KR100689795B1

KR100689795B1 - 복합체 형성 방법

Info

Publication number: KR100689795B1
Application number: KR1020037003766A
Authority: KR
Inventors: 사가와히로아키; 에노키다츠지; 고바야시에이지; 도모노준; 가토이쿠노신
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2000-09-19
Filing date: 2001-09-18
Publication date: 2007-03-09
Also published as: AU8626801A; EA200300385A1; CA2422736A1; EA004630B1; AU2001286268B2; JPWO2002024901A1; WO2002024901A1; US20040236094A1; KR20030034183A; EP1319710A1; EP1319710A4

Abstract

(a) 하나의 더블-스트랜드 핵산 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드이고 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 갖는다); (b) 더블 스트랜드 핵산이 변성되지 않는 조건하에서 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 복합체를 형성하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 더블-스트랜드 핵산 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 복합체를 형성하는 방법.

Description

복합체 형성 방법{Method of forming complex}

본 발명은 유전공학 분야에서 유용한 더블-스트랜드 핵산 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 복합체를 형성하는 방법, 핵산상에서 복제 기점을 형성하는 방법, 및 핵산 복제 방법에 관한 것이다.

분자 생물학 분야에서의 연구 발전이 다양한 연구 기술을 가져왔다. 이중, 핵산 혼성화 기술은 관심의 대상이 되는 핵산을 검출 및 측량할 수 있도록 하는 매우 유용한 기술이며, 분자 생물학 분야외의 다양한 분야에서 각 목적에 적절한 방식으로 사용되어 왔다.

기초적으로, 혼성화는 서로 상보적인 싱글-스트랜드 핵산의 염기쌍 형성 반응이다. 따라서, 우선 하나의 더블-스트랜드 핵산 및 하나의 싱글-스트랜드 핵산, 또는 더블-스트랜드들 사이의 혼성화를 위해 하나의 더블-스트랜드 핵산을 두개의 싱글 스트랜드로 분리(변성)시키는 것이 필요하다. 상기 변성을 위해 가열 또는 알카리 처리가 사용된다. 그러나, 단백질의 활성을 제거하지 않고 단백질 등의 존재하에서 상기 처리를 수행하는 것은 불가능하다.

추가로, 더블-스트랜드 핵산을 사용하는 혼성화 과정에서, 약간의 빈도로 원(original) 더블-스트랜드 핵산이 형성되는 것은 필연적이다.

삼중 나선구조(triple helix)가 변성되지 않은 더블-스트랜드 핵산 및 싱글-스트랜드 핵산사이에 형성될 수 있다고 공지되어 있다(nucleic acids Research, 16:11431-11440 (1988)). 그러나, 상기 삼중 나선구조 형성의 적용은 특정 서열, 즉, 퓨린 고함량 서열 및 피리미딘 고함량 서열에 의해 형성되는 더블-스트랜드 핵산의 부위에 제한된다.

더블-스트랜드 핵산 및 싱글-스트랜드 핵산의 복합체는 상동성 재조합에 관여하는 RecA 단백질의 존재하에 비변성 조건하에서 형성된다고 공지되어 있다. 그러나 이러한 현상은 RecA 단백질의 활성에 기초하고, 유사한 복합체를 비효소적으로 형성하는 기술은 공지되어 있지 않다.

분리된 핵산 분자를 유지시키거나 증폭시키는 기술은 유전공학 분야의 연구에서 필수적이다. 유지 또는 증폭은 통상 분리된 핵산을 적절한 벡터내로 삽입하여 재조합 DNA 분자를 제조함으로써 달성된다. 상기 재조합 DNA 분자는 분리된 상태로 안정하게 유지될 수 있거나, 적절한 숙주에서 보유(harboring)될 수 있다. 추가로, 필요한 경우 재조합 DNA 분자를 보유하는 숙주를 배양하여 세포수를 증가시킴으로써 분자수를 증가시킬 수 있다.

플라스미드, 파지, 바이러스 등으로부터 유래된 다수의 벡터가 공지되어 있다. 또한, 사용에 적절한 다양한 작용을 갖도록 인공적으로 변형된 벡터가 개발되었고 상업적으로 이용가능하다.

벡터를 사용하여 유전자를 유지시키거나 증폭시키는데 숙주를 사용하는 것이 필수적이다. 따라서, 관심의 대상이 되는 핵산 분자가 벡터내로 삽입되는 재조합 DNA 분자, 예를 들면 관심의 대상이 되는 핵산 분자가 숙주에 해로운 경우(예: 벡터가 숙주에 치명적인 산물을 코딩하는 유전자를 포함하는 경우) 재조합 DNA 분자를 작제하는 것은 난해하다.

숙주 세포밖에서(즉, 시험관내)에서 재조합 DNA 분자를 복제함으로써 숙주를 매개로 하지 않고 관심의 대상이 되는 핵산 분자를 증폭시키는 것이 고려될 수 있다. 그러나, 모든 공지된 벡터는 고유의 메카니즘에 의해 정의된 복제 기점으로부터 복제되기 때문에 인공적으로 핵산 분자를 복제하는 일반적인 목적 방법은 공지되어 있지 않다.

발명의 목적

본 발명의 주요 목적은 변성시키지 않고 더블-스트랜드 핵산 및 싱글-스트랜드 핵산으로 구성된 복합체를 형성하는 방법, 숙주 유기체를 사용하지 않고 핵산 분자를 복제하는 용이한 일반-목적 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

집중적으로 연구한 결과, 본 발명자들은 리보뉴클레오티드를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드를 변성되지 않은 더블 스트랜드 핵산에 어닐링하여 시험관내에서 복합체를 형성하고, 복합체는 핵산상에서 복제 기점으로서 작용하며, 핵산이 복제 기점으로부터 복제될 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명은 완성되었다.

본 발명의 제 1면은

a) 하나의 더블-스트랜드 핵산 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 혼합 하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드이고 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 갖는다);

(b) 더블 스트랜드 핵산이 변성되지 않는 조건하에서 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 복합체를 형성하는 것을 포함하는 더블 스트랜드 핵산 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 복합체를 형성하는 방법에 관한 것이다.

제 1면에서 사용되는 더블 스트랜드 핵산의 예는 선형 DNA 및 게놈 DNA를 포함한다.

올리고뉴클레오티드는 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나에 상보적인 DNA를 합성하기 위한 프라이머로서 작용할 수 있고/거나 표지화될 수 있다.

본 발명의 제 2면은

(a)제 1면의 방법에 따라 더블-스트랜드 핵산 및 올리고뉴클레오티드 로 구성된 복합체를 형성하고(여기에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드이고 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 갖는다);

(b) 복합체를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것을 포함하는, 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 더블-스트랜드 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제 3면은

(a) 더블-스트랜드 핵산 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드이고 DNA 폴리머라제에 의해 그의 3' 말단으로부터 신장할 수 있고, 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 갖는다);

(b) 더블 스트랜드 핵산이 변성되지 않는 조건하에서 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 복합체를 형성하는 것을 포함하는 더블-스트랜드 핵산상에서 복제 기점을 형성하는 방법에 관한 것이다.

제 3면에서 사용되는 더블 스트랜드 핵산의 예는 선형 DNA, 환형 DNA 및 게놈 DNA를 포함한다.

본 발명의 제 4면은 DNA 폴리머라제의 존재하에 제 3면의 방법에 따라 형성된 복제 기점으로부터 더블-스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나에 상보적인 DNA를 합성하는 것을 포함하는 핵산을 복제하는 방법에 관한 것이다.

제 4면에서 사용되는 DNA 폴리머라제는 스트랜드 치환 활성을 갖는 효소에 의해 예시된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명의 방법에 따라 형성된 복제 기점으로부터 증폭된 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명의 방법에 따라 형성된 복제 기점으로부터 증폭된 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.

도 3은 본 발명의 방법에 따라 형성된 복제 기점으로부터 증폭된 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명의 방법에 따라 형성된 복제 기점으로부터 증폭된 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.

본 명세서에서 사용되는 바, 더블-스트랜드 핵산 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 복합체는 더블-스트랜드 핵산 및 올리고뉴클레오티드가 서로 비공유결합적으로 결합된 복합체를 언급한다. 그의 형태와 관련하여 특별히 제한되는 바는 없ㄴ다. 예로서 삼중 나선구소를 형성하는 것 및 올리고뉴클레오티드 더블-스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 오직 하나와만 염기쌍을 형성하는 것을 포함한다. 더블-스트랜드 핵산 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 복합체는는 이하 "복합체"로서 간단하게 언급될 수 있다.

본 발명에 따라 뉴클레오티드는 통상 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이다. 임의로 뉴클레오티드의 유사체 또는 유도체(변형)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 데옥시리보뉴클레오티드는 당 부위가 D-2-데옥시리보스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 데옥시리보뉴클레오티드는 예를 들 면, 염기 부위로서 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 티민을 갖는 것을 포함한다. 추가로, 데옥시리보뉴클레오티드는 또한 염기 부위로서 7-데아자구아노신 또는 이노신과 같은 변형된 염기를 같은 데옥시리보뉴클레오티드 유사체를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오티드는 당 부위가 D-리보스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 리보뉴클레오티드는 예를 들면, 염기 부위로서 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 우라실을 갖는 것을 포함한다. 리보뉴클레오티드는 또한 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황 원자에 의해 치환된 변형된 리보뉴클레오티드((α-S) 리보뉴클레오티드)와 같은 변형된 리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 유사체를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 복제 기점은 더블-스트랜드 핵산의 복제, 즉, 핵산의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA의 합성을 위한 반응 개시점으로서 작용할 수 있는 사이트를 언급한다. 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 특징화되는 사이트로 제한하지 않는다.

이하, 본 발명을 상세히 설명할 것이다.

(1) 본 발명에 따라 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드

본 발명에 따라 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드이다. 키메라성 올리고뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 유사체 및 데옥시리보뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부 터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

예를 들면, 염기 부위로서 이노신 또는 7-데아자구아닌과 같은 염기를 갖는 뉴클레오티드 유사체, 또는 락(locked) 핵산과 같은 리보스 유도체를 갖는 뉴클레오티드 유사체(LNA; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:5633-5638 (2000); WO 99/14226)를 본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 유사체로서 사용할 있다. 변형된 리보뉴클레오티드는 인산 그룹에 결합된 산소 원자가 황 원자에 의해 치환된 (α-S) 뉴클레오티드, 또는 표지 화합물이 첨가된 뉴클레오티드에 의해 예시된다. 또한, 본 발명에 따른 키메라성 올리고뉴클레오티드는 펩티드 핵산을 포함할 수 있다(PNA; Nature, 365:566-568 (1993)).

본 발명에 따라 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드가 관심의 대상인 되는 더블-스트랜드 핵산과 복합체를 형성할 수 있는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다. 또한 리보뉴클레오티드를 포함하는 위치와 관련하여 특정의 것으로 제한하지 않는다. 예를 들면, 리보뉴클레오티드가 프라이머의 3' 말단 또는 3'-말단측상에 위치하는 것이 사용될 수 있다. 또한, 리보뉴클레오티드의 수를 특별히 제한하지 않는다. 반 이하의 구성 염기가 리보뉴클레오티드인 키메라성 올리고뉴클레오티드가 예시된다.

본 명세서에서 사용되는 바, 3'-말단측은 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산의 중심으로부터 3' 말단으로의 위치를 언급한다. 유사하게, 5' 말단측은 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산의 중심으로부터 5' 말단으로의 위치를 언급한다.

본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드는 키메라성 올리 고뉴클레오티드이 복합체를 형성하기 위한 더블-스트랜드 핵산의 뉴클레오티드 서열의 일부에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 바, "실질적으로 상보적적인 뉴클레오티드 서열"은 핵산이 더블-스트랜드 형태를 취할 수 있는 조건, 예로서 발명을 수행하는 조건하에서 더블-스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나에 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드의 길이가 특별히 제한되지 않지만, 예로서 12개의 뉴클레오티드 내지 100개의 뉴클레오티드, 바람직하게 15개의 뉴클레오티드 내지 40개의 뉴클레오티드이다.

뉴클레오티드 유사체를 키메라성 올리고뉴클레오티드내로 삽입시키는 것이 키메라성 올리고뉴클레오티드 스스로 고차 구조를 형성하는 것을 억제하는데 효과적이다. LNA와 같이 강력한 염기쌍 결합을 형성할 수 있는 뉴클레오티드 유사체의 삽입이 고도로 유효한 복합체의 형성에 유용하다.

상기 키메라성 올리고뉴클레오티드는예를 들면, 포스포르아미다이트 방법에 따라 Applied Biosystems Inc. (ABI)로부터 입수한 394 유형 DNA 합성기를 사용하여 합성하여 원하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 다르게는, 포스페이트 트리에스테르 방법, H-포스포네이트 방법 및 티오포스포네이트 방법을 포함하는 모든 방법을 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.

(2) 본 발명의 복합체를 형성하는 방법

본 발명은 1)에 기술된 키메라성 올리고뉴클레오티드 및 키메라성 올리고뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 더블 스트랜드로 구 성된 복합체를 형성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서 사용되는 더블 스트랜드 핵산과 관련하여 특별히 제한하는 바는 없다. 본 발명은 선형 및 환형의 것으로 적용될 수 있다. 예를 들면, 플라스미드 DNA, 게놈 DNA, 그의 단편, PCR에 의해 증폭된 DNA 단편 등에서 하나의 복제 기점을 형성할 수 있다. 본 발명의 방법은 자연 발생된 핵산 또는 인공적으로 제조된 핵산에 적용될 수 있다.

본 발명에 따라 더블 스트랜드 핵산을 변성시키지 않고 적절한 조건하에서 상기 (1)에 기술된 바와 같은 키메라성 올리고뉴클레오티드 및 더블-스트랜드 핵산을 혼합하여 시험관내에서 복합체를 형성할 수 있다. 조건과 관련하여 특별히 제한하는 바는 없지만 사용하고자 하는 더블-스트랜드 핵산이 싱글 스트랜드로 변성되지 않는 조건을 통상 사용한다. 예를 들면, 0 내지 70℃ 온도에서 6.0 내지 9.5, 바람직하게 7.0 내지 9.2의 pH에서 복합체가 형성될 수 있다.

복합체를 형성하기 위한 반응 혼합물은 이온 세기 또는 다른 성분을 조절하기 위하여 적절한 pH, 중성 염을 유지시키는 완충 성분을 포함할 수 있다. 또한, 형성된 복합체에 작용할 수 있는 효소 및 효소의 활성을 나타내기 위해 요구되는 다양한 성분을 포함할 수 있다. 또한, 추가의 디메틸 설폭시드 (디메틸 설폭시드), 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 포름아미드가 키메라성 올리고뉴클레오티드의 비특정 어닐링을 감소시킨다.

사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드의 양과 관련하여 특별히 제한되는 바는 없지만 예를 들면, 50㎕의 반응 용량중 양은 1 내지 1000pmol, 바람직하게 10 내지 150 pmol의 범위일 수 있다.

키메라성 올리고뉴클레오티드의 3' 말단으로부터 DNA를 합성하는 본 발명의 방법에 따라 형성된 복합체를 사용하여 더블-스트랜드의 두개의 스트랜드중 하나에 상보적인 서열을 갖는 DNA 스트랜드를 합성할 수 있다. 이러한 경우, 동시에 DNA 합성을 수행하기 위하여 DNA 폴리머라제, 기질로서 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 마그네슘 염 및 등을 포함하는 반응 혼합물에서 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 복합체를 형성하기 위한 방법은 리보뉴클레아제 H (RNase H)의 존재하에서 수행할 수 있다. 두개의 고온성 리보뉴클레아제 H 및 열-내성 리보뉴클레아제 H를 본 발명에 따라 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, E. coli로부터의 RNase H외에, 상업적으로 이용가능한 Hybridase^TM Thermostable RNase H (Epicenter Technologies) 및 바실러스(Bacillus)속, 써모스(Thermus)속, 피로코쿠스(Pyrococcus)속, 써모토가(Thermotoga)속 등의 고온성 박테리아로부터의 RNase를 사용할 수 있다. 또한, 자연 발생 리보뉴클레아제 및 변이체를 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터의 열-내성 RNase H를바람직하게 사용할 수 있다. 이 RNase H를 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) DSM3638로부터 수득할 수 있다. 다르게는, 하기 참고 실시예에 기술되는 효소를 코딩하는 유전자를 사용하여 수득할 수 있다.

본 발명을 리보뉴클레아제 H의 존재하에서 수행하는 경우, 사용하고자 하는 리보뉴클레아제 H가 그의 활성을 나타낼 수 있는 반응 혼합물중에서 수행하는 것이 바람직하다.

사용하는 RNase H의 유형에 따라 다르지만, 적절한 완충 성분 및 마그네슘 염 및/또는 망간 염을 포함하는 반응 혼합물을 통상 사용한다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 예를 들면, 마그네슘 염/망간 염으로 염화마그네슘, 아세트산마그네슘, 염화망간, 아세트산망간 또는 황산마그네슘을 최종 농도 1 mM 내지 20 mM, 바람직하게 2 mM 내지 10 mM으로 바람직하게 사용할 수 있다. 완충 성분으로 예를 들면, Bicine, Tricine, HEPES, Tris 및 포스페이트(예: 인산나트륨 및 인산칼륨)를 포함하는 반응 혼합물을 사용할 수 있다. 제한하지 않고 최종 농도 5 mM 내지 100 mM, 바람직하게 10 mM 내지 50 mM, pH 6.0 내지 9.5, 바람직하게 7.0 내지 9.2의 완충 성분을 포함하는 반응 혼합물을 사용한다.

본 발명을 복합체 형성으로만 제한하는 것은 아니고, 변성없이 상기-언급한 복합체를 형성하는 단계를 복합하는 다양한 공정을 포함한다.

본 발명의 복합체를 형성하는 방법을 사용하여 하기 기술하는 핵산을 검출할 수 있다. 또한, 특정 작용을 갖는 핵산의 부위(예: 프로모터 부위)에서 복합체를 형성하여 상기 작용을 억제하거나 저해할 수 있다.

(3) 본 발명의 핵산을 검출하는 방법

복합체를 형성하는 상기-언급된 방법에 기초하여, 본 발명은 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 더블-스트랜드 핵산을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 (1)에 기술된 키메라성 올리고뉴클레오티드는 키메라성 올리고뉴클레오 티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 더블-스트랜드 핵산과 복합체를 형성한다. 따라서, 키메라성 올리고뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 더블-스트랜드 핵산은 복합체 형성을 조사하여 검출될 수 있다.

이 구체예에서, 표지된 키메라성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 표지 형태와 관련하여 제한되는 바는 없다. 예를 들면, 방사선동위원소 (³²P 등), 염료, 형광물질, 발광물질, 다양한 리간드(바이오틴, 디곡시게닌 등), 효소 등을 사용할 수 있다. 표지된 키메라성 올리고뉴클레오티드의 존재는 상기 표지에 적절한 검출 방법에 의해 확인될 수 있다. 직접 검출할 수 없는 리간드의 경우, 리간드에 결합할 수 있고 검출가능한 표지로 표지화된 물질과의 배합물로 사용될 수 있다. 예를 들면, 리간드로 표지된 키메라성 올리코뉴클레오티드 및 배합물로서 표지된 항-리간드 항체를 사용하고, 시그날을 증폭시켜 고감도로 표적 핵산을 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 표적 핵산을 검출할 수 있는 방법은 상기 (2)에서 기술된 리보뉴클레아제 H의 존재하에 수행될 수 있다.

(4) 본 발명의 복제 기점을 형성하는 방법

본 발명의 복제 기점을 형성하는 방법은

(a) 더블-스트랜드 핵산 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 리보뉴클 레오티드, 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드이고 DNA 폴리머라제에 의해 그의 3' 말단으로부터 신장할 수 있고, 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 서열을 갖는다);

(b) 더블 스트랜드 핵산을 변성시키지 않는 조건하에서 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 올리고뉴클레오티드를 더블 스트랜드 핵산에 어닐링시키는 것을 포함한다.

본 발명의 복제 기점을 형성하는 방법에서 사용되는 더블 스트랜드 핵산 과 관련하여 특별히 제한되는 바는 없다. 상기 (2)에서 기술된 것중 어는 것을 사용할 수 있다. 또한, 상기 (2)에서 기술된 바와 같은 본 발명의 복합체를 형성하기 위하여 사용되는 조건을 사용할 수 있다.

상기 (1)에서 기술된 바와 같은 DNA 폴리머라제에 의해 그의 3' 말단으로부터 신장하도록 하는 키메라성 올리고뉴클레오티드는 더블-스트랜드 핵산과 복합체를 형성할 때 DNA 합성용 프라이머로서 사용될 수 있다. DNA 폴리머라제는 키메라성 올리고뉴클레오티드의 3' 말단으로부터 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나에 상보적이 DNA를 합성하여 DNA를 복제한다. 따라서, 복합체는 더블 스트랜드 핵산상에서 복제 기점으로서 작용한다.

본 발명에 따라, 키메라성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 따라 더블-스트랜드 핵산의 어느 위치에서 복제 기점을 형성할 수 있다. 형성되는 복제 기점의 수를 하나로 제한하고자 하는 것은 아니다. 다수의 키메라성 올리고뉴클레 오티드 프라이머를 사용하여 동시에 다수의 복제 기점을 형성할 수 있다.

추가로, 본 발명의 복제 기점을 형성하는 방법은 상기 (2)에 기술된 리보뉴클레아제 H의 존재하에서 수행될 수 있다.

(5) 본 발명의 핵산을 복제하는 방법

본 발명의 핵산을 복제하는 방법은 상기 (4)에 기술된 방법에 따라 더블 스트랜드 핵산상에서 형성된 복제 기점을 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드의 3' 말단으로부터 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나에 상보적인 DNA 스트랜드를 DNA 폴리머라제 작용에 의해 합성하여 달성된다.

DNA 합성은 프라이머로서 키메라성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 개시하고, 주형으로서 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드, 키메라성 올리고뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 스트랜드중에서 사용하여 진행된다.

본 발명의 핵산을 복제하는 방법에서 사용되는 DNA 폴리머라제는 주형으로서 DNA 스트랜드를 사용하여 새로운 DNA 스트랜드를 합성하는 활성을 갖는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다. 예를 들면, Pol I-type DNA 폴리머라제s (에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) DNA 폴리머라제 I, 클레나우(Klenow) 단편, Taq DNA 폴리머라제 등), α-형 DNA 폴리머라제 [피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터의(Stratagene), VENT DNA 폴리머라제 (New England Biolabs), KOD DNA 폴리머라제 (Toyobo), DEEP VENT DNA 폴리머라제 (New England Biolabs)] 및 비-α, 비-Pol I-type DNA 폴리머라제 (WO 97/24444에 기술된 바와 같은 DNA 폴리 머라제)를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 또한, 다수의 DNA 폴리머라제를 혼합하여 사용할 수 있다. 선형 더블 스트랜드 핵산을 복제하기 위하여 그의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제를 사용하는 것인 바람직할 수 있다.

DNA에 대하여 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. "스트랜드 치환 활성"은 스트랜드를 치환시킬 수 있는 활성, 즉, DNA 스트랜드를 치환하여 주형 스트랜드에 어닐링된 상보적인 스트랜드를 분리시키면서 주형으로서의 핵산의 서열에 기초하여 DNA를 복제할 수 있는 활성을 언급한다. 또한, 스트랜드 치환 결과로서 주형으로서 핵산 서열로부터 분리된 DNA 스트랜드를 "치환된 스트랜드"로서 언급한다.

하나의 바람직한 일면으로, 본 발명의 핵산을 복제하는 방법은 고온 조건(예: 45 내지 70℃)하에 수행된다. 이 일면으로, 열-내성 DNA 폴리머라제, 바람직하게 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax) 또는 바실러스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus)와 바실러스(Bacillus) 속의 고온성 박테리아로부터 유래된 DNA 폴리머라제 및 그의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제의 돌연변이를 사용한다. 이들 DNA 폴리머라제는 상기 언급한 스트랜드 치환 활성을 갖는다.

복제 반응은 DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 4개의 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 사용하고자 하는 효소에 적절한 반응 조건하에서 효소의 활성을 나타내기 위하여 요구되는 다른 성분을 포함하는 반응 혼합물중에서 수행될 수 있다. 보통, 조성물중 반응 혼합물중 각 성분의 농도, 반응 혼합물의 pH, 반응 온도, 반 응 시간 등을 사용하고자 하는 효소 및 복제하고자 하는 핵산에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

복제 반응 단계는 복제 기점 형성 단계후 연속하여 수행될 수 있다. 다르게는, 이 단계는 동시에 수행될 수 있다. 이 경우, 사용하고자 하는 DNA 폴리머라제 및 다른 효소(들)을 선택하고 반응 조건을 결정하여 그의 활성이 충분히 나타나도록 한다.

복제 반응 단계는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 리보뉴클레아제 H를 조합하여 사용하는 핵산 증폭 방법을 사용하여 연속적으로 수행될 수 있다. 상기 방법은 WO 00/56877에 기재되어 있고 상기 기술된 바와 같이 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 리보뉴클레아제 H를 사용하여 수행될 수 있다. 이 경우, 이 방법에 적절한 형태로 키메라성 올리고뉴클레오티드를 반드는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 복제 기점으로부터 핵산을 복제시켜 서로 마주 대하도록 위치한 두개의 복제 기점사이에 놓인 부위로부터 핵산 단편을 동시에 증폭시킬 수 있다. 본 발명은 이러한 일면을 포함한다.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하여 그의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

참고 실시예

피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) RNase HII 유전자 클로닝

(1) 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 게놈 DNA 제조

1% 트립톤(Difco Laboratories), 0.5% 효모 추출물(Difco Laboratories), 1% 가용성 전분 (Nacalai Tesque), 3.5% Jamarine S Solid (Jamarine Laboratory), 0.5% Jamarine S Liquid (Jamarine Laboratory), 0.003% MgSO₄, 0.001% NaCl, 0.0001% FeSO₄·7H₂0, 0.0001% CoSO₄, 0.0001% CaCl₂·7H ₂0, 0.0001% ZnSO₄, 0.1ppm CuSO₄·5H₂0, 0.1ppm KAI(SO₄)₂, 0.1ppm H₃BO ₄, 0.1ppm Na₂MoO₄·2H₂0, 및 0.25mM NiCl₂·6H₂0를 포함하는 2L 배지를 2L 배지용 병에 놓고, 20분동안 120 ℃에서 멸균하고 질소 가스로 버블링하여 산소를 제거한 후 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)(Deutsche Sammlung von Migrooranismen; DSM3638)을 배지내 접종하고 진탕하지 않고 16시간동안 95 ℃에서 배양하였다. 배양 후 세포를 원심분리에 의해 회수하였다.

생성된 세포를 4㎖의 25% 수크로오스, 및 50mM tris-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 물중 0.4㎖의 10mg/㎖의 리소자임 클로라이드(Nacalai Tesque)를 가하였다. 혼합물을 1시간동안 20 ℃에서 반응시켰다. 반응 후, 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 20mM tris-HCl(pH 8.0), 0.2㎖의 20mg/㎖ 프로테이나제 K(Takara Shuzo) 및 2㎖을 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액을 포함하는 24㎖의 혼합물을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 1시간동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후 혼합물을 페놀-클로로포름 추출후 에탄올 침전시켜 1mg의 게놈 DNA를 제조하였다.

(2) RNase HII 유전자 클로닝

피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshi)의 전장 게놈 서열이 공개되었다[DNA Research, 5:55-76 (1998)]. 게놈중 RNase HII(PH1650)의 동족체를 코딩하는 하나의 유전자의 존재가 공지되었다(서열번호:1, the home page of National Institute of Technology 및 Evaluation: http://www.nite.go.jp/).

PH1650 유전자 및 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)의 일부 공개된 게놈 서열 (the home page of University of Utah, Utah Genome Center: http://www.genome.utah.edu/sequence.html)의 상동성을 조사하였다. 결과 고도의 상동성 서열을 발견하였다.

프라이머 1650Nde (서열번호:2) 및 1650Bam (서열번호:3)을 상동 서열에 기초하여 합성하였다.

주형으로서 200ng의 참고 실시예 (1)에서 제조된 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 게놈 DNA, 및 프라이머로서 20pmol의 1650Nde 및 20pmol 1650Bam을 사용하여 100㎕의 용량으로 PCR을 수행하였다. Takara EX Taq(Takara Shuzo)를 첨부된 프로토콜에 따라 PCR를 위해 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 30초동안 94 ℃, 30초동안 55 ℃, 1분동안 72 ℃에서 30싸이클. 약 0.7kb의 증폭된 DNA 단편을 NdeI 및 BamHI(Takara Shuzo)로 분해하였다. 생성된 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pET3a(Novagen)중 NdeI 및 BamHI 사이트 사이에 삽입하여 플라스미드 pPFU220을 제조하였다.

(3) RNase HII 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 확인

참고 실시예 (2)에서 수득한 pPFU220 내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 방법에 의해 확인하였다.

확인된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HII를 코딩하는 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임의 존재를 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 4에 나타낸다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase H의 아미노산 서열을 서열번호 5에 나타낸다.

플라스미드 pPFU220로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pPFU220로 명명하고 2000년 월 5일(원기탁일)에 기탁번호 BP-7654하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다.

(4) 정제된 RNase HII 샘플의 제조

에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3) (Novagen)을 참고 실시예 (2)에서 수득한 pPFU220으로 형질전환시켰다. pPFU220을 포함하는 생성된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HMS174(DE3)을 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 2L의 LB 배지내로 접종하고 37 ℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 66.0㎖의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상층액을 15분동안 60 ℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 따라서, 61.5㎖의 가열된 상층액을 수득하였다.

가열된 상층액을 완충액 A[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase HII는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.

60.0㎖의 이동(flow-through) RNase HII 분획을 완충액 A으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 0 내지 500mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 150mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다.

2.0㎖의 RNase H 분획을 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA을 포함하는 50mM tris-HCl(pH 8.0)으로 평형화된 Superdex 200 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase HII가 분자량 17킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase HII의 것과 일치한다.

용리된 RNase HII를 Pfu RNase HII 샘플로서 사용하였다.

수득한 Pfu RNase HII 샘플의 효소 활성을 하기와 같이 측정하였다.

10mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM 디티오트레이티올(Nacalai Tesque), 0.003% 소 혈청 알부민(분획 V, Sigma), 4% 글리세롤, 20μg/㎖ poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech) 및 30μg/㎖ poly(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)를 함께 혼합하였다.혼합물을 10분동안 37 ℃에서 인큐베이션시키고 RNase H 활성 측정을 위한 기질 용 액으로서 사용하였다.

1㎕의 1M MnCl₂의 100㎕의 기질 용액에 가하였다. 혼합물을 40 ℃에서 인큐베이션시켰다. 10㎕의 세포 원추출물의 10배 희석액을 혼합물에 가하여 반응을 개시시켰다. 30분동안 40 ℃에서 반응시킨 후, 10㎕의 0.5M EDTA를 가하여 반응을 종결시켰다. 260nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과, Pfu RNase HII 샘플을 가한 반응 혼합물에 대하여 관찰된 260nm에서의 흡광도는 Pfu RNase HII 샘플을 가하기 전 10㎕의 0.5M EDTA를 가한 반응 혼합물에 대하여 관찰된 것보다 높았다. 따라서, 이 샘플이 RNA HII 활성을 갖는다고 나타났다.

실시예 1

(1) 1.5 x 10⁵ 세포/㎖의 농도로 10% 우태아 혈청(Gibco)를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (Bio Whittaker, 12-604F)중에 RAW264.7 세포 (ATCC TIB 71)를 현탁시켰다. 5㎖의 현탁액을 6-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 가하고 5% CO₂ 존재하에 밤새도록 37℃에서 인큐베이션시켰다. 물중 100μg/㎖의 리로폴리사카라이드(LPS, Sigma, L-2012) 용액 50㎕ 및 물중 1000U/㎕의 인터페론-γ(INF-γ, Genzyme Techne, 3485) 용액 50㎕을 웰에 가하였다. 플레이트를 추가의 4시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 키트에 첨부된 안내서에 따라 RNeasy Mini Kit(Qiagen)을 사용하여 세포로부터 RNA를 제조하였다.

3μg의 제조된 RNA, 10mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 8.3), 50mM KCl, 5mM MgCl₂, 1mM 각 dNTPs, 150pmol의 무작위 6mers 프라이머, 60U의 리보뉴클레아제 저해제(Takakra Shuzo, 2310A) 및 15U의 역전사효소 XL(AMV)(Takakra Shuzo, 2620A)을 포함하는 60㎕의 혼합물을 30℃에서 10분, 42℃에서 1시간, 이어서 99℃에서 5분동안 인큐베이션하여 써말 사이클러(GeneAmp PCR System 9600, Applied Biosystems)을 사용하여 효소를 불활성화시켜 cDNA를 제조하였다.

(2) 서열번호 6 및 7로 각각 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머 NS-PCR1 및 NS-PCR2를 마우스 유도 NO 신타아제(iNOS)(GeneBank 수탁번호 NM-010927)의 mRNA의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 주형으로서 실시예 1-(1)에서 제조된 cDNA 및 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하여 741-bp DNA 단편을 증폭시켰다. 단편을 Suprec02 (Takara Shuzo)을 사용하여 정제한 후 하기 시험에 사용하였다.

(3) 서열번호 8 및 9로 각각 나타낸 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 마우스 유도 NO 신타아제의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다.

10 fg 내지 100pg/㎕의 농도로 실시예 1-(2)에서 수득한 PCR-증폭 DNA 단편 포함하는 1㎕의 용액 또는 물(음성 대조군), 50pmol의 각 프라이머 NS5 및 NS6, 0.5mM dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% 소 혈청 알부민, 1.0% 디메틸 설폭시드, 참고 실시예에서 제조된 0.0156μg Pfu RNase HII 및 1U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 50㎕의 혼합물을 써말 사이클러에서 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다.

반응 후, 5㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분석하였다. 전기영동 사진을 도 1에 나타낸다.

도 1은 반응 산물의 전기영동 사진이다. 레인 1: 100bp DNA 래더 마커; 레인 2: 음성 대조군(물); 레인 3: 10fg의 주형; 레인 4: 100fg의 주형; 레인 5: 1pg의 주형, 레인 6: 10pg의 주형; 레인 7: 100pg의 주형.

도 1에 나타낸 바와 같이, 1pg 이상의 주형을 반응에서 사용할 때 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 사이의 주형 부위에 상응하는 DNA 단편이 증폭되었음을 보였다. 이 결과는 주형 DNA을 변성시키기 않고도 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이 주형 DNA에 어닐링한 결과로서 복제 기점이 형성된다는 것을 나타내고, DNA 폴리머라제가 복제 기점으로부터 DNA 합성에 작용하여 복제 기점사이의 DNA 단편을 증폭시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 2

(1) 3' 말단에 3개의 RNA 잔기를 갖는 각각의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 pDON-AI-1 및 pDON-AI-2를 플라스미드 pDON-AI DNA (Takara Shuzo)중 패키징 부위의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 이들 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 10 및 11에 나타낸다.

(2) 10 fg 내지 1ng/㎕의 농도로 pDON-AI DNA(환형)을 포함하는 1㎕의 용액 또는 물(음성 대조군), 50pmol의 각 프라이머 pDON-AI-1 및 pDON-AI-2, 0.5mM dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4mM 아세트산마그네슘, 0.01% 소 혈청 알부민, 1.0% 디메틸 설폭시드, 참고 실시예에서 제조된 0.0156μg Pfu RNase H 및 1U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 50㎕의 혼합물을 써말 사이클러에서 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다.

5㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분석하였다. 결과를 도 2에 나타낸다.

도 2는 반응 산물의 전기 영동 사진이다. 레인 1: 100bp DNA 래더 마커; 레인 2: 음성 대조군(물); 레인 3: 10fg의 주형; 레인 4: 100fg의 주형; 레인 5: 1pg의 주형, 레인 6: 10pg의 주형; 레인 7: 100pg의 주형: 레인 8: 1ng의 주형.

도 2에 나타낸 바와 같이, 10fg 이상의 주형을 사용할 때 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 사이의 부위에 일치하는 DNA 단편을이 증폭되었다. 따라서 복제 기점이 RNase H 및 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 환형 DNA 분자 상에서 형성됨을 보여주었다.

실시예 3

(1) 3' 말단에 3개의 RNA 잔기를 갖는 각각의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 SEA-1 및 SEA-2를 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 엔테로톡신 A 유전자 부위의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. 프라이머 SEA-1는 센스 프라이머고, 프라이머 SEA-2는 안티센스 프라이머이다. 프라이머 SEA-1 및 SEA-2의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 12 및 13에 각각 나타낸다. (2) 0.115ng 또는 1.15ng의 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 게놈 DNA를 포함하는 1㎕의 용액 또는 음성 대조군용으로 1㎕의 물, 50pmol의 각 프라이머 SEA-1 및 SEA-2, 0.5mM dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4mM 아세트산마그네슘, 0.01% 소 혈청 알부민, 1.0% 디메틸 설폭시드, 참고 실시예에서 제조된 0.0156μg Pfu RNase H 및 1U BcaBEST DNA 폴리머라제를 포함하는 50㎕의 혼합물을 써말 사이클러에서 1시간동안 58℃에서 인큐베이션시켰다.

5㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분석하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.

도 3은 반응 산물의 전기 영동 사진이다. 레인 1: 100bp DNA 래더 마커; 레인 2: 음성 대조군(물); 레인 3: 0.115ng의 주형; 레인 4: 1.15ng의 주형. 1.15ng의 주형 DNA를 반응에 사용할 때 특정 증폭 산물이 생성되었음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 게놈 DNA상에서 복제 기점을 형성할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 4

(1) 인산칼슘 방법에 따라 벡터 플라스미드 pDON-AI가 패키징 세포 GPE-86(ATCC CRL 9642)내로 삽입된 배양 상층액으로부터 동종숙주역의 레트로바이러스의 제조하였다. NIH/3T3 세포(ATCC CRL-1658)를 상기 레트로바이러스로 감염시키고 14일동안 G418을 포함하는 배지중에서 배양하여 형질전환된 세포를 제조하였다. 통상의 방법에 따라 27μg의 게놈 DNA를 4 x 10⁴의 레트로바이러스-감염 세포로부터 제조하였다.

(2) 프라이머의 제조

각각 3' 말단에 3개의 RNA 염기를 갖는 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 pDON-AI-68-1 (센스 프라이머) 및 pDON-AI-68-2 (안티센스 프라이머)를 플라스미드 pDON-AI의 패키징 부위의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. pDON-AI-68-1 및 pDON-AI-68-2의 뉴클레오티드 서열을 각각 서열 번호 14 및 15에 나타낸다.

(3) 주형을 변성시키지 않는 DNA 단편의 증폭

10fg 또는 1ng의 pDON-AI를 포함하는 1㎕의 용액, 1ng, 10ng 또는 100ng의 pDON-AI이 삽입된 NIH/3T3 세포로부터의 게놈 DNA를 포함하는 1㎕의 용액, 또는 또는 음성 대조군용으로 1㎕의 물, 상기 실시예 4-(2)에서 제조된 50pmol의 각 프라이머, 0.5mM dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4mM 아세트산마그네슘, 0.01% 소 혈청 알부민, 1.0% 디메틸 설폭시드, 참고 실시예에서 제조된 18.5U의 Pfu RNase HII 및 4U BcaBEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 포함하는 50㎕의 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 써말 사이클러에서 1시간동안 64℃에서 인큐베이션시켰다.

반응 후, 반응 산물을 확인하기 위하여 5㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분석하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.

도 4는 반응 산물의 전기 영동 사진이다. 레인 M: 100bp DNA 래더 마커; 레인 1: 음성 대조군(물); 레인 2: 10fg의 주형으로서 pDON-AI; 레인 3: 1ng의 주형으로서 pDON-AI; 레인 4: 1ng의 주형으로서 pDON-AI를 갖는 NIH/3T3 세포로부터의 게놈 DNA; 레인 5: 10ng의 주형으로서 pDON-AI를 갖는 NIH/3T3 세포로부터의 게놈 DNA; 및 레인 6: 100ng의 주형으로서 pDON-AI를 갖는 NIH/3T3 세포로부터의 게놈 DNA.

도 4에 나타낸 바와 같이, pDON-AI 또는 통합된 pDON-AI를 포함하는 게놈 DNA를 사용한 단편의 특정 증폭이 관찰되었따. 따라서, 게놈 DNA를 주형으로서 사용하는 경우에서 반응에 앞서 주형 DNA를 변성시키지 않고 관심의 대상이 되는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있음을 보여주었다.

실시예 5

(1) 키메라성 올리고뉴클레오티드 및 프라이머의 합성

3' 말단에 3개의 RNA 잔기를 갖고 5' 말단에 X-로다민 이소티오시아네이트(XRITC) 로 표지된 키메라성 올리고뉴클레오티드 k-ras-X 를 작제하고 인간 c-Ki-ras 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 합성하였다. k-ras-X의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 16에 나타낸다.

프라이머 ras-F (센스) 및 ras-R (안티센스)을 주형으로서 사용하고자 하는 PCR 단편의 제조를 위한 PCR용 프라이머쌍으로서 합성하였다. ras-F 및 ras-R의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 17 및 18에 각각 나타낸다.

(2) 키메라성 올리고뉴클레오티드과 주형의 반응

주형으로서 1㎕의 인간 게놈 DNA 및 프라이머 ras-F 및 ras-R를 사용하여 PCR을 수행하여 k-ras-X에 상보적인 서열을 갖는, 주형으로서 사용하고자 하는 DNA 단편을 합성하였다. 270 ng의 이 DNA 단편 및 25 pmol의 k-ras-X를 포함하는 하기의 조성물을 갖는 50㎕의 반응 혼합물을 제조하였다: 0.5 mM 각각의 dNTPs, 32mM HEPES-수산화칼륨 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4mM 아세트산마그네슘, 0.01% 소 혈청 알부민, 1.0% 디메틸 설폭시드. 반응 혼합물을 써모 사이클러에서 5분간 52 ℃에서 인큐베이션시켰다. k-ras-X에 상보적인 서열이 없는 200-bp PCR 증폭 단편을 반응 혼합물에 가하여 음성 대조군을 제조하고 유사한 방식으로 인큐베이션시켰다.

20㎕의 반응 혼합물을 5%의 변성되지 않은 폴리아크릴아미드상에서 전기영동시켰다. 전기영동 후, FMBIO-II Multi-View (Takara Shuzo)을 사용하여 겔을 분석하여 k-ras-X의 전기영동상의 위치를 확인하였다. 결과, 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편과 인큐베이션한 경우, k-ras-X로부터의 형광은 DNA 단편의 크기에 일치하는 전기영동 위치에서 관찰되었고, 이로써 키메라성 올리고뉴클레오티드가 DNA 단편과 복합체를 형성하였음을 확인하였다. 한편, 음성 대조군에 대해서는 프라이머가 DNA 단편에 결합된 바 없었다. 따라서, DNA 단편에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴클레오티드가 효소-독립적 방식을 DNA 단편을 변성시키지 않고 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합한다는 것을 보여주었다.

산업상 이용가능성

본 발명은 복제 기점 on a 핵산 분자상에서 복제 기점을 인공적으로 형성하고 복제 기점을 사용하여 핵산 분자를 복제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따라, 핵산 분자를 벡터내로 삽입시키지 않고 이를 시험관내에서 용이하게 복제할 수 있다. 또한, 복제 기점은 자유자제로 위치할 수 있기 때문에 핵산의 필요한 부위만 특이적으로 복제할 수 있거나, 동시에 다수의 복제 기점으로부터 복제 반응을 수행할 수 있다.

서열 목록 프리 텍스트

서열번호:2: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 RNase HII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 코딩하기 위한 PCR 프라이머 1650Nde

서열번호:3: 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 RNase HII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 코딩하기 위한 PCR 프라이머 1650Bam

서열번호:6: 마우스로부터 iNOS-코딩 서열 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드

서열번호:7: 마우스로부터 iNOS-코딩 서열 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드

서열번호:8: 마우스로부터 iNOS-코딩 서열 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 21 내지 23은 리보뉴클레오티드이고-나머지 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"

서열번호:9: 마우스로부터 iNOS-코딩 서열 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 19 내지 22은 리보뉴클레오티드이고-나머지 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"

서열번호:10: 플라스미드 pDON-AI를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 17 내지 19은 리보뉴클레오티드이고-나머지 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".

서열번호:11: 플라스미드 pDON-AI를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-나머지 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".

서열번호:12: 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 게놈 DNA 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-나머지 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".

서열번호:13: 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 게놈 DNA 부위를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드. "뉴클레오티드 19 내지 21은 리보뉴클레오티드이고-나머지 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다".

　　　　　　　　　　　　　 <110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> Method for formation of complex <130> 662808 <150> JP 2000-284420 <151> 2000-09-19 <150> JP 2001-139286 <151> 2001-05-09 <150> JP 2001-177537 <151> 2001-06-12 <160> 18 <210> 1 <211> 663 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 1 atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60 ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120 tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180 gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240 aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300 aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360 gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420 gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480 caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540 gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600 gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660 tga 663 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus <400> 2 caggaggaga gacatatgaa aataggggga att 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus <400> 3 gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta 33 <210> 4 <211> 672 <212> DNA <213> Pyrococcus furiosus <400> 4 atgaaaatag ggggaattga cgaagcagga agaggaccag cgatagggcc attagtagta 60 gctactgtcg tcgttgatga gaaaaacatt gagaagctca gaaacattgg agtaaaagac 120 tccaaacaac taacacccca tgaaaggaag aatttatttt cccagataac ctcaatagcg 180 gatgattaca aaatagtgat agtatcccca gaagaaatcg acaatagatc aggaacaatg 240 aacgagttag aggtagagaa gtttgctctc gccttaaatt cgcttcagat aaaaccagct 300 cttatatacg ctgatgcagc ggatgtagat gccaatagat ttgcaagctt gatagagaga 360 agactcaatt ataaggcgaa gattattgcc gaacacaagg ccgatgcaaa gtatccagta 420 gtttcagcag cttcaatact tgcaaaggtt gttagggatg aggaaattga aaaattaaaa 480 aagcaatatg gagactttgg ctctgggtat ccaagtgatc caaaaaccaa gaaatggctt 540 gaagagtact acaaaaaaca caactctttc cctccaatag tcagacgaac ctgggaaact 600 gtaagaaaaa tagaggaaag cattaaagcc aaaaaatccc agctaacgct tgataaattc 660 tttaagaaac ct 672 <210> 5 <211> 224 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 5 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile 1 5 10 15 Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile 20 25 30 Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr 35 40 45 Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala 50 55 60 Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn 65 70 75 Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu 80 85 90 Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp 95 100 105 Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg 110 115 120 Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp 125 130 135 Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val 140 145 150 Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp 155 160 165 Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu 170 175 180 Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg 185 190 195 Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala 200 205 210 Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 215 220 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS- encoding sequence from mouse <400> 6 cacaaggcca catcggattt c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS- encoding sequence from mouse <400> 7 tgcataccac ttcaacccga g 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chmeric oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS-encoding sequence from mouse. “nucleotides 21 to 23 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 8 ctcatgccat tgagttcatc aac 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chmeric oligonucleotide primer to amplify a portion of iNOS-encoding sequence from mouse. “nucleotides 19 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 9 gctggtaggt tcctgttgtu uc 22 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chmeric oligonucleotide primer to amplify a portion of plasmid pDON-AI. “nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 10 agctctgtat ctggcggac 19 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chmeric oligonucleotide primer to amplify a portion of plasmid pDON-AI. “nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 11 gatcgggatt tttggactca g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chmeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Genomic DNA of Staphylococcus aureus. “nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 12 tgtatgtatg gtggtgtaac g 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chmeric oligonucleotide primer to amplify a portion of Genomic DNA of Staphylococcus aureus. “nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 13 taaccgtttc caaaggtacu g 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chmeric oligonucleotide primer to amplify a portion of plasmid pDON-AI. “nucleotides 20 to 22 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 14 actagctctg tatctggcgg ac 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chmeric oligonucleotide primer to amplify a portion of plasmid pDON-AI. “nucleotides 21 to 23 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 15 acgatcggga tttttgcact cag 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed chmeric oligonucleotide complementary to human ki-ras gene. “nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 16 gactgaatat aaacttgugg 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human ki-ras gene. <400> 17 tgacatgttc taatatagtc ac 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify a portion of human ki-ras gene. <400> 18 actcatgaaa atggtcagag 20 ６６２８０８ 10/10

Claims

a) 하나의 더블-스트랜드 핵산 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 및 (α-S) 리보뉴클레오티드로 구성된 그룹에서 선택된 멤버를 3' 말단 또는 3'-말단측상에 포함하고, 데옥시리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹에서 선택된 멤버를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드이고 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드 중 하나의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는다);

(b) 더블-스트랜드 핵산이 싱글 스트랜드로 변성되지 않는 조건인 0 내지 70℃ 온도 및 6.0 내지 9.5의 pH 하에서, 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 더블 스트랜드 핵산 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 복합체를 형성하는 방법.
제 1항에 있어서, 더블-스트랜드 핵산이 선형 DNA, 환형 DNA 및 게놈 DNA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산인 방법.
제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나에 상보적인 DNA를 합성하기 위한 프라이머로서 작용할 수 있는 방법.
제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 표지된 방법.
(a)제 1항에 의해 정의된 방법에 따라 더블-스트랜드 핵산 및 올리고뉴클레오티드로 구성된 복합체를 형성하고(여기에서, 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 및 (α-S) 리보뉴클레오티드로 구성된 그룹에서 선택된 멤버를 3' 말단 또는 3'-말단측상에 포함하고, 데옥시리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹에서 선택된 멤버를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드이고 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드 중 하나의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는다);

(b) 복합체를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것을 포함하는, 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 더블-스트랜드 핵산을 검출하는 방법.
(a) 하나의 더블-스트랜드 핵산 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고(여기에서, 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 및 (α-S) 리보뉴클레오티드로 구성된 그룹에서 선택된 멤버를 3' 말단 또는 3'-말단측상에 포함하고, 데옥시리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹에서 선택된 멤버를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드이고 더블 스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드 중 하나의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 갖는다);

(b) 더블-스트랜드 핵산이 싱글 스트랜드로 변성되지 않는 조건인 0 내지 70℃ 온도 및 6.0 내지 9.5의 pH 하에서, 반응 혼합물을 인큐베이션시켜 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 더블-스트랜드 핵산상에서 복제 기점을 형성하는 방법.
제 6항에 있어서, 더블-스트랜드 핵산이 선형 DNA, 환형 DNA 및 게놈 DNA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산인 방법.
DNA 폴리머라제의 존재하에 제 6항에 정의된 방법에 따라 형성된 복제 기점으로부터 더블-스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나에 상보적인 DNA를 합성하는 것을 포함하는 핵산을 복제하는 방법.
제 8항에 있어서, DNA 폴리머라제가 스트랜드 치환 활성을 갖는 효소인 방법.