polymerase und eTaq-Polymerase -
(Ct=cycle threshold; zeigt den PCR-Zyklus an, ab dem eine Amplifikation messbar wird; ct=50: Keine Amplifikation bis zum letzten PCR-Zyklus der Untersuchung messbar; Rep. Ct= Ct- ittelwert aus zwei unabhängigen parallelen PCR-Ansätzen; Mastennix: Biochemikalien zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion: Puffer mit Nukleotiden; hier: ohne Polymerase)
Figure imgf000006_0002
In Abb. 1 wird deutlich sichtbar, mit welcher Signalintensität ein Restgehalt an E. coli im Polymerase-Enzym eine PCR-Untersuchung zum £.co//-Nachweis in einer Analysenprobe stören kann. In einem Nachweissystem für E. coli ist für eine sichere Diagnostik die Abwesenheit von Testsystem-eigener E.coli-ΌΝΑ daher zwingend erforderlich, wie in den PCR-Ansätzen 5 und 6 gezeigt; hier wurden keine den Nachweis störenden PCR-Signale detektiert; s. dazu auch Tab. 2) .
Figure imgf000006_0001
"Tö " '20 '30 '40 Cycle real-time PCR-Amplifikationskurven des PCR-Tests auf Reinheit der Polymerase- Enzyme von £.co//-DNA - Vergleich von herkömmlicher Taq-Polymerase und euTaq- Polymerase (s. Tab. 2) Beispiel 2: Protein-Herstellung in Pilzen:
In diesem Teil der vorliegenden Arbeit wurde beispielhaft ein Protein, welches Relevanz in der Molekularbiologie hat, in Pilzstämmen produziert. Als Produktionsstämme wurden die Hefen Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae ausgewählt, beide zur Familie der Saccharomycetaceae gehörend.
Zur Herstellung hitzestabiler DNA-Polymerasen in Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae wurde die kodierende DNA-Sequenz der DNA-Polymerase von Thermus aquaticus (Taq) mittels PCR vervielfältigt und jeweils hinter einen induzierbaren Promotor kloniert. Das DNA-Konstrukt wurde danach in das Genom von Pichia pastoris bzw. Saccharomyces cerevisiae mittels Transformation integriert. Danach wurden die von den Hefen produzierten Taq DNA-Polymerasen über eine HPLC-Säule gereinigt.
Als für die molekulare Diagnostik relevantes Protein wurde wiederum die Taq-Polymerase ausgewählt. Die in den beiden Hefen produzierten„Eu-Taq Pol" wurden anschliessend ebenfalls auf ihre enzymatische Aktivität im Rahmen von PCR-Untersuchungen getestet.

Claims

Verwendungsansprüche:
1. Die Herstellung von Proteinen mit Relevanz in der Molekularbiologie (molekularbiologischen Diagnostik) in eukaryontischen Zellen, und deren Verwendung in der Molekularbiologie molekularbiologischen Diagnostik.
2. Die Herstellung von Proteinen mit Relevanz in der molekularbiologischen Diagnostik von Mikroorganismen in eukaryontischen Zellen, und deren Verwendung in der molekularbiologischen Diagnostik von Mikroorganismen.
3. Herstellung und Verwendung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese Proteine eine für die molekularbiologische Diagnostik von Mikroorganismen relevante DNA-Polymerasefunktion haben.
4. Herstellung und Verwendung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass diese Proteine eine für die molekularbiologische Diagnostik von Mikroorganismen relevante R A-Polymerasefunktion haben.
5. Herstellung und Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Protein in Pilzen produziert wurde.
6. Herstellung und Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Protein in Pichia pastoris produziert wurde.
7. Herstellung und Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Protein in tierischen Zellen produziert wurde.
8. Herstellung und Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Protein in Insekten produziert wurde.
9. Herstellung und Verwendung nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Protein bei Nachweisverfahren eingesetzt wird, in denen eine PCR-Reaktion erforderlich ist.
10. Herstellung und Verwendung nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Protein bei Nachweisverfahren eingesetzt wird, in denen eine klassische PCR mit PCR-Produkt-Nachweis durchgeführt wird.
11. Herstellung und Verwendung nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Protein bei Nachweis verfahren eingesetzt wird, in denen eine real-time PCR durchgeführt wird.
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