JPWO2002024901A1 - 複合体の形成方法 - Google Patents
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Abstract
二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体の形成方法であって、二本鎖核酸および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、前記二本鎖核酸の一方の鎖の塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および前記二本鎖核酸が変性しない条件下、反応混合物をインキュベートし、複合体を形成させる工程；を包含することを特徴とする二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体の形成方法。
Description
技術分野
本発明は、遺伝子工学分野において有用な二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体の形成方法、核酸の複製開始点の創成方法、ならびに核酸の複製方法に関する。
背景技術
分子生物学分野の研究の進展は種々の研究手法をもたらした。特に核酸のハイブリダイゼーション技術は、目的の核酸の検出、定量を可能にする極めて有用な手法であり、分子生物学分野にとどまらないさまざまな分野で、また、各々の目的に応じた形で利用されている。
ハイブリダイゼーションは、基本的には互いに相補的な一本鎖核酸同士が塩基対を形成する反応である。したがって、二本鎖核酸と一本鎖核酸、もしくは二本鎖核酸同士のハイブリダイゼーションにおいては、まず二本鎖核酸を２つの一本鎖に分離（変性）する必要がある。変性の方法としては加熱やアルカリ処理が使用されるが、これらの処理はタンパク質などの存在下、その活性を失わずに実施することはできない。
また、二本鎖核酸を使用するハイブリダイゼーションでは、その過程である頻度でもとどおりの二本鎖核酸が形成されることは避けられない。
変性しない二本鎖核酸と一本鎖核酸との間で三本鎖核酸（ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ）を形成させることが可能であることが知られている［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１６巻、１１４３１〜１１４４０頁（１９８８）］。しかしながら、このような三本鎖形成は特定の配列、すなわち高プリン含量の配列と高ピリミジン含量の配列から形成された二本鎖核酸領域に限って適用可能な方法である。
相同組換えに関与するＲｅｃＡタンパク質の存在下、非変性条件下で二本鎖核酸と一本鎖核酸との複合体が形成されることが知られている。しかしながらこの現象はＲｅｃＡタンパク質の有する活性に基づくものであり、非酵素的に同様の複合体を形成させる技術は知られていない。
一方、遺伝子工学分野の研究においては、単離された核酸分子を維持、もしくは増幅させる技術が不可欠である。通常、上記の目的は単離された核酸を適当なベクターに挿入して組換えＤＮＡ分子とすることによって達成される。このような組換えＤＮＡ分子は単離された状態、あるいは適切な宿主に保持された状態で安定に維持することができる。また、必要に応じてこの組換えＤＮＡ分子を保持する宿主を培養し、その細胞数を増加させることで分子数を増加させることができる。
上記のベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス等に由来するものが数多く知られており、また、使用の目的に応じてさまざまな機能が人為的に付与されたものが開発され、市販されている。
しかし、ベクターを使用する遺伝子の維持、増幅には宿主の利用が不可欠である。このため、例えば目的とする核酸分子が宿主に対して有害であるような場合、例えば宿主に致死的な産物をコードする遺伝子を含有しているような場合には目的の核酸分子をベクターに組み込ませた組換えＤＮＡ分子を作成することが困難である。
組換えＤＮＡ分子を宿主細胞の外、すなわちインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で複製することにより、宿主を介することなく目的の核酸分子を増幅することが考えられる。しかしながら、公知のベクターはすべて一定の複製開始点より固有のメカニズムによって複製されており、汎用性のある、人工的な核酸分子の複製手段は知られていない。
発明の目的
本発明の目的は、変性処理を伴うことなく二本鎖核酸と一本鎖核酸からなる複合体を形成する方法、ならびに宿主生物を使用することなく、汎用性があり、かつ簡便な核酸分子の複製方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドが変性処理されていない二本鎖核酸にアニーリングし、インビトロで複合体を形成すること、このような複合体が当該核酸の複製開始点として機能することを見い出した。さらにこの複製開始点より当該核酸が複製され得ることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１の発明は、二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体の形成方法であって、
（ａ）二本鎖核酸および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、前記二本鎖核酸の一方の鎖の塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記二本鎖核酸が変性しない条件下、反応混合物をインキュベートし、複合体を形成させる工程；
を包含することを特徴とする。
第１の発明において使用される二本鎖核酸としては直鎖状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが例示される。
また、オリゴヌクレオチドは上記二本鎖核酸の一方の鎖に相補的なＤＮＡ合成のプライマーとして機能し得るもの、および／または標識されたものであってもよい。
本発明の第２の発明は、標的とする塩基配列を有する二本鎖核酸を検出する方法であって、
（ａ）第１の発明の方法により二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体を形成させる工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、標的とする塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記複合体を形成するオリゴヌクレオチドを検出する工程；
を包含することを特徴とする。
本発明の第３の発明は、二本鎖核酸の複製開始点の創成方法であって、
（ａ）二本鎖核酸および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、その３’末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能であり、さらに前記二本鎖核酸の一方の鎖の塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記二本鎖核酸が変性しない条件下、反応混合物をインキュベートし、複合体を形成させる工程；
を包含することを特徴とする。
第３の発明において使用される二本鎖核酸としては直鎖状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが例示される。
本発明の第４の発明は、核酸の複製方法であって、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、第３の発明の方法により創製された複製開始点より二本鎖核酸の一方の鎖に相補的なＤＮＡ合成を行う工程を包含することを特徴とする。
第４の発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては鎖置換活性を有する酵素が例示される。
発明の詳細な説明
本明細書において二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体とは、二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドが非共有結合的に結合した複合体を言うが、その形態に特に限定はなく、例えば、三本鎖核酸を形成したものや、二本鎖核酸の一方の鎖のみとオリゴヌクレオチドが塩基対を形成した状態のものを包含する。以下、二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体を単に「複合体」と記載することがある。
本明細書においてヌクレオチドとは、通常、デオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドである。必要に応じ、ヌクレオチドのアナログや誘導体（修飾物）を含有することができる。
本明細書においてデオキシリボヌクレオチドとは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、塩基部分に７−デアザグアノシン、イノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
本明細書においてリボヌクレオチドとは、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドにはリボヌクレオチドのアナログ、修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド］も含まれる。
本明細書において複製開始点とは、二本鎖核酸の複製、すなわち該核酸の塩基配列を有するＤＮＡの合成の反応開始点として機能しうる部位をいい、特定の塩基配列によって特徴づけられる部位に限定されるものではない。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチド
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドである。該キメラオリゴヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドのアナログ、デオキシリボヌクレオチドのアナログから選択される１以上を含有するオリゴヌクレオチドも含まれる。
本発明に使用されるヌクレオチドのアナログとしては、例えば塩基部分にイノシン、７−デアザグアニン等の塩基を有するヌクレオチドアナログ、ＬＮＡ［Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９７巻、第５６３３〜５６３８頁（２０００年）、国際公開第９９／１４２２６号パンフレット］のようなリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログを使用することができる。また、修飾ヌクレオチドとしては、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）ヌクレオチドや標識化合物が付加されたヌクレオチドなどが例示される。さらに、本発明のキメラオリゴヌクレオチドはペプチド核酸［ＰＮＡ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３６５巻、第５６６〜５６８頁（１９９３年）］を含有するものであってもよい。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドは、目的とする二本鎖核酸と複合体を形成し得るものであれば特に限定はない。リボヌクレオチドが含有される位置にも特に限定はないが、例えば該プライマーの３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドが配置されたものを使用することができる。また、その数にも特に限定はなく、例えば、構成塩基の１／２以下がリボヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレオチドが例示される。
本明細書において３’末端側とは、核酸、例えばオリゴヌクレオチドにおいてその中央より３’末端にかけての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸においてその中央より５’末端にかけての部分を指す。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、該キメラオリゴヌクレオチドと複合体を形成する二本鎖核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有するものである。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、核酸が二本鎖形態を取りうる条件、例えば、本発明が実施される条件において前記二本鎖核酸の一方の鎖にアニーリング可能な塩基配列を意味する。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、例えば、１２ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチドが挙げられる
ヌクレオチドアナログのキメラオリゴヌクレオチドへの導入は、キメラオリゴヌクレオチド自身の高次構造形成を抑制する観点からも有効である。また、ＬＮＡのような強い塩基対結合を形成しうるヌクレオチドアナログの導入は、より高い効率での複合体の形成に有用である。
これらのキメラオリゴヌクレオチドは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
（２）本発明の複合体の形成方法
本発明は、上記（１）に記載されたキメラオリゴヌクレオチドと、該キメラオリゴヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列を有する二本鎖核酸とから構成される複合体の形成方法を提供する。
本発明の方法に使用される二本鎖核酸には特に限定はなく、直鎖状、環状のものに適用することができ、例えば、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、これらの断片、ＰＣＲ法などによって増幅されたＤＮＡ断片等に複製開始点を創成することができる。また、天然の核酸、人為的に作製された核酸のいずれであっても本発明の方法を適用できる。
本発明においては、二本鎖核酸を一本鎖に変性する処理を行うことなく、（１）に記載されたキメラオリゴヌクレオチドと二本鎖核酸とを適切な条件において混合するのみで、インビトロで複合体を形成させることが可能である。その条件には特に限定はないが、通常、使用される二本鎖核酸が一本鎖に変性しない条件が使用される。例えば、０〜７０℃の温度範囲、ｐＨ６．０〜９．５、好ましくはｐＨ７．０〜９．２の条件で複合体が形成されうる。
複合体の形成を行う反応液は、適切なｐＨを保つための緩衝成分、イオン強度を調整するための中性塩やその他の成分を含むことができる。また、形成された複合体に作用させるための酵素類や該酵素の活性の発現に必要な各種成分を含有していてもよい。さらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、および／またはホルムアミド等の添加により、キメラオリゴヌクレオチドの非特異的なアニーリングの軽減が期待される。
使用するキメラオリゴヌクレオチドの量には特に限定はないが、例えば、反応液量５０μｌ当たり１ｐｍｏｌ〜１０００ｐｍｏｌの範囲で使用することができ、特に１０ｐｍｏｌ〜１５０ｐｍｏｌの範囲が好ましい。
本発明の方法により形成された複合体を使用し、キメラオリゴヌクレオチドの３’末端からＤＮＡ合成を行うことによって、二本鎖核酸の一方の鎖に相補的な配列を有するＤＮＡ鎖を合成することができる。この場合には、ＤＮＡポリメラーゼ、基質となるデオキシヌクレオチド３リン酸、マグネシウム塩等を含む反応液中で前記複合体を形成させ、同時にＤＮＡ合成を実施することが可能である。
本発明を特に限定するものではないが、本発明の複合体の形成方法はリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）の共存下に実施することができる。本発明には常温性から耐熱性のリボヌクレアーゼＨのいずれもが好適に使用できる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲＮａｓｅＨの他、例えば市販のＨｙｂｒｉｄａｓｅＴＭ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＲＮａｓｅＨ（エピセンターテクノロジーズ社製）や、好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍａｓ）属細菌、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属細菌等由来のＲＮａｓｅＨを使用することができる。さらに、該リボヌクレアーゼは、天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。本発明には、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の耐熱性ＲＮａｓｅＨが好適に使用できる。当該ＲＮａｓｅＨはピロコッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８より得ることができ、また、下記の参考例に示すように、該酵素をコードする遺伝子を利用して得ることもできる。
リボヌクレアーゼＨの共存下での本発明の態様においては、使用されるリボヌクレアーゼＨがその活性を有する反応液中での実施が好適である。
反応液は、使用するＲＮａｓｅＨの種類にもよるが、通常、適切な緩衝成分とマグネシウム塩および／またはマンガン塩を含有するものが使用される。マグネシウム塩／マンガン塩としては、特に限定はないが、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガンあるいは硫酸マンガンが好適に使用でき、その濃度は、最終濃度で１ｍＭ〜２０ｍＭ、特に好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。緩衝成分としては、例えば、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、トリス（Ｔｒｉｓ）、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）を含有する反応液を使用することができる。また、該緩衝成分の最終濃度は特に限定するものではないが、５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨ６．０〜９．５、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．２の範囲のものが使用される。
なお、本発明は複合体の形成のみに限定されるものではなく、変性操作を伴わずに前記複合体を形成させる工程を包含する種々の操作を包含する。
本発明の複合体の形成方法を利用することにより、後述する核酸の検出を行うことができる。また、特定の機能を有する核酸上の領域、例えばプロモーター領域において複合体を形成させることにより、当該機能を抑制、もしくは阻害することが可能である。
（３）本発明の核酸の検出方法
本発明は、上記の複合体の形成方法に基づいて標的とする塩基配列を有する二本鎖核酸を検出する方法を提供する。
上記（１）に記載されたキメラオリゴヌクレオチドは、該キメラオリゴヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列を有する二本鎖核酸と複合体を形成する。したがって、前記複合体の形成を調べることにより、当該キメラオリゴヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列を有する二本鎖核酸を検出することができる。
上記の態様においては、標識されたキメラオリゴヌクレオチドの使用が好適である。標識の種類には限定はなく、例えば放射性同位体（３２Ｐ等）、色素、蛍光物質、発光物質、種々のリガンド（ビオチン、ジゴキシゲニン等）、酵素等が使用できる。標識されたキメラオリゴヌクレオチドは当該標識に応じた検出方法でその存在を確認することができる。直接検出できないリガンドの場合には、検出可能な標識を付されたリガンド結合性の物質と組み合わせればよい。例えば、リガンド標識したキメラオリゴヌクレオチドと酵素標識した抗リガンド抗体とを組み合せ、シグナルを増幅することによって標的核酸を高感度に検出することが可能である。
さらに、本発明の標的核酸の検出方法は、前記（２）に記載されたようなリボヌクレアーゼＨの存在下に実施することもできる。
（４）本発明の複製開始点の創成方法
本発明の複製開始点の創成方法は、
（ａ）二本鎖核酸および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、その３’末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能であり、さらに前記二本鎖核酸の一方の鎖の塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記二本鎖核酸が変性しない条件下、反応混合物をインキュベートし、二本鎖核酸にオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程；
を包含することを特徴とする。
本発明の複製開始点の創成方法に使用される二本鎖核酸には特に限定はなく、上記（２）に記載されたもののいずれもが使用できる。また、反応条件も、上記（２）の本発明の複合体の形成方法に用いられるものが使用できる。
上記（１）の３’末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能なキメラオリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸との間で複合体を形成した場合にはＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成のプライマーとなることができる。ＤＮＡポリメラーゼは当該キメラオリゴヌクレオチドの３’末端から二本鎖核酸の一方の鎖に相補的なＤＮＡを合成しすることにより、ＤＮＡを複製する。すなわち、前記複合体は二本鎖核酸の複製起点として機能する。
本発明によれば、キメラオリゴヌクレオチドの塩基配列に応じて、二本鎖核酸上の任意の部位に複製開始点を創成することができる。また、創成される複製開始点は１ヶ所に限定されるものではなく、複数種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、複数の複製開始点を同時に創成することもできる。
さらに、本発明の複製開始点の創成方法は、前記（２）に記載されたようなリボヌクレアーゼＨの存在下に実施することもできる。
（５）本発明の核酸の複製方法
本発明の核酸複製方法は、上記（４）に記載された方法によって二本鎖核酸上に創成された複製開始点に含有されるキメラオリゴヌクレオチドの３’末端より、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって二本鎖核酸の一方の鎖に相補的なＤＮＡ鎖が合成されることにより行われる。
上記のＤＮＡ合成は、キメラオリゴヌクレオチドをプライマーとして開始され、二本鎖核酸のうちの該キメラオリゴヌクレオチドと実質的に相補的な塩基配列を有する鎖を鋳型として進行する。
本発明の核酸の複製方法に使用されるＤＮＡポリメラーゼには特に限定はなく、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する活性を有していればよい。例えば、ポルＩ（Ｐｏｌ Ｉ）型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなど）、α型ＤＮＡポリメラーゼ［ピロコッカス フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス社製）］、及び非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９７／２４４４４号パンフレット記載のＤＮＡポリメラーゼ）等が本発明に使用できる。さらに、複数のＤＮＡポリメラーゼを混合して使用してもよい。なお、直鎖状の二本鎖核酸の複製にあたっては、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＤＮＡポリメラーゼの使用が好適である。
本発明には、ＤＮＡの鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換することができる活性のことをいう。また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したＤＮＡ鎖のこと「置換鎖」と称する。
本発明の一つの好ましい態様においては、本発明の核酸複製方法は高温条件下、例えば４５〜７０℃で実施される。この態様においては耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、特に好ましくはバチルス カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）やバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ及び該ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体等が使用される。これらのＤＮＡポリメラーゼは上記の鎖置換活性を有している。
複製反応は、ＤＮＡポリメラーゼの基質となる４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）や該酵素の活性発現に必要なその他の成分を含有する反応液中で、使用される酵素に適した反応条件において実施することができる。反応液中の各成分の組成、濃度、反応液のｐＨ、反応温度、時間等を使用する酵素や複製しようとする核酸に応じて適切なものに調整できることは言うまでもない。
また複製反応の工程は、上記の複製開始点の創成工程に続いて行うことができる他、これらの両工程を同時に実施することも可能である。この場合には、使用されるＤＮＡポリメラーゼやその他の酵素が十分な活性を示すように酵素を選択し、また、反応条件を設定すればよい。
上記の複製反応の工程を、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとリボヌクレアーゼＨを組み合わせた核酸増幅方法を用いることにより、連続して実施することができる。該方法は国際公開第００／５６８７７号パンフレットに記載されており、上記のような鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨを使用して実施することができる。また、この場合にはキメラオリゴヌクレオチドは当該方法に適した形態で作製されることが好ましい。
さらに、向かい合った２つの複製起点より同時に核酸の複製を実施することにより、両複製起点にはさまれた領域の核酸断片を増幅することが可能となる。このような態様も本発明に包含される。
実施例
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
参考例
ピロコッカス フリオサスのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）１％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）０．５％、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製）１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ４ ０．００３％、ＮａＣｌ ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ４ ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ４ ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２ ０．１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ４ ０．１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２５ｐｐｍの組成の培地２リットルを２リットル容のメジュウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメンより購入：ＤＳＭ３６３８）を接種して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ 塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。
反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）の全ゲノム配列が公開されており〔ＤＮＡ リサーチ（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号１、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）。
そこで、このＰＨ１６５０遺伝子（配列番号１）と一部公開されているピロコッカス フリオサスのゲノム配列（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ，Ｕｔａｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｈｔｍｌ）でホモロジー検索をおこなった。その結果、非常にホモロジーの高い配列が見つかった。
得られた配列をもとにプライマー１６５０Ｎｄｅ（配列番号２）及び１６５０Ｂａｍ（配列番号３）を合成した。
参考例−（１）で得たピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌの１６５０Ｎｄｅ及び２０ｐｍｏｌの１６５０Ｂａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＦＵ２２０を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
参考例−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）が見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号４に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。
なお、プラスミドｐＰＦＵ２２０で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＰＦＵ２２０と命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６５４として寄託されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
参考例−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０を用いて大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、得られたｐＰＦＵ２２０を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を６６．０ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、６１．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分６０．０ｍｌをバッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分 ２．０ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、１７キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて下記の方法によりＲＮａｓｅＨ活性を測定した。
１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ、ナカライテスク社製）、０．００３％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、シグマ社製）、４％グリセロール、２０μｇ／ｍｌ ポリ（ｄＴ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌ ポリ（ｒＡ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を混合し、３７℃で１０分間保温した。これをＲＮａｓｅＨ活性を測定するための基質液として使用した。
１００μｌの基質液に１μｌの１Ｍ ＭｎＣｌ２を加えて４０℃で保温し、これに上記のＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品を適当に希釈したものを加えて反応を開始した。４０℃で３０分間反応を行った後、１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応を停止し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、上記のＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品を添加した反応液では、先に１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えた後にこれを添加したものに比べて２６０ｎｍにおける吸光度の値が高かった。よって、当該標品がＲＮａｓｅＨ活性を有することが明らかになった。
実施例１
（１）１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有、ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカー社製、１２−６０４Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ７１）を１．５×１０５／ｍｌになるように懸濁し、６穴マイクロタイタープレートのウェルに５ｍｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で一晩培養した。各ウェルに５０μｌの１００μｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社製、Ｌ−２０１２）水溶液および５０μｌの１０００Ｕ／μｌ インターフェロン−γ水溶液（ＩＦＮ−γ、ジェンザイムテクネ社製、３４８５）を添加して４時間培養後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、７４１０４）を用いてキットの説明書に従いＲＮＡを調製した。
上記により調製したＲＮＡ ３μｇと１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１５０ｐｍｏｌのランダム６ｍｅｒｓプライマー、６０Ｕのリボヌクレアーゼ インヒビター（宝酒造社製、２３１０Ａ）、１５ＵのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（宝酒造社製、２６２０Ａ）を含む全液量６０μｌをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、３０℃で１０分間、続いて４２℃で１時間保温した後、酵素を失活させるために９９℃で５分間加熱してｃＤＮＡを調製した。
（２）マウス誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）のｍＲＮＡの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ−０１０９２７）に従って、配列表の配列番号６及び７記載の塩基配列を有するプライマー、ＮＳ−ＰＣＲ１、ＮＳ−ＰＣＲ２を合成した。当該プライマー対を使用し、上記実施例１−（１）のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施し、７４１ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。該断片はＳｕｒｅｃ０２（宝酒造社製）を使用して精製したうえ、以下の実験に使用した。
（３）マウス誘導型ＮＯ合成酵素のｍＲＮＡの塩基配列に従って、配列表の配列番号８、９に示すキメラオリゴヌクレオチドプライマーＮＳ５、ＮＳ６をそれぞれ作成した。
上記実施例１−（２）で得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の１０ｆｇ〜１００ｐｇ／μｌ溶液 １μｌあるいは水（陰性対照）１μｌ、各５０ｐｍｏｌのＮＳ５およびＮＳ６プライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、０．０１５６μｇの参考例に記載のＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む全液量５０μｌの反応液をサーマルサイクラーで６０℃、１時間保温した。
反応終了後、この反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分析した。その電気泳動写真を図１に示す。
図１は、上記反応産物の電気泳動写真であり、レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照（水）の場合、レーン３は鋳型１０ｆｇの場合、レーン４は鋳型１００ｆｇの場合、レーン５は鋳型１ｐｇの場合、レーン６は鋳型１０ｐｇの場合、レーン７は鋳型１００ｐｇの場合である。
図１に示したように、上記の反応により、１ｐｇ以上の鋳型を使用した場合には鋳型のキメラオリゴヌクレオチドプライマー間の領域に相当するＤＮＡ断片が増幅されていることが示された。このことは、鋳型ＤＮＡの変性を行っていないにもかかわらずキメラオリゴヌクレオチドプライマーが鋳型ＤＮＡにアニーリングした複製開始点が形成されており、ＤＮＡポリメラーゼが当該複製開始点からのＤＮＡ合成を行うことによって複製開始点間のＤＮＡ断片が増幅されることを示している。
実施例２
（１）プラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ（宝酒造社製）のパッケージング領域の塩基配列に従って、３’末端の３残基をＲＮＡにしたキメラオリゴヌクレオチドプライマーｐＤＯＮ−ＡＩ−１、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２を合成した。これらのプライマーの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１０、１１に示す。
（２）１０ｆｇ〜１ｎｇ／μｌのｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ（環状）溶液１μｌあるいは水（陰性対照）１μｌ、前記各５０ｐｍｏｌのプライマーｐＤＯＮ−ＡＩ−１、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、０．０１５６μｇの参考例に記載のＰｆｕＲＮａｓｅＨ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量５０μｌの反応液をサーマルサイクラーで６０℃、１時間保温した。
この反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図２に示す。
図２は、上記反応産物の電気泳動写真であり、レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照（水）、レーン３は鋳型１０ｆｇ、レーン４は鋳型１００ｆｇ、レーン５は鋳型１ｐｇ、レーン６は鋳型１０ｐｇ、レーン７は鋳型１００ｐｇ、レーン８は鋳型１ｎｇの場合である。
図２に示すように、１０ｆｇ以上の鋳型量では使用したキメラオリゴヌクレオチド間の領域に相当するＤＮＡ断片が増幅されていた。すなわち、ＲＮａｓｅＨとキメラオリゴヌクレオチドプライマーとによって環状ＤＮＡ分子上にも複製開始点が創成されることが明らかとなった。
実施例３
（１）黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ遺伝子領域の塩基配列に従って、３’末端の３残基をＲＮＡにしたキメラオリゴヌクレオチドプライマーＳＥＡ−１、ＳＥＡ−２をそれぞれ合成した。プライマーＳＥＡ−１はセンス方向のプライマーであり、ＳＥＡ−２はアンチセンス方向のプライマーである。配列表の配列番号１２、１３に、それぞれプライマーＳＥＡ−１、ＳＥＡ−２の塩基配列を示す。
（２）０．１１５ｎｇまたは１．１５ｎｇの黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ１３５６５）ゲノムＤＮＡを含有する溶液１μｌあるいは陰性対照の水１μｌと、前記のプライマーＳＥＡ−１、ＳＥＡ−２各５０ｐｍｏｌ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、０．０１５６μｇの参考例に記載のＰｆｕＲＮａｓｅＨ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む全液量５０μｌの反応液を調製し、サーマルサイクラーで５８℃、１時間保温した。
この反応液５μｌを３％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図３に示す。
図３は上記反応産物の電気泳動写真であり、レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照（水）、レーン３は鋳型０．１１５ｎｇ、レーン４は鋳型１．１５ｎｇの場合である。上記の反応によって、１．１５ｎｇの鋳型ＤＮＡを使用した場合には特異的な増幅産物が生成していることが確認された。すなわち、本発明の方法によってゲノムＤＮＡ上に複製起点を創成することが可能であることが明らかとなった。
実施例４
（１）パッケージング細胞ＧＰ＋Ｅ−８６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６４２）にプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩをリン酸カルシウム法にて導入し、この導入細胞の培養上清からエコトロピックレトロウイルスを調製した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）に上記レトロウイルスを感染させ、Ｇ４１８を含む培地で１４日間培養することにより形質転換細胞を調製した。このレトロウイルス感染細胞４×１０４個より常法によりゲノムＤＮＡを調製し、２７μｇのゲノムＤＮＡを得た。
（２）プライマーの作成
プラスミドｐＤＯＮ−ＡＩのパッケージング領域の塩基配列に従って、３’末端の３塩基をＲＮＡとした２種のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、ｐＤＯＮ−ＡＩ−６８−１（センス方向のプライマー）、ｐＤＯＮ−ＡＩ−６８−２（アンチセンス方向のプライマー）をそれぞれ合成した。ｐＤＯＮ−ＡＩ−６８−１、ｐＤＯＮ−ＡＩ−６８−２の塩基配列を、配列表の配列番号１４、１５にそれぞれ示す。
（３）鋳型の変性を伴わないＤＮＡ断片の増幅
それぞれ１０ｆｇ、１ｐｇのｐＤＯＮ−ＡＩを含む１μｌの溶液、ｐＤＯＮ−ＡＩを組み込まれたＮＩＨ／３Ｔ３細胞由来のゲノムＤＮＡそれぞれ１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇを含む１μｌの溶液、ならびに陰性対照である１μｌの水に、上記実施例４−（２）のプライマー各５０ｐｍｏｌ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、１８．５Ｕの参考例に記載のＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ、４ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む全量５０μｌの反応液を調製した。この反応液をサーマルサイクラーにセットし、６４℃で１時間保温した。
反応終了後、反応液５μｌを３％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物を確認した。この結果を図４に示す。
図４は上記反応産物の電気泳動写真であり、レーンＭは１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン１は陰性対照（水）、レーン２、３はそれぞれ鋳型として１０ｆｇ、１ｐｇのｐＤＯＮ−ＡＩを使用したもの、レーン４、５、６はそれぞれ鋳型としてｐＤＯＮ−ＡＩを組み込まれたＮＩＨ／３Ｔ３細胞由来のゲノムＤＮＡ１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇを使用したものである。
図４に示されるように、ｐＤＯＮ−ＡＩ、ｐＤＯＮ−ＡＩを組み込まれたゲノムＤＮＡのどちらにおいても特異的なＤＮＡ断片の増幅が確認された。すなわち、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる場合も、反応に先立って鋳型ＤＮＡを変性することなく目的のＤＮＡ断片を増幅することが可能であることが明らかとなった。
実施例５
（１）キメラオリゴヌクレオチド、プライマーの合成
ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列に従って、３’末端の３残基をＲＮＡとし、５’末端をＸ−ローダミンイソチオシアネート（ＸＲＩＴＣ）標識したキメラオリゴヌクレオチド ｋ−ｒａｓ−Ｘをデザインし、合成した。配列表の配列番号１６にｋ−ｒａｓ−Ｘの塩基配列を示す。
また、鋳型とするＰＣＲ断片を調製するためのＰＣＲ用プライマー対として、プライマー ｒａｓ−Ｆ（センス方向）、ｒａｓ−Ｒ（アンチセンス方向）を合成した。配列表の配列番号１７、１８にそれぞれｒａｓ−Ｆ、ｒａｓ−Ｒの塩基配列を示す。
（２）キメラオリゴヌクレオチドと鋳型の反応
ヒトゲノムＤＮＡ １μｌを鋳型とし、プライマーｒａｓ−Ｆ、ｒａｓ−Ｒを用いたＰＣＲを行い、鋳型として使用する、ｋ−ｒａｓ−Ｘに相補的な配列を有するＤＮＡ断片を合成した。このＤＮＡ断片２７０ｎｇと２５ｐｍｏｌの前記ｋ−ｒａｓ−Ｘを含む下記組成の反応液を調製した：０．５ｍＭのｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、全量５０μｌ。この反応液をサーマルサイクラーで５２℃、５分間保温した。なお、陰性対照としてｋ−ｒａｓ−Ｘに相補的な配列を含まない２００ｂｐのＰＣＲ増幅断片を添加した反応液を調製し、同様に保温した。
上記の反応液２０μｌをとり、５％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後のゲルをＦＭＢＩＯ−ＩＩ Ｍｕｌｔｉ−Ｖｉｅｗ（宝酒造社製）により解析し、ｋ−ｒａｓ−Ｘの泳動位置を確認した。その結果、相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片とともに保温した場合にはｋ−ｒａｓ−Ｘ由来の蛍光が当該ＤＮＡ断片のサイズに対応する泳動位置に観察され、このキメラオリゴヌクレオチドがＤＮＡ断片と複合体を形成していることが確認された。一方、陰性対照では上記のようなプライマーとＤＮＡ断片の結合は認められなかった。すなわち、ＤＮＡ断片に相補的な塩基配列を有するキメラオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ断片を変性することなく、酵素非依存的、かつＤＮＡ断片の塩基配列に特異的に結合することが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
本発明により、人為的に核酸分子上に複製開始点を創成し、さらに、該複製開始点を利用して核酸分子を複製する方法が提供される。
本発明の方法によれば、核酸分子をベクターに挿入することなく、また生体外で簡便に複製させることが可能である。また、複製の開始点も任意に設定することができるため、核酸上の必要な部位のみを特定して複製させたり、あるいは複数の開始点から同時に複製反応を実施することも可能である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１：本発明の方法により創成された複製開始点から増幅されたＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
図２：本発明の方法により創成された複製開始点から増幅されたＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
図３：本発明の方法により創成された複製開始点から増幅されたＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
図４：本発明の方法により創成された複製開始点から増幅されたＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
本発明は、遺伝子工学分野において有用な二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体の形成方法、核酸の複製開始点の創成方法、ならびに核酸の複製方法に関する。
背景技術
分子生物学分野の研究の進展は種々の研究手法をもたらした。特に核酸のハイブリダイゼーション技術は、目的の核酸の検出、定量を可能にする極めて有用な手法であり、分子生物学分野にとどまらないさまざまな分野で、また、各々の目的に応じた形で利用されている。
ハイブリダイゼーションは、基本的には互いに相補的な一本鎖核酸同士が塩基対を形成する反応である。したがって、二本鎖核酸と一本鎖核酸、もしくは二本鎖核酸同士のハイブリダイゼーションにおいては、まず二本鎖核酸を２つの一本鎖に分離（変性）する必要がある。変性の方法としては加熱やアルカリ処理が使用されるが、これらの処理はタンパク質などの存在下、その活性を失わずに実施することはできない。
また、二本鎖核酸を使用するハイブリダイゼーションでは、その過程である頻度でもとどおりの二本鎖核酸が形成されることは避けられない。
変性しない二本鎖核酸と一本鎖核酸との間で三本鎖核酸（ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ）を形成させることが可能であることが知られている［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１６巻、１１４３１〜１１４４０頁（１９８８）］。しかしながら、このような三本鎖形成は特定の配列、すなわち高プリン含量の配列と高ピリミジン含量の配列から形成された二本鎖核酸領域に限って適用可能な方法である。
相同組換えに関与するＲｅｃＡタンパク質の存在下、非変性条件下で二本鎖核酸と一本鎖核酸との複合体が形成されることが知られている。しかしながらこの現象はＲｅｃＡタンパク質の有する活性に基づくものであり、非酵素的に同様の複合体を形成させる技術は知られていない。
一方、遺伝子工学分野の研究においては、単離された核酸分子を維持、もしくは増幅させる技術が不可欠である。通常、上記の目的は単離された核酸を適当なベクターに挿入して組換えＤＮＡ分子とすることによって達成される。このような組換えＤＮＡ分子は単離された状態、あるいは適切な宿主に保持された状態で安定に維持することができる。また、必要に応じてこの組換えＤＮＡ分子を保持する宿主を培養し、その細胞数を増加させることで分子数を増加させることができる。
上記のベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス等に由来するものが数多く知られており、また、使用の目的に応じてさまざまな機能が人為的に付与されたものが開発され、市販されている。
しかし、ベクターを使用する遺伝子の維持、増幅には宿主の利用が不可欠である。このため、例えば目的とする核酸分子が宿主に対して有害であるような場合、例えば宿主に致死的な産物をコードする遺伝子を含有しているような場合には目的の核酸分子をベクターに組み込ませた組換えＤＮＡ分子を作成することが困難である。
組換えＤＮＡ分子を宿主細胞の外、すなわちインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で複製することにより、宿主を介することなく目的の核酸分子を増幅することが考えられる。しかしながら、公知のベクターはすべて一定の複製開始点より固有のメカニズムによって複製されており、汎用性のある、人工的な核酸分子の複製手段は知られていない。
発明の目的
本発明の目的は、変性処理を伴うことなく二本鎖核酸と一本鎖核酸からなる複合体を形成する方法、ならびに宿主生物を使用することなく、汎用性があり、かつ簡便な核酸分子の複製方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドが変性処理されていない二本鎖核酸にアニーリングし、インビトロで複合体を形成すること、このような複合体が当該核酸の複製開始点として機能することを見い出した。さらにこの複製開始点より当該核酸が複製され得ることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１の発明は、二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体の形成方法であって、
（ａ）二本鎖核酸および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、前記二本鎖核酸の一方の鎖の塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記二本鎖核酸が変性しない条件下、反応混合物をインキュベートし、複合体を形成させる工程；
を包含することを特徴とする。
第１の発明において使用される二本鎖核酸としては直鎖状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが例示される。
また、オリゴヌクレオチドは上記二本鎖核酸の一方の鎖に相補的なＤＮＡ合成のプライマーとして機能し得るもの、および／または標識されたものであってもよい。
本発明の第２の発明は、標的とする塩基配列を有する二本鎖核酸を検出する方法であって、
（ａ）第１の発明の方法により二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体を形成させる工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、標的とする塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記複合体を形成するオリゴヌクレオチドを検出する工程；
を包含することを特徴とする。
本発明の第３の発明は、二本鎖核酸の複製開始点の創成方法であって、
（ａ）二本鎖核酸および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、その３’末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能であり、さらに前記二本鎖核酸の一方の鎖の塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記二本鎖核酸が変性しない条件下、反応混合物をインキュベートし、複合体を形成させる工程；
を包含することを特徴とする。
第３の発明において使用される二本鎖核酸としては直鎖状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが例示される。
本発明の第４の発明は、核酸の複製方法であって、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、第３の発明の方法により創製された複製開始点より二本鎖核酸の一方の鎖に相補的なＤＮＡ合成を行う工程を包含することを特徴とする。
第４の発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては鎖置換活性を有する酵素が例示される。
発明の詳細な説明
本明細書において二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体とは、二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドが非共有結合的に結合した複合体を言うが、その形態に特に限定はなく、例えば、三本鎖核酸を形成したものや、二本鎖核酸の一方の鎖のみとオリゴヌクレオチドが塩基対を形成した状態のものを包含する。以下、二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体を単に「複合体」と記載することがある。
本明細書においてヌクレオチドとは、通常、デオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドである。必要に応じ、ヌクレオチドのアナログや誘導体（修飾物）を含有することができる。
本明細書においてデオキシリボヌクレオチドとは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、塩基部分に７−デアザグアノシン、イノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
本明細書においてリボヌクレオチドとは、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドにはリボヌクレオチドのアナログ、修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド］も含まれる。
本明細書において複製開始点とは、二本鎖核酸の複製、すなわち該核酸の塩基配列を有するＤＮＡの合成の反応開始点として機能しうる部位をいい、特定の塩基配列によって特徴づけられる部位に限定されるものではない。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチド
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドである。該キメラオリゴヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドのアナログ、デオキシリボヌクレオチドのアナログから選択される１以上を含有するオリゴヌクレオチドも含まれる。
本発明に使用されるヌクレオチドのアナログとしては、例えば塩基部分にイノシン、７−デアザグアニン等の塩基を有するヌクレオチドアナログ、ＬＮＡ［Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９７巻、第５６３３〜５６３８頁（２０００年）、国際公開第９９／１４２２６号パンフレット］のようなリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログを使用することができる。また、修飾ヌクレオチドとしては、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）ヌクレオチドや標識化合物が付加されたヌクレオチドなどが例示される。さらに、本発明のキメラオリゴヌクレオチドはペプチド核酸［ＰＮＡ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３６５巻、第５６６〜５６８頁（１９９３年）］を含有するものであってもよい。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドは、目的とする二本鎖核酸と複合体を形成し得るものであれば特に限定はない。リボヌクレオチドが含有される位置にも特に限定はないが、例えば該プライマーの３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドが配置されたものを使用することができる。また、その数にも特に限定はなく、例えば、構成塩基の１／２以下がリボヌクレオチドであるキメラオリゴヌクレオチドが例示される。
本明細書において３’末端側とは、核酸、例えばオリゴヌクレオチドにおいてその中央より３’末端にかけての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸においてその中央より５’末端にかけての部分を指す。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、該キメラオリゴヌクレオチドと複合体を形成する二本鎖核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有するものである。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、核酸が二本鎖形態を取りうる条件、例えば、本発明が実施される条件において前記二本鎖核酸の一方の鎖にアニーリング可能な塩基配列を意味する。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、例えば、１２ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチドが挙げられる
ヌクレオチドアナログのキメラオリゴヌクレオチドへの導入は、キメラオリゴヌクレオチド自身の高次構造形成を抑制する観点からも有効である。また、ＬＮＡのような強い塩基対結合を形成しうるヌクレオチドアナログの導入は、より高い効率での複合体の形成に有用である。
これらのキメラオリゴヌクレオチドは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
（２）本発明の複合体の形成方法
本発明は、上記（１）に記載されたキメラオリゴヌクレオチドと、該キメラオリゴヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列を有する二本鎖核酸とから構成される複合体の形成方法を提供する。
本発明の方法に使用される二本鎖核酸には特に限定はなく、直鎖状、環状のものに適用することができ、例えば、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、これらの断片、ＰＣＲ法などによって増幅されたＤＮＡ断片等に複製開始点を創成することができる。また、天然の核酸、人為的に作製された核酸のいずれであっても本発明の方法を適用できる。
本発明においては、二本鎖核酸を一本鎖に変性する処理を行うことなく、（１）に記載されたキメラオリゴヌクレオチドと二本鎖核酸とを適切な条件において混合するのみで、インビトロで複合体を形成させることが可能である。その条件には特に限定はないが、通常、使用される二本鎖核酸が一本鎖に変性しない条件が使用される。例えば、０〜７０℃の温度範囲、ｐＨ６．０〜９．５、好ましくはｐＨ７．０〜９．２の条件で複合体が形成されうる。
複合体の形成を行う反応液は、適切なｐＨを保つための緩衝成分、イオン強度を調整するための中性塩やその他の成分を含むことができる。また、形成された複合体に作用させるための酵素類や該酵素の活性の発現に必要な各種成分を含有していてもよい。さらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、および／またはホルムアミド等の添加により、キメラオリゴヌクレオチドの非特異的なアニーリングの軽減が期待される。
使用するキメラオリゴヌクレオチドの量には特に限定はないが、例えば、反応液量５０μｌ当たり１ｐｍｏｌ〜１０００ｐｍｏｌの範囲で使用することができ、特に１０ｐｍｏｌ〜１５０ｐｍｏｌの範囲が好ましい。
本発明の方法により形成された複合体を使用し、キメラオリゴヌクレオチドの３’末端からＤＮＡ合成を行うことによって、二本鎖核酸の一方の鎖に相補的な配列を有するＤＮＡ鎖を合成することができる。この場合には、ＤＮＡポリメラーゼ、基質となるデオキシヌクレオチド３リン酸、マグネシウム塩等を含む反応液中で前記複合体を形成させ、同時にＤＮＡ合成を実施することが可能である。
本発明を特に限定するものではないが、本発明の複合体の形成方法はリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）の共存下に実施することができる。本発明には常温性から耐熱性のリボヌクレアーゼＨのいずれもが好適に使用できる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲＮａｓｅＨの他、例えば市販のＨｙｂｒｉｄａｓｅＴＭ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＲＮａｓｅＨ（エピセンターテクノロジーズ社製）や、好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍａｓ）属細菌、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属細菌等由来のＲＮａｓｅＨを使用することができる。さらに、該リボヌクレアーゼは、天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。本発明には、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の耐熱性ＲＮａｓｅＨが好適に使用できる。当該ＲＮａｓｅＨはピロコッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８より得ることができ、また、下記の参考例に示すように、該酵素をコードする遺伝子を利用して得ることもできる。
リボヌクレアーゼＨの共存下での本発明の態様においては、使用されるリボヌクレアーゼＨがその活性を有する反応液中での実施が好適である。
反応液は、使用するＲＮａｓｅＨの種類にもよるが、通常、適切な緩衝成分とマグネシウム塩および／またはマンガン塩を含有するものが使用される。マグネシウム塩／マンガン塩としては、特に限定はないが、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガンあるいは硫酸マンガンが好適に使用でき、その濃度は、最終濃度で１ｍＭ〜２０ｍＭ、特に好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。緩衝成分としては、例えば、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、トリス（Ｔｒｉｓ）、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）を含有する反応液を使用することができる。また、該緩衝成分の最終濃度は特に限定するものではないが、５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨ６．０〜９．５、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．２の範囲のものが使用される。
なお、本発明は複合体の形成のみに限定されるものではなく、変性操作を伴わずに前記複合体を形成させる工程を包含する種々の操作を包含する。
本発明の複合体の形成方法を利用することにより、後述する核酸の検出を行うことができる。また、特定の機能を有する核酸上の領域、例えばプロモーター領域において複合体を形成させることにより、当該機能を抑制、もしくは阻害することが可能である。
（３）本発明の核酸の検出方法
本発明は、上記の複合体の形成方法に基づいて標的とする塩基配列を有する二本鎖核酸を検出する方法を提供する。
上記（１）に記載されたキメラオリゴヌクレオチドは、該キメラオリゴヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列を有する二本鎖核酸と複合体を形成する。したがって、前記複合体の形成を調べることにより、当該キメラオリゴヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列を有する二本鎖核酸を検出することができる。
上記の態様においては、標識されたキメラオリゴヌクレオチドの使用が好適である。標識の種類には限定はなく、例えば放射性同位体（３２Ｐ等）、色素、蛍光物質、発光物質、種々のリガンド（ビオチン、ジゴキシゲニン等）、酵素等が使用できる。標識されたキメラオリゴヌクレオチドは当該標識に応じた検出方法でその存在を確認することができる。直接検出できないリガンドの場合には、検出可能な標識を付されたリガンド結合性の物質と組み合わせればよい。例えば、リガンド標識したキメラオリゴヌクレオチドと酵素標識した抗リガンド抗体とを組み合せ、シグナルを増幅することによって標的核酸を高感度に検出することが可能である。
さらに、本発明の標的核酸の検出方法は、前記（２）に記載されたようなリボヌクレアーゼＨの存在下に実施することもできる。
（４）本発明の複製開始点の創成方法
本発明の複製開始点の創成方法は、
（ａ）二本鎖核酸および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、その３’末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能であり、さらに前記二本鎖核酸の一方の鎖の塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記二本鎖核酸が変性しない条件下、反応混合物をインキュベートし、二本鎖核酸にオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程；
を包含することを特徴とする。
本発明の複製開始点の創成方法に使用される二本鎖核酸には特に限定はなく、上記（２）に記載されたもののいずれもが使用できる。また、反応条件も、上記（２）の本発明の複合体の形成方法に用いられるものが使用できる。
上記（１）の３’末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能なキメラオリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸との間で複合体を形成した場合にはＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成のプライマーとなることができる。ＤＮＡポリメラーゼは当該キメラオリゴヌクレオチドの３’末端から二本鎖核酸の一方の鎖に相補的なＤＮＡを合成しすることにより、ＤＮＡを複製する。すなわち、前記複合体は二本鎖核酸の複製起点として機能する。
本発明によれば、キメラオリゴヌクレオチドの塩基配列に応じて、二本鎖核酸上の任意の部位に複製開始点を創成することができる。また、創成される複製開始点は１ヶ所に限定されるものではなく、複数種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、複数の複製開始点を同時に創成することもできる。
さらに、本発明の複製開始点の創成方法は、前記（２）に記載されたようなリボヌクレアーゼＨの存在下に実施することもできる。
（５）本発明の核酸の複製方法
本発明の核酸複製方法は、上記（４）に記載された方法によって二本鎖核酸上に創成された複製開始点に含有されるキメラオリゴヌクレオチドの３’末端より、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって二本鎖核酸の一方の鎖に相補的なＤＮＡ鎖が合成されることにより行われる。
上記のＤＮＡ合成は、キメラオリゴヌクレオチドをプライマーとして開始され、二本鎖核酸のうちの該キメラオリゴヌクレオチドと実質的に相補的な塩基配列を有する鎖を鋳型として進行する。
本発明の核酸の複製方法に使用されるＤＮＡポリメラーゼには特に限定はなく、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する活性を有していればよい。例えば、ポルＩ（Ｐｏｌ Ｉ）型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなど）、α型ＤＮＡポリメラーゼ［ピロコッカス フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブス社製）］、及び非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９７／２４４４４号パンフレット記載のＤＮＡポリメラーゼ）等が本発明に使用できる。さらに、複数のＤＮＡポリメラーゼを混合して使用してもよい。なお、直鎖状の二本鎖核酸の複製にあたっては、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＤＮＡポリメラーゼの使用が好適である。
本発明には、ＤＮＡの鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換することができる活性のことをいう。また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したＤＮＡ鎖のこと「置換鎖」と称する。
本発明の一つの好ましい態様においては、本発明の核酸複製方法は高温条件下、例えば４５〜７０℃で実施される。この態様においては耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、特に好ましくはバチルス カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）やバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ及び該ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体等が使用される。これらのＤＮＡポリメラーゼは上記の鎖置換活性を有している。
複製反応は、ＤＮＡポリメラーゼの基質となる４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）や該酵素の活性発現に必要なその他の成分を含有する反応液中で、使用される酵素に適した反応条件において実施することができる。反応液中の各成分の組成、濃度、反応液のｐＨ、反応温度、時間等を使用する酵素や複製しようとする核酸に応じて適切なものに調整できることは言うまでもない。
また複製反応の工程は、上記の複製開始点の創成工程に続いて行うことができる他、これらの両工程を同時に実施することも可能である。この場合には、使用されるＤＮＡポリメラーゼやその他の酵素が十分な活性を示すように酵素を選択し、また、反応条件を設定すればよい。
上記の複製反応の工程を、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとリボヌクレアーゼＨを組み合わせた核酸増幅方法を用いることにより、連続して実施することができる。該方法は国際公開第００／５６８７７号パンフレットに記載されており、上記のような鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨを使用して実施することができる。また、この場合にはキメラオリゴヌクレオチドは当該方法に適した形態で作製されることが好ましい。
さらに、向かい合った２つの複製起点より同時に核酸の複製を実施することにより、両複製起点にはさまれた領域の核酸断片を増幅することが可能となる。このような態様も本発明に包含される。
実施例
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
参考例
ピロコッカス フリオサスのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）１％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）０．５％、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製）１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ４ ０．００３％、ＮａＣｌ ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ４ ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ４ ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２ ０．１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ４ ０．１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２５ｐｐｍの組成の培地２リットルを２リットル容のメジュウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメンより購入：ＤＳＭ３６３８）を接種して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ 塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。
反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）の全ゲノム配列が公開されており〔ＤＮＡ リサーチ（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号１、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）。
そこで、このＰＨ１６５０遺伝子（配列番号１）と一部公開されているピロコッカス フリオサスのゲノム配列（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ，Ｕｔａｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｈｔｍｌ）でホモロジー検索をおこなった。その結果、非常にホモロジーの高い配列が見つかった。
得られた配列をもとにプライマー１６５０Ｎｄｅ（配列番号２）及び１６５０Ｂａｍ（配列番号３）を合成した。
参考例−（１）で得たピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌの１６５０Ｎｄｅ及び２０ｐｍｏｌの１６５０Ｂａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＦＵ２２０を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
参考例−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）が見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号４に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。
なお、プラスミドｐＰＦＵ２２０で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＰＦＵ２２０と命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６５４として寄託されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
参考例−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０を用いて大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、得られたｐＰＦＵ２２０を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を６６．０ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、６１．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分６０．０ｍｌをバッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分 ２．０ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、１７キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて下記の方法によりＲＮａｓｅＨ活性を測定した。
１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ、ナカライテスク社製）、０．００３％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、シグマ社製）、４％グリセロール、２０μｇ／ｍｌ ポリ（ｄＴ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌ ポリ（ｒＡ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を混合し、３７℃で１０分間保温した。これをＲＮａｓｅＨ活性を測定するための基質液として使用した。
１００μｌの基質液に１μｌの１Ｍ ＭｎＣｌ２を加えて４０℃で保温し、これに上記のＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品を適当に希釈したものを加えて反応を開始した。４０℃で３０分間反応を行った後、１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応を停止し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、上記のＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品を添加した反応液では、先に１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えた後にこれを添加したものに比べて２６０ｎｍにおける吸光度の値が高かった。よって、当該標品がＲＮａｓｅＨ活性を有することが明らかになった。
実施例１
（１）１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有、ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカー社製、１２−６０４Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ７１）を１．５×１０５／ｍｌになるように懸濁し、６穴マイクロタイタープレートのウェルに５ｍｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で一晩培養した。各ウェルに５０μｌの１００μｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社製、Ｌ−２０１２）水溶液および５０μｌの１０００Ｕ／μｌ インターフェロン−γ水溶液（ＩＦＮ−γ、ジェンザイムテクネ社製、３４８５）を添加して４時間培養後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、７４１０４）を用いてキットの説明書に従いＲＮＡを調製した。
上記により調製したＲＮＡ ３μｇと１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１５０ｐｍｏｌのランダム６ｍｅｒｓプライマー、６０Ｕのリボヌクレアーゼ インヒビター（宝酒造社製、２３１０Ａ）、１５ＵのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（宝酒造社製、２６２０Ａ）を含む全液量６０μｌをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、３０℃で１０分間、続いて４２℃で１時間保温した後、酵素を失活させるために９９℃で５分間加熱してｃＤＮＡを調製した。
（２）マウス誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）のｍＲＮＡの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ−０１０９２７）に従って、配列表の配列番号６及び７記載の塩基配列を有するプライマー、ＮＳ−ＰＣＲ１、ＮＳ−ＰＣＲ２を合成した。当該プライマー対を使用し、上記実施例１−（１）のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを実施し、７４１ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。該断片はＳｕｒｅｃ０２（宝酒造社製）を使用して精製したうえ、以下の実験に使用した。
（３）マウス誘導型ＮＯ合成酵素のｍＲＮＡの塩基配列に従って、配列表の配列番号８、９に示すキメラオリゴヌクレオチドプライマーＮＳ５、ＮＳ６をそれぞれ作成した。
上記実施例１−（２）で得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の１０ｆｇ〜１００ｐｇ／μｌ溶液 １μｌあるいは水（陰性対照）１μｌ、各５０ｐｍｏｌのＮＳ５およびＮＳ６プライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、０．０１５６μｇの参考例に記載のＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む全液量５０μｌの反応液をサーマルサイクラーで６０℃、１時間保温した。
反応終了後、この反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分析した。その電気泳動写真を図１に示す。
図１は、上記反応産物の電気泳動写真であり、レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照（水）の場合、レーン３は鋳型１０ｆｇの場合、レーン４は鋳型１００ｆｇの場合、レーン５は鋳型１ｐｇの場合、レーン６は鋳型１０ｐｇの場合、レーン７は鋳型１００ｐｇの場合である。
図１に示したように、上記の反応により、１ｐｇ以上の鋳型を使用した場合には鋳型のキメラオリゴヌクレオチドプライマー間の領域に相当するＤＮＡ断片が増幅されていることが示された。このことは、鋳型ＤＮＡの変性を行っていないにもかかわらずキメラオリゴヌクレオチドプライマーが鋳型ＤＮＡにアニーリングした複製開始点が形成されており、ＤＮＡポリメラーゼが当該複製開始点からのＤＮＡ合成を行うことによって複製開始点間のＤＮＡ断片が増幅されることを示している。
実施例２
（１）プラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ（宝酒造社製）のパッケージング領域の塩基配列に従って、３’末端の３残基をＲＮＡにしたキメラオリゴヌクレオチドプライマーｐＤＯＮ−ＡＩ−１、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２を合成した。これらのプライマーの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１０、１１に示す。
（２）１０ｆｇ〜１ｎｇ／μｌのｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ（環状）溶液１μｌあるいは水（陰性対照）１μｌ、前記各５０ｐｍｏｌのプライマーｐＤＯＮ−ＡＩ−１、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、０．０１５６μｇの参考例に記載のＰｆｕＲＮａｓｅＨ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量５０μｌの反応液をサーマルサイクラーで６０℃、１時間保温した。
この反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図２に示す。
図２は、上記反応産物の電気泳動写真であり、レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照（水）、レーン３は鋳型１０ｆｇ、レーン４は鋳型１００ｆｇ、レーン５は鋳型１ｐｇ、レーン６は鋳型１０ｐｇ、レーン７は鋳型１００ｐｇ、レーン８は鋳型１ｎｇの場合である。
図２に示すように、１０ｆｇ以上の鋳型量では使用したキメラオリゴヌクレオチド間の領域に相当するＤＮＡ断片が増幅されていた。すなわち、ＲＮａｓｅＨとキメラオリゴヌクレオチドプライマーとによって環状ＤＮＡ分子上にも複製開始点が創成されることが明らかとなった。
実施例３
（１）黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ遺伝子領域の塩基配列に従って、３’末端の３残基をＲＮＡにしたキメラオリゴヌクレオチドプライマーＳＥＡ−１、ＳＥＡ−２をそれぞれ合成した。プライマーＳＥＡ−１はセンス方向のプライマーであり、ＳＥＡ−２はアンチセンス方向のプライマーである。配列表の配列番号１２、１３に、それぞれプライマーＳＥＡ−１、ＳＥＡ−２の塩基配列を示す。
（２）０．１１５ｎｇまたは１．１５ｎｇの黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ１３５６５）ゲノムＤＮＡを含有する溶液１μｌあるいは陰性対照の水１μｌと、前記のプライマーＳＥＡ−１、ＳＥＡ−２各５０ｐｍｏｌ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、０．０１５６μｇの参考例に記載のＰｆｕＲＮａｓｅＨ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む全液量５０μｌの反応液を調製し、サーマルサイクラーで５８℃、１時間保温した。
この反応液５μｌを３％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図３に示す。
図３は上記反応産物の電気泳動写真であり、レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照（水）、レーン３は鋳型０．１１５ｎｇ、レーン４は鋳型１．１５ｎｇの場合である。上記の反応によって、１．１５ｎｇの鋳型ＤＮＡを使用した場合には特異的な増幅産物が生成していることが確認された。すなわち、本発明の方法によってゲノムＤＮＡ上に複製起点を創成することが可能であることが明らかとなった。
実施例４
（１）パッケージング細胞ＧＰ＋Ｅ−８６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６４２）にプラスミドｐＤＯＮ−ＡＩをリン酸カルシウム法にて導入し、この導入細胞の培養上清からエコトロピックレトロウイルスを調製した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）に上記レトロウイルスを感染させ、Ｇ４１８を含む培地で１４日間培養することにより形質転換細胞を調製した。このレトロウイルス感染細胞４×１０４個より常法によりゲノムＤＮＡを調製し、２７μｇのゲノムＤＮＡを得た。
（２）プライマーの作成
プラスミドｐＤＯＮ−ＡＩのパッケージング領域の塩基配列に従って、３’末端の３塩基をＲＮＡとした２種のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、ｐＤＯＮ−ＡＩ−６８−１（センス方向のプライマー）、ｐＤＯＮ−ＡＩ−６８−２（アンチセンス方向のプライマー）をそれぞれ合成した。ｐＤＯＮ−ＡＩ−６８−１、ｐＤＯＮ−ＡＩ−６８−２の塩基配列を、配列表の配列番号１４、１５にそれぞれ示す。
（３）鋳型の変性を伴わないＤＮＡ断片の増幅
それぞれ１０ｆｇ、１ｐｇのｐＤＯＮ−ＡＩを含む１μｌの溶液、ｐＤＯＮ−ＡＩを組み込まれたＮＩＨ／３Ｔ３細胞由来のゲノムＤＮＡそれぞれ１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇを含む１μｌの溶液、ならびに陰性対照である１μｌの水に、上記実施例４−（２）のプライマー各５０ｐｍｏｌ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、１８．５Ｕの参考例に記載のＰｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ、４ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む全量５０μｌの反応液を調製した。この反応液をサーマルサイクラーにセットし、６４℃で１時間保温した。
反応終了後、反応液５μｌを３％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物を確認した。この結果を図４に示す。
図４は上記反応産物の電気泳動写真であり、レーンＭは１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン１は陰性対照（水）、レーン２、３はそれぞれ鋳型として１０ｆｇ、１ｐｇのｐＤＯＮ−ＡＩを使用したもの、レーン４、５、６はそれぞれ鋳型としてｐＤＯＮ−ＡＩを組み込まれたＮＩＨ／３Ｔ３細胞由来のゲノムＤＮＡ１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇを使用したものである。
図４に示されるように、ｐＤＯＮ−ＡＩ、ｐＤＯＮ−ＡＩを組み込まれたゲノムＤＮＡのどちらにおいても特異的なＤＮＡ断片の増幅が確認された。すなわち、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる場合も、反応に先立って鋳型ＤＮＡを変性することなく目的のＤＮＡ断片を増幅することが可能であることが明らかとなった。
実施例５
（１）キメラオリゴヌクレオチド、プライマーの合成
ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の塩基配列に従って、３’末端の３残基をＲＮＡとし、５’末端をＸ−ローダミンイソチオシアネート（ＸＲＩＴＣ）標識したキメラオリゴヌクレオチド ｋ−ｒａｓ−Ｘをデザインし、合成した。配列表の配列番号１６にｋ−ｒａｓ−Ｘの塩基配列を示す。
また、鋳型とするＰＣＲ断片を調製するためのＰＣＲ用プライマー対として、プライマー ｒａｓ−Ｆ（センス方向）、ｒａｓ−Ｒ（アンチセンス方向）を合成した。配列表の配列番号１７、１８にそれぞれｒａｓ−Ｆ、ｒａｓ−Ｒの塩基配列を示す。
（２）キメラオリゴヌクレオチドと鋳型の反応
ヒトゲノムＤＮＡ １μｌを鋳型とし、プライマーｒａｓ−Ｆ、ｒａｓ−Ｒを用いたＰＣＲを行い、鋳型として使用する、ｋ−ｒａｓ−Ｘに相補的な配列を有するＤＮＡ断片を合成した。このＤＮＡ断片２７０ｎｇと２５ｐｍｏｌの前記ｋ−ｒａｓ−Ｘを含む下記組成の反応液を調製した：０．５ｍＭのｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、全量５０μｌ。この反応液をサーマルサイクラーで５２℃、５分間保温した。なお、陰性対照としてｋ−ｒａｓ−Ｘに相補的な配列を含まない２００ｂｐのＰＣＲ増幅断片を添加した反応液を調製し、同様に保温した。
上記の反応液２０μｌをとり、５％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後のゲルをＦＭＢＩＯ−ＩＩ Ｍｕｌｔｉ−Ｖｉｅｗ（宝酒造社製）により解析し、ｋ−ｒａｓ−Ｘの泳動位置を確認した。その結果、相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片とともに保温した場合にはｋ−ｒａｓ−Ｘ由来の蛍光が当該ＤＮＡ断片のサイズに対応する泳動位置に観察され、このキメラオリゴヌクレオチドがＤＮＡ断片と複合体を形成していることが確認された。一方、陰性対照では上記のようなプライマーとＤＮＡ断片の結合は認められなかった。すなわち、ＤＮＡ断片に相補的な塩基配列を有するキメラオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ断片を変性することなく、酵素非依存的、かつＤＮＡ断片の塩基配列に特異的に結合することが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
本発明により、人為的に核酸分子上に複製開始点を創成し、さらに、該複製開始点を利用して核酸分子を複製する方法が提供される。
本発明の方法によれば、核酸分子をベクターに挿入することなく、また生体外で簡便に複製させることが可能である。また、複製の開始点も任意に設定することができるため、核酸上の必要な部位のみを特定して複製させたり、あるいは複数の開始点から同時に複製反応を実施することも可能である。
【図面の簡単な説明】
図１：本発明の方法により創成された複製開始点から増幅されたＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
図２：本発明の方法により創成された複製開始点から増幅されたＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
図３：本発明の方法により創成された複製開始点から増幅されたＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
図４：本発明の方法により創成された複製開始点から増幅されたＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
Claims (9)
- 二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体の形成方法であって、
（ａ）二本鎖核酸および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、前記二本鎖核酸の一方の鎖の塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記二本鎖核酸が変性しない条件下、反応混合物をインキュベートし、複合体を形成させる工程；
を包含することを特徴とする二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体の形成方法。 - 二本鎖核酸が直鎖状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから選択される核酸である請求項１記載の複合体の形成方法。
- オリゴヌクレオチドが二本鎖核酸の一方の鎖に相補的なＤＮＡ合成のプライマーとして機能し得るものである請求項１記載の複合体の形成方法。
- オリゴヌクレオチドが標識されている請求項１記載の複合体の形成方法。
- 標的とする塩基配列を有する二本鎖核酸を検出する方法であって、
（ａ）請求項１記載の方法により二本鎖核酸とオリゴヌクレオチドからなる複合体を形成させる工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、標的とする塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記複合体を形成するオリゴヌクレオチドを検出する工程；
を包含することを特徴とする標的とする塩基配列を有する二本鎖核酸の検出方法。 - 二本鎖核酸の複製開始点の創成方法であって、
（ａ）二本鎖核酸および少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該オリゴヌクレオチドは少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、その３’末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能であり、さらに前記二本鎖核酸の一方の鎖の塩基配列に実質的に相補的な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドであり；および
（ｂ）前記二本鎖核酸が変性しない条件下、反応混合物をインキュベートし、複合体を形成させる工程；
を包含することを特徴とする二本鎖核酸の複製開始点の創成方法。 - 二本鎖核酸が直鎖状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから選択される核酸である請求項６記載の複製開始点の創成方法。
- ＤＮＡポリメラーゼの存在下、請求項６記載の方法により創製された複製開始点より二本鎖核酸の一方の鎖に相補的なＤＮＡ合成を行う工程を包含することを特徴とする、核酸の複製方法。
- ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有する酵素である請求項８記載の核酸の複製方法。
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Legal Events
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