UA47423C2 - Рекомбінантна термостабільна дhк-полімераза, фрагмент нуклеїнової кислоти, композиція для застосування в реакції секвенування днк, спосіб секвенування нуклеїнової кислоти-мішені, набір для секвенування нуклеїнової кислоти - Google Patents
Рекомбінантна термостабільна дhк-полімераза, фрагмент нуклеїнової кислоти, композиція для застосування в реакції секвенування днк, спосіб секвенування нуклеїнової кислоти-мішені, набір для секвенування нуклеїнової кислоти Download PDFInfo
- Publication number
- UA47423C2 UA47423C2 UA97084100A UA97084100A UA47423C2 UA 47423 C2 UA47423 C2 UA 47423C2 UA 97084100 A UA97084100 A UA 97084100A UA 97084100 A UA97084100 A UA 97084100A UA 47423 C2 UA47423 C2 UA 47423C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- dna polymerase
- sequencing
- nucleic acid
- dna
- sequence
- Prior art date
Links
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 113
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 title claims abstract description 112
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 83
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 46
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 97
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 92
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 39
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims abstract description 37
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 49
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 47
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 28
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 23
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 18
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 13
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 95
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 95
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 22
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 abstract description 18
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 8
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 abstract description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 abstract description 6
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 abstract description 6
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 abstract description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 64
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 38
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 239000002585 base Substances 0.000 description 32
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 14
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 14
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 14
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- -1 ribonucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 7
- KQLDDLUWUFBQHP-UHFFFAOYSA-N Cordycepin Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OCC(CO)C1O KQLDDLUWUFBQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 7
- OFEZSBMBBKLLBJ-BAJZRUMYSA-N cordycepin Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)C[C@H]1O OFEZSBMBBKLLBJ-BAJZRUMYSA-N 0.000 description 7
- NLIHPCYXRYQPSD-VGIXGZPDSA-N cordycepin triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1O[C@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)C[C@@H]1O NLIHPCYXRYQPSD-VGIXGZPDSA-N 0.000 description 7
- OFEZSBMBBKLLBJ-UHFFFAOYSA-N cordycepine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)CC1O OFEZSBMBBKLLBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 7
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 7
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 7
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 6
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 101100006982 Mus musculus Ppcdc gene Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 2
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003203 nucleic acid sequencing method Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanedioic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C(N)CCC(O)=O OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DJHOBIUAJLDRDQ-UUOKFMHZSA-N 2-hydroxy-ATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(O)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O DJHOBIUAJLDRDQ-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102000000662 3'-5' exonuclease domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008023 3'-5' exonuclease domains Proteins 0.000 description 1
- XMGKYXFDYYTZFD-UHFFFAOYSA-N 4-amino-1-hydroxy-2-methylbutane-2-sulfonic acid Chemical compound OCC(C)(S(O)(=O)=O)CCN XMGKYXFDYYTZFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHQAUSOKYWFWHO-UHFFFAOYSA-N 4-aminobutane-2-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(C)CCN NHQAUSOKYWFWHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000611750 Coregonus kiyi Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108010076551 DNA polymerase C Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N dITP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N diclofenac Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- KMJYFAKEXUMBGA-UHFFFAOYSA-N n-[amino(ethylamino)phosphoryl]ethanamine Chemical compound CCNP(N)(=O)NCC KMJYFAKEXUMBGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSHXTAQSSIEBQS-UHFFFAOYSA-N s-[3-carbamoylsulfanyl-2-(dimethylamino)propyl] carbamothioate;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=O)SCC([NH+](C)C)CSC(N)=O MSHXTAQSSIEBQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Abstract
Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза, яка здатна більш ефективно включати невластиві нуклеотиди, такі як рибонуклеотиди, в ДНК-продукти, в порівнянні з нативною термостабільною ДНК-полімеразою, та придатна для використання в реакціях секвенування ДНК. Винахід забезпечує створення нових більш дешевих та ефективних способів аналізу послідовностей ДНК. Описані також гени, які кодують вказані модифіковані ферменти, способи їх одержання та використання.
Description
Опис винаходу
Даний винахід відноситься до термостабільної ДНК-полімерази, здатної більш ефективно включати 2 рибонуклеозидтрифосфати. У винаході описані методи і способи виділення такої полімерази. Ферменти по винаходу можуть застосовуватися для різних цілей, зокрема для секвенування нуклеїнових кислот. Таким чином, винахід також відноситься до поліпшених методів аналізу послідовності нуклеїнових кислот.
Секвенування ДНК звичайно включає отримання чотирьох популяцій фрагментів одноланцюгової ДНК, що мають одне певне закінчення і одне вариабельне закінчення. Вариабельне закінчення звичайно закінчується на 70 конкретних основах нуклеотидів (на гуанині (Г), аденині (А), тимидині (Т), або на цитозині (Ц)). Кожний з чотирьох різних наборів фрагментів розділяють на основі їх довжини. З цією метою використовують поліакриламідний гель з високою дозволяючою здатністю. Кожна смуга на таких гелях відповідає конкретному нуклеотиду в послідовності ДНК, показуючи тим самим його положення в послідовності.
Методом секвенування ДНК, що часто застосовується, є дидезоксі-або ланцюг-термінуючий метод 12 секвенування, який включає ферментативний синтез ланцюга ДНК (Запоег і інш., 1977, Ргос. Маї. Асад. Зсі. 74: 5463). Звичайно здійснюють чотири різні реакції синтезу, кожна з яких повинна закінчитися на певній основі (Г, А, Т або Ц) шляхом включення відповідного термінуючого ланцюга нуклеотида, такого, як дідезоксінуклеотид.
Продукти реакції легко визначити, оскільки кожна смуга відповідає тільки Г, А, Т або Ц.
У дидезоксі- або ланцюг-термінуючому методі випалюють короткий одноланцюговий праймер, відповідний одноланцюговій матриці. Праймер подовжують на його 3'-кінці шляхом включення дезоксінуклеотидів (ДНТФ) до включення дідезоксінуклеотида (ддНТФ). Після включення ддНТФ подовження припиняється. Однак для гарантії правильності реплікації ДНК ДНК-полімераза володіє більш вираженою здатністю включати природні для них субстраті, тобто ДНТФ, і не включати аналоги нуклеотидів, звані невластивими нуклеотидами. При синтезі ДНК рибонуклеотиди (рНТФ) розглядаються як невластиві нуклеотиди, оскільки на відміну від ддНТФ рНТФ звичайно с неє природними субстратами для ДНК-полімераза іп мімо. У клітці ця властивість сприяє зниженню включення Ге) аномальних основ, таких, як дезоксінозинтрифосфат (ДИТ Ф) або рНТФ, в зростаючий ланцюг ДНК.
Двома методами автоматичного секвенування, що найбільш часто використовуються, є секвенування з використанням забарвленого праймера і забарвленого термінатора. Ці методи придатні для використання з флуоресцентно міченими фрагментами. Хоч секвенування також може бути здійснене з використанням о радіоактивне мічених фрагментів, секвенування, засноване на флуоресценції, є більш переважним. Загалом, при «с секвенуванні із забарвленим праймером флуоресцентно мічений праймер застосовують в комбінації з неміченими ддНТФ. Процес здійснюється з використанням чотирьох реакцій синтезу і до отримання на гелі З чотирьох смуг для кожної підлягаючої секвенуванню матриці, (відповідних продукту термінации, який ча специфічний для кожної основи). Після подовження праймера підлягаючі секвенуванню суміші, що містять 3о продукти термінації з включеними дідезоксінуклеотидами, звичайно аналізують з використанням електрофореза З на гелі для секвенування ДНК. Після електрофоретичного розділення флуоресцентно мічені продукти вирізають за допомогою лазера з основи геля і флуоресценцію визначають з використанням відповідного монітора. У автоматичних системах при проходженні реакційних сумішей через матрикс геля під час електрофореза « детектор сканує основу геля для виявлення, який з мічених фрагментів використовується (Зтійй і інш., 1986, З 70 Машге 321: 674-679). У модифікації цього методу кожний з чотирьох праймерів мітять різним флуоресцентним с маркером. По завершенні чотирьох різних реакцій секвенування реакційні суміші об'єднують і об'єднані
Із» реакційні суміші піддають гель-аналізу для кожної смуги, за допомогою чого індивідуально виявляють різні флуоресцентні мітки (відповідні чотирьом різним продуктам термінації, які специфічні для кожної основи).
У іншому варіанті застосовують метод секвенування з використанням забарвленого термінатора. У цьому 42 методі для включення дНнтФ застосовують ДНК-полімераза і флуоресцентно мічені ддНТФ на кінці шк ДНК-праймера, що нарощується (і ее і інш., 1992, Мисівіс Асій Кезеагсп 20: 2471). Перевагою цього способу є -І відсутність необхідності синтезувати мічені барвником праймери. Крім того, реакції з використанням забарвленого термінатора є більш зручними, оскільки при цьому всі чотири реакції можуть бути здійснені в шк одній і тій же пробірці. Раніше були описані модифіковані термостабільні ДНК-полімерази, що володіють ка 20 зниженою здатністю розрізнювати дцНТФ (див. публікацію європейської заявки ЕР-А-655506 і заявку на патент
США 08/448223). Прикладом модифікованої термостабільної ДНК-полімерази є мутантна форма ДНК-полімерази с» з Т.адиаййсиз, що має залишок тирозина в положенні 667 (замість залишку фенілаланину), тобто так звана
Е667у- мутантна форма ДНК-полімерази Тад.АтріїТад? Е5, яка виготовляється фірмою Нойтапп-і/ а Косне і продається через фірму РегКіп ЕІтег, знижує кількість дцНТФ, необхідну для ефективного секвенування 29 нуклеїнової кислоти-мішені, в декілька сотень або декілька тисяч разів. АтріїТад? 5 являє собою мутантну
ГФ) форму ДНК-полімерази з Т. адцайсиз, що має мутацію Е667У і додатковий залишок аспарагінової кислоти в юю положенні 46 (замість залишку гліцина; 546О-мутація). Таким чином, існує необхідність в термостабільної
ДНЕК-полімеразі, що застосовується для альтернативних методів синтезу нуклеїнових кислот, придатних для точного і ефективного з точки зору вартості аналізу нуклеотидної послідовності в ДНК. Також існує 60 необхідність в розробці методів, заснованих на флуоресценції, для яких не потрібне застосування дідезоксінуклеотидів. Даний винахід направлений на рішення цих задач.
Даний винахід відноситься до залежної від матриці термостабільної ДНК-полімерази, яка включає характерну амінокислотну послідовність-мотив ЗегОІпІеХааі енАгаХаа (5ЕО ІО МО: 1), причому "Хаа" в положенні 4 цієї послідовності являє собою залишок будь-якої амінокислоти, крім залишку глутамінової кислоти (10), а "Хаа" в бо положенні 7 цієї послідовності являє собою залишок валіну (Маї) або залишок ізолейцину (Не). При вираженні в однолітерному коді амінокислот ця послідовність-мотив може бути позначена як 5 01 ХІІ КМ, де"Х" в положенні 4 цієї послідовності являє собою залишок будь-якої амінокислоти, крім залишку глутамінової кислоти.
Здатність термостабільної ДНК-полімерази, що має амінокислотну послідовність, що включає вказану послідовність-мотив, де "Х" в положенні 4 цієї послідовностімотиву не є залишком глутаміновою кислоти, обмежувати включення рибонуклеотидів в порівнянні з раніше описаної термостабільної полімерази знижена.
Для зростаючого ланцюга ДНК рибонуклеотиди е невластивими нуклеотидами. Таким чином, першим предметом винаходу є нові ферменти, здатні включати невластиві аналоги основ, такі, як рибонуклеотиди, в зростаючий ланцюг ДНК і на декілька порядків більш ефективні, ніж виявлені раніше термостабільні 7/0 ДНК-синтезуючі ферменти. Гени, що кодують ці ферменти, також відносяться до цього винаходу, рівно як і рекомбінантні вектори експресії і клітки-господарі що включають ці вектори. За допомогою таких трансформованих кліток-господарів можуть бути отримані великі кількості обчищених термостабільних ферментів полімерази.
Відповідно до даного винаходу була виявлена область або послідовність-мотив всередині амінокислотної /5 послідовності термостабільной ДНК-полімерази, збільшуюча здатність полімерази включати рибонуклеотиди, зберігаючи при цьому здатність правильно включати дезоксірибонуклеотиди. Зміни в цій області, наприклад, заміна однієї або декількох амінокислот (наприклад, введення їх шляхом сайтнаправленого мутагенеза), приводить до отримання термостабільного ферменту полімерази, який здатний синтезувати РНК або РНК/ДНК- химери або гібридний ланцюг на матриці ДНК.
Іншим предметом винаходу є вдосконалені методи і композиції, призначені для визначення послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, при цьому необхідність в термінуванні ланцюг ддНТФ відпадає. За допомогою представлених в даному описі вдосконалених методів рибонуклеотиди (рРНТФ) включаються в продукти подовження праймерів. Оскільки ферменти, що є предметом винаходу, точно і ефективно включають як рНІТФ, так і дДНТФ, в реакціях секвенування можуть використовуватися суміші обох нуклеотидів. Після подовження сч праймера знову синтезовані олігонуклеотидні продукти можуть бути розщеплені по місцях включення рНТФ методами, відомими в даній області техніки, наприклад, шляхом гідролізу, що приводить тим самим до (8) отримання популяції фрагментів, придатних для фракціонування і аналізу послідовності стандартними методами, такими, як гель-електрофорез. Ці методи, засновані на застосуванні нових термостабільних ферментів полімерази, представлені в даному описі. Таким чином, цей предмет винаходу відноситься до с зо термостабільної ДНК-полімерази, яка відрізняється тим, що полімераза включає критичний мотив
БЗегОіІпіеХааі енАгаХаа (ЗЕО І МО), де "Хаа" в положенні 4 може являти собою залишок будь-якої с амінокислоти, крім залишку глутаміновою кислоти (СІМ), а "Хаа" в положенні 7 являє собою залишок валіну (Маї) «г або залишок изолейцина (Пе).
Іншим предметом винаходу є модифіковані полімерази, представленого в справжньому описі, який включає - рибонуклеотиди або аналоги, що містять гідроксильну групу або інший заступник в положенні 2", які звичайно «Е відсутні у дезоксірибонуклеотидів. Ці нуклеотиди можуть бути по-різному помічені, що створює альтернативні варіанти звичайному застосуванню дідезоксінуклеотидів для цілей секвенування ДНК.
Мутантні термостабільні полімерази по винаходу здатний більш ефективно включати невластиві нуклеотиди, зокрема рибонуклеотиди, в порівнянні з відповідними ферментами дикого типу. У переважному варіанті «
Здійснення винаходу підлягаючий включенню невластивий нуклеотид може бути аналогом термінувати ланцюг 7-3 с основи, таким, як 2'-гидрокси-3'-дезоксіАТФ (кордицепінтрифосфат), що є "риботермінатором"-аналогом АТФ, . або нетермінуючим ланцюгом нуклеотидом, таким, як рНТФ. и?» Іншим предметом винаходу є мутантні термостабільні полімерази, які здатні більш ефективно включати невластиві нуклеотиди, зокрема рибонуклеотидам, чим відповідні ферменти дикого типу. Таким чином, цей предмет винаходу відноситься до рекомбінатних термостабільних ДНК- полімераз, кожна з яких їх характеризується тим, що (а) в своїй нативній формі полімераза включає амінокислотну послідовність зегоіІпіесіш епАгоХаа (ЗЕО ІО МО: 2), де "Хаа" в положенні 7 цієї послідовності означає залишок валіну (Маї)
Ш- або залишок изолейцина (Пе); (б) в амінокислотній послідовності рекомбінантного ферменту, переважно в їх положенні 4 цієї послідовності, отримують мутацію, при якій залишок глутамінової кислоти в положенні 4 являє собою залишок іншої амінокислоти, переважно залишок гліцина; і (в) здатність рекомбінантного ферменту ю обмежувати включення рибонуклеотидів і аналогів рибонуклеотидів в порівнянні з нативной формою цього сю ферменту знижена.
Іншим предметом винаходу є полімераза, який призначений для фрагментації продуктів амплифікації і продуктів подовження праймера, причому такі фрагментированні продукти можуть бути придатні для ов Використання в методах, заснованих на гибридизации, і для різних стратегій визначення послідовності.
Ферменти по даному винаходу і кодуючі їх гени можуть застосовуватися для створення композицій, придатних
Ф) для здійснення реакцій секвенування ДНК і включаючих суміш звичайних нуклеотидів і принаймні один ка рибонуклеотид або аналог рибонуклеотида. У переважному варіанті здійснення винаходу невластивий нуклеотид являє собою рибонуклеотид, а концентрація рибонуклеотида нижче за концентрацію відповідного во дезоксірибонуклеотида, тобто відношення рРНТФ:ІДНТФ складає 1:11 або менш. Ферменти по винаходу також придатні для продажу у вигляді наборів, які також можуть включати будь-який з додаткових елементів, необхідних для здійснення реакції секвенування нуклеїнової кислоти, такої, як, наприклад, ДНТФ, рНТФ, буфери та/(або праймери.
Даний винахід відноситься до нового і поліпшеного модифікованого термостабільного ДНК-пол і меразам, 65 композицій і наборів, охарактеризованого в формулі винаходу. Ферменти по винаходу більш ефективно включають невластиві нуюігозидтрифосфати в порівнянні з раніше відомимі полімеразамі або відповідними полімеразами дикого типу, з яких отримують ці нові полімерази. Згідно з винаходом також пропонуються послідовності ДНК, що кодують ці модифіковані ферменти, вектори для експресії модифікованих ферментів і клітки з такими впровадженими в них векторами. Ферменти по винаходу придатні для практичного застосування
В нових методах секвенування ДНК, які володіють рядом переваг в порівнянні з методами секвенування ДНК, відомими з рівня техніки.
Нижче для полегшення розуміння суті даного винаходу визначені деякі поняття.
Поняття "звичайний", якщо воно згадується в зв'язку з основами нуклеїнової кислоти, нуклеозидтрифосфатами або нуклеотидами, відноситься до такого, який зустрічається в природних умовах у /о вказаному полинуклеотиді (наприклад, для ДНК це дАТтТФ, дГТФ, дЦТФ та дТТФ). Крім того, в реакціях синтезу
ДНК іп міго, таких, як секвенування, замість ДЦТФ часто використовують с/дГТФ і дИТФ (хоч вони включаються з меншою ефективністю). Загалом вони можуть бути узагальнені поняттям дезоксірибонуклеозидтрифосфати (дДНТФ).
Поняття "система експресії" відноситься до последователностям ДНК, що містить необхідну кодуючу /5 послідовність ії функціонально пов'язані контролюючі послідовності, так що господарі, трансформовані цими послідовностями, володіють здатністю продуцировать протеїни, що кодуються. Для осуществленийя трансформації система експресії може бути включена у вектор, хоч придатна ДНК також може бути включена в хромосому господаря.
Поняття "ген" відноситься до послідовності ДНК, яка включає контролюючі і кодуючі послідовності, необхідні для отримання, що відтворюється біологічно активного полипептида або попередника. Поліпептид може кодуватися повноразмірною послідовністю гена або будь-якою маючу достатню довжину частиною кодуючої послідовності, щоб зберегти ферментативну активність.
Поняття "клітка(ї) -господар(ї)" відноситься як до одноклітинним прокариотическим або еукариотическим організмам, таким, як бактерії, дріжджі і актиномицети, так і до окремих кліток з рослині або тваринних вищих сч ов Загонів, якщо вони здатні рости в культурі кліток.
Поняття, що Використовується в даному описі "реакційна суміш для секвенування ДНК" відноситься до і) реакційної суміші, яка включає елементи, необхідні для реакції секвенування ДНК. Таким чином, реакційна суміш для секвенування ДНК придатна для використання в методі секвенування ДНК для визначення послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, хоч спочатку реакційна суміш може бути неповною, щоб користувач міг с зо Контролювати ініціація реакції секвенування. У цьому випадку реакція може бути почата після того, як буде доданий останній елемент, такий, як фермент, який вводиться для отримання повної реакційної суміші для с секвенування ДНК. Звичайно реакційна суміш для секвенування ДНК повинна містити буфер, придатний для «г полімеризації, нуклеозидтрифосфати і принаймні один невластивий нуклеотид. Реакційна суміш також може містити праймер, який може подовжуватися на мішені полімеразою, полімеразу і нуклеїнову кислоту-мішень. ї-
Праймер, рівно як і один з нуклеотидів звичайно включає той, що містить мітку, наприклад, флуоресцентну, «Е фрагмент, який може бути виявлений. Звичайно реакційна суміш являє собою суміш, яка включає чотири звичайних нуклеотиди і принаймні один невластивий нуклеотид. У переважному варіанті здійснення полімераза являє собою термостабільну ДНК-полімеразу, а невластивий нуклеотид являє собою рибонуклеотид.
Поняття "олігонуклеотид", що використовується в даному описі, відноситься до молекули, що складається з «
ДВОХ або декількох дезоксірибонуклеотидов або рибонуклеотидів, переважно більш ніж з трьох і звичайно більш пл») с ніж з десяти. Точний розмір олігонуклеотида може залежати від багатьох чинників, включаючи основну функцію або застосування олігонуклеотида. ;» Олігонуклеотиди можуть бути отримані будь-яким придатним методом, включаючи, наприклад, клонирование і рестрикцию відповідних последовательностей, і методом прямого хімічного синтезу, таким, як фосфотриефирний метод Магапа і інш., 1979, Мей. Епгутої. 68: 90-99; фосфодиефирний метод Вгом/лп і інш., їх 1979, Меїй. Епгутої. 68: 109-151; диетилфосфорамидний метод Веайсаде і інш., 1981, Тейгапедгоп Гей. 22: 1859-1862; триефирний метод Мацйешссі і інш., 1981, 5. Ат. Спет. бос. 103: 3185-3191; автоматичними методами - синтезу або методом з використанням твердої підкладки, описаним в патенті США 4458066. їх Поняття "праймер", що використовується в даному описі, відноситься до природному або синтетичному Оолігонуклеотиду, який здатний служити точкою ініціація синтезу при створенні умов, при яких починається о подовження праймера. Праймер переважно являє собою одноланцюговий олігодезоксірибонуклеотид. 4) Відповідна довжина праймера залежить від призначення праймера, але звичайно складає від 15 до 35 нуклеотидів. Для коротких молекул праймера звичайно необхідні більш низькі температури для утворення досить стабільних гібридних комплексів з матрицею. Праймер не повинен відображати точну послідовність ов Матриці, але для того, щоб відбувалося подовження праймера, повинен володіти достатньою мірою комплементарноетм для гибридизації з матрицею. іФ) При необхідності праймер може бути помічений шляхом включення мітки, яка може бути виявлена ко спектроскопичними, фотохимичними, біохімічними, иммунохимичними або хімічними способами. Наприклад, придатні мітки включають ЗР, флуоресцентниє барвники, електронноплотние реагенти, ферменти (такі, як 60 звичайно що застосовуються в методах ЕГІ5А), биотин або гаптени і протеїни, для яких є антисиворотки або моноклональние антитіла.
Поняття "термостабільна полімераза" відноситься до ферменту, який стабільний при нагріванні і який стійкий до нагрівання і зберігає достатню активність для послідуючего здійснення реакції подовження праймера при впливі підвищених температур протягом часу, необхідного для здійснення денатурації двохланцюгових 65 нуклеїнових кислот. Згідно з даним описом термостабільна полімераза придатний для використання в реакції з температурними циклами, такій, як полімерізна ланцюгова реакція (ПЛР). Для термостабільної полімерази під ферментативною активністю розуміють здатність відповідним образом катализувати приєднання нуклеотидів для формування продуктів подовження праймера, які комплементарии до ланцюга нуклеїнової кислоти-матриці.
Необхідні для денатурації нуклеїнової кислоти умови нагрівання можуть залежати, наприклад, від концентрації солі в буфері, а також складу і довжини нуклеїнових кислот, що підлягає денатурации, але звичайно вони знаходяться в інтервалі від приблизно 907С до приблизно 105"С, переважно від 907С до 100"С, а тривалість нагрівання в основному залежить від температури і довжини нуклеїнової кислоти, і звичайно вона складає від декількох секунд до чотирьоххвилин.
Поняття "невластивий" або "модифікований", коли воно характеризує основу нуклеїнової кислоти, 7/0 Нуклеозидтрифосфат або нуклеотид, включає модифікацію, похідні або аналоги звичайних основ або нуклеотидів, які зустрічаються в ДНК в природних умовах. Зокрема згідно з даним описом невластиві нуклеотиди модифіковані в положенні 2" цукру рибози в порівнянні із звичайними дНТФ. Таким чином, хоч рибонуклеотиди (тобто АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ, звані в цілому рНТФ) і явялються нуклеотидами, що зустрічаються в природних умовах РНК, в контексті даного опису ці рибонуклеотиди є невластивими нуклеотидами, оскільки мають в 7/5 положенні 2' цукру гідроксильну групу, яка відсутня в ДНТФ. Аналоги рибонуклеотидів, що містять заступники в положенні 2, такі, як 2-фтор-, 2'-аминозамещенние аналоги, підпадають під об'єм винаходу. Крім того, аналоги рибонуклетидів можуть бути модифіковані в положенні 3, наприклад, шляхом заміщення нормальної гідроксильної групи на водневу групу (3-дезоксі)), що приводить до отримання аналога-термінатор рибонуклеотида. Такі нуклеотиди також включені в об'єм поняття "невластиві нуклеотиди".
Оскільки ДНК звичайно складається з ДНТФ, включення рНТФ повинно розглядатися як невластиве, і, отже, рНТФ повинен розглядатися як невластива основа. Таким чином, в переважному варіанті винаходу при здійсненні методів подовження ДНК-праймера, включаючи методи секвенування ДНК, як продукти отримують нуклеїнові кислоти, які містять як звичайні, так і невластиві нуклеотиди, але в основному вони містять звичайні нуклеотиди, які являють собою ДНТФ. сч
Невластиві основи можуть бути флуоресцентно міченими, наприклад, флуоресцином або родаміном; нефлуоресцентно міченими, наприклад, біотином., міченими ізотопами, наприклад, ЗР, ЗЗР або 958., або о неміченими.
Для пояснення суті винаходу в описі приведені приклади специфічних термостабільних ферментів
ДНК-полімераз по винаходу, однак ці посилання не повинні розглядатися як обмежуючі об'єм винаходи. У со переважному варіанті термостабільні ферменти по винаходу застосовували в різних методах секвенування нуклеїнових кислот, хоч нові термостабільні полімерази, приведеного в даному описі, може застосовуватися для с будь-якої мети, де така ферментативна активність є необхідною або бажаною. Фермент також може «І застосовуватися в реакціях амплифікації, таких, як ПЛР.
Термостабільні полімерази по винаходу відрізняється тим, що кожна з них містить критичний мотив - з5 ЗегоіпіеХааі енАгоХаа (ЗЕО ІО МО: 1), де "Хаа" в положенні 4 цієї послідовності являє собою залишок будь-якої «ф амінокислоти, крім залишку глутаміновою кислоти (Сію), а "Хаа" в положенні 7 цієї послідовності являє собою залишок валіну (Маї) або залишок изолейцина (Пе). Гени, які кодують термостабільні полімерази, які мають залишок глутамінової кислоти в положенні 4 цього мотиву, може бути модифіковані згідно з справжнім описом з « отриманням придатних модифікованих полімераз. Ці модифіковані термостабільні полімерази відрізняється тим, що в порівнянні з відповідними нативними ферментами або ферментами дикого типу вони мають модифікацію в с амінокислотній послідовності-мотиві ЗегОІпіесіш енАгоаХаа (ЗЕБЕО ІО МО: 2), де "Хаа" в положенні 7 цієї й послідовності означає залишок валіну (маї) або залишок изолейцина (Пе); тобто цей мотив був модифікований "» шляхом заміщення залишку глутаміновою кислоти в положенні 4 залишком іншої амінокислоти. Критичний мотив термостабільної ДНК-полімерази по даному винаходу приведений нижче з використанням стандартного
ОоДднолітерного коду амінокислот (І енпіпдег, Віоспетівігу, Мем/ Могк, ММопй Рирбі-ізНегв Іпс., 1970, стор. 67). «г» ЗЕО ІЮО МО: 1 бЗегОіІпіеХааі енАгаХаа, де "Хаа" в положенні 4 представляє з себе залишок будь-якої амінокислоти, крім залишку глутаміновою кислоти (СІМ), а "Хаа" в положенні 7 являє собою залишок валіну (Маї) 7 або залишок изолейцина (е). «г» Кодуючі послідовності генів, рівно як і протеїни, що містять цю критичну амінокислотну послідовність, де
Хаа в положенні 4 не є залишком глутаміновою кислоти (Сім), відносяться до полімерази, здатність якої ді обмежувати включення рНТФ знижена, і включені в об'єм даного винаходу. Всередині критичного мотиву можуть с» бути здійснені додаткові модифікації залишків інших амінокислот, переважно залишків амінокислот, вибраних з групи, що включає глутамин (Сіп або С), лейцин (І еи або І) або аргинин (Аго або К).
Даний винахід може використовуватися для отримання термостабільних ДНК-полімераз з поліпшеними властивостями шляхом певної модифікації в послідовності гена, який кодує термостабільну ДНК-полімеразу. У переважному варіанті винаходу послідовність гена і фермент, що кодується відбуваються з видів роду Тпегтив, іФ) хоч еубактерии, що не відносяться до роду Тпептив, також включені в даний винахід, як це більш детально ко описане нижче. Аналогічно цьому, в зв'язку з висококонсервативною природою виявленого в даному дослідженні критичного мотиву, нові термостабільні ДНК-полімерази можуть бути виявлені на основі їх гомології, наприклад, бо з Тад-полімеразою. Такі термостабільні полімерази включений в об'єм даного винаходу при умові, що їх амінокислотна послідовність включає мотив ЗОЇ ХІ КМ/, де Х означає залишок будь-якої амінокислоти, крім залишку глутаміновою кислоти, і ця амінокислотна послідовність в цілому гомологична (ідентичність послідовності) принаймні приблизно на 3995, переважно принаймні приблизно на 6095, більш переважно принаймні приблизно на 8095 амінокислотній послідовності нативної Тад-полімерази. Вся довжина послідовності 65 цієї Тад-полімерази приведена в УУО 89/06691 і зареєстрована під реєстраційним номером РООБ556 в базі даних запатентованих послідовностей ЗЕМЕ5ЕО або під реєстраційним номером М26480 в базі даних послідовностей
ЕМВІ і під реєстраційним номером АЗ3530 в базі даних послідовностей РІК.
Прикладом термостабільних ДНК-полімераз по даному винаходу є рекомбінантні похідні нативних полімераз з організмів, приведених нижче в таблиці 1. У таблиці 1 приведена конкретна послідовність критичного мотиву і положення залишку "Х" для кожної з цього нативних полімераз. Оскільки кожного термостабільного
ДНК-полімераза є унікальною, положення амінокислот критичного мотиву є визначеним для кожного ферменту.
Для перерахованих нижче полімераз амінокислотний залишок в положенні "Х" критичного мотиву ЗОЇ ХІ КЕМ/Л являє собою глутаминовую кислоту. Молекулярна маса переважних полімераз по даному винаходу складає від 85000 до 105000 Так, більш переважно від 90000 до 95000 Так. Амінокислотна послідовність цих полімераз 7/0 складається з приблизно 750-950 залишків амінокислот, переважно із 800-850 залишків амінокислот. Полімерази по даному винаходу може перебувати з приблизно 540 або більше за амінокислоти і включають принаймні полімеразний домен і частину, відповідну 3'-5'-екзонуклеазному домену (отримана полімераза може володіти або не володіти 3'-5'єекзонуклеазной активністю), і можливо частини 5'-3'-екзонуклеазного домена, який розташований на першій третині амінокислотної послідовності багатьох повнорозмірних термостабільних /5 Полімераз.
Для термостабільних ДНК-полімераз, не приведеного в таблиці 1, вибір відповідною глутаміновою кислоти, що підлягає модифікації є простоєм, якщо визначений критичний мотив або консенсусний мотив в амінокислотній послідовності.
Незалежно від точного положення всередині термостабільної ДНК-полімерази, заміщення залишку го глутаміновою кислоти (СІМ) на залишок іншої амінокислоти всередині послідовності-мотиву зегоіІпіесіш епАгоХаа (ЗЕО ІО МО: 2), де "Хаа" в положенні 7 цієї послідовності означає залишок валіну (Маї) або залишок изолейцина (Пе), в полімеразному домені дозволяє отримати термостабільного полімераза, здібного до ефективного включення невластивих нуклеотидів. У переважному варіанті глутаміновую кислоту замінюють на амінокислоту, що має ненавантажену полярну До- групу, таку, як гліцин, серин, цистейин, треонин, с ов або на амінокислоту, що має невелику неполярну К-групу, таку, як, наприклад, аланин. У найбільш переважному варіанті залишок глутаміновою кислоти замінюють на залишок гліцина (б). Програми, що дозволяють встановити і) амінокислотну і нуклеотидную послідовність, можуть бути придбані у фірми Сепеїйсв Сотршег (гор, 575
Зсіепсе Огіме, Медісон, шт. Віськонсин. Програми, придатні для конкретного, певного в даному описі мотиву включають, наприклад, "ЗАР", "ВЕБЗТРЇІТ" ії "РІГЕОР", сприяючі виявленню точної послідовності підлягаючої с зо Модифікації області.
Як видно з приведеній нижче таблиці 1, існують дві необхідні форми консервативні послідовності-мотиву с
ЗегоіІпПесіш енАгаХаа (ЗЕО ІЮО МО: 2) всередині полімеразного домену термостабільних ДНК-полімераз цих «г термофільних організмів. Послідовність-мотив ЗегОІпіесіш ешАгоМа! (ЗЕ ІО МО: 3) присутній в нативних термостабільних полімерах таких видів роду Тпегтив, як, наприклад, Тпегтивз адиаїйсив, Тпегтиз саІдорпісв, в.
Тпегтивз (епторийив5, Тпегтив ЙПЙамиз і Тйептивз ПЙШогтів, а також видів Тйептив врві/ і 205. «Е
Послідовність-мотив ЗегоІпіесіш ецАгамМа! (ЗЕО ІО МО: 3) також присутній в полімеразном домені інших термостабільних ДНК- полімераз, які отримуються, наприклад, з Тіегтовзірнпо аїгісапиз і з різних штамів
Васіїшв, таких, як Васійшв саідоїеепах і Васійшв звіеагоїпегторнпіив. Послідовність-мотив
ЗегоіІпПесічі ецАгоПе (ЗЕО ІЮО МО: 4), наприклад, присутній в нативних термостабільних полімеразах Тпепгтоїода « тапцта, Тнегтоюда пеароїйапа і Апаегосеїїнт (пегторніїчт. з ш ї» вам їв г
З г я. з с» ов о де) во Повна послідовність нуклеїнової кислоти і амінокислотна последовніссь для кожної з Тад-, ТІй-, 205-, зраеІ7-, Тта- і Тагполімераз описана в патенті США 5466591 і включена в даний опис як посилання.
Послідовність ДНК-полімерази з Теа, ТЯ, Тпе, АФ, Вса і Ввзі описана в наступних публікаціях: Теа в базі даних послідовностей ЕМВІ під реєстраційним номером Шб2584 (див. також у Кмоп, 1997, Мої. Сеїйв 7(2): 264-271); ТЯ у АКптеїгіапом і Макпйом, 1992, Мисівіїс Асідв Кезеагсп 20(21): 5839; Тпе в МО 97/09451 і в МО 65 96/А41014; АК в базі даних послідовностей ЕМВІ. під реєстраційним номером Х98575 (більш докладне штамм Ай описаний у Каїпеу і інш., 1993, 3. Васіегіої. 175(15): 4772-4779); Вві у МОетогі і інш., 1993, 9. Віоснет.
113: 401-410 і в базі даних послідовностей ЕМВІ під реєстраційним номером 023149 (див. також у РНапа і інш., 1995, Сепе 163: 65-68). Амінокислотні послідовності Вві-полімерази, що містять "Е" в критичному мотиві в положенні 658, також описані в опублікованому японському патенті УР. 05/304964А, опублікованої європейській заявці ЕРА-699760 і у Аїйойа і інш., 1996, Сепеї. Апаї. 12: 185-195; послідовність також може бути отримана з бази даних послідовностей ЕМВІ під реєстраційним номером 033536. Послідовність, як описано в Сепе 163: 65-68 (1995), містить залишок "Е" в положенні 661 критичного мотиву. Вса-полімераза описана у Оетогі і інш., 1993, 9. Віоспет. 113: 401-410 і в базі даних послідовностей ЕМВІ під реєстраційним номером 012982.
Термостабільна ДНК- полімераза з Тпегтивз ПйШйогтів (див. РЕМ Місгобріої. Гей. 22: 149-153, 1994; також 7/0 депонована в АТСС під номером 43280) може бути відновлена з використанням методів, описаних в патенті
США 4889818, а також на основі інформації про послідовність, представлену в таблиці 1. Кожна з вищезгаданих послідовностей і публікацій включені в даний опис як посилання. Гомологія (ідентичність послідовності) між амінокислотною послідовністю нативної форми Тад-полімерази, як указано в МО 89/06691, і послідовністю вказаного раніше ТІ-полімеразою складає більше за 87,495. Відповідна гомологія з ТІй-полімеразою складає 87,495, з Тса-полімеразою складає 86,695, з Вві-полімеразою (реєстраційний номер 023149) складає 42,095, з
Вса-полімераза складає 426965 і з А(п-полімераза складає 39,7905.
Як видно з таблиці 1, критичний мотив є помітно консервативним у термостабільних ДНК-полімераз. У випадку, коли "Х" означає залишок глутаміновою кислоти, зміна гена, що кодує полімеразу, дозволяє отримати фермент по винаходу, який легко включає рНТФ в порівнянні, наприклад, з Тад-полімеразою, у якій критичний го Мотив не модифікований. Отже, винахід відноситься до класу ферментів, який також включає, наприклад, термостабільну ДНК-полімеразу, і до відповідного гена і векторів експресії з Тйегтив озпітаії (УМШіатзв і інш., 1996, Іпї У. Бузі. Васіегіої. 46(2): 403-408); Тпептив звімапиз і Тпегтив спПііагорпій5 (Тепгеїго і інш., 1995, Іпї 9. Бузі. Васіегіої. 45(4): 633-639); Тпегтив зсоїодисіиз (Тепгейго і інш., 1995, Кев.
Місгоріої. 146(4): 315-324); Тпегптив БгосКіапиз (Мипзвіег, 1986, Сеп. МісгобріоЇї. 132: 1677) і Тпегтив гирег сч ов (Годіпом і інш., 1984, Іпбі у. зЗуві. Васіегіої. 34: 498-499; також депоновані в АТСС під номером 35948). Крім того, винахід включає, наприклад, модифіковані форми термостабільних ДНК-полімераз і відповідні гени і (8) вектори експресії з ТПпегптоїода екії (Камої і інш., 1995, Іпб у. Бузі. Васіегіої. 45: 312; також депоновані в О5М під номером 9442) і Тпегтоїода (пегтаїшт (М/іпарбегдег і інш., 1992, Іпб 9. уві. ВасіегіоЇї. 42; 327; також депоновані в ОЗМ під номером 5069). Кожна з вищезгаданих послідовностей і публікацій включені в даний с зо опис як посилання.
У переважному варіанті підлягаючий модифікації критичний мотив знаходиться всередині амінокислотної с послідовності І епАзрТугзего ІпіІТесіш ецАгоМаї енАІаНіз еиз (5ЕБО ІО МО: 5). Таким чином, одним з предметів «г винаходу є отримання мутантних термостабільних ДНК-полімераз, що виявляє істотно збільшену ефективність по включенню невластивих нукпеотидів при використанні матриці У особливо переважному прикладі - послідовність полімерази включає ІеиАвгртТугзегОІпІесіуЇ енАгоаМаІ енАІаНізві ен (ЗЕБЕО І МО: 6). Такі «Е термостабілні ДНК-полімерази особливо придатний в таких процесах, як секвенування ДНК, синтез РНК на основі ДНК і синтез іп міго ДНК, що мають як заступників РНТФ.
Отримання термостабільних ДНК-полімераз з підвищеною ефективністю по включенню невластивих основ може бути здійснене за допомогою таких способів, як сайтнаправлений мутагенез. Див., наприклад, публікацію «
ЗатбргооК і інш., МоїІесшаг Сіопіпд: А І арогаїгу Мапиаї, Соїй 5ргіпд Нагрог, 1989, друге видання, розділ в с 15.51, "ОЇїдописіеоїіде- МедіаФе(й Миїадепевзів", включену в даний опис як посилання. Наприклад, мутація, що полягає в заміні "А" на "з" у другому положенні кодона, що кодує залишок глутаміновою кислоти 615 в ;» послідовності гена ДНК-полімерази Тпептиз адицаїййсиз (Тад) (див. 5ЕБЕО ІЮ МО:7), приводить до більш ніж 500-кратному збільшенню ефективності включення невластивих нуклеотидів згідно з даним описом, зберігаючи при цьому здатність ферменту медиирувати ПЛР в присутності звичайних нуклеотидів, тобто дНТФ. Ця їх конкретна мутація в ДНК-полімеразі Тад приводить до заміни амінокислоти Е (глутаминова кислота) на Про (гліцин). Хоч ця конкретна заміна амінокислоти істотно змінює здатність ферменту включати невластиві ш- нуклеотиди, потрібно чекати, що заміна залишку глутаміновою кислоти на залишки будь-яких інших амінокислот, їх такі, як, наприклад, залишки серіну, цистеїну, треоніну, аланіну, валіну або лейцину, буде надавати таку ж дію. Отже, даний винахід включає і інші амінокислотні заступники, які заміняють ЕбЄ15, хоч мутант Еб15О є о переважним. Таким чином, в основі винаходу лежить той факт, що четвертий залишок амінокислоти в мотиві, 4) представленому в ЗЕО ІЮО МО: 1, не є залишком глутаміновою кислоти.
Сайт-направлений мутагенез також може бути здійснений шляхом сайт-специфічного праймернаправленого мутагенеза. Цей спосіб в даний час є стандартним в даній області техніки, і його здійснюють з використанням дв бинтетичного олігонуклеотидного праймера, комплементарного одноланцюгової ДНК фага, яка підлягає мутурванню, за винятком обмеженого помилкового спаровування, що являє собою необхідну мутацію. Загалом (Ф, як праймер для прямого синтезу ланцюга, комплементарній плазмиді або фагу, застосовують синтетичний ка олігонуклеотид, а двохланцюгову ДНК, що утворилася трансформують в бактерію-господаря, підтримуючу фаг.
Бактерія, що Утворилася може бути проаналізована, наприклад, методом секвенування ДНК або шляхом во гибридизації із зондом з метою виявити ті бляшки, які несуть необхідну змінену послідовність гена. У альтернативному варіанті можуть застосовуватися методи "рекомбінантної ПЛР", описані в РОК Ргоіосоїв, Зап
Оіедо, Асадетіс Ргезв, під ред. Іппіз і інш., 1990, розділ 22, озаглавлений "Кесотбіпапі РОК", Нідиспі, сгор. 177-183. Як показано в таблиці 1, глутаминова кислота в критичному мотиві Тад-полімерази зберігається в інших термостабільних ДНК-полімеразах, однак може бути локалізована в іншому, але близькому положенні 65 амінокислотної послідовності. Зміна консервативною глутаміновою кислоти в ЗЕС ІЮО МО: 2 термостабільних
ДНК-полімераз з представників роду Тпептив і ДНК-полімераз з родинних родів Тпептоїода, ТНептозірго і
АпаегосейШт повинне також посилювати здатність полімерази по ефективному включенню невластивих нуклеотидів в порівнянні з Тад-полімеразою, що містить 5ЕО ІЮ МО: 2.
Зміна залишку глутаміновою кислоти в критичному мотиві іншого термостабільних ДНК-полімераз можуть бути здійснені з використанням принципів і способів, що застосовуються в сайтнаправленому мутагенезі. У
СепеВапк або в базі даних ЗміззРго/РІК існує декілька послідовностей ДНК-полімерази ВасіШв5 віеагоїпегторпйЇив. Ці последовносгі мають високу міру спорідненості, однак дещо відрізняються один від одного, але кожна з них містить ідентичну критичну послідовність-мотив ЗегоІпіесіш епАгоХаа (ЗЕО ІЮО МО: 2), де "Хаа" в положенні 7 цієї послідовності означає залишок валіну (Маї) або залишок изолейцина (Не), хоч і в 7/0 різних положеннях послідовності. Засновуючись на опублікованій інформації про доступні амінокислотні і нуклеотидних послідовності термостабільних ДНК-полімераз, представлені в даному описі, за допомогою стандартних методів рекомбінації також можна конструювати химерні полімерази, які состоять з доменів, що відбуваються з різних термостабільних ДНК-полімераз. У патентах США 5466591 і 5374553 описані методи обміну різними функціональними сегментами термостабільних полімераз, такими, як 5'-3'екзонуклеазний домен, 3-5'-екзонуклеазний домен і полімеразний домен, з отриманням нових ферментів. Переважні хімерні термостабільні ферменти полімерази включають 5'-3-екзонуклеазний домен, 3-5'-екзонуклеазний домен і полімеразний домен, причому один з доменов відбувається від іншої полімерази, і полімеразний домен містить критичний мотив ЗегОІпіеХаа! енАгаоХаа (ЗЕО ІО МО: 1), де "Хаа" в положенні 4 цієї послідовності являє собою залишок будь-якої амінокислоти, крім залишку глутаміновою кислоти (Сі), а "Хаа" в положенні 7 цієї 2о послідовності являє собою залишок валіну (Маї) або изолейцина (Пе). Прикладами таких химерних молекул є химерні ферменти Тад/ГТта, будова яких приведена в таблиці 2. Як видно з цієї таблиці, полімеразний домен цих хімерних ферментів Тад/Тта містить мутацію у вказаному вище критичному мотиві. сч зв 7 Б зеюонутеазнийдомен|5 5екюнуютеаанийдомен| 000 Полмеразний домен о со 30 й й й
Плазмида рсІ відповідно за Будапештським договором була депонована в АТСС 17 липня 1996 р. і отримала с реєстраційний номер 98107. Плазмида рсі містить ген, що кодує термостабільну ДНК-полімеразу з мутацією в « кодоне, що кодує залишок глутаміновою кислоти в положенні 615 амінокислотної послідовності нативної
Тад-гюлімерази, що приводить до отримання мутантні форми Тад-полімерази, яка має залишок гліцина в - положенні 615 (Еб615О-мутантна Тад-полімераза). Цей депозит дозволяєє застосовувати альтернативні способи « 35 для отримання термостабільних ДНК-полімераз, що володіють підвищеною ефективністю по включенню невластивих аналогів нуклеотидів. У прикладі 1 показано, що застосування фланкуючих сайтів рестрикції, придатних для субклонування мутації Еб15б, дозволяє створити інші термостабільні ферменти ДНК- полімерази. Оскільки для числених термостабільних ДНК-полімераз відома повна послідовність гена, « засновуючись на інформації про послідовність критичного мотиву, приведену в описі, для введення мутації Е615 з можна використати інші відомі фахівцям в даній області техніки способи, такі, як розщеплення рестриктазами і с заміщення фрагмента або сайт-специфічний мутагенез іп мйго. Модифікований ген або фрагмент гена, :з» отриманий сайт-специфічним мутагенезом, може бути отриманий з плазмиди або фага стандартними способами і лигирован з вектором експресії для наступного культивування і виділення ферменту, що утворився. Для практичного здійснення винаходу придатні численні клониручи і експрессиручи вектори, включаючи системи, їх 15 придатні для ссавців і бактерій, і вони описані, наприклад, у ЗатбргооК і інш., МоіІесшаг Сіопіпд: А
І арогаїюгу Мапиаї, Соїд ргіпд Нагрог, друге видання, 1989. Для зручності в даному винаході приведений -і приклад використання промотора РІ, що відбувається з фага лямбда (Зпітаїйаке і інш., 1981, Майшге 292: 128). їх Застосування це промотора, зокрема, описане в патентах США 4711845 і 5079352.
Термостабільні ДНК-полімерази по даному винаходу звичайно виділяє з мікроорганізмів, таких, як Е. сої, іме) 50 які були трансформовані вектором експресії, функціонально пов'язаним з геном, що кодує ДНК-полімеразу сю» дикого типу або модифіковану термостабільну ДНК-полімеразу. Прикладом придатного мікроорганізму-господаря є штамм Е. соїї ОС116, описаний у І амууег і інш., 1993, РСК Меїїподвз апа Арріїсайнопз 2: 275-287, і цей штамм також може бути отриманий з американської колекції типових культур (Атегісап Турові
Сийиге СоїІесійоп) під реєстраційним номером АТСС 53601. Методи очищення термостабільної полімерази також описані, наприклад, у І ажгуег і інш., 1993, РОК Меїйїйодвз апа Арріїсайопз 2: 275- 287.
ГФ) Для фахівця в даній області техніки очевидно, що вищезгадані термостабільні ДНК-полімерази, що володіють
ГФ збільшеною ефективністю по включенню невластивих нуклеотидів, найбільш легко може бути отриманий з використанням методів, заснованих на технології рекомбінантної ДНК. Необхідність отримання одного з ферментів по даному винаходу або похідного або гомолога цих ферментів припускає створення рекомбінантної бо форми ферменту, яке звичайно включає конструювання вектора експресії, трансформацію клітки-господаря цим вектором і культивування трансформованою клітки-господаря в умовах, при яких така експресія буде відбуватися. Способи отримання векторів експресії, трансформації і культивування трансформованою клітки-господаря добре відомі в даній області техніки і детально описані, наприклад, у Затргоок і інш., 1989, ббо/ лив. вище. 2, , , -
Даний винахід відноситься до термостабільних ДНК-полімеразам, який разом з рибонуклеозидтрифосфатами придатний для здійснення численних функцій, включаючи амплифікацію нуклеїнової кислоти, методи визначення і секвенування ДНК. Застосування рибонуклеотидів при секвенуванні дозволяє виключити використання ланцюг-термінувати аналогів, що мають високу вартість, таких, як дАНТФ, і, що є важливим чинником, полегшує отримання нових продуктів амплифікації, придатних не тільки для аналізу послідовності ДНК, але і для інших типів аналізу, таких, як електрофорез або гібридизація, без необхідності наступного проведення реакцій секвенування ДНК.
Раніше вже було підтверджено, що пирофосфатаза поліпшує результати секвенування при використанні як мезофильних полімераз, так і термостабільних ДНК-полімераз за рахунок зниження кількості продуктів 7/0 подовження, що нагромаджуються, отриманого в результаті пирофосфоролизису. При цьому до початку циклу секвенування необхідно використати методи, що дозволяють вводити додатковий фермент в реакцію секвенування. Однак найбільш істотна перевага даного винаходу полягає в тому, що для секвенування ДНК не потрібно пирофосфатазу. Таким чином, застосувавші нових, представлених в даному описі ферментів усуває необхідність в додаткових витратах по введенню другого ферменту в суміш для реакції секвенування.
При застосуванні ферментів по даному винаходу реакції амплифікації і секвенування об'єднують, що сприяє економії часу і матеріалів, а також спрощує весь аналіз. Ці, а також інші переваги досягаються, насамперед, завдяки тому, що включення як звичайних нуклеотидів, так і рибонуклеотидів і їх аналогів в продукт подовження праймера дозволяє отримати химерний ланцюг РНК/ДНК, чутливий до гідролізу РНК. Обробка не надає впливу на скелет ДНК і приводить до отримання популяції фрагментів нуклеїнової кислоти, кожний з яких закінчується в го тому положенні, де був вбудований рибонуклеотид замість відповідного ДНТФ. Гідроліз легко здійснюють різними способами, що включають, але"не обмежуючись ними, лужний гідроліз (наприклад, обробка Маон в кінцевій концентрації О0,2М, як описано нижче в прикладі МІ), нагрівання або ферментативна обробка РНКазой (під ред. Модеї і інш., Іпогтайопа!| Масготоїіесціаг, Мемжм/ Могк, Асадетіс Ргезв, 1963, розділ, написана Вего і інш., озаглавлена "Пе Зупійевзів ої Міхей Роїуписіеоїдев Сопіаіпіпу Кіро-апа Оеохугірописіеоїде ру Ригйєй с
Ргерагайоп ої ОМА Роїутегазе їгот Е. соїї", стор. 467-483).
У переважному варіанті даний винахід відноситься до нових і поліпшених композицій, найбільш придатних о для методів секвенування ДНК. Нові ферменти, приведені в даному описі, можуть використовуватися для методів секвенування нуклеїнових кислот, заснованих на застосуванні або забарвлених термінаторів, або забарвлених праймерів, а також для інших методів секвенування. Як описано раніше, методи термінації ланцюга се зо звичайно вимагають використання матриці для подовження праймера в присутності термінувати ланцюг нуклеотидів, що приводить до створення неповних фрагментів, які потім розділяють по розміру. У стандартному с дидезоксі-секвенуванні для термінації ланцюга використовуються дидезоксінуклеозидтрифосфати |і «І
ДНЕК-полімерази, такого, як фрагмент Кленова з штаму Е. сої Ро! І (Запдег і інш., див. вище).
Таким чином, основна методика дидезоксі-секвенування включає (І) відпал олігонуклеотидного праймера, -
Відповідного матриці; (І) подовження праймера за допомогою ДНК-полімерази в чотирьох різних реакційних «Її сумішах, в кожній з яких міститься один мічений нуклеотид або мічений праймер, суміш немічених ДНТФ і один термінуючий ланцюг ддНТФ; (І) розділення чотирьох наборів продуктів реакцій за допомогою, наприклад, гель-електрофореза на денатурируючому поліакриламидном гелі з високою дозволяючою здатністю/мочевине, « капілярного розділення або інших способів розділення; і (ІМ) отримання авторадіографичного зображення геля, 70 яке може бути проаналізоване для отримання висновку про послідовність. У альтернативному варіанті для - с отримання інформації про послідовність ДНК можуть застосовуватися мас-спектрометричні методи або методи, ц засновані на гибридизації, з використанням флуоресцентно мічених праймерів або нуклеотидів. "» Доступність термостабільних полімераз, таких, як Тад-полімераза, привела до поліпшення методу секвенування (див. патент США 507216) і до його модифікацій, званих "циклічним секвенуванням". При циклічному секвенуванні повторюють цикли нагрівання і охолоджування, що дозволяє отримати численні «г» продукти подовження кожної молекули-мішені (див. Миггау, 1989, Мисіеіс Асідз Кезеагсп, 17: 8889). Ця асиметрична ампліфікація послідовностей-мішеней, комплементарних послідовностей матриці, в присутності і дидезоксі-термінаторів ланцюга приводить до отримання родини продуктів подовження всіх можливих довжин. «г» Після денатурації продукту реакції подовження ДНК-матриці множинні цикли відпалу праймера і подовження праймера здійснюють в присутності дидезоксі-термінаторів. Термостабільні ДНК-полімерази мають декілька ді переваг при циклічному секвенуванні; вони стійки до жорстких температур відпалу, які необхідні для с» специфічної гибридізації праймера з нуклеїновими кислотами-мішенями, а також стійкі до безлічі циклів високотемпературної денатурації, які здійснюються в кожному циклі, тобто до температури 90-95". З цієї причини різні форми ДНК-полімерази АтріїТад? були включені в набори для циклічного секвенування з ВвИиКОристанням Тад, які реалізовуються через фірму Регкіп ЕІтег, Норуолк, шт. Коннектікут.
Однак здатність ДНК-полімерази Тад обмежувати включення невластивих нуклеотидів, таких, як ддНтТФ,
Ф, пов'язана з проблемою її використання для циклічного секвенування, оскільки дАНТФ або флуоресцентно мічені ко ДАНТФ повинні бути включені як термінатори ланцюга. Загалом, до створення даного винаходу секвенування
ДНК за допомогою термостабільних ДНК-полімераз вимагало наявність суміші нуклеотидів, що термінують бо ланцюг, звичайно дідезоксінуклеотидів, у високій концентрації з метою гарантувати отримання популяції продуктів подовження, яка включає фрагменти, що мають всі можливі довжини, аж до довжини в декілька сотень основ. Часто для зниження вартості цього процесу застосовували протоколи з використанням дуже низьких концентрацій звичайних дНТФ, що робило реакції неефективними. Ці реакційні суміші, що включають низьку концентрацію ДНТФ і високу концентрацію ддНТФ, створювали умови, при яких термостабільна полімераза 65 Відчуває істотну нестачу нуклеотидних субстратів.
Незважаючи на появу модифікованих ферментів, таких, як ДНК-полімераза АтріїТадя 5, що дозволяють збільшити концентрацію ДНТФ до більш оптимальних рівнів, для ферментів-прототипів все ще були необхідні
ДАНТФ, які дорого коштують, для секвенування ДНК. У протилежність цьому даний винахід відноситься до ферментів, які не тільки дозволяють збільшувати концентрацію ДНТФ, але і виключають застосування ддНІТФ, які дорого коштують, оскільки замість них в зростаючий ланцюг включають рНТФ. Здатність нових ферментів ефективно здійснювати часткове заміщення рибонуклеотидами полегшує отримання рівнів для секвенування
ДНК при відсутності окремої реакції по включенню термінуючого нуклеотида.
Вибір невластивих нуклеотидних аналогів, придатних для використання в методах секвенування ДНК, раніше визначався здатністю термостабільної ДНК-полімерази включати ці аналоги. На жаль ці нуклеотидні аналоги є 7/0 досить дорогими. Наприклад, ціна ддаНтФ приблизно в 25 раз перевищує ціну як рНТФ, так і дНТФ. Оскільки раніше термостабільні ДНК-полімерази не володіли здатністю ефективно включати рНТФ в зростаючий ланцюг
ДНК при використанні матриці, такі рибонуклеотиди, які є легко доступними і недорогими, не могли використовуватися для секвенування ДНК з участю термостабільної ДНК-полімерази. Даний винахід дозволяє виключити необхідність в дцЦНТФ в реакціях секвенування ДНК. Таким чином, одиним із предметів винаходу є /5 Метод секвенування ДНК, який є істотно менше дорогим в порівнянні з методами термінації ланцюга, що раніше застосовувалися.
Присутність Марганця в реакції подовження праймера може впливати на здатність полімерази точно включати правильні пари нуклеотидних основ. Марганець може застосовуватися для посилення некоректного спаровування основ або для зниження обмеження по інсерції нуклеотидного аналога. Раніше дослідники 2о застосовували марганець з тією метою, щоб індукувати мутагенез при реплікації або ампліфікації ДНК. Таким чином, марганець може впливати на правильність реакції полімеризації, а також на вихід продукту реакції.
Послідовність, що утворилася, може виявитися неправильною або ж - в методі секвенування ДНК - отримана інформація може виявитися невірною. Способи згідно з цим винаходом не вимагають включення двовалентного катіона Марганця в суміш для реакції секвенування з метою посилення здатності полімерази включати сч невластивий нуклеотид. У протилежність відомим з рівня техніки ДНК-полімеразам в даному винаході описаний критичний мотив, що входить в полімеразний домен, контролюючий здатність ферменту розрізнювати і) 2'-заміщені і незаміщені нуклеотиди, не використовуючи для цього марганець.
Ферменти по даному винаходу не вимагають для секвенування високих концентрацій невластивих аналогів основ. До створення даного винаходу при здійсненні секвенування, заснованому на термінації ланцюгу ДНК (див. с зо також патент США 5075216 на ім'я Іппіз і інш.), невластиві аналоги основ і відповідні традиційні основи звичайно були присутніми в співвідношенні (наприклад, ддАТФ:ідДАТФ) приблизно від 1,3:1 до 24:11. Для с порівняння термостабільні полімерази, що описані в даному винаході, дозволяють знизити відношення «г невластивих аналогів основ до звичайних основ в сто або в декілька тисяч разів. Відношення рНТФ:дНТФ, рівне 171 або нижче, в поєднанні з новими ферментами, що представлені в даному описі, є достатнім для аналізу в. послідовності ДНК. У переважному варіанті відношення рНТФ:ІдДНнНТФ знижують до менш ніж 1:8. Відношення «Е 2'-заміщеного нуклеотида до відповідного природного ДНТФ може складати навіть 1:80 або 1:200, що залежить від конкретного плану експеримента і необхідної довжини фрагментів.
Таким чином, оскільки ферменти по даному винаходу легко включають невластиві нуклеотиди, такі, як 2'-заміщені нуклеотиди, немає необхідності посилювати їх здатність по включенню рНТФ з допомогою високої «
Концентрації РНТФ і обмеження концентрації відповідного ДНТФ. Отже, методи по даному винаходу дозволяють пт») с застосовувати оптимальні концентрації ДНТФ в поєднанні з невеликими кількостями рНТФ. . Коли у відповідному методі, такому, як секвенування із забарвленим праймером, застосовують модифіковані и?» ферменти полімерази по даному винаходу, хороші результати по секвенуванню ДНК отримують при концентрації кожного ДНТФ в 50-500мкМ. Переважно концентрація ДНТФ складає від 100 до З0ОмкМ. При
Використанні цих інтервалів відповідний РНТФ може бути присутнім приблизно в такій же концентрації, що і ї5» ДНТФ, або в більш низкої. Переважно концентрація рНТФ складає приблизно від 0,1мкМ-100мкМ, найбільш переважно приблизно від 2,5мкМ до 25мМкМ.
Ш- Концентрація рНТФ, придатна для застосування модифікованих ферментів по даному винаходу, легко може їх бути визначена звичайним фахівцем в даній області техніки шляхом титрования і оптимізації експериментів.
Необхідна кількість РНТФ або аналога визначається типом експеримента, і на нього може впливати розмір і ю чистота мішені, а також вибір буфера і конкретні види ферменту. Відношення рНТФ:.ДНТФ буде визначати 4) частоту, з якої РНТФ вбудовуються в зростаючий олігонуклеотид. Оскільки в кожному вбудованому РНТФ може відбуватися гідроліз, відношення РНТФ:ДНТФ можна регулювати таким чином, щоб забезпечити користувачеві гнучкість в можливості збільшення або зменшення розміру фрагментів, що утворилися.
Як добре відомо, ДНК являє собою полімер, синтезований з ДНТФ. Кожний дезоксінуклеозидтрифосфат включає цукор рибозу, який має гідроксильну групу в З'-положенні і водень в 2- положенні. Рібонуклеотіди
Ф) також містять гідроксильну групу в 3З'-положенні цукру. ка Однак рНТФ відрізняються від дНТФ тим, що в 2-положенні цукру атом водня заміщений на другу гідроксильну групу. У даному випадку рРНТФ є прикладом, на якому виявляється здатність ферментів по бо винаходу точно включати 2-заміщені нуклеотиди. Однак З'єднання по винаходу не обмежені застосуванням невластивих нуклеотидів, які являють собою рибонуклеотиди. Модифікація послідовності термостабільної полімерази в (критичному домені, приведеному в даному описі, дозволяє матриці спрямовано включати альтернативні 2-- заміщені нуклеотиди, такі, як 2-гидроксил, З'і-дезоксінуклеотиди і нуклеотиди, заміщені в 2'-положенні фтором або аміногрупой. 65 Як описано в приведених нижче прикладах, включення 3'-дезоксі, 2-гидроксиАТФ, який в даному описі позначений також як кордицепинтрифосфат, полегшується наявністю другої мутації в термостабільній полімеразі, здатність якої обмежувати включення нуклеотида, що містить дезоксігрупу в З'-положенні рибози знижена. Такі ферменти раніше були описані, наприклад, в ЕР-А-655506 і в заявці на патент США 08/448223, поданій 23 травня 1995 р., яка включена в даний опис як посилання. Депозит АТСС 69820, депонований відповідно до Будапештського договору 10 травня 1995 р., забезпечує отримання гена, що кодує модифікованную термостабільную ДНК-полімеразу Тпептиз адиаїйїсив, здатність якої обмежувати включення аналогів, таких, як ддНТФ, знижена. Дідезоксінуклеотиди мають заступник в З-положенні в порівнянні із звичайними ДНТФ. Таким чином, в поєднанні з справжнім винаходом подвійна мутація, прикладом якої в даному описі є Е6150, РБб7У-мутант Тад-полімерази, дозволяє використати нуклеотидні аналоги, які містять заступник в 7/0. 3-1 2-положеннях рибози в порівнянні з ДНТФ (див. приклади ПП і М).
Конкретним застосуванням винаходу є метод секвенування з використанням рНТФ, де секвенуючий праймер що виявляється за допомогою флуоресцентної, або радіоактивної мітки. На відміну від Дд4ІНТФ включення немодифікованого рНТФ не приводить до такої дії, як термінація ланцюга. Реакційна суміш для секвенування
ДНК включає як рНТФ, так і дНТФ в поєднанні з ферментом по винаходу, що приводить до отримання суміші безладно заміщених продуктів подовження праймера, чутливих до розщеплення по 3'-5'і--фосфодиефирному зв'язку між рибонуклеотидом і сусіднім дезоксірибонуклеотидом. Після подовження праймера, наприклад, при
ПЛР-амгашфікації або при циклічному секвенуванні, і до розділення продуктів подовження праймера, наприклад, за допомогою гель-електрофореза, реакційну суміш або обробляють лугом, нагрівають, обробляють рибонуклеазой, або іншими способами гидролізують продукти подовження по кожному рибонуклеотиду, що
Зустрічається. Для кожного міченого продукту подовження праймера тільки найбільш великий 5'-фрагмент, який є проміжним продуктом подовження міченого праймера, виявляється на секвенируючим гелі. Для даної мішені аналіз отриманого секвенуючого теля дає рівні секвенування, тобто серії сигналів, що виявляються в Г-, А-, Т- їі Ц-лініях, відповідних нуклеотидній послідовності мішені. Отримані рівні секвенування надають таку ж інформацію, що і звичайний метод, що передбачає використання дцНТтТФ або заснований на використанні рРНІТФ і сч г Нових термостабільних полімераз, представленого в даному описі. Таким чином, при застосуванні даного винаходу ддНТФ, що дорого коштують для секвенування ДНК більше не потрібні (див. приклад МІ). і)
У альтернативному методі секвенування застосовують термінувати ланцюг рибонуклеотиди. У цьому варіанті як термінатори застосовують 2'-гидрокси, З'-дезоксінуклеотиди, такі, як кордицепинтрифосфат. Ці аналоги РНТФ можуть бути флуоресцентно міченими, і їх застосовують для секвенування ДНК. У І ее і інш., див. вище, описане с зо застосування забарвлених термінаторів ддНТФ. У ЕР-А-655506 і в заявці на патент США 08/448223, яка подана 23 травня 1995 р., описані модифіковані ферменти для застосування з ддНТФ. Термостабільна ДНК-полімераза, с що містить як модифікацію, присутню в ДНК-полімеразі ЕЗ АтріїТаде (див. вище), так і таку, представлену і 5ЕС «
ІО МО: 1, де Х не означає глутамінову кислоту (Е), як описане раніше, може застосовуватися для ефективного включення мічених аналогів рРНТФ при здійсненні реакції секвенування, яка заснована на термінації ланцюгу. Цей ї- з5 процес може бути автоматизований і не вимагає синтезу мічених барвником праймерів. Крім того, оскільки «г реакції із забарвленим термінатором дозволяють здійснювати в одній і тій же пробірці всі чотири реакції, вони більш зручні, ніж методи із забарвленим праймером. 2-гидрокси, 3З'-дезоксінуклеотиди можуть бути синтезовані з комерческі доступних З'-нуклеотидів (3-дА, 3-дЦ, 3-дГ і 3-дТ, наприклад, що поставляються фірмою бідта Спетіса!| Согрогайоп, Ст. Луис, шт. Міссурі, і при доданні 5'і-трифосфата, як описано у І цдм/ід, «
Віорпозрпайез апа Тпеїг Зупіпевзіз Зігисіиге, Меїароїзт апа Асіїмйу, під ред. Вгигік і Біес, Амстердам, с-) с ЕІвеміег Зсіепсе Рибіїзпегв, 1987, стор. 201-204. . Крім застосування в нових методах секвенування, модифіковані ферменти, представлені в даному описі, и?» можуть застосовуватися для різних цілей в молекулярній біології. У одному з прикладів здійснення винаходу модифіковані ферменти застосовують в реакційних сумішах для амплифікації, що містять як звичайні, так і невластиві нуклеотиди, наприклад, ДНТФ і принаймні що один виявляється в результаті помічений рНТФ, влучні, їх які включають, наприклад, флуоресцентні мітки або радіоіїзотоп. Керований матрицею синтез комплементарного ланцюга приводить до отримання ДНК-продукту, що містить рибонуклеозидмонофосфат в різних положеннях по
Ш- його довжині. Нагрівання та/або обробка лугом гидролізують продукт подовження нуклеїнової кислоти на їх кожному рибонуклеотиді. Таким чином, отримують сімейство сегментів ДНК, де кожний фрагмент містить один мічений залишок на своєму 3'-кінці. Розмір фрагментів нуклеїнової кислоти, що утворилися може бути змінений ю шляхом регулювання відношення і кількості РНТФ, включеного в реакцію. 4) Ампліфікація мішені з використанням рНТФ і ферментів по даному винаходу створює численні переваги, зумовлені конкретним застосуванням. У описаному вище методі при використанні міченого РНТФ все отримане сімейство фрагментів виявляється міченим з рівною інтенсивністю: одна мітка на один олігонуклеотидний дв фрагмент. Для досягнення оптимальних результатів при здійсненні таких методів, як виявлення нуклеїнової кислоти з використанням олігонуклеотидного зонда, певним чином фіксованого на тонкому шарі силікону,
Ф) звичайно необхідне, щоб амплифікована мішень була випадковим образом фрагментована в межах фіксованого ка і розміру, що відтворюється з метою обмежити утворення повторних структур для контролю кінетики гибридизації. Крім того, для виявлення гибридизації при впорядкованому розташуванні тисяч зондів на тонкому бо шарі силікону, може виявитися переважним, щоб фрагменти нуклеїнової кислоти були мічені з рівною інтенсивністю. Згідно з справжнім винаходом були розроблені способи отримавші сімейств фрагментів, що задовольняють цьому стандарту, полегшуючи тим самим застосування альтернативних форматів виявлення, таких, як методи, засновані на використанні тонких шарів, описані, наприклад, у Стгопіп та інш., 1996, Нитап
Мшиайоп, 7: 244-255. 65 У іншому прикладі передбачається застосування одного міченого праймера і одного неміченого праймера в суміші для реакції амплифікації, яка включає термостабільну полімеразу по винаходу, а також рнтТФ і дНТФ, що дозволяє одночасно поліпшити реакції амплифікації і секвенування. Для цього методу потрібно, щоб здійснювалися чотири різні реакції амплифікації, по одній для кожного рНТФ. Таким чином, наприклад, оскільки фермент По винаходу придатний для амплифікації мішені, наприклад, з допомогою ПЛР, або інших способів амплифікації, отриманий продукт, якщо він присутній, може бути виявлений звичайними способами, такими, як гель-електрофорез або гібридизація із зондом при використанні частини продукту реакції. Ці методи визначення не приводять до гідролізу включених рибонуклеотидів, а поведінка РНК/ДНК-химерних ланцюгів буде такою, як це очікується для звичайного продукту амплифікації нуклеїнової кислоти. Якщо необхідний продукт виявлений, частина цієї ж реакційної суміші, що залишилася може бути оброблена лугом і проаналізована за допомогою /о Гель-електрофореза з метою визначити послідовність нуклеїнової кислоти. Таким чином, після виявлення продукту наступна реакція секвенування не є необхідною. Ця спрощена методика забезпечує економію витрат часу і матеріалів і характеризується підвищеною точністю завдяки зменшенню стадій: виявлений продукт і є секвенованим продуктом.
Крім того, також може застосовуватися аналогічна методика з чотирма міченими рНТФ і одним біотинилированим (міченим біотином) праймером. Після амплифікації продукт розкладають за допомогою лужного гідролізу, а праймер, пов'язаний з продуктами, видаляють шляхом взаємодії з покритими стрептавидином гранулами. Захоплені гранулами продукти потім аналізують на секвенуючому гелі. Ця модифікація дозволяє здійснювати реакцію секвенування в одній пробірці, виключаючи тим самим необхідність в чотирьох різних амплифікаціях.
Відповідно до іншого предмета винаходу ферменти, представлені в даному описі, можуть застосовуватися для отримання РНК з використанням ДНК-матриці або для отримання заміщеної ДНК для медиируючим лугом стерилізації без застосування звичайних стерилізуючих агентів, таких, як урацил-М-глікозілаза (МО), як описано в міжнародній заявці УМО 92/01814.
У приведених прикладах здійснення винаходу термостабільна полімераза також містить мутацію в сч 5-3--екзонуклеазном домені, яка приводить до значного погіршення екзонуклеазній активність Модифіковані форми Тад-полімерази описані в патенті США 5466591. У одному з варіантів здійснення винаходу кодон, що і) кодує залишок гліцина (0) в положенні 46 амінокислотної послідовності, заміняли кодоном, що кодує аспарагінову кислоту (Ю). Отриманим таким чином фермент володіє перевагою при використанні в реакціях циклічного секвенування завдяки зниженій 5'-3'-екзонуклеазной активності і є переважним для застосування по с зо даному винаходу. У порівнянні з ферментом дикого типу наявність мутації 5460 не надає впливу на полімеразний домен амінокислотної послідовності і на полімеразну активність. с
Згідно з винаходом пропонуються також набори для секвенування нуклеїнових кислот, що містять «Е термостабільну полімеразу по даному винаходу, що є прикладом комерційного застосування винаходу. Такі набори звичайно включають додаткові реагенти для секвенування ДНК, такі, як, наприклад, РНТФ, дДНІТФ і в. зв Відповідні буфери. Якщо рНТФ є неміченими, також може бути включений мічений праймер. «г
Нижче винахід проілюстрований на прикладах, що не обмежують його об'єм.
Приклад 1
Експресія гена модифікованої Тад-полімерази із зниженою здатністю обмежувати включення невластивих нуклеотидів «
С-кінцева частина амінокислотної послідовності ДНК-полімерази Тад кодує домен, що включає сайт пт) с полімеразну активність (І аугуег і інш., 1993, РОК Меїподз апа Арріїсайопе 2: 275-287, публікація включена в . даний опис як посилання). Фрагмент ДНК, що містить цю область, виділяли з повнорозмірного гена Тая і и?» здійснювали мутагенез з допомогою ПЛР-амплифікації в присутності Марганця (І ецпд і інш., Тесппідце 1(1): 11-153. У цьому прикладі все рестриктази були отримані від фірми Мем Епдіапа Віоїарв, Беверлі, шт.
Массачусетс. Фрагменти, що містять мутації, розщеплювали рестриктазами Рей! і Во! ї клонували в плазмиді, їх експресуючій Тад, в даному випадку в плазмиді рі К102, яку заздалегідь розщеплювали Рваї! і Ва. Плазмида рі К102 являє собою модифіковану форму гшазмиди рОУсС1578, яка експресує Тад (І ам/уег і інш., див. вище). - Фрагмент НіпсІ/ЕсокУ, локалізований на 3'-області, що кодучий полімеразу, видаляли для створення гшазмиди їх рі КІОЇ. Рвей- ВаП-фрагмент довжиною 898 пар основ потім видаляли з ріК101 і замінювали коротким 5р Оолігонуклеотидним дуплексом Рай-ЕсокМ-Воїї! для створення плазмиди рі-К102. Таким чином, в результаті цієї ю делеции було віддалено 900 пар основ з 3'-кінця роІ-гена ДНК Тад з їх заміщенням більш короткою ділянкою сю ДНК.
Отриманими експресуючими плазмидами трансформували штам Е. соїї М1624 (описаний у Собезтап, 1973,
У. Мої. Вісі. 77: 531; він також може бути отриманий з Е. соїї Сепейс Зіоск Сепіег в Йельськом Університеті, в Номер штаму СОЗС 5066) і отриманих трансформантів піддавали скринингу на здатність більш ефективно в порівнянні з ферментом дикого типу включати рНТФ. Використовуючи цю методику виявляли мутант СІ, здатний
Ф) більш ефективно включати рНтТФ. ка Для визначення, яка частина гена Тад-полімерази відповідальна за змінений фенотип, що містить мутацію плазмиди, експресуючу Тад, названу рС1 і виділену з мутанта С1, розщеплювали різними рестриктазами і во рестрикційні фрагменти, що утворилися субклонували в плазмиді рі К101, несучої ген ДНК-полімерази Тад дикого типу, заміняючи рестрикцийні фрагменти, що не містять мутацій. Аналіз субклонів, що утворилися показав, що мутація, яка відповідає за фенотип, знаходилася в рестрикційному фрагменті МНеІ-Ватні довжиною 265 пар основ.
Здійснювали аналіз послідовності ДНК цієї області плазмиди рС1, використовуючи набір АВІ РКІЗМУ Оуе 65 Тептіпаюг Сусіє Зедцепсіпуд Соге Кії, в який входить ДНК-полімераза Е5 АтріїТаде), що поставляється фірмою
Арріїей Віозувіетв, Фостер Ситі, Каліфорнія, і система для секвенування Арріїед Віозузіетв, Моде! З7ЗА ОМА
Зедцепсіпд Зувіет. Аналіз послідовності виявив дві миссенс-мутації в гені Тад-полімерази між сайтами Мне! і
Ватні. Мутація амінокислоти в положенні 615 привела до того, що залишок глутаміновою кислоти (Е) був заміщений залишком гліцина (С), а інша мутація в положенні 653 привела до заміщення залишку аланіну (А) на треонін (Т). Нумерацію починають з кодону, що кодує перший залишок метионіну зрілого протеїну, як описано в патенті США 5079352. Мутація Е6150 привела до заміни ОАО на 500 в кодоні 615. Мутація АЄ5ЗТ привела до заміни ОСС на АСС в кодоне 653. Плазмиди СІ в штамі-господарі Е. соїї Т1624 була депонована відповідно до
Будапештським договору в АТСС 17 липня 1996 року і отримала реєстраційний номер 98107.
Дві крапкові мутації аналізували роздільно шляхом субклонування кожної окремо в гені Тад-полімерази 7/0 дикого типу, використовуючи рекомбінантну ПЛР (під. ред Іппіз і інш., РОК РгоїосоЇї5, Зап Оіедо, Асадетіс
Ргезв, 1990, розділ 22, озаглавлена "Ресотбріпапі РОК", автор Нідиспі, стор. 177-183). Продукти експресії, що
Утворилися аналізували з метою визначити, яка з мутацій Еб150 або Аб5ЗТ або обидві відповідальні за фенотип, для якого характерно включення рибонуклеотидів. Результати експеримента показали, що за мутантні фенотип відповідальна виключно мутація Еб150.
Для подальшого аналізу і кількісної оцінки ефективності включення аналогів нуклеотидів ПЛР-фрагмент
Ватні- Мине довжиною 265 пар основ, що містить мутацію Еб150б, клонували у векторі експресії Тад, позначеному РКОАЗ-2. Вектор експресії РКОАЗ-2 містив повнорозмірний генів Тад, функціонально пов'язаний з промотором фага-лямбда РІ.
Екзонуклеазний домен гена Тад в цьому векторі містив крапкову мутацію в кодоне, що кодує гліцин, тобто амінокислотний залишок в положенні 46, яка знижує 5'-3'єекзонуклеазную активність. Однак послідовність гена всередині полімеразного домену вектора експресії рРКОАЗ-2 ідентична послідовності гена Тад дикого типу.
Плазмида рКОАЗ-2 повністю описана в патенті США 5466591, який включений в даний опис як посилання, де плазмида позначена як "клон 3-2". Плазмиду РКОАЗ-2 розщеплювали з допомогою Ватні і МНпеї і ПЛ;-фрагмент довжиною 265 пар основ стандартними способами лигірували з вектором. с
Отриманою плазмидою рі К108 трансформували штамм Е. соїї ОС116 (І ажууег і інш., 1993, див. вище, цей штамм також може бути отриманий з американської колекції типових культур під номером АТСС 53606). і)
Плазмида рі К108 кодує термостабільну ДНК-полімеразу, позначеного в даному описі як 5460, Еб150-Тад. З допомогою рекомбінантної ПЛР шляхом комбінації мутацій Еб150 і Е667М у фрагменті ВатНі-МНе! отримували мутант 0460, Е6150, РБб67У-Тад. Цей фрагмент клонували в плазмиді РКОАЗ-2 для створення плазмиди рі К109. с зо Експресуючий гшазмидами рі К108 і рі К109 протеїн термостабільної ДНК-полімерази виділяли відповідно до методу, описаного у І ажуег і інш., 1993, див. вище, хоч стадії хроматографії були виключені. Представляючу с інтерес послідовність підтверджували за допомогою аналізу послідовності ДНК. У вставці (инсерції) рі К108 була «г виявлена додаткова мутація в послідовності; однак ця мутація не змінювала амінокислотну послідовність протеїну. ї-
Після часткового очищення активність модифікованого ферменту визначали відповідно до методу оцінки «Е активності, описаного у І амжуег і інш., 1989, 9. Віої. Спет. 264: 6427-6437, включеним в даний опис як посилання. Активність модифікованого ферменту оцінювали таким чином: одна одиниця ферменту відповідає 10 нмолям продукту, синтезованого протягом ЗОхвилин. ДНК-полімеразна активність ферменту дикого типу прямо пропорційна концентрації ферменту, що забезпечує включення до 80-100 пмолей дЦМФ (розбавлення ферменту « складає до 0,12-0,15 одиниць на реакцію). Активність мутантів Еб6150, 5460 і Еб6150, Е667М, 5460 прямо з с пропорційна концентраціям, що забезпечують включення до 0,25-3 пмолей ДЦМФ (розбавлення ферменту ц складає від бх107 до 5х107 одиниць на реакцію). Цей препарат ферменту використали для оцінки включення і "» для реакцій секвенування, описаних в прикладах ІПІ-М. Для прикладів ІІ ії МІ фермент очищали відповідно до методів, описаних у І аугуег і інш. (див. вище).
Приклад ІЇ «г» Аналіз порівняльної ефективності включення - Відносну здатність 5460- і 5460, Еб61505-Тад включати рНТФ визначали шляхом вимірювання кількості
І0-2РІ рНТФ, яке кожний з ферментів може включити на ДНК-матриці з активованої сперми лосося при ве обмеженій концентрації цього ферменту. Для кількісної оцінки включення рАТФ реакційну суміш готували таким г) 20 чином, щоб кінцеві концентрації в 5Омкл реакційній суміші складали 12,5 мкг ДНК активованої сперми лосося, отриманої по описаній нижче методиці, 200мкМ кожного з дЦТФ, ДГТФ і дТтТФ (фірма Регкіп ЕІтег, Норуолк, шт. с» Коннектікут), 100мкМ Іо-2РІрРАТФ, 1ММ р-меркаптоетанола, 25ММ М-тріс Ігидроксіметіл метил-3-аминопропансульфоновой кислоти (ТАРФБ), рН 9,5 при 20"С, 50мММ КС і 2,25мМ Мас.
Аналогічну суміш для аналізу отримували для кількісної оцінки включення руЦтФ, рГТФ і рУТФ. У кожному 29 випадку рРНТФ були радіоактивне міченими і були присутнім в концентрації 100мкМ, а кожний з трьох інших дНТтФ
ГФ) (ДАТФ, ДГТФідтТТФ для рРЦТФ, дАТФ, дДЦТФідтТтФ для рГТФ і дАТФ, дЦТФ і ДГТФ для рУТФ) був присутнім в концентрації 200мкМ. Як стандарт також вимірювали включення кожним ферментом відповідного ДНТФ. Суміш о для аналізу в цих дослідах була аналогічна такої, що застосовуються в досвіді по включенню рНТФ, які описані вище, за винятком того, що кожний (о-2Р|рНТФ був замінений 100мкМ відповідного (5-2РІ|ДНТФ. Неочищену бо ДНК сперми лосося в кількості 1 г/л, отриману від фірми Ууогійіпдіоп Віоспетіса! (Фріхоля, шт. Нью Йорк), активували шляхом інкубації в 10мМ трис-НСІ, рН 7,2, 5мМ МосСіІ» при температурі 2-8"С протягом 96 годин.
Потім додавали ЕДТК і МасСі до концентрації 12,5мМ і 0,1 М відповідно. Потім ДНК екстрагували фенолом/хлороформом і далі осаджували етанолом і ресуспендували в 10ММ трис, їмММ ЕДТК, рН 7,5. Потім б препарат активованої ДНК піддавали диализу по відношенню до цього ж буфера. 45мкл кожної реакційної суміші розливали у вигляді аликвотних кількостей в п'ять пробірок об'ємом 0,5 мл
(наприклад, в пробірки Еппендорфа), вносячи в кожну 5'-мічені попередники нуклеотидів. Таким чином, кожну полімеразу 5460-Тад та 5460, Еб6150-Тад оцінювали двічі, при цьому одну пробірку залишали як негативний контроль. Суміш, отриману в результаті реакції полімеризації, з кожного досвіду в двох пробірках, змішували спочатку з БбБмкл або полімерази 5460-Тад (0,02 одиниці), або 3460, Еб150-Тад (0,002 одиниці). Як контроль рівня фону до реакційної суміші, що застосовується як негативний контроль, замість ферменту додавали 5мкл буфера для розбавлення ферменту, Кожну реакційну суміш протягом короткого інтервалу часу центрифугували і инкубували протягом 10хвилин при температурі 75"С. Реакції припиняли, додаючи 10мкл бОмММ ЕДТК, і зберігали на льоду. Для кожного зразка аликвоти об'ємом 5Омкл з бОмкл реакційної суміші розбавляли 1 мл 2ММ ЕДТК, 50 7/0 Мкг/мл фрагментованою ДНК сперми лосося. ДНК осаждали за допомогою трихлороцету кислоти (ТХО), використовуючи стандартні методи і збираючи на фільтрувальний диски типу ОБ/С (фірма У/паїтап, Кент,
Великобританія). Кількість включеного (а- З2Р|- міченого нуклеотида або рибонуклеотида кількісно оцінювали з допомогою рідинной сцинтилляційной спектрометрії і потім підраховували кількість включених пмолей. Кількість пмолей кожного рНТФ, включена кожним ферментом, співвідносили з кількістю пмолей відповідного 75. |а-З2РІДНТФ, включеного кожним ферментом. Нижче приведені отримані дані. з використанням полімераз С460-і 5460.Е6150-Тад дАТФІ 0 РАТФ оду; оРЦТФО де РФ одтФО рт)
Ці результати показують, що полімераза 546О0,Е61505 включає рибонуклеотиди більш ніж в 500 раз ря ефективніше в порівнянні з тим, як це може здійснювати полімераза 5460 (наприклад, ефективніше для рГТФ в см 181:0,36 - 502 разу, для рЦТФ в 189:0,22 - 859 разів і для рАТФ в 210:0,18 - 1166 разів). Таким чином, (о) миссенс-мутація в гені полімерази в кодоне 615 приводить до отримання нового фенотипу: до отримання термостабільного ДНК- полімерази, що володіє здатністю крім дезоксірибонуклеотидів ефективно включати рибонуклеотиди. с
Приклад ІІ
Аналіз порівняльної ефективності включення 3'-дезоксіА ТФ (кордицепину) с
Відносну здатність полімераз 05460-; (5460,Е6150- 5460, Е61505,Е667У-; і 5460,Е667у-Тад включати « 3'-дезоксіаденозин-5- трифосфат (кордицепинтрифосфат) визначали шляхом вимірювання кількості | о-2Р) кордицепинтрифосфата, яке кожний фермент може включити на ДНК-матриці з активованої сперми лосося при в. обмеженій концентрації цього ферменту. Для кількісної оцінки включення Іо-92Р| кордицепинтрифосфата досвід « проводили таким чином, щоб кінцеві концентрації в 5Омкл реакційній суміші складали: 12,5 мкг ДНК активованої сперми лосося, 200мМкМ кожного з дЦТФ, дГТФ і дТтТФ, 50МмкМ дАТФ (фірма РегКкіп ЕІтег), 50мкМ Ї о-З2РІ -З'ДАТФ/З-дАТФ (фірма Мем Епдіапа Мисіеаг, бідта), 1мМ р-меркаптоетанола, 25ММ М-тріс (гидроксиметил| « метил-3-аминопропансульфоновой кислоти (ТАРФБ), рН 9,5 при 20"С, 55мМ КС і 2,25мМ Мас. 45мкл кожної реакційної суміші розливали у вигляді аликвотних кількостей в дев'ять пробірок об'ємом 0,5 - с мл, тобто кожну реакцію проводили або з (3460-; 3460, Еб150-; (3460,Е6150,Е667У-; або з (3460, Е667У-Тад в ц двох повторностях, при цьому одну пробірку залишали без ферменту як негативний контроль. Суміш, отриману в "» результаті реакції полімеризації, для кожного досвіду в двох пробірках, змішували спочатку з бмкл (0,058 одиниць) полімераза 5460-Тад. Таку ж операцію проводили з полімераза 5460,Е61506-Тад (0,0025 одиниць), полімераза 5460,Е6150, Ебб67У-Тад (0,0034 одиниці) або полімераза (3460, Еб667У-Тад (0,083 одиниці). Як т» контроль рівня фону в одну пробірку, що залишилася замість ферменту спочатку додавали буфер для -І розбавлення ферменту.
Кожну реакційну суміш протягом короткого інтервалу часу центрифугували і инкубували протягом 1О0хвилин т» при 75"С. Реакції припиняли, додаючи 1Омкл бОмММ ЕДТК, і зберігали на льоду. Кожний зразок аликвоти об'ємом БОмкл з бОмкл реакційної суміші розбавляли 1 мл 2мММ ЕДТК, 50 мкг/мл фрагментований ДНК сперми лосося. о ДНК осаджали з допомогою ТХУ, використовуючи стандартні методи і збираючи на фильтровальні диски типу сб» ОР/С (фірма М/патап, Кент, Великобританія). Кількість включеного | а--2РІ-міченого нуклеотида оцінювали з допомогою рідинной сцинтилляційної спектрометрии, після чого підраховували кількість включених пмолей.
Кількість пмолей |5-32Р| кордицепинтри-фосфату, включена кожним ферментом, співвідносили з кількістю го одиниць кожного ферменту, застосованого в досвіді, для отримання кількості пмолей, включених одиницею
ГФ! ферменту. Нижче за приведені отримані дані. ю во б5 Ці результати показують, що обидві мутації Еб150 і Е667У необхідні для ефективного включення молекули кордицепіна в ДНК.
Приклад ЇМ
Секвенування ДНК на основі лужного розкладання з використанням
ДНК-полімерази 5460.Е61505-Тад
У цьому прикладі показане застосування модифікованої полімерази по винаходу для секвенування на основі лужного розкладання з використанням ДНК, частково заміщеної рНТФ. Відношення рНТФ до ДНТФ в реакційних сумішах складало від 1:80 до 1:8. Реакції подовження праймера здійснювали в буфері, що складається з 5Х0ОММ
Вісіпе (К,К-біс(2-гидрокси-етил)гліцин); рН 8,3), 25мММ КОАс і 2,5мМ Масі». Проводили чотири окремі реакції, по одній для кожного з чотирьох рНТФ. Кожна реакційна суміш (5Омкл) містила по 200мкМ кожного з дАТФ, дЦтТФ, 7/0 ВГТФ і дтТФ (фірма Регкіп ЕІтег) і по 0,09 пмолей одноланцюгової ДНК-матриці МІЗІпРШ (фірма Регкіп ЕІтег), яку випалювали з 5--| З2Р|-міченим 0048 (ІГамжуєг і інш., 1993, РСЕ Меїйподз апа Арріїсайопе 2: 275-287).
Реакційні суміші також містили 2,5, 2,5, 2,5 або 25мкм рАТФ, рцЦтТФ, рГТФ або рУТФ відповідно.
Кожну з цих чотирьох реакцій починали шляхом додання 7 одиниць ДНК-полімерази 53460, Еб1558-Таяд і інкубували протягом 1Охвилин при температурі 75"С. Реакції припиняли доданням їОмкл бОМмМ ЕДТК і 75 вміщували на лід. 20мкл кожної реакційної суміші додавали до вОмкл 50мММ Вісіпе (рН 8,3), 25мММ КОАс і 2,5мММ
МасСі». Продукти розщеплення отримували доданням 7мкл їн. МаОН і инкубували протягом 15хвилин при температурі 98"С. Реакції нейтралізували доданням 7мкл ін. НС1. Кожну реакційну суміш осаджували, додаючи
З12мкл 9595-ного етанола і 1Омкл ЗМ ацетату натрію (рН 4,8). Реакційні суміші мікроцентрифугували протягом 15хвилин для збору осадка, супернатант видаляли, дебрис промивали 50О0мкл 7095-ного етанола і сушили.
Кожний дебрис ресуспендували в бмкл 0,5-кратного стоп-буфера (що поставляється фірмою РегкКкіп ЕІтег,
Норуолк, шт.Коннектікут, який містить 9595 формамиду, 20мММ ЕДТК і 0,0595 бромфенолу синього), витримували при температурі 987"С протягом Зхвилин і безпосередньо завантажували на секвенуючий гель для ДНК, що складається із заздалегідь підданого електрофорезу б9б-ного поліакриламиду/8М мочевини, і здійснювали електрофорез. Гель сушили і знімали на рентгенівську плівку. Отримана плівка показала виражені секвенируючі су
СХОДИ, які дають надлишок в 100 основ правильної послідовності.
Приклад М о
Секвенування днк з використанням ДНК-полімеразис4б6О,Е6150.Е667-Тад і
З'-дезоксінуклеотидтрифосфатів
У цьому прикладі описане застосування модифікованої полімерази (3460, Еб150, Рбб/У-Тад для со зо секвенування ДНК з використанням 3'-дезоксінуклеотидтрифосфатів. Цей експеримент здійснювали з використанням 3'-дезоксіАТФ; однак він також може бути здійснений з використанням інших с 3'-дезоксінуклеотидів. Реакції подовження праймера здійснювали в буфері, що складається з 50мММ Вісіпе (рн «І 8,3), 25ММ КОАс і 2,5мММ МасІі»- Кожна реакційна суміш (5Омкл) містила по 200мкМ кожного з дАТФ, дДЦТФ, ДІФ і дтТТФ (фірма Регкіп ЕІтег) і по 0,09 пмолей одноланцюгової ДНК-матриці МіЗтр18 (фірма Регкіп ЕІтег), яку -
Зз5 випалювали з 5-Г2РІ|-міченим 0048 (І амуег і інш., 1993, РСВ. Меїйовдз апа Арріїсайопе 2: 275-287). Реакційні «Ж суміші також містили 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1 або 5мкМ 3'-дезоксіА ТФ.
Кожну з реакцій починали шляхом додання 7 одиниць ДНК-полімерази 54610,Е6150,Рбб7У-Тад і инкубували протягом 1Охвилин при 75"С. Реакції припиняли доданням 1Омкл бОмММ ЕДТК і вміщували на лід. ЗОмкл кожної « реакційної суміші осаджували етанолом і ресуспендували в стоп-буфері, витримували при температурі 987С протягом Зхвилин і безпосередньо завантажували на секвенуючий гель для ДНК, що складається із заздалегідь - с підданого електрофорезу бУо-ного полі«акриламиду/8М мочевини, і здійснювали електрофорез. Гель сушили і а знімали на рентгенівську плівку. Смуги, які містили продукти реакції, проведеної в присутності кордицепину, "» свідчили про наявність ясно виражених сходів термінации. Смуги, що містять найбільші кількості кордицепину, тобто 5мМкМ, показали сходи термінации, в якої в середньому смуги були коротше по довжині в порівнянні з смугами, відповідними більш низьким рівням кордицепина. Смуги, які містили продукти реакції, проведеної у т» відсутності кордицепина, свідчили про наявність продукту, що має повну довжину, і показали відсутність сходів - термінации. Ці результати показують, що мутантний фермент здатний включати кордицепин, і включення цієї молекули в продукт подовження праймера викликає термінацію. Цей метод також може застосовуватися для г» створення сходів секвенування ДНК з використанням 3'-дезоксіЦтТ Ф, З'-дезоксі" ТФ і 3'-дезоксіУ ТФ. 7 50 Приклад МІ
ПЛР-секвенування із забарвленим праймером з використанням ДНК- сю полімерази 5460. Еб15О-Тад
Цей метод ілюструє застосування модифікованої полімерази по винаходу для секвенування із забарвленим праймером з використанням рибонуклеозидтрифосфатів (рНТФ) в ПЛР при відношенні рНТФ:дДНТФ не більше за 1:30. Проводили чотири окремі реакції, кожну з використанням рНТФ. Реакції секвенування на основі ПЛР проводили в буфері, що складається з 25ММ трис-НСЇІ (рН 9), 5;0мМ Масі» і 1095-ного гліцерину (об'єм/об'єм). о Кожна реакційна суміш також містила по 500мМмкМ кожного з дАТФ, дЦТФ, дГТФ і дТтТтФ (фірма Регкіп ЕІтег), де матрицю, що являє собою 5х10 9 копій/мкл плазміди рВЗМ13-- (фірма Зігаіадепе), лінеаризований в результаті обробки ендонуклеазою рестрикції Хтпі. і 0,05 одиниць/мкл ДНК-полімерази 5460, Еб150-Тад. Реакційні суміші 60 рибо-АТФ (10мкл) містили 2,5мкМ АТФ (фірма РНагтасіа Віоїесі), О,1мкл праймера УОЕ М13 Кемегзе Юуе Ргітег (фірма Регкіп ЕІптег) і О0,1мкМ праймера АЗСА6 (5-СОВССАТТСОССАТТСАО). Реакційні суміші рибо-ЦДТФ (1Омкл) містили 2,5мкМ ЦТФ (фірма РНагтасіа Віоїесі), О,їмкл праймера ГАМ М13 Кемегзе Оуе Р'гітег (фірма Регкіп
ЕІтег) і О0,1МмкМ праймера АЗС46. Реакційні суміші рибо-ГТФ (20мкл) містили 2,5мкМ ГГФ (фірма Ріагтасіа
Віоїесп), О,1мкл праймера ТАМКА М13 Кемегзе Юуе Ргітег (фірма РегКіп ЕІтег) і О01мМкМ праймера АЗСА6. 65 Реакційні суміші рибо-УТФ (20мкл) містили 1бмкМ УТФ (фірма РНагтасіа Віоїесі), О,їмкл праймера КОХ М13
Кемегзе Буе Ргітег (фірма Регкіп ЕІтег) і О0,1мкМ праймера АЗСА46.
Кожну з чотирьох реакційних сумішей вміщували в заздалегідь нагріту (757С) термокомірку для проведення
ПЛР типу Регкіп Еітег СепеАМРУ РСЕ. Зувіет 9600 і піддавали ЗО циклам: витримка при температурі 952С протягом 10 секунд, при температурі 557"С протягом 1Осекунд, поступове пониження температури до 65'С протягом їхвилини і витримка при 657С протягом 5хвилин. У результаті кожної з реакцій з участю рАТФ і рЦТтФ отримували по 6бх10!! копій міченого барвником амплифікованого продукту довжиною 300 пар основ, а в результаті реакцій з участю рГТФ і УТФ отримували по 1,2х1012 копій міченого барвником амплифікованого продукту довжиною З00 пар основ.
Для визначення послідовності ДНК амплифікованих продуктів ПЛР без використання розділення за 70 допомогою ферментативних реакцій секвенування ДНК реакційні суміші об'єднували, обробляли лугом і нагрівали, нейтралізували і осаждали таким чином. Об'єднували 4мкл кожної з реакційних сумішей з. використанням АТФ і ЦТФ і вмкл кожної з реакційних сумішей з використанням ГТФ і УТФ. До об'єднаних реакційних сумішей додавали 2мкл 0,25М ЕДТК (рН 8,0) (кінцева концентрація 10мММ), 1Омкл 1М Маон (кінцева концентрація 200мММ) і 14мкл Н 20, а потім инкубували при температурі 9573 протягом бхвилин в термокомірці для проведення ПЛР типу Регкіп Еітег СепеА4МРо РСК БЗувіет 9600 і нейтралізували 10мкМ 1М НС. Потім об'єднану реакційну суміш осаждали доданням 15Омкл 9595-ного етанола з наступною інкубацією при температурі 47"С протягом 15хвилин. Потім її мікроцентрифугували протягом 15хвилин при температурі 47С для збору осадка і супернатант видаляли шляхом аспирації. Дебріс промивали ЗООмкл 7095-ного етанола, мікроцентріфугували протягом бхвилин, супернатант видаляли шляхом аспирації і дебріс сушили. Дебріс ресуспендували в бмкл формамиду, БОмг/мл блакитного декстрана (в 25мММ ЕДТК, 5:1 (об'єм/об'єм)) і витримували при температурі 90С протягом Зхвилин. 1,5мкл ресуспендованого дебріса безпосередньо завантажували на секвенуючий гель, що складається із заздалегідь підданого електрофорезу 595-ного поліакриламіду типу Гопд Капдег (фірма ЕМС ВіоРгодисів) з ЄМ мочевиною. Потім проводили електрофорез і аналізували на ДНК-секвенаторі типу Регкіп ЕІтег АВІ Ргізттм 377 ОМА Зедиепсег відповідно до інструкції СМ виробника. Автоматичне визначення основ на основі програмного забезпечення для аналізу послідовності Регкіп Ге)
ЕІтег АВІ Ргізттм 377 ОМА Зедпепсіпу Апаїузіз показало більш ніж 9996-ную точність визначення послідовності
ДНК продукту довжиною 300 пар основ, амгашфікованого з використанням ПЛР. со
Claims (25)
1. Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза, яка являє собою мутовану форму нативної « термостабільної ДНК-полімерази, що має амінокислотну послідовність, яка містить амінокислотний фрагмент Зег їм СіІп Пе Сі Геи Агу Хаа, в якому Хаа в положенні 7 вказаного фрагменту є залишком валіну Маї або ізолейцину Ме, причому вказана мутована форма модифікована таким чином, що вона містить відмінну від СІй амінокислоту « в положенні 4 послідовності приведеного фрагменту і згадана мутована форма має знижену вибірковість по відношенню до включення невластивих нуклеотидів в порівнянні з нативною термостабільною ДНК-полімеразою.
2. Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п. 1, яка відрізняється тим, що її здатність включати « невластиві нуклеотиди перевищує здатність відповідної нативної термостабільної ДНК-полімерази включати невластивий нуклеотид принаймні у 20 разів. З с
3. Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п. 2, яка відрізняється тим, що має достатню активність "» для застосування в реакції секвенування ДНК, що передбачає використання невластивого нуклеотиду і " відповідного звичайного нуклеотиду при співвідношенні 1:1 або менше.
4. Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п. 3, яка відрізняється тим, що невластивий нуклеотид є рибонуклеозидтрифосфатом. ве
5. Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п. 4, яка відрізняється ТИМ, що -І рибонуклеозидтрифосфат присутній в концентрації меншій за 100 мкМ, а відповідний звичайний нуклеотид присутній в концентрації більшій за 100 мкМ. ве
6. Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п. 5, яка відрізняється тим, що нативна термостабільна Ге 50 ДНК-полімераза вибрана з групи, яка включає термостабільні ДНК-полімерази Тпегтив адпиаїйсив, Тпегтив саідорпйив5, Тпегтивз спііагорпів5, Тпегтив йШйогтів, ТПегтивз ПЙамив, ТПпегтивз о5Пітаїії, Тпегтив гибег, с» Тпегтиз взсоїодисійв, Тнептиз віїмапив, Тпептив вид 205, Тпегтиз вид врз 17, Тпегтиз (пегпторпйЙшв, Тпегтоїода тагйіта, Тпептоїода пеароїйапа, Тпегтовзірпо аїйісапиз, АпаегосеПйШт (пегторпййт, Васій5 саїЇдогепах, Васійиз зі(еагоіпегторпйшв.
7. Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п. 5, яка відрізняється тим, що нативна термостабільна ГФ! ДНК-полімераза є термостабільною ДНК-полімеразою роду Тпептив.
8. Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п. 5, яка відрізняється тим, що нативна термостабільна о ДНК-полімераза є термостабільною ДНК-полімеразою роду ТПегптоїіода.
9. Рекомбінантна термостабільна ДНК-полімераза за п. 5, яка відрізняється тим, що нативна термостабільна 60 /ДНК-полімераза містить амінокислотну послідовність І еи Азр Туг Зег СіІп Пе Сім І еи Агу Маї І еи Аа Ніз І еи 5ег.
10. Фрагмент нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує рекомбінантну термостабільну ДНК-полімеразу за п. 1.
11. Фрагмент нуклеїнової кислоти за п. 10, який відрізняється тим, що рекомбінантна термостабільна ДНЕК-полімераза має достатню активність для застосування в реакції секвенування ДНК. 65
12. Фрагмент нуклеїнової кислоти за п. 11, який відрізняється тим, що в реакції секвенування ДНК використовують невластивий нуклеотид та відповідний звичайний нуклеотид при співвідношенні 1:1 або менше.
13. Фрагмент нуклеїнової кислоти за п. 12, який відрізняється тим, що невластивий нуклеотид є рибонуклеозидтрифосфатом.
14. Фрагмент нуклеїнової кислоти за п. 13, який відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза вибрана з групи, яка включає термостабільні ДНК-полімерази Тпегтиз адиаїййсив, Тпегтив саідорпйив5, Тпегтивз спііагорпів5, Тпегтив йШйогтів, ТПегтивз ПЙамив, ТПпегтивз о5Пітаїії, Тпегтив гибег, Тпегтиз взсоїодисійв, Тнептиз віїмапив, Тпептив вид 205, Тпегтиз вид врз 17, Тпегтиз (пегпторпйЙшв, Тпегтоїода тагйіта, Тпептоїода пеароїйапа, Тпегтовзірпо аїйісапиз, АпаегосеПйШт (пегторпййт, Васій5 саїЇдогепах, Васіиз в8іеагоіпегторпіШв. 70
15. Фрагмент нуклеїнової кислоти за п. 13, який відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза є термостабільною ДНК-полімеразою роду Тпептив.
16. Фрагмент нуклеїнової кислоти за п. 13, який відрізняється тим, що нативна термостабільна ДНК-полімераза є термостабільною ДНК-полімеразою роду ТПегптоїіода.
17. Фрагмент нуклеїнової кислоти за п. 12, який відрізняється тим, що нативна термостабільна
7/5. ДНК-полімераза містить амінокислотну послідовність Гей Авр Туг Зег Сіп Пе Сім Геи Аго Маї Геим Аа Нів Геи зег.
18. Композиція для застосування в реакції секвенування ДНК, яка містить нуклеїнову кислоту-матрицю, праймер, суміш звичайних ДНТФ та принаймні один невластивий нуклеотид, яка відрізняється тим, що містить рекомбінантну термостабільну ДНК-полімеразу за п. 5, і де праймер, комплементарний вказаній матриці є олігонуклеотидним праймером, причому співвідношення між невластивим нуклеотидом та відповідним 2ор Звичайним нуклеотидом складає 1:1 або менше, а невластивий нуклеотид є рибонуклеозидтрифосфатом.
19. Композиція за п. 18, яка відрізняється тим, що рибонуклеозид присутній в концентрації нижчій ніж 100 МКМ, а відповідний звичайний нуклеотид присутній в концентрації більшій ніж 100 мкМ.
20. Композиція за п. 19, яка відрізняється тим, що невластивий нуклеотид є неміченим.
21. Спосіб секвенування нуклеїнової кислоти-мішені, що включає підготовку реакційної суміші, обробку сч реакційної суміші, обробку продуктів подовження праймера, розділення продуктів реакції і визначення о послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, який відрізняється тим, що включає підготовку невластивого нуклеотиду і відповідного звичайного нуклеотиду для реакції секвенування ДНК, причому невластивий і відповідний звичайний нуклеотиди присутні в співвідношенні менш ніж 1:1, де реакція секвенування. ДНК передбачає використання рекомбінантної термостабільної ДНК-полімерази за п. 1, обробку отриманої реакційної с зо Суміші в умовах, придатних для подовження праймера, що включає цей невластивий нуклеотид, обробку отриманих продуктів подовження праймера в умовах, придатних для гідролізу цих продуктів подовження с праймера, розділення отриманих продуктів реакції і визначення послідовності нуклеїнової кислоти-мішені. «г
22. Спосіб секвенування за п. 21, який відрізняється тим, що невластивий нуклеотид є рибонуклеотидом.
23. Спосіб секвенування за п. 22, який відрізняється тим, що рибонуклеотид присутній в концентрації ї- приблизно 0,1 мкМ - 100 мкм. «г
24. Спосіб секвенування за п. 23, який відрізняється тим, що відповідний звичайний нуклеотид присутній в концентрації приблизно 50 - 500 мкм.
25. Набір для секвенування нуклеїнової кислоти, який містить реагенти для секвенування нуклеїнової кислоти, який відрізняється тим, що містить ензим термостабільної ДНК-полімерази з амінокислотною « послідовністю Зег Сіп Пе Хаа І еи Аго Хаа, де Хаа в положенні 4 цієї послідовності є амінокислотним залишком, ета) с відмінним від глютамінової кислоти Сі та Хаа в положенні 7 приведеної послідовності є залишком валіну Маї . або ізолейцину Пе, суміш звичайних ДНТФ і принаймні один невластивий нуклеотид, причому співвідношення між а невластивим нуклеотидом та відповідним звичайним нуклеотидом переважно менше ніж 1. щ» -І щ» з 50 сю» Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2337696P | 1996-08-06 | 1996-08-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA47423C2 true UA47423C2 (uk) | 2002-07-15 |
Family
ID=21814728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA97084100A UA47423C2 (uk) | 1996-08-06 | 1997-08-04 | Рекомбінантна термостабільна дhк-полімераза, фрагмент нуклеїнової кислоти, композиція для застосування в реакції секвенування днк, спосіб секвенування нуклеїнової кислоти-мішені, набір для секвенування нуклеїнової кислоти |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5939292A (uk) |
| EP (1) | EP0823479B1 (uk) |
| JP (1) | JP3170229B2 (uk) |
| KR (1) | KR100510619B1 (uk) |
| CN (1) | CN1154733C (uk) |
| AT (1) | ATE278020T1 (uk) |
| AU (1) | AU714929B2 (uk) |
| BR (1) | BR9704260B1 (uk) |
| CA (1) | CA2210951C (uk) |
| CZ (1) | CZ293215B6 (uk) |
| DE (1) | DE69730926T2 (uk) |
| DK (1) | DK0823479T3 (uk) |
| ES (1) | ES2227640T3 (uk) |
| HU (1) | HUP9701341A3 (uk) |
| IL (1) | IL121441A (uk) |
| MX (1) | MX9705961A (uk) |
| NO (1) | NO322135B1 (uk) |
| PL (1) | PL321478A1 (uk) |
| RU (1) | RU2235773C2 (uk) |
| TW (1) | TW528802B (uk) |
| UA (1) | UA47423C2 (uk) |
Families Citing this family (67)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6395524B2 (en) | 1996-11-27 | 2002-05-28 | University Of Washington | Thermostable polymerases having altered fidelity and method of identifying and using same |
| US20030215857A1 (en) * | 1996-12-20 | 2003-11-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application |
| WO1998040496A1 (en) | 1997-03-12 | 1998-09-17 | The Perkin-Elmer Corporation | Dna polymerases having improved labeled nucleotide incorporation properties |
| US6346379B1 (en) * | 1997-09-11 | 2002-02-12 | F. Hoffman-La Roche Ag | Thermostable DNA polymerases incorporating nucleoside triphosphates labeled with fluorescein family dyes |
| US6566059B1 (en) | 1998-10-01 | 2003-05-20 | Variagenics, Inc. | Method for analyzing polynucleotides |
| US6458945B1 (en) | 1998-10-01 | 2002-10-01 | Variagenics, Inc. | Method for analyzing polynucleotides |
| US6777188B2 (en) | 1998-10-01 | 2004-08-17 | Variagenics, Inc. | Genotyping by mass spectrometric analysis of allelic fragments |
| US6855500B2 (en) | 1998-10-01 | 2005-02-15 | Sequenom, Inc. | Fluorescence-based genotyping |
| US6994998B1 (en) | 1998-10-01 | 2006-02-07 | Sequenom, Inc. | Base-modified nucleotides and their use for polymorphism detection |
| US6500650B1 (en) | 1998-10-01 | 2002-12-31 | Variagenics, Inc. | Method for identifying polymorphisms |
| US6610492B1 (en) | 1998-10-01 | 2003-08-26 | Variagenics, Inc. | Base-modified nucleotides and cleavage of polynucleotides incorporating them |
| US6440705B1 (en) | 1998-10-01 | 2002-08-27 | Vincent P. Stanton, Jr. | Method for analyzing polynucleotides |
| AU5008900A (en) * | 1999-05-12 | 2000-11-21 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis |
| GB9921318D0 (en) * | 1999-09-09 | 1999-11-10 | Kristensen Tom | Chimeric molecules |
| US6329178B1 (en) | 2000-01-14 | 2001-12-11 | University Of Washington | DNA polymerase mutant having one or more mutations in the active site |
| US7179590B2 (en) | 2000-04-18 | 2007-02-20 | Roche Molecular Systems, Inc | High temperature reverse transcription using mutant DNA polymerases |
| US6214557B1 (en) * | 2000-06-06 | 2001-04-10 | Washington University | Cold sensitive mutant DNA polymerases |
| US20020102577A1 (en) * | 2000-07-31 | 2002-08-01 | Raillard Sun Ai | Nucleotide incorporating enzymes |
| US6811979B2 (en) * | 2000-10-11 | 2004-11-02 | Applera Corporation | Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers |
| IL155450A0 (en) * | 2000-10-20 | 2003-11-23 | Expression Diagnostics Inc | Leukocyte expression profiling |
| WO2002073504A1 (en) * | 2001-03-14 | 2002-09-19 | Gene Logic, Inc. | A system and method for retrieving and using gene expression data from multiple sources |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US6905827B2 (en) | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US6887690B2 (en) * | 2001-06-22 | 2005-05-03 | Pe Corporation | Dye-labeled ribonucleotide triphosphates |
| CA2460546A1 (en) * | 2001-09-14 | 2003-03-27 | Invitrogen Corporation | Dna polymerases and mutants thereof |
| US20050042629A1 (en) | 2002-09-13 | 2005-02-24 | Applera Corporation | Thermus scotoductus nucleic acid polymerases |
| WO2003048308A2 (en) | 2001-11-30 | 2003-06-12 | Applera Corporation | Thermus brockianus nucleic acid polymerases |
| US6723546B2 (en) * | 2002-03-26 | 2004-04-20 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and expression of BsaI restriction endonuclease and BsaI methylase in E. coli |
| US7148049B2 (en) | 2002-04-02 | 2006-12-12 | Roche Molecular Systems, Inc. | Thermostable or thermoactive DNA polymerase molecules with attenuated 3′-5′ exonuclease activity |
| US7820030B2 (en) | 2003-04-16 | 2010-10-26 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US7892745B2 (en) | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7572581B2 (en) * | 2003-06-30 | 2009-08-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | 2′-terminator nucleotide-related methods and systems |
| US7947817B2 (en) * | 2003-06-30 | 2011-05-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Synthesis and compositions of 2'-terminator nucleotides |
| EP1493824A1 (en) * | 2003-07-02 | 2005-01-05 | Consortium National de Recherche en Genomique (CNRG) | Method for detection of mutations in DNA |
| JP4127204B2 (ja) * | 2003-12-17 | 2008-07-30 | セイコーエプソン株式会社 | 液晶表示装置の製造方法 |
| US20080311627A1 (en) * | 2004-06-17 | 2008-12-18 | Epigenomics Ag | Compositions and Methods for Preventing Carry-Over Contamination in Nucleic Acid Amplification Reactions |
| US7745125B2 (en) | 2004-06-28 | 2010-06-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | 2′-terminator related pyrophosphorolysis activated polymerization |
| US7645575B2 (en) | 2004-09-08 | 2010-01-12 | Xdx, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| US7890268B2 (en) * | 2004-12-28 | 2011-02-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | De-novo sequencing of nucleic acids |
| US20060292578A1 (en) * | 2005-06-28 | 2006-12-28 | Weidong Zheng | DNA polymerase blends and mutant DNA polymerases |
| WO2007002890A2 (en) * | 2005-06-28 | 2007-01-04 | Agencourt Personal Genomics Corporation | Methods of producing and sequencing modified polynucleotides |
| EP1762629B1 (en) | 2005-09-12 | 2009-11-11 | Roche Diagnostics GmbH | Detection of biological DNA |
| US20070154894A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-05 | Affymetrix, Inc. | Labeling and non-enzymatic fragmentation of cDNA using a ribonucleoside triphosphate analog |
| US7993832B2 (en) | 2006-08-14 | 2011-08-09 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| WO2008140484A2 (en) | 2006-11-09 | 2008-11-20 | Xdx, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| US20080242560A1 (en) * | 2006-11-21 | 2008-10-02 | Gunderson Kevin L | Methods for generating amplified nucleic acid arrays |
| US10150990B2 (en) | 2008-04-21 | 2018-12-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Ribonucleotide tag nucleic acid detection |
| WO2011123246A2 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Illumina, Inc. | Solid-phase clonal amplification and related methods |
| EP2644699B1 (en) | 2010-11-24 | 2018-02-21 | Kaneka Corporation | Amplified nucleic acid detection method and detection device |
| WO2012146260A1 (de) | 2011-04-23 | 2012-11-01 | Biolytix Ag | Herstellung und verwendung von proteinen in der molekularbiologie |
| JP6219816B2 (ja) * | 2012-04-27 | 2017-10-25 | 株式会社カネカ | 核酸の増幅方法、および、増幅核酸の検出方法 |
| US9309501B2 (en) | 2012-12-24 | 2016-04-12 | Industrial Technology Research Institute | Isolated DNA polymerases, kits and applications thereof |
| WO2014150851A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleotide analogs for sequencing |
| RU2688435C2 (ru) | 2013-08-19 | 2019-05-21 | Эбботт Молекьюлар Инк. | Набор для получения реакционной смеси для синтеза 3′-o-пропаргил-модифицированной нуклеиновой кислоты |
| JP6691380B2 (ja) | 2013-11-22 | 2020-04-28 | 株式会社カネカ | 短鎖ｒｎａの検出方法 |
| CN103966182A (zh) * | 2014-04-30 | 2014-08-06 | 厦门安普利生物工程有限公司 | 一种提取纯化Tth DNA聚合酶的方法 |
| KR102154812B1 (ko) * | 2014-09-29 | 2020-09-11 | 박진우 | 광고 및 태양광 충전 기능을 가진 가방 |
| US11180522B2 (en) | 2015-05-08 | 2021-11-23 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Disulfide-linked reversible terminators |
| WO2019014359A2 (en) * | 2017-07-12 | 2019-01-17 | The Scripps Research Institute | POLYMERASE CHAIN TRANSCRIPTION (PCT): EXPONENTIAL SYNTHESIS OF RNA AND MODIFIED RNA |
| KR20200086371A (ko) | 2017-09-20 | 2020-07-16 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 패신저 유전자 돌연변이 부담이 높은 종양을 가진 환자에 대한 면역 치료요법 |
| CN108130318B (zh) * | 2018-02-28 | 2020-07-14 | 深圳市艾伟迪生物科技有限公司 | 突变型Taq DNA聚合酶、免核酸提取直接PCR扩增的试剂盒及其应用 |
| CN113195511A (zh) | 2018-09-28 | 2021-07-30 | 生捷科技控股公司 | 二硫键连接的可逆终止剂 |
| CN110093410A (zh) * | 2019-05-21 | 2019-08-06 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 一种dna测序反应试剂及其制备方法 |
| GB202007428D0 (en) | 2020-05-19 | 2020-07-01 | Fabricnano Ltd | Polynucleotide synthesis |
| CN112322715B (zh) * | 2020-11-17 | 2022-11-25 | 清华大学 | 一种核酸测序方法 |
| GB202114105D0 (en) | 2021-10-01 | 2021-11-17 | Fabricnano Ltd | Nucleotide synthesis |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5466591A (en) * | 1986-08-22 | 1995-11-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases |
| US4889818A (en) * | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| US5912155A (en) * | 1994-09-30 | 1999-06-15 | Life Technologies, Inc. | Cloned DNA polymerases from Thermotoga neapolitana |
| US5614365A (en) * | 1994-10-17 | 1997-03-25 | President & Fellow Of Harvard College | DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing |
| ATE143057T1 (de) * | 1994-10-17 | 1996-10-15 | Harvard College | Dns polymerase mit veränderter nukleotid- bindungstelle |
-
1997
- 1997-07-18 CZ CZ19972299A patent/CZ293215B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-07-29 TW TW086110793A patent/TW528802B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-07-31 ES ES97113182T patent/ES2227640T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-31 EP EP97113182A patent/EP0823479B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-31 IL IL12144197A patent/IL121441A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-07-31 AT AT97113182T patent/ATE278020T1/de active
- 1997-07-31 DK DK97113182T patent/DK0823479T3/da active
- 1997-07-31 DE DE69730926T patent/DE69730926T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-01 CA CA002210951A patent/CA2210951C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-01 HU HU9701341A patent/HUP9701341A3/hu unknown
- 1997-08-04 UA UA97084100A patent/UA47423C2/uk unknown
- 1997-08-05 KR KR1019970037399A patent/KR100510619B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-08-05 MX MX9705961A patent/MX9705961A/es active IP Right Grant
- 1997-08-05 BR BRPI9704260-9A patent/BR9704260B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-08-05 US US08/906,484 patent/US5939292A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-05 PL PL97321478A patent/PL321478A1/xx unknown
- 1997-08-05 NO NO19973595A patent/NO322135B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-08-05 CN CNB971153922A patent/CN1154733C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-06 RU RU97113529/13A patent/RU2235773C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-08-06 AU AU33197/97A patent/AU714929B2/en not_active Ceased
- 1997-08-06 JP JP21235097A patent/JP3170229B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA47423C2 (uk) | Рекомбінантна термостабільна дhк-полімераза, фрагмент нуклеїнової кислоти, композиція для застосування в реакції секвенування днк, спосіб секвенування нуклеїнової кислоти-мішені, набір для секвенування нуклеїнової кислоти | |
| AU741366B2 (en) | Altered thermostable DNA polymerases for sequencing | |
| EP0727496B1 (en) | DNA polymerases | |
| EP2202312B1 (en) | DNA polymerases having improved labelled nucleotide incorporation properties | |
| EP1287146B1 (en) | Cold sensitive mutant dna polymerases | |
| MXPA97005961A (en) | Thermostable dna polymerase, modification | |
| WO1996012042A2 (en) | Dna polymerases having modified nucleotide binding site for dna sequencing | |
| JP2002536981A (ja) | 核酸標的配列の存在を測定する方法およびその応用 | |
| AU2001266726A1 (en) | Cold sensitive mutant DNA polymerases | |
| KR20230075403A (ko) | 활성 및 열안정성이 증가된 역전사효소 돌연변이체 | |
| US20040058330A1 (en) | Methods of use for thermostable RNA ligases | |
| KR100484124B1 (ko) | 변형된 뉴클레오티드 결합부위를 갖는 dna 서열화용 dna 폴리머라제 | |
| KR100689795B1 (ko) | 복합체 형성 방법 | |
| JP2005512566A (ja) | ＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼＩ変異体による核酸標識 | |
| JP2005512566A6 (ja) | ＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼＩ変異体による核酸標識 |