JPH06133800A - 増幅方法 - Google Patents
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- JPH06133800A JPH06133800A JP3007996A JP799691A JPH06133800A JP H06133800 A JPH06133800 A JP H06133800A JP 3007996 A JP3007996 A JP 3007996A JP 799691 A JP799691 A JP 799691A JP H06133800 A JPH06133800 A JP H06133800A
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- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヌクレオチド配列の増幅に際し、標的核酸フ
ラグメント／ベクトレット単位を、ハイブリッド形成条
件下で適当なヌクレオシド トリホスフェート類及びこ
れらの重合剤を用いて処理することによって、第１プラ
イミング領域のエクステンション生成物が第１プライミ
ング領域に対して実質的に相補的であるように選択され
た第１プライマーがハイブリッド化する第１プライミン
グ領域を有する一重鎖標的核酸／ベクトレット単位にの
み相補的に合成される。 【効果】 長いヌクレオチド配列の迅速かつ効果的な塩
基配列の決定が可能となる。
ラグメント／ベクトレット単位を、ハイブリッド形成条
件下で適当なヌクレオシド トリホスフェート類及びこ
れらの重合剤を用いて処理することによって、第１プラ
イミング領域のエクステンション生成物が第１プライミ
ング領域に対して実質的に相補的であるように選択され
た第１プライマーがハイブリッド化する第１プライミン
グ領域を有する一重鎖標的核酸／ベクトレット単位にの
み相補的に合成される。 【効果】 長いヌクレオチド配列の迅速かつ効果的な塩
基配列の決定が可能となる。
Description
【０００１】本発明はヌクレオチド配列の増幅方法とそ
のためのキットとに関する。このような方法は例えばそ
の一部のみが知られている配列の増幅に関して重要であ
り、長いヌクレオチド配列の迅速かつ効果的な配列決定
を可能にする。
のためのキットとに関する。このような方法は例えばそ
の一部のみが知られている配列の増幅に関して重要であ
り、長いヌクレオチド配列の迅速かつ効果的な配列決定
を可能にする。
【０００２】我々のヨーロッパ特許出願第８９３０７６
７２．９号、公報第０３５６０２１号では、未知配列を
含む核酸フラグメントのプライマーエクステンションに
よる増幅方法であって、標的核酸を開裂して標的核酸フ
ラグメントを得る工程；前記フラグメントの一つが開始
プライマーとハイブリッド化するための既知ヌクレオチ
ド配列の開始プライミング領域を含む；標的核酸フラグ
メントから既知配列のベクトレット プライミング領域
を有する各単位の連結によって標的核酸フラグメント／
ベクトレット単位を製造する工程；および開始プライマ
ーのエクステンション生成物が第１プライミング領域に
対して実質的に相補的であるように選択された開始プラ
イマーがハイブリッド化する第１プライミング領域を有
する一重鎖標的核酸／ベクトレット単位に相補的に合成
されるが、このようなエクステンション生成物がこのよ
うな第１プライミング領域を有さない一重鎖標的核酸フ
ラグメント／ベクトレット単位に相補的に合成されない
ように、標的核酸フラグメント／ベクトレット単位をハ
イブリッド形成条件において適当なヌクレオシドトリホ
スフェートおよびヌクレオシド トリホスフェートの重
合剤によって同時にまたは連続的に処理する工程から成
る方法を述べ、特許請求した。
７２．９号、公報第０３５６０２１号では、未知配列を
含む核酸フラグメントのプライマーエクステンションに
よる増幅方法であって、標的核酸を開裂して標的核酸フ
ラグメントを得る工程；前記フラグメントの一つが開始
プライマーとハイブリッド化するための既知ヌクレオチ
ド配列の開始プライミング領域を含む；標的核酸フラグ
メントから既知配列のベクトレット プライミング領域
を有する各単位の連結によって標的核酸フラグメント／
ベクトレット単位を製造する工程；および開始プライマ
ーのエクステンション生成物が第１プライミング領域に
対して実質的に相補的であるように選択された開始プラ
イマーがハイブリッド化する第１プライミング領域を有
する一重鎖標的核酸／ベクトレット単位に相補的に合成
されるが、このようなエクステンション生成物がこのよ
うな第１プライミング領域を有さない一重鎖標的核酸フ
ラグメント／ベクトレット単位に相補的に合成されない
ように、標的核酸フラグメント／ベクトレット単位をハ
イブリッド形成条件において適当なヌクレオシドトリホ
スフェートおよびヌクレオシド トリホスフェートの重
合剤によって同時にまたは連続的に処理する工程から成
る方法を述べ、特許請求した。
【０００３】下記に詳述するような好ましい特徴を含む
この方法はここでは化学的遺伝学方法と呼ぶことにす
る。
この方法はここでは化学的遺伝学方法と呼ぶことにす
る。
【０００４】任意に、上記エクステンション生成物をベ
クトレット プライミング領域に対して実質的に相補的
であるように選択したベクトレット プライマーの存在
下で増幅することもできる。
クトレット プライミング領域に対して実質的に相補的
であるように選択したベクトレット プライマーの存在
下で増幅することもできる。
【０００５】標的核酸フラグメント／ベクトレット単位
を開始プライマーによってこのように処理し、開始プラ
イマーエクステンション生成物を例えばアール．ケイ．
サイキ（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ）等がサイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）２３９ ４８７−４９１頁（１９８７年）に
述べられているように増幅する場合には、さらにベクト
レットプライマーによって処理する。ベクトレット プ
ライマーを用いない場合には、開始プライミング領域へ
の開始プライマーのハイブリッド化によって算術的また
は線状増幅（以下では線状増幅と呼ぶ）を達成し、次に
ハイブリッド形成条件下で適当なヌクレオシド トリホ
スフェートとヌクレオシド トリホスフェートの重合剤
との存在下におけるプライマーエクステンションおよび
変性を実施する。プライミング、プライマーエクステン
ションおよび変性のこのプロセスを適当な回数くり返し
て、目的の増幅レベルに達する。しかし、以下に説明す
るＰＣＲ方法を用いて、開始プライマーとベクトレット
プライマーとの両方の存在下で増幅を行うことが好ま
しい。
を開始プライマーによってこのように処理し、開始プラ
イマーエクステンション生成物を例えばアール．ケイ．
サイキ（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ）等がサイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）２３９ ４８７−４９１頁（１９８７年）に
述べられているように増幅する場合には、さらにベクト
レットプライマーによって処理する。ベクトレット プ
ライマーを用いない場合には、開始プライミング領域へ
の開始プライマーのハイブリッド化によって算術的また
は線状増幅（以下では線状増幅と呼ぶ）を達成し、次に
ハイブリッド形成条件下で適当なヌクレオシド トリホ
スフェートとヌクレオシド トリホスフェートの重合剤
との存在下におけるプライマーエクステンションおよび
変性を実施する。プライミング、プライマーエクステン
ションおよび変性のこのプロセスを適当な回数くり返し
て、目的の増幅レベルに達する。しかし、以下に説明す
るＰＣＲ方法を用いて、開始プライマーとベクトレット
プライマーとの両方の存在下で増幅を行うことが好ま
しい。
【０００６】上記ヨーロッパ特許出願の好ましい実施態
様では、プライマーエクステンション生成物または好ま
しくはベクトレット プライマー増幅生成物の合成が開
始プライマーのエクステンション生成物の初期合成に依
存するように、発明が実施される。
様では、プライマーエクステンション生成物または好ま
しくはベクトレット プライマー増幅生成物の合成が開
始プライマーのエクステンション生成物の初期合成に依
存するように、発明が実施される。
【０００７】これは例えば、線状増幅によってまたは好
ましくは初期プライマーのエクステンション生成物にの
みハイブリッド化しうるベクトレット プライマーの使
用によって達成される。従って、標的核酸フラグメント
／ベクトレット単位のベクトレット部分が第１鎖と第２
鎖とを有し、第１鎖が末端重合阻止部分を有し、開始プ
ライミング領域を含む、標的核酸フラグメント鎖に連結
する第２鎖が一重鎖部分を有し、末端重合阻止部分が、
ハイブリッド形成条件下、適当なヌクレオシドトリホス
フェートとヌクレオシド トリホスフェートの重合剤と
の存在下において第２鎖の前記一重鎖部分に対する補体
を形成する第１ストランドのエクステンションの阻止に
有効であることが有利である。従って、ベクトレット
プライマーは標的核酸フラグメント／ベクトレット単位
にハイブリッド化することができないが、開始プライマ
ーのエクステンション生成物にハイブリッド化すること
はできる。従って、開始プライマーのエクステンション
生成物が生ずるまでベクトレット プライマー エクス
テンション生成物は得られない、開始プライマーのエク
ステンション生成物が生じた後、得られたエクステンシ
ョン生成物は通常第２鎖の一重鎖部分の既知ヌクレオチ
ド配列に相補的な部分を含む。この有利な実施態様は以
下の図１に説明する。
ましくは初期プライマーのエクステンション生成物にの
みハイブリッド化しうるベクトレット プライマーの使
用によって達成される。従って、標的核酸フラグメント
／ベクトレット単位のベクトレット部分が第１鎖と第２
鎖とを有し、第１鎖が末端重合阻止部分を有し、開始プ
ライミング領域を含む、標的核酸フラグメント鎖に連結
する第２鎖が一重鎖部分を有し、末端重合阻止部分が、
ハイブリッド形成条件下、適当なヌクレオシドトリホス
フェートとヌクレオシド トリホスフェートの重合剤と
の存在下において第２鎖の前記一重鎖部分に対する補体
を形成する第１ストランドのエクステンションの阻止に
有効であることが有利である。従って、ベクトレット
プライマーは標的核酸フラグメント／ベクトレット単位
にハイブリッド化することができないが、開始プライマ
ーのエクステンション生成物にハイブリッド化すること
はできる。従って、開始プライマーのエクステンション
生成物が生ずるまでベクトレット プライマー エクス
テンション生成物は得られない、開始プライマーのエク
ステンション生成物が生じた後、得られたエクステンシ
ョン生成物は通常第２鎖の一重鎖部分の既知ヌクレオチ
ド配列に相補的な部分を含む。この有利な実施態様は以
下の図１に説明する。
【０００８】重合阻止部分は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）フラグメント、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａ
ｇＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼのような
ヌクレオシド トリホスフェートの重合剤の存在下で鋳
型ヌクレオチド配列の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を
形成する、プライマーからのヌクレオチド配列の重合を
阻止するために効果的である。この重合阻止部分は例え
ばコルジセピンもしくは３’−アミノもしくは３’−チ
オ官能基等の、ジデオキシヌクレオシドまたは３’−デ
オキシヌクレオシドのような適当に改質されたヌクレオ
シドである、このために公知の通常の基である。
ｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）フラグメント、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａ
ｇＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼのような
ヌクレオシド トリホスフェートの重合剤の存在下で鋳
型ヌクレオチド配列の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を
形成する、プライマーからのヌクレオチド配列の重合を
阻止するために効果的である。この重合阻止部分は例え
ばコルジセピンもしくは３’−アミノもしくは３’−チ
オ官能基等の、ジデオキシヌクレオシドまたは３’−デ
オキシヌクレオシドのような適当に改質されたヌクレオ
シドである、このために公知の通常の基である。
【０００９】さらに特に好ましい実施態様では、標的核
酸フラグメント／ベクトレット単位のベクトレット部分
が第１鎖と第２鎖から成る二重鎖部分を含み、ベクトレ
ット部分の第２鎖が開始プライミング領域を含む標的核
酸フラグメントの鎖に連結し、第１鎖、第２鎖およびベ
クトレット プライマーのヌクレオチド配列を、ベクト
レット プライマーが第２鎖の補体にハイブリッド化し
うるが、同じハイブリッド形成条件下で第１鎖にはハイ
ブリッド化しないように選択する。この実施態様の重合
阻止部分の存在が不要であることが理解されよう。さら
に、この場合にベクトレット プライマーの配列がベク
トレットの第２鎖の少なくとも一部の配列と同じである
ことが理解されよう。本発明のこの特に好ましい実施態
様はさらに以下で図２に関連して考察する。
酸フラグメント／ベクトレット単位のベクトレット部分
が第１鎖と第２鎖から成る二重鎖部分を含み、ベクトレ
ット部分の第２鎖が開始プライミング領域を含む標的核
酸フラグメントの鎖に連結し、第１鎖、第２鎖およびベ
クトレット プライマーのヌクレオチド配列を、ベクト
レット プライマーが第２鎖の補体にハイブリッド化し
うるが、同じハイブリッド形成条件下で第１鎖にはハイ
ブリッド化しないように選択する。この実施態様の重合
阻止部分の存在が不要であることが理解されよう。さら
に、この場合にベクトレット プライマーの配列がベク
トレットの第２鎖の少なくとも一部の配列と同じである
ことが理解されよう。本発明のこの特に好ましい実施態
様はさらに以下で図２に関連して考察する。
【００１０】化学的遺伝学方法は広範囲に利用可能であ
る。例えば化学的遺伝学方法を用いて、例えば植物また
は動物（特にヒト）の疾患の原因となる微生物のような
特定の微生物に特徴的なヌクレオチド配列を同定するこ
とができる、このような微生物は例えば菌類、酵母、細
菌またはウィルスならびに寄生体［例えばプラスモジウ
ム（マラリア）、またはトリパノソーム（眠り病）］で
ある。化学的遺伝学方法を用いて、一定生物の薬物耐
性、例えば抗生物質耐性の原因となるヌクレオチド配列
を確認することもできる。従って、この方法は動物また
は植物の疾患を診断するプローブの製造を可能にし、さ
らに例えば抗生物質耐性のような薬物耐性を診断するプ
ローブの製造を可能にする。
る。例えば化学的遺伝学方法を用いて、例えば植物また
は動物（特にヒト）の疾患の原因となる微生物のような
特定の微生物に特徴的なヌクレオチド配列を同定するこ
とができる、このような微生物は例えば菌類、酵母、細
菌またはウィルスならびに寄生体［例えばプラスモジウ
ム（マラリア）、またはトリパノソーム（眠り病）］で
ある。化学的遺伝学方法を用いて、一定生物の薬物耐
性、例えば抗生物質耐性の原因となるヌクレオチド配列
を確認することもできる。従って、この方法は動物また
は植物の疾患を診断するプローブの製造を可能にし、さ
らに例えば抗生物質耐性のような薬物耐性を診断するプ
ローブの製造を可能にする。
【００１１】化学的遺伝学方法は、例えば（１）植物、
特に動物（特にヒト）における遺伝的障害の原因とな
る、例えば点突然変異のような、ヌクレオチド配列の変
化の検出；（２）動物（特にヒト）における新生物形成
疾患の原因となる、例えば欠失のような、ヌクレオチド
配列の変化の検出；（３）植物、特に動物（特にヒト）
における疾患または障害の素因の原因となるヌクレオチ
ド配列の変化の検出；および（４）例えば植物における
花の色、作物の収量、または除草剤耐性等の好ましい特
性のような特異的特性の原因となるヌクレオチド配列の
変化の検出に用いることができる。
特に動物（特にヒト）における遺伝的障害の原因とな
る、例えば点突然変異のような、ヌクレオチド配列の変
化の検出；（２）動物（特にヒト）における新生物形成
疾患の原因となる、例えば欠失のような、ヌクレオチド
配列の変化の検出；（３）植物、特に動物（特にヒト）
における疾患または障害の素因の原因となるヌクレオチ
ド配列の変化の検出；および（４）例えば植物における
花の色、作物の収量、または除草剤耐性等の好ましい特
性のような特異的特性の原因となるヌクレオチド配列の
変化の検出に用いることができる。
【００１２】本発明の少なくとも一部は、標的核酸フラ
グメント／ベクトレット単位の標的核酸フラグメント／
ベクトレット部分がその二重鎖相補形またはその一重鎖
形において蛋白質によって結合される核酸配列を含むと
いう発見に基づくものである。 従って、本発明の１態
様によると、標的核酸フラグメント／ベクトレット単位
の少なくとも一部の増幅方法であって、前記部分が
（１）未知配列、（２）第１プライマーとのハイブリッ
ド形成のための既知ヌクレオチド配列の第１プライミン
グ領域および（３）その少なくとも一つの鎖がその二重
鎖相補形またはその一重鎖形において蛋白質によって結
合されうる核酸配列を有するベクトレット部分から成
り、第１プライミング領域のエクステンション生成物が
第１プライミング領域に対して実質的に相補的であるよ
うに選択された第１プライマーがハイブリッド化する第
１プライミング領域を有する一重鎖標的核酸／ベクトレ
ット単位に相補的に合成されるが、このようなエクステ
ンション生成物がこのような第１プライミング領域を有
さない一重鎖標的核酸フラグメント／ベクトレット単位
に相補的に合成されないように、標的核酸フラグメント
／ベクトレット単位をハイブリッド形成条件において適
当なヌクレオシド トリホスフェートおよびヌクレオシ
ド トリホスフェートの重合剤によって同時にまたは連
続的に処理することから成る方法を提供する。
グメント／ベクトレット単位の標的核酸フラグメント／
ベクトレット部分がその二重鎖相補形またはその一重鎖
形において蛋白質によって結合される核酸配列を含むと
いう発見に基づくものである。 従って、本発明の１態
様によると、標的核酸フラグメント／ベクトレット単位
の少なくとも一部の増幅方法であって、前記部分が
（１）未知配列、（２）第１プライマーとのハイブリッ
ド形成のための既知ヌクレオチド配列の第１プライミン
グ領域および（３）その少なくとも一つの鎖がその二重
鎖相補形またはその一重鎖形において蛋白質によって結
合されうる核酸配列を有するベクトレット部分から成
り、第１プライミング領域のエクステンション生成物が
第１プライミング領域に対して実質的に相補的であるよ
うに選択された第１プライマーがハイブリッド化する第
１プライミング領域を有する一重鎖標的核酸／ベクトレ
ット単位に相補的に合成されるが、このようなエクステ
ンション生成物がこのような第１プライミング領域を有
さない一重鎖標的核酸フラグメント／ベクトレット単位
に相補的に合成されないように、標的核酸フラグメント
／ベクトレット単位をハイブリッド形成条件において適
当なヌクレオシド トリホスフェートおよびヌクレオシ
ド トリホスフェートの重合剤によって同時にまたは連
続的に処理することから成る方法を提供する。
【００１３】標的核酸フラグメント／ベクトレット単位
は例えば標的核酸を開裂して標的核酸フラグメントを
得、前記フラグメントの一つが第１プライミング領域を
含むようにし、標的核酸フラグメントとベクトレットと
の結合によって前記ベクトレット単位を製造することに
よって得られる、この場合ベクトレットは少なくとも一
つの鎖がその二重鎖相補形または一重鎖形において蛋白
質によって結合されうる核酸配列を有するような部分を
少なくとも一つ含む。望ましい場合には、ベクトレット
は第２プライマーとのハイブリッド形成のための既知配
列のプライミング領域を含むこともできる。
は例えば標的核酸を開裂して標的核酸フラグメントを
得、前記フラグメントの一つが第１プライミング領域を
含むようにし、標的核酸フラグメントとベクトレットと
の結合によって前記ベクトレット単位を製造することに
よって得られる、この場合ベクトレットは少なくとも一
つの鎖がその二重鎖相補形または一重鎖形において蛋白
質によって結合されうる核酸配列を有するような部分を
少なくとも一つ含む。望ましい場合には、ベクトレット
は第２プライマーとのハイブリッド形成のための既知配
列のプライミング領域を含むこともできる。
【００１４】蛋白質によって結合されうる核酸配列が、
その二重鎖相補形において蛋白質によって結合されうる
かまたはその一重鎖形において蛋白質によって結合され
うるかのいずれかであり、蛋白質がこのような両方の形
の前記核酸配列と結合できないことによって定義される
ことは理解されよう。核酸配列はそれが二重鎖相補形で
あるときにのみ蛋白質によって結合されうるような核酸
配列であることが好ましい。
その二重鎖相補形において蛋白質によって結合されうる
かまたはその一重鎖形において蛋白質によって結合され
うるかのいずれかであり、蛋白質がこのような両方の形
の前記核酸配列と結合できないことによって定義される
ことは理解されよう。核酸配列はそれが二重鎖相補形で
あるときにのみ蛋白質によって結合されうるような核酸
配列であることが好ましい。
【００１５】上述したように、標的核酸フラグメント／
ベクトレット単位のベクトレット部分はその二重鎖相補
形または一重鎖形のいずれかにおいて蛋白質によって結
合されうる核酸配列を含む。二重鎖形のこのような配列
は、例えば二次反応を刺激しうるｃＡＭＰ結合蛋白質部
位、組換え蛋白質結合部位、制限酵素結合部位および特
異的な環境シグナルによって活性化される調節蛋白質の
結合部位ならびに一重鎖末端または二重鎖末端を識別し
うる一重鎖特異的結合蛋白質部位を含み、また特に隣接
配列のインビトロ転写／複写を指示しうるプロモーター
をも含む。核酸蛋白質結合配列の特定の例は、ＲＮＡポ
リメラーゼを結合しうる核酸、例えばＳＰ６またはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼを結合しうる核酸配列である。こ
のようなポリメラーゼの使用は、例えば、ハイブリッド
化プローブとしてまたは転写マップ形成に用いられるヌ
クレオチド配列決定鋳型として用いられるＲＮＡ転写体
の製造を可能にする。前記で定義した化学的遺伝学方法
が核酸配列の好ましいソースからの重複核酸フラグメン
トの規則的な系列の形成を可能にすることは明らかであ
ろう。この方法は、この方法の次の「段階」に用いるた
めの他のプライマーを製造するために、得られた増幅生
成物の配列を決定することによって実施される。このよ
うにして、この方法の操作者は増幅生成物の形成、配列
決定および次の段階の新しい段階に用いるための新しい
ポリマーの製造の工程をくり返すことによって、核酸配
列に沿って段階的に進むことができる。しかし、この方
法は大きな核酸フラグメント（例えば２Ｋｂより大き
い）を形成することができ、このような場合には、次の
段階のプライマーを製造するために十分な末端配列のみ
を決定することが好ましい。これに関して、本発明は標
的核酸フラグメント／ベクトレット単位を標的核酸フラ
グメント部分の未知配列領域において開裂して、開裂さ
れた標的核酸部分にベクトレットを連結して、各端部に
ベクトレット部分を有するベクトレット単位を形成する
ことによって、上記問題が軽減されるという発見にも基
づくものである。
ベクトレット単位のベクトレット部分はその二重鎖相補
形または一重鎖形のいずれかにおいて蛋白質によって結
合されうる核酸配列を含む。二重鎖形のこのような配列
は、例えば二次反応を刺激しうるｃＡＭＰ結合蛋白質部
位、組換え蛋白質結合部位、制限酵素結合部位および特
異的な環境シグナルによって活性化される調節蛋白質の
結合部位ならびに一重鎖末端または二重鎖末端を識別し
うる一重鎖特異的結合蛋白質部位を含み、また特に隣接
配列のインビトロ転写／複写を指示しうるプロモーター
をも含む。核酸蛋白質結合配列の特定の例は、ＲＮＡポ
リメラーゼを結合しうる核酸、例えばＳＰ６またはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼを結合しうる核酸配列である。こ
のようなポリメラーゼの使用は、例えば、ハイブリッド
化プローブとしてまたは転写マップ形成に用いられるヌ
クレオチド配列決定鋳型として用いられるＲＮＡ転写体
の製造を可能にする。前記で定義した化学的遺伝学方法
が核酸配列の好ましいソースからの重複核酸フラグメン
トの規則的な系列の形成を可能にすることは明らかであ
ろう。この方法は、この方法の次の「段階」に用いるた
めの他のプライマーを製造するために、得られた増幅生
成物の配列を決定することによって実施される。このよ
うにして、この方法の操作者は増幅生成物の形成、配列
決定および次の段階の新しい段階に用いるための新しい
ポリマーの製造の工程をくり返すことによって、核酸配
列に沿って段階的に進むことができる。しかし、この方
法は大きな核酸フラグメント（例えば２Ｋｂより大き
い）を形成することができ、このような場合には、次の
段階のプライマーを製造するために十分な末端配列のみ
を決定することが好ましい。これに関して、本発明は標
的核酸フラグメント／ベクトレット単位を標的核酸フラ
グメント部分の未知配列領域において開裂して、開裂さ
れた標的核酸部分にベクトレットを連結して、各端部に
ベクトレット部分を有するベクトレット単位を形成する
ことによって、上記問題が軽減されるという発見にも基
づくものである。
【００１６】従って、本発明の他の態様によると各端部
にベクレット部分を有する標的核酸フラグメント／ベク
レット単位の製造方法であって、前記ベクレット単位の
標的核酸フラグメント部分の未知配列領域において標的
核酸フラグメント／ベクトレット単位を開裂して、得ら
れた開裂標的核酸部分にベクトレットを連結して、前記
単位の各端部にベクレット部分を有するベクレット単位
を形成する方法を提供する。
にベクレット部分を有する標的核酸フラグメント／ベク
レット単位の製造方法であって、前記ベクレット単位の
標的核酸フラグメント部分の未知配列領域において標的
核酸フラグメント／ベクトレット単位を開裂して、得ら
れた開裂標的核酸部分にベクトレットを連結して、前記
単位の各端部にベクレット部分を有するベクレット単位
を形成する方法を提供する。
【００１７】開裂標的核酸部分に連結するためのベクレ
ットはその二重鎖相補形またはその一重鎖形において蛋
白質によって結合される核酸配列を含むことが好まし
い。このような核酸配列の例は前述した通りである。
ットはその二重鎖相補形またはその一重鎖形において蛋
白質によって結合される核酸配列を含むことが好まし
い。このような核酸配列の例は前述した通りである。
【００１８】従って、単位の各端部にベクレット部分を
有する標的核酸フラグメント／ベクトレット単位は例え
ばアール．ケイ．サイキ（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ）等のサ
イエンス２３９，４８７−４９１（１９８１）および米
国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２
０２号に述べられているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）方法またはＰＣＴ特許公報第ＷＯ８７／０６２７０
号［またはバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）６巻，１９８８年１０月］、ＰＣＴ特許公報第
ＷＯ８８／１０３１５号またはＰＣＴ特許公報第ＷＯ８
９／０１０５０号に述べられている増幅方法によって、
下記に述べるような好ましいやり方で増幅される。
有する標的核酸フラグメント／ベクトレット単位は例え
ばアール．ケイ．サイキ（Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ）等のサ
イエンス２３９，４８７−４９１（１９８１）および米
国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２
０２号に述べられているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）方法またはＰＣＴ特許公報第ＷＯ８７／０６２７０
号［またはバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）６巻，１９８８年１０月］、ＰＣＴ特許公報第
ＷＯ８８／１０３１５号またはＰＣＴ特許公報第ＷＯ８
９／０１０５０号に述べられている増幅方法によって、
下記に述べるような好ましいやり方で増幅される。
【００１９】ＰＣＲによる増幅が不要であることは理解
されるであろう。従って、例えば二重鎖プロモーター配
列、例えば二重鎖ＲＮＡポリメラーゼ プロモーター配
列はベクトレット プライマーの不存在下で第１プライ
マーのプライマー エクステンションによって形成さ
れ、標的配列の次の増幅は転写配列、例えばＲＮＡ転写
体の反復形成によって行われる。
されるであろう。従って、例えば二重鎖プロモーター配
列、例えば二重鎖ＲＮＡポリメラーゼ プロモーター配
列はベクトレット プライマーの不存在下で第１プライ
マーのプライマー エクステンションによって形成さ
れ、標的配列の次の増幅は転写配列、例えばＲＮＡ転写
体の反復形成によって行われる。
【００２０】このように、本発明の他の実施態様ではベ
クトレット単位の少なくとも一部の増幅を（ａ）１）未
知配列と２）プロモーター配列とを含む核酸配列の第１
プライミング領域にハイブリッド化する第１プライマー
のプライマー エクステンションと、その後の（ｂ）前
記プロモーター配列の制御下での核酸配列の反復形成と
によって行う。標的核酸フラグメント／ベクトレット単
位のベクトレット部分が、制限酵素によって結合されう
る少なくとも一つの核酸配列を含むことが便利である。
核酸配列は便利には二重鎖であり、相補的鎖が第１プラ
イマーのエクステンションによって形成されることが好
ましい。例えば１，２，３，４，５または６、特に２，
３または例えば３のような、便利な数のこのような核酸
配列がベクトレット部分に含まれる。核酸配列は特定制
限酵素の認識配列である。個々の制限エンドヌクレアー
ゼの例には、ヌクレイック アシドス リサーチ、シー
ケンス増刊、１６巻、１９８８、ｒ２７１−ｒ３１３頁
および「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」１９８７−１９８８、アウス
ベル エフ．エム．（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．）、ブ
レント アール．（Ｂｒｅｎｔ Ｒ．）、キングストン
アール．エー．（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ Ｒ．Ｅ．）、ム
ーア デイ．デイ．（Ｍｏｏｒ Ｄ．Ｄ．）、スミス
ジェイ．エイ．（Ｓｍｉｔｈ Ｊ．Ａ．）、セイドマン
ジェイ．ジー．（Ｓｅｉｄｏｍａｎ Ｊ．Ｇ．）およ
びストルール ケイ．（Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ．）編集、ウ
イリー インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒ
ｓｃｉｅｎｃｅ）、セクション３、表３．１−１に述べ
られているものがある。ベクトレット部分における少な
くとも一つの制限部位の存在は開裂後に、核酸フラグメ
ント／ベクレット単位をクローニング／サブクローニン
グ、配列決定または表現のために適したベクトルに挿入
するために特に有用である既知配列の末端を提供する。
例えば、クロンテック ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），４０３０ファビアン
ウエイ、パロ アルト、カリフォルニア９４３０３、米
国またはプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），２８００ウッド
ス ホロウ ロード、マジソン、ウイスコンシン５３７
１１−５３９９、米国のカタログから選択されるよう
な、便利なベクトルを用いることができる。便利なベク
トルにはプラスミドと例えばＭ１３のようなバクテリオ
ファージ ベクトルがある。開裂後に核酸フラグメント
／ベクトレット単位が異なる末端を有する場合には、こ
れの配向は容易に決定されるので、これはベクトルに挿
入するために特に便利である。この代わりに、開裂後に
核酸フラグメント／ベクトレットを下記に説明するよう
な好ましい機能を有する他の核酸配列に接合または結合
させることができる。同じまたは異なる機能の蛋白質に
結合するための核酸配列の如何なる組み合わせも核酸フ
ラグメント／ベクトレット単位のベクトレット部分に含
めることができることは理解されよう。従って、例えば
ベクトレット単位は制限酵素による認識のための部位
と、例えばプロモーターのような他の蛋白質による認識
のための部位とを含みうる。
クトレット単位の少なくとも一部の増幅を（ａ）１）未
知配列と２）プロモーター配列とを含む核酸配列の第１
プライミング領域にハイブリッド化する第１プライマー
のプライマー エクステンションと、その後の（ｂ）前
記プロモーター配列の制御下での核酸配列の反復形成と
によって行う。標的核酸フラグメント／ベクトレット単
位のベクトレット部分が、制限酵素によって結合されう
る少なくとも一つの核酸配列を含むことが便利である。
核酸配列は便利には二重鎖であり、相補的鎖が第１プラ
イマーのエクステンションによって形成されることが好
ましい。例えば１，２，３，４，５または６、特に２，
３または例えば３のような、便利な数のこのような核酸
配列がベクトレット部分に含まれる。核酸配列は特定制
限酵素の認識配列である。個々の制限エンドヌクレアー
ゼの例には、ヌクレイック アシドス リサーチ、シー
ケンス増刊、１６巻、１９８８、ｒ２７１−ｒ３１３頁
および「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」１９８７−１９８８、アウス
ベル エフ．エム．（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．）、ブ
レント アール．（Ｂｒｅｎｔ Ｒ．）、キングストン
アール．エー．（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ Ｒ．Ｅ．）、ム
ーア デイ．デイ．（Ｍｏｏｒ Ｄ．Ｄ．）、スミス
ジェイ．エイ．（Ｓｍｉｔｈ Ｊ．Ａ．）、セイドマン
ジェイ．ジー．（Ｓｅｉｄｏｍａｎ Ｊ．Ｇ．）およ
びストルール ケイ．（Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ．）編集、ウ
イリー インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒ
ｓｃｉｅｎｃｅ）、セクション３、表３．１−１に述べ
られているものがある。ベクトレット部分における少な
くとも一つの制限部位の存在は開裂後に、核酸フラグメ
ント／ベクレット単位をクローニング／サブクローニン
グ、配列決定または表現のために適したベクトルに挿入
するために特に有用である既知配列の末端を提供する。
例えば、クロンテック ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），４０３０ファビアン
ウエイ、パロ アルト、カリフォルニア９４３０３、米
国またはプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），２８００ウッド
ス ホロウ ロード、マジソン、ウイスコンシン５３７
１１−５３９９、米国のカタログから選択されるよう
な、便利なベクトルを用いることができる。便利なベク
トルにはプラスミドと例えばＭ１３のようなバクテリオ
ファージ ベクトルがある。開裂後に核酸フラグメント
／ベクトレット単位が異なる末端を有する場合には、こ
れの配向は容易に決定されるので、これはベクトルに挿
入するために特に便利である。この代わりに、開裂後に
核酸フラグメント／ベクトレットを下記に説明するよう
な好ましい機能を有する他の核酸配列に接合または結合
させることができる。同じまたは異なる機能の蛋白質に
結合するための核酸配列の如何なる組み合わせも核酸フ
ラグメント／ベクトレット単位のベクトレット部分に含
めることができることは理解されよう。従って、例えば
ベクトレット単位は制限酵素による認識のための部位
と、例えばプロモーターのような他の蛋白質による認識
のための部位とを含みうる。
【００２１】ベクトレット単位はその二重鎖相補形また
はその一重鎖形において蛋白質によって結合される核酸
配列を含む増幅生成物の合成が第１プライマーのエクス
テンション生成物の初期合成に依存するようなものであ
ることが好ましい。従って、例えば２ベクトレット部分
（ベクトレット単位の各端部に１ベクトレット部分）を
有する標的核酸フラグメント／ベクレット単位を用いる
ことが望ましい場合には、ベクトレット部分の少なくと
も一つは増幅生成物の合成が前記ベクトレット部分の他
方のにハイブリッド化しうるプライマーのエクステンシ
ョン生成物の初期合成に依存するようなものである。従
って、標的核酸フラグメント／ベクレット単位の少なく
とも一つのベクトレット部分が第１鎖と第２鎖とを有
し、第１鎖が末端重合阻止部分を有し、第２鎖がその二
重鎖相補形またはその一重鎖形において蛋白質によって
結合される核酸配列を含む一重鎖部分を有し、第２鎖が
第１プライマーとハイブリッド化する第１プライミング
領域を含む標的核酸フラグメントの鎖に結合し、末端重
合阻止部分がハイブリッド形成条件下、適当なヌクレオ
シド トリホスフェートとヌクレオシド トリホスフェ
ートの重合剤との存在下において、第２鎖の一重鎖部分
への補体を形成する第１鎖のエクステンションを阻止す
るために有効である。従って、第２プライマーは標的核
酸フラグメント／ベクレット単位にハイブリッド化でき
ないが、第１プライマーのエクステンション生成物にハ
イブリッド化できるように設計される。従って、第１プ
ライマーのエクステンション生成物の形成まで第２プラ
イマーのエクステンション生成物は得られず、第１プラ
イマーのエクステンション生成物の形成後に得られたエ
クステンション生成物は通常第２プライマーの一重鎖部
分の既知ヌクレオチド配列に相補的な部分を含む。この
有利な実施態様は下記の図１において説明する。
はその一重鎖形において蛋白質によって結合される核酸
配列を含む増幅生成物の合成が第１プライマーのエクス
テンション生成物の初期合成に依存するようなものであ
ることが好ましい。従って、例えば２ベクトレット部分
（ベクトレット単位の各端部に１ベクトレット部分）を
有する標的核酸フラグメント／ベクレット単位を用いる
ことが望ましい場合には、ベクトレット部分の少なくと
も一つは増幅生成物の合成が前記ベクトレット部分の他
方のにハイブリッド化しうるプライマーのエクステンシ
ョン生成物の初期合成に依存するようなものである。従
って、標的核酸フラグメント／ベクレット単位の少なく
とも一つのベクトレット部分が第１鎖と第２鎖とを有
し、第１鎖が末端重合阻止部分を有し、第２鎖がその二
重鎖相補形またはその一重鎖形において蛋白質によって
結合される核酸配列を含む一重鎖部分を有し、第２鎖が
第１プライマーとハイブリッド化する第１プライミング
領域を含む標的核酸フラグメントの鎖に結合し、末端重
合阻止部分がハイブリッド形成条件下、適当なヌクレオ
シド トリホスフェートとヌクレオシド トリホスフェ
ートの重合剤との存在下において、第２鎖の一重鎖部分
への補体を形成する第１鎖のエクステンションを阻止す
るために有効である。従って、第２プライマーは標的核
酸フラグメント／ベクレット単位にハイブリッド化でき
ないが、第１プライマーのエクステンション生成物にハ
イブリッド化できるように設計される。従って、第１プ
ライマーのエクステンション生成物の形成まで第２プラ
イマーのエクステンション生成物は得られず、第１プラ
イマーのエクステンション生成物の形成後に得られたエ
クステンション生成物は通常第２プライマーの一重鎖部
分の既知ヌクレオチド配列に相補的な部分を含む。この
有利な実施態様は下記の図１において説明する。
【００２２】重合阻止部分は例えば大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼIのクレノウ フラグメント、Ｔ７ＤＮＡポリメ
ラーゼまたはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ 等のＤＮＡ
ポリメラーゼのようなヌクレオシド トリホスフェート
の重合剤の存在下で鋳型ヌクレオシド配列の補体を形成
するプライマーからのヌクレオチド配列の重合を阻止す
るために有効である。重合阻止部分は例えばジデオキシ
ヌクレオシドまたは３’−デオキシヌクレオシドのよう
な適当な修飾ヌクレオシド、例えばコルジセピン、３’
−アミノまたは３’−チオ官能基等のこのために公知の
便利な基である。重合阻止部分は我々の英国特許出願第
８９２００９７．６号に詳述されているものによっても
例示される。
ラーゼIのクレノウ フラグメント、Ｔ７ＤＮＡポリメ
ラーゼまたはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ 等のＤＮＡ
ポリメラーゼのようなヌクレオシド トリホスフェート
の重合剤の存在下で鋳型ヌクレオシド配列の補体を形成
するプライマーからのヌクレオチド配列の重合を阻止す
るために有効である。重合阻止部分は例えばジデオキシ
ヌクレオシドまたは３’−デオキシヌクレオシドのよう
な適当な修飾ヌクレオシド、例えばコルジセピン、３’
−アミノまたは３’−チオ官能基等のこのために公知の
便利な基である。重合阻止部分は我々の英国特許出願第
８９２００９７．６号に詳述されているものによっても
例示される。
【００２３】本発明の他の特に好ましい実施態様では、
標的核酸フラグメント／ベクトレット単位の少なくとも
一つのベクトレット部分が第１鎖と第２鎖とを有する二
重鎖部分を含み、ベクトレット部分の第２鎖は第１プラ
イミング部分を含む標的核酸フラグメントのこの鎖に連
結され、第１鎖、第２鎖および第２プライマーのヌクレ
オチド配列は第２プライマーが第２鎖の補体にハイブリ
ッド化しうるが、同じハイブリッド形成条件下で第１鎖
にハイブリッド化しないように選択される。この実施態
様では重合阻止部分の存在が不要であることが理解され
よう。さらに、この場合に、第２プライマーの配列がベ
クトレットの第２鎖の少なくとも一部の配列と実質的に
同じであることがさらに理解されよう。本発明のこの特
に好ましい実施態様は下記で図２に関連してさらに説明
する。この特に好ましい実施態様では、ベクトレットは
その二重鎖相補形に少なくとも一つの非相補性領域を含
む。この非相補性領域は便利には相補的配列の２領域の
間に配置される。本発明の方法のこの実施態様では、そ
の二重鎖相補形またはその一重鎖形のいずれかにおいて
蛋白質によって結合されうる核酸配列がベクトレットの
非相補的領域の少なくとも一つの鎖に存在する。ベクト
レットの非相補的領域の各鎖は任意に、異なる核酸配列
を含むことができ、各配列はその二重鎖相補形またはそ
の一重鎖形のいずれかにおいて蛋白質（通常は異なる蛋
白質）によって結合されうる。
標的核酸フラグメント／ベクトレット単位の少なくとも
一つのベクトレット部分が第１鎖と第２鎖とを有する二
重鎖部分を含み、ベクトレット部分の第２鎖は第１プラ
イミング部分を含む標的核酸フラグメントのこの鎖に連
結され、第１鎖、第２鎖および第２プライマーのヌクレ
オチド配列は第２プライマーが第２鎖の補体にハイブリ
ッド化しうるが、同じハイブリッド形成条件下で第１鎖
にハイブリッド化しないように選択される。この実施態
様では重合阻止部分の存在が不要であることが理解され
よう。さらに、この場合に、第２プライマーの配列がベ
クトレットの第２鎖の少なくとも一部の配列と実質的に
同じであることがさらに理解されよう。本発明のこの特
に好ましい実施態様は下記で図２に関連してさらに説明
する。この特に好ましい実施態様では、ベクトレットは
その二重鎖相補形に少なくとも一つの非相補性領域を含
む。この非相補性領域は便利には相補的配列の２領域の
間に配置される。本発明の方法のこの実施態様では、そ
の二重鎖相補形またはその一重鎖形のいずれかにおいて
蛋白質によって結合されうる核酸配列がベクトレットの
非相補的領域の少なくとも一つの鎖に存在する。ベクト
レットの非相補的領域の各鎖は任意に、異なる核酸配列
を含むことができ、各配列はその二重鎖相補形またはそ
の一重鎖形のいずれかにおいて蛋白質（通常は異なる蛋
白質）によって結合されうる。
【００２４】標的核酸フラグメント／ベクトレット単位
のベクトレット部分が制限酵素によって結合されうる少
なくとも一つの核酸配列を含む場合には、ベクトレット
の一つの鎖は例えば３個までの、便利には３個までの制
限エンドヌクレアーゼの認識配列を含みうる。制限エン
ドヌクレアーゼは核酸配列が第１プライマーのエクステ
ンションによって二重鎖にされた場合にのみ核酸配列を
認識するように選択することが好ましい。次に開裂核酸
フラグメント／ベクトレット単位が既述したようにサブ
クローン化される。
のベクトレット部分が制限酵素によって結合されうる少
なくとも一つの核酸配列を含む場合には、ベクトレット
の一つの鎖は例えば３個までの、便利には３個までの制
限エンドヌクレアーゼの認識配列を含みうる。制限エン
ドヌクレアーゼは核酸配列が第１プライマーのエクステ
ンションによって二重鎖にされた場合にのみ核酸配列を
認識するように選択することが好ましい。次に開裂核酸
フラグメント／ベクトレット単位が既述したようにサブ
クローン化される。
【００２５】本発明の他の好ましい実施態様は同一第１
プライマーと共に用いるための複数の異なる官能性ベク
トレットライブラリーの製造を含む、各ベクトレットラ
イブラリーは標的核酸の異なる開裂部位における開裂お
よび標的核酸フラグメントからの前記官能性ベクトレッ
トライブラリーを形成するような結合による標的核酸フ
ラグメント／ベクトレット単位の形成によって製造さ
れ、各官能性ベクトレットライブラリーをハイブリッド
形成条件下で適当なエンドヌクレオシド トリホスフェ
ートとエンドヌクレオシド トリホスフェートの重合剤
とによって別々にまたは同時に処理することによって同
一開始プライマーの使用に基づく、複数の第１プライマ
ー エクステンション生成物が得られる。このようなエ
クステンション生成物のサイズは第１プライマーから最
も近い、特定開裂手段（例えば、特定ライブラリー構成
に用いる制限酵素）のための３’部位までの距離によっ
て測定される。
プライマーと共に用いるための複数の異なる官能性ベク
トレットライブラリーの製造を含む、各ベクトレットラ
イブラリーは標的核酸の異なる開裂部位における開裂お
よび標的核酸フラグメントからの前記官能性ベクトレッ
トライブラリーを形成するような結合による標的核酸フ
ラグメント／ベクトレット単位の形成によって製造さ
れ、各官能性ベクトレットライブラリーをハイブリッド
形成条件下で適当なエンドヌクレオシド トリホスフェ
ートとエンドヌクレオシド トリホスフェートの重合剤
とによって別々にまたは同時に処理することによって同
一開始プライマーの使用に基づく、複数の第１プライマ
ー エクステンション生成物が得られる。このようなエ
クステンション生成物のサイズは第１プライマーから最
も近い、特定開裂手段（例えば、特定ライブラリー構成
に用いる制限酵素）のための３’部位までの距離によっ
て測定される。
【００２６】望ましい場合には、１種類以上の前記第１
プライマー エクステンション生成物を単離および／ま
たは配列決定することができる、またはエクステンショ
ン生成物の少なくとも一部を前記のように配列決定する
ことができる。従って、例えばこの実施態様は目的の、
通常は最も長い、第１プライマー領域を含む標的核酸フ
ラグメントの同定に用いることができるので、本発明の
方法をさらに用いるための新しい出発点を形成するため
に、３’末端を前述のように便利に配列決定することが
できる。上記の最も長い標的核酸フラグメントの３’末
端の配列は他の区切りのベクトレットライブラリー多重
第１プライマー エクステンション生成物形成、最も長
い標的核酸フラグメントの同定および配列決定のための
新しい標的核酸フラグメントの第１プライミング領域に
成る。標的核酸フラグメントの３’末端において本発明
の方法を用いて得られる新しい配列データに基づく新し
い第１プライミング領域を選択する場合には、このよう
な新しい配列データを既知核酸配列の公的に利用可能な
データベース コンパイル（例えば、ゲンバンク ＥＭ
ＢＬ）とルーチンに比較して、提案される新しい第１プ
ライミング領域が例えば問題のゲノムＤＮＡにおいて他
の公知の核酸配列と偶然にも密接に一致することがない
ことを保証することができる。このことは、特定の標的
核酸配列の３’末端が例えばＡｌｕ配列のような反復要
素をたまたま含む場合に明らかに非常に起こりやすい。
このような場合には、生成するエクステンション生成物
の少なくとも一つが他の第１プライミング領域の選択の
ための非反復／唯一の３’末端を有することを保証する
ために、一定第１プライマーを含む複数のベクトレット
ライブラリーに対して本発明の方法を実施することが
有利である。
プライマー エクステンション生成物を単離および／ま
たは配列決定することができる、またはエクステンショ
ン生成物の少なくとも一部を前記のように配列決定する
ことができる。従って、例えばこの実施態様は目的の、
通常は最も長い、第１プライマー領域を含む標的核酸フ
ラグメントの同定に用いることができるので、本発明の
方法をさらに用いるための新しい出発点を形成するため
に、３’末端を前述のように便利に配列決定することが
できる。上記の最も長い標的核酸フラグメントの３’末
端の配列は他の区切りのベクトレットライブラリー多重
第１プライマー エクステンション生成物形成、最も長
い標的核酸フラグメントの同定および配列決定のための
新しい標的核酸フラグメントの第１プライミング領域に
成る。標的核酸フラグメントの３’末端において本発明
の方法を用いて得られる新しい配列データに基づく新し
い第１プライミング領域を選択する場合には、このよう
な新しい配列データを既知核酸配列の公的に利用可能な
データベース コンパイル（例えば、ゲンバンク ＥＭ
ＢＬ）とルーチンに比較して、提案される新しい第１プ
ライミング領域が例えば問題のゲノムＤＮＡにおいて他
の公知の核酸配列と偶然にも密接に一致することがない
ことを保証することができる。このことは、特定の標的
核酸配列の３’末端が例えばＡｌｕ配列のような反復要
素をたまたま含む場合に明らかに非常に起こりやすい。
このような場合には、生成するエクステンション生成物
の少なくとも一つが他の第１プライミング領域の選択の
ための非反復／唯一の３’末端を有することを保証する
ために、一定第１プライマーを含む複数のベクトレット
ライブラリーに対して本発明の方法を実施することが
有利である。
【００２７】今までに未知の第１プライミング領域から
他のプライミング領域までの標的核酸に沿った段階的進
行を標的核酸フラグメント／ベクトレット単位（前記で
定義した「ベクトレット ライブラリー」）の調製に用
いたものと同じ制限エンドヌクレアーゼによる完成のた
めに別々に開裂し、アガロースゲル電気泳動およびサザ
ン ブロッチングを実施した前記標的核酸のサンプルを
用いて便利にモニターすることができる。開始第１プラ
イマーによってこのように得られたフィルターのプロー
ビング（Ｐｒｏｂｉｎｇ）は標的核酸内のこの開始第１
プライミング領域を囲む様々な制限酵素認識部位と一致
するバンドのパターンを明らかにする。複数のベクトレ
ット ライブラリーとこの開始第１プライマーとによる
本発明の方法の使用は、各の３’末端が問題のベクトレ
ット ライブラリーの形成に用いられる制限酵素の最も
近い認識部位の第１プライミング領域に対する位置によ
って定義される、一連のエクステンション生成物を形成
する。このようにして、開始第１プライマーの３’側ま
での制限部位のマップが効果的に得られる。次に、今ま
でに未知の配列の第２の新しい第１プライミング領域を
選択すると、開始第１プライミング領域への結合は第２
の新しい第１プライマーによる上記サザンブロット フ
ィルターによる再プロービングによって確認される。得
られたバンドのパターンは第１プライミング領域と第２
の第１プライミング領域との間に問題の制限酵素の認識
部位が存在しない場合に開始第１プライマーによって得
られたものと同じである。対応ベクトレット ライブラ
リーにおける小エクステンション生成物の出現によって
判断されるように問題の制限酵素の認識部位が第１プラ
イミング領域間に生ずるような場合には、第２の第１プ
ライマーによるサザンブロット フィルターの再プロー
ビング時に異なるサイズのフラグメントが通常観察され
る。この方法を繰り返すことによって、一つの開始プラ
イミング領域から他のプライミング領域への標的核酸に
沿った段階的進行の一貫性、正確性および信頼性が維持
され、保証される。
他のプライミング領域までの標的核酸に沿った段階的進
行を標的核酸フラグメント／ベクトレット単位（前記で
定義した「ベクトレット ライブラリー」）の調製に用
いたものと同じ制限エンドヌクレアーゼによる完成のた
めに別々に開裂し、アガロースゲル電気泳動およびサザ
ン ブロッチングを実施した前記標的核酸のサンプルを
用いて便利にモニターすることができる。開始第１プラ
イマーによってこのように得られたフィルターのプロー
ビング（Ｐｒｏｂｉｎｇ）は標的核酸内のこの開始第１
プライミング領域を囲む様々な制限酵素認識部位と一致
するバンドのパターンを明らかにする。複数のベクトレ
ット ライブラリーとこの開始第１プライマーとによる
本発明の方法の使用は、各の３’末端が問題のベクトレ
ット ライブラリーの形成に用いられる制限酵素の最も
近い認識部位の第１プライミング領域に対する位置によ
って定義される、一連のエクステンション生成物を形成
する。このようにして、開始第１プライマーの３’側ま
での制限部位のマップが効果的に得られる。次に、今ま
でに未知の配列の第２の新しい第１プライミング領域を
選択すると、開始第１プライミング領域への結合は第２
の新しい第１プライマーによる上記サザンブロット フ
ィルターによる再プロービングによって確認される。得
られたバンドのパターンは第１プライミング領域と第２
の第１プライミング領域との間に問題の制限酵素の認識
部位が存在しない場合に開始第１プライマーによって得
られたものと同じである。対応ベクトレット ライブラ
リーにおける小エクステンション生成物の出現によって
判断されるように問題の制限酵素の認識部位が第１プラ
イミング領域間に生ずるような場合には、第２の第１プ
ライマーによるサザンブロット フィルターの再プロー
ビング時に異なるサイズのフラグメントが通常観察され
る。この方法を繰り返すことによって、一つの開始プラ
イミング領域から他のプライミング領域への標的核酸に
沿った段階的進行の一貫性、正確性および信頼性が維持
され、保証される。
【００２８】複数の第１プライマー エクステンション
生成物の全ての３’末端の配列ガそれ自体公知の方法に
よって配列決定用の同じベクトレット プライマーまた
はネステッド ベクトレット プライマーを用いて容易
に得られることは理解されるであろう。このようにし
て、標的ＤＮＡ核酸の未知セグメントの全配列が容易
な、系統的な方法で、例えばＭ１３「ショットガン」ク
ローニングを用いるよりも非常に便利に決定される。こ
れは、第１プライマー エクステンション生成物がサイ
ズによって順序づけられるので、オリジナルの標的核酸
中のそれらの配列の順序が明らかに成るからである。各
第１プライマーのエクステンション生成物は第１プライ
マーによって決定される５’末端とその特定ベクトレッ
ト ライブラリーの合成に用いられる特定開裂手段（例
えば、制限酵素）のための最も近い３’部位によって決
定される３’末端とを共有する。従って、本発明の好ま
しい実施態様では、得られた第１プライマー エクステ
ンション生成物のいずれかまたは全てを少なくとも一定
第１プライマーから遠位の端部において配列決定して、
他の第１プライマーの配列を決定することによって、他
の第１プライマーのプライマー エクステンションに基
づく他の第１プライマー エクステンション生成物を得
る。
生成物の全ての３’末端の配列ガそれ自体公知の方法に
よって配列決定用の同じベクトレット プライマーまた
はネステッド ベクトレット プライマーを用いて容易
に得られることは理解されるであろう。このようにし
て、標的ＤＮＡ核酸の未知セグメントの全配列が容易
な、系統的な方法で、例えばＭ１３「ショットガン」ク
ローニングを用いるよりも非常に便利に決定される。こ
れは、第１プライマー エクステンション生成物がサイ
ズによって順序づけられるので、オリジナルの標的核酸
中のそれらの配列の順序が明らかに成るからである。各
第１プライマーのエクステンション生成物は第１プライ
マーによって決定される５’末端とその特定ベクトレッ
ト ライブラリーの合成に用いられる特定開裂手段（例
えば、制限酵素）のための最も近い３’部位によって決
定される３’末端とを共有する。従って、本発明の好ま
しい実施態様では、得られた第１プライマー エクステ
ンション生成物のいずれかまたは全てを少なくとも一定
第１プライマーから遠位の端部において配列決定して、
他の第１プライマーの配列を決定することによって、他
の第１プライマーのプライマー エクステンションに基
づく他の第１プライマー エクステンション生成物を得
る。
【００２９】本発明の他の好ましい実施態様では、第１
プライマー エクステンション生成物またはその一部を
配列決定することによって、前記エクステンション生成
物またはその一部を特性化する。
プライマー エクステンション生成物またはその一部を
配列決定することによって、前記エクステンション生成
物またはその一部を特性化する。
【００３０】本発明の他の態様では、未知配列の核酸フ
ラグメントのプライマー エクステンションによる増幅
用のキットであって、次の要素：標的核酸フラグメント
への連結用または標的核酸フラグメント／ベクトレット
単位への連結用のベクトレット、前記フラグメントまた
はベクトレット単位は使用時に単一末端ベクトレットを
有するかまたは標的核酸フラグメントの各末端にベクト
レットを有する標的フラグメント／ベクトレット単位を
形成する標的核酸開裂手段によって得られたものであ
り、前記ベクトレットはその少なくとも一つの鎖がその
二重鎖相補形または一重鎖形において蛋白質によって結
合され得る核酸配列を有するようなベクトレットであ
る；書かれたまたは印刷されたキットの使用説明書を含
むキットを提供する。このキットは下記に挙げるものか
ら選択される一つ以上の要素をさらに含むことが有利で
ある：本発明のキットはさらに、ベクトレット中に存在
する核酸配列と結合しうる適当な蛋白質を含むことが好
ましい。従って、例えば核酸配列がＲＮＡポリメラーゼ
によって結合される場合には、キットは付加的にＲＮＡ
ポリメラーゼ、例えばＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼを含む。
ラグメントのプライマー エクステンションによる増幅
用のキットであって、次の要素：標的核酸フラグメント
への連結用または標的核酸フラグメント／ベクトレット
単位への連結用のベクトレット、前記フラグメントまた
はベクトレット単位は使用時に単一末端ベクトレットを
有するかまたは標的核酸フラグメントの各末端にベクト
レットを有する標的フラグメント／ベクトレット単位を
形成する標的核酸開裂手段によって得られたものであ
り、前記ベクトレットはその少なくとも一つの鎖がその
二重鎖相補形または一重鎖形において蛋白質によって結
合され得る核酸配列を有するようなベクトレットであ
る；書かれたまたは印刷されたキットの使用説明書を含
むキットを提供する。このキットは下記に挙げるものか
ら選択される一つ以上の要素をさらに含むことが有利で
ある：本発明のキットはさらに、ベクトレット中に存在
する核酸配列と結合しうる適当な蛋白質を含むことが好
ましい。従って、例えば核酸配列がＲＮＡポリメラーゼ
によって結合される場合には、キットは付加的にＲＮＡ
ポリメラーゼ、例えばＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼを含む。
【００３１】（１）標的核酸フラグメントを得るためま
たは標的核酸フラグメント／ベクトレッ ト単位を
得るために特定部位において標的核酸を開裂する手段； （２）４種類のヌクレオシド トリホスフェート；およ
び （３）（２）のヌクレオシド トリホスフェートの重合
剤。
たは標的核酸フラグメント／ベクトレッ ト単位を
得るために特定部位において標的核酸を開裂する手段； （２）４種類のヌクレオシド トリホスフェート；およ
び （３）（２）のヌクレオシド トリホスフェートの重合
剤。
【００３２】ベクトレットが標的核酸フラグメントまた
は標的核酸フラグメント／ベクトレット単位（単一末端
ベクトレット単位）への連結に適したものであるなら
ば、標的核酸フラグメントを得るためまたは標的核酸フ
ラグメント／ベクトレット単位を得るために特定部位に
おいて標的核酸を開裂する手段がベクトレットの末端を
製造するための手段と必ずしも同じである必要がないこ
とは理解されよう。
は標的核酸フラグメント／ベクトレット単位（単一末端
ベクトレット単位）への連結に適したものであるなら
ば、標的核酸フラグメントを得るためまたは標的核酸フ
ラグメント／ベクトレット単位を得るために特定部位に
おいて標的核酸を開裂する手段がベクトレットの末端を
製造するための手段と必ずしも同じである必要がないこ
とは理解されよう。
【００３３】キットは付加的に適当な第１プライマーお
よび／またはベクトレット プライマーを含み、このよ
うなプライマーは化学的遺伝学方法（前述）に関して述
べたようなハイブリッド形成用プライマーおよび／また
はその二重鎖相補形またはその一重鎖形において蛋白質
によって結合される核酸配列へのハイブリッド化用プラ
イマーを含む。
よび／またはベクトレット プライマーを含み、このよ
うなプライマーは化学的遺伝学方法（前述）に関して述
べたようなハイブリッド形成用プライマーおよび／また
はその二重鎖相補形またはその一重鎖形において蛋白質
によって結合される核酸配列へのハイブリッド化用プラ
イマーを含む。
【００３４】下記で定義するような標的核酸フラグメン
ト／ベクトレット単位のベクトレット部分にベクトレッ
ト プライミング領域が存在してもまたは存在しなくて
もよい。従って、本発明のキットのベクトレット（２）
はそれ自体ベクトレット プライミング領域を含まない
ことがある。従って、このような単位は例えば以下に述
べるような第１プライマーのプライマー エクステエン
ションの結果としてのみ生ずるベクトレット プライミ
ング領域を含む。さらに、標的核酸フラグメント／ベク
トレット単位がベクトレット プライミング部分を含ま
ないことが好ましい、増幅は例えば、ヌクレオシド ト
リホスフェートの重合剤、例えばＤＮＡポリメラーゼま
たはＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６またはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ）によって結合されうるベクトレッ
ト中の核酸配列を用いて行われる。以下で定義する「標
的核酸フラグメント／ベクトレット単位」（「ベクトレ
ット単位」とも呼ぶ）なるこの明細書を通しての表現は
このように理解すべきである。 キットは任意に、標的
核酸フラグメント／ベクトレット単位のベクトレット
プライミング領域に実質的に相補的なヌクレオチド配列
を有するベクレットプライマーを含むことができる。本
発明のキット中にこのようなベクトレットプライマーが
存在することは、標的核酸フラグメント／ベクトレット
単位の増幅のＰＣＲ方法（以下で定義）による実施を、
これが望ましい場合には可能にする。 このキットは、
例えば必要な場合にはまたは望ましい場合には第２増幅
反応のためにおよび／または、ユー．ビー．ギレンスタ
イン（Ｕ．Ｂ．Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｉｎ）およびエッ
チ．エールリッヒ（Ｈ．Ｅｈｒｌｉｃｈ）によってプロ
ク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ８５、７６５２−７
６５６（１９８８）に述べられているように、増幅生成
物の直接配列決定のために用いられる、一連の「ネステ
ッド」ベクトレット プライマーをも含みうる。このよ
うなベクトレット プライマーの全てが第１プライマー
のみを用いる線状増幅によって得られるフラグメントの
遠位端部のための直接配列決定用プライマーとして有用
であることは理解されよう。
ト／ベクトレット単位のベクトレット部分にベクトレッ
ト プライミング領域が存在してもまたは存在しなくて
もよい。従って、本発明のキットのベクトレット（２）
はそれ自体ベクトレット プライミング領域を含まない
ことがある。従って、このような単位は例えば以下に述
べるような第１プライマーのプライマー エクステエン
ションの結果としてのみ生ずるベクトレット プライミ
ング領域を含む。さらに、標的核酸フラグメント／ベク
トレット単位がベクトレット プライミング部分を含ま
ないことが好ましい、増幅は例えば、ヌクレオシド ト
リホスフェートの重合剤、例えばＤＮＡポリメラーゼま
たはＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６またはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ）によって結合されうるベクトレッ
ト中の核酸配列を用いて行われる。以下で定義する「標
的核酸フラグメント／ベクトレット単位」（「ベクトレ
ット単位」とも呼ぶ）なるこの明細書を通しての表現は
このように理解すべきである。 キットは任意に、標的
核酸フラグメント／ベクトレット単位のベクトレット
プライミング領域に実質的に相補的なヌクレオチド配列
を有するベクレットプライマーを含むことができる。本
発明のキット中にこのようなベクトレットプライマーが
存在することは、標的核酸フラグメント／ベクトレット
単位の増幅のＰＣＲ方法（以下で定義）による実施を、
これが望ましい場合には可能にする。 このキットは、
例えば必要な場合にはまたは望ましい場合には第２増幅
反応のためにおよび／または、ユー．ビー．ギレンスタ
イン（Ｕ．Ｂ．Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｉｎ）およびエッ
チ．エールリッヒ（Ｈ．Ｅｈｒｌｉｃｈ）によってプロ
ク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ８５、７６５２−７
６５６（１９８８）に述べられているように、増幅生成
物の直接配列決定のために用いられる、一連の「ネステ
ッド」ベクトレット プライマーをも含みうる。このよ
うなベクトレット プライマーの全てが第１プライマー
のみを用いる線状増幅によって得られるフラグメントの
遠位端部のための直接配列決定用プライマーとして有用
であることは理解されよう。
【００３５】調べるべき標的核酸は通常キットの使用者
にとって特別であるので、第１プライマーは通常はキッ
ト中に存在しないが、キットの使用者によって製造され
る。しかし、本発明のキットは任意にさらに、第１プラ
イマーと望ましい場合には、ネステッド第１プライマー
とを含みうる。 本発明のキットは本発明の方法を実施
するための緩衝剤を含むことも有利であり、キットの特
徴は例えば、反応混合物のカリウム、マグネシウムおよ
びヌクレオシド トリホスフェート濃度を変えるための
緩衝剤の存在である。これらの後者の緩衝剤は本発明の
方法の次のサイクルのための最適条件を決定するために
望ましい。
にとって特別であるので、第１プライマーは通常はキッ
ト中に存在しないが、キットの使用者によって製造され
る。しかし、本発明のキットは任意にさらに、第１プラ
イマーと望ましい場合には、ネステッド第１プライマー
とを含みうる。 本発明のキットは本発明の方法を実施
するための緩衝剤を含むことも有利であり、キットの特
徴は例えば、反応混合物のカリウム、マグネシウムおよ
びヌクレオシド トリホスフェート濃度を変えるための
緩衝剤の存在である。これらの後者の緩衝剤は本発明の
方法の次のサイクルのための最適条件を決定するために
望ましい。
【００３６】キットが標的核酸または標的核酸フラグメ
ント／ベクトレットをそれぞれ特定の単位部位において
開裂するための手段を二つ以上（複数）含むことが望ま
しい。複数のこのような手段が存在する場合に、キット
は得られる各セットの標的核酸フラグメントまたは標的
核酸フラグメント／ベクトレット単位（それぞれ単一ベ
クトレット部分を含む）に関して標的核酸フラグメント
／ベクトレット単位の形成を可能にするために、存在す
るこのような各手段に対して異なるベクトレットを通常
含む。本発明はこの用途に限定されないが、複数の異な
るベクトレットがベクトレット プライマーに相補的な
配列を共有することが有利である。このような場合に、
複数の標的核酸開裂部位から単一ベクトレット プライ
マーが増幅される。
ント／ベクトレットをそれぞれ特定の単位部位において
開裂するための手段を二つ以上（複数）含むことが望ま
しい。複数のこのような手段が存在する場合に、キット
は得られる各セットの標的核酸フラグメントまたは標的
核酸フラグメント／ベクトレット単位（それぞれ単一ベ
クトレット部分を含む）に関して標的核酸フラグメント
／ベクトレット単位の形成を可能にするために、存在す
るこのような各手段に対して異なるベクトレットを通常
含む。本発明はこの用途に限定されないが、複数の異な
るベクトレットがベクトレット プライマーに相補的な
配列を共有することが有利である。このような場合に、
複数の標的核酸開裂部位から単一ベクトレット プライ
マーが増幅される。
【００３７】従って、好ましい実施態様では、本発明の
キットは付加的に次の要素：第１プライマー、ネステッ
ド ベクトレット プライマー、ネステッド第１プライ
マー、配列決定用プライマー、本発明の方法を実施する
ための緩衝剤ならびに、マグネシウム、カリウムおよび
ヌクレオシド トリホスフェート濃度を変えるための緩
衝剤から選択される一つ以上の要素を含みうる。
キットは付加的に次の要素：第１プライマー、ネステッ
ド ベクトレット プライマー、ネステッド第１プライ
マー、配列決定用プライマー、本発明の方法を実施する
ための緩衝剤ならびに、マグネシウム、カリウムおよび
ヌクレオシド トリホスフェート濃度を変えるための緩
衝剤から選択される一つ以上の要素を含みうる。
【００３８】本発明の他の態様によると、未知配列の核
酸フラグメントのプライマー エクステンションによる
増幅用のベクトレット ライブラリー キットを提供す
る、このキットは次の要素を含む： （１）動物、植物または微生物の種の固体要素のヌクレ
オシド配列から得られ、１個または２個の末端ベクトレ
ット部分を含み、前記部分の少なくとも一つがその二重
鎖相補形またはその一重鎖形において蛋白質によって結
合され得る核酸配列を含む少なくとも一つの鎖を有する
標的核酸フラグメント／ベクトレット単位セットをそれ
ぞれ含む少なくとも一つのベクトレット ライブラリ
ー；および （２）標的核酸フラグメント／ベクトレット単位の第１
プライミング領域にハイブリッド化する第１プライマー
（複数の場合も）。
酸フラグメントのプライマー エクステンションによる
増幅用のベクトレット ライブラリー キットを提供す
る、このキットは次の要素を含む： （１）動物、植物または微生物の種の固体要素のヌクレ
オシド配列から得られ、１個または２個の末端ベクトレ
ット部分を含み、前記部分の少なくとも一つがその二重
鎖相補形またはその一重鎖形において蛋白質によって結
合され得る核酸配列を含む少なくとも一つの鎖を有する
標的核酸フラグメント／ベクトレット単位セットをそれ
ぞれ含む少なくとも一つのベクトレット ライブラリ
ー；および （２）標的核酸フラグメント／ベクトレット単位の第１
プライミング領域にハイブリッド化する第１プライマー
（複数の場合も）。
【００３９】ベクトレット ライブラリー キットは複
数のベクトレット ライブラリーを含むことが好まし
い。
数のベクトレット ライブラリーを含むことが好まし
い。
【００４０】ベクトレット ライブラリー キットは本
発明の既述したキットに比べて付加的に上記特徴の一つ
以上を含む。
発明の既述したキットに比べて付加的に上記特徴の一つ
以上を含む。
【００４１】標的核酸フラグメント／ベクトレット単位
は例えば、望ましい種から直接または、プラスミド、フ
ァージ、コスミドまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベク
ターにおける初期クローニング後にこのような種から間
接的に製造される。用いる動物、植物または微生物の種
は好ましくはヒトであるが、他の動物、植物または例え
ば細菌、ウイルス、酵母または寄生体のような微生物の
いずれでもよい。ヌクレオチド配列は好ましくはゲノム
ＤＮＡからであるが、特定の染色体またはクローンから
でもよい。
は例えば、望ましい種から直接または、プラスミド、フ
ァージ、コスミドまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベク
ターにおける初期クローニング後にこのような種から間
接的に製造される。用いる動物、植物または微生物の種
は好ましくはヒトであるが、他の動物、植物または例え
ば細菌、ウイルス、酵母または寄生体のような微生物の
いずれでもよい。ヌクレオチド配列は好ましくはゲノム
ＤＮＡからであるが、特定の染色体またはクローンから
でもよい。
【００４２】用いるベクトレット単位は単一開裂方法に
基づくものである、および／または多重開裂方法に基づ
く複数のベクトレット単位であり、これらは一緒にまた
は別々にベクトレット ライブラリーまたは複数のベク
トレット ライブラリー（以下で定義）を構成し得る。
基づくものである、および／または多重開裂方法に基づ
く複数のベクトレット単位であり、これらは一緒にまた
は別々にベクトレット ライブラリーまたは複数のベク
トレット ライブラリー（以下で定義）を構成し得る。
【００４３】用いる標的核酸フラグメントは幾つかの異
なるソースに基づくものでもよい。従って、例えば標的
核酸フラグメントは動物、植物または微生物の種の単一
固体から、例えばそれらの種に典型的な固体から得られ
る。標的核酸フラグメントはまた特定遺伝座、例えばの
う性線維症または他の遺伝疾患を生ずる座に対してヘテ
ロ接合体であると知られている単一固体からも得られ
る。 標的核酸フラグメントはまた特定遺伝座、例えば
のう性線維症または他の遺伝疾患を生ずる座に対してホ
モ接合体であると知られている単一固体からも得られ
る。 標的核酸フラグメントはまた特定遺伝座、例えば
のう性線維症または他の遺伝疾患を生ずる座に対して正
常ホモ接合体であると知られている単一固体からも得ら
れる。標的核酸フラグメントは共有表現型を有する固体
群（単一固体に対して）からも得られる。表現型を共有
する群の各要素からの核酸または組織は任意にプールす
ることができる。各固体群は少なくとも２、好ましくは
１０００未満、 例えば５０−５００の要素から成る。
ベクトレット単位は標的核酸フラグメントから製造さ
れ、プールされるかまたは別々に用いられてベクトレッ
ト ライブラリーを形成する。共有表現型は任意に疾患
または疾患素因、遺伝疾患の真正キャリッジまたは、疾
患もしくは疾患素因の徴候を示さない正常状態である。
なるソースに基づくものでもよい。従って、例えば標的
核酸フラグメントは動物、植物または微生物の種の単一
固体から、例えばそれらの種に典型的な固体から得られ
る。標的核酸フラグメントはまた特定遺伝座、例えばの
う性線維症または他の遺伝疾患を生ずる座に対してヘテ
ロ接合体であると知られている単一固体からも得られ
る。 標的核酸フラグメントはまた特定遺伝座、例えば
のう性線維症または他の遺伝疾患を生ずる座に対してホ
モ接合体であると知られている単一固体からも得られ
る。 標的核酸フラグメントはまた特定遺伝座、例えば
のう性線維症または他の遺伝疾患を生ずる座に対して正
常ホモ接合体であると知られている単一固体からも得ら
れる。標的核酸フラグメントは共有表現型を有する固体
群（単一固体に対して）からも得られる。表現型を共有
する群の各要素からの核酸または組織は任意にプールす
ることができる。各固体群は少なくとも２、好ましくは
１０００未満、 例えば５０−５００の要素から成る。
ベクトレット単位は標的核酸フラグメントから製造さ
れ、プールされるかまたは別々に用いられてベクトレッ
ト ライブラリーを形成する。共有表現型は任意に疾患
または疾患素因、遺伝疾患の真正キャリッジまたは、疾
患もしくは疾患素因の徴候を示さない正常状態である。
【００４４】本発明の方法を用いて得られたヌクレオチ
ド配列の比較は、例えば一定疾患または疾患素因によっ
て「関係」する集団における一般的な遺伝的変異型を検
出する。これがＲＦＬＰテクノロジーを用いて今までに
試みられた以上に詳細な分析の範囲を広げるものである
ことは理解されよう。
ド配列の比較は、例えば一定疾患または疾患素因によっ
て「関係」する集団における一般的な遺伝的変異型を検
出する。これがＲＦＬＰテクノロジーを用いて今までに
試みられた以上に詳細な分析の範囲を広げるものである
ことは理解されよう。
【００４５】本発明のベクトレット ライブラリー キ
ットは付加的にベクトレット プライマーを含み、有利
にはネステッド第１プライマー、ネステッド ベクトレ
ットプライマーおよび配列決定用プライマーから選択さ
れた一つ以上を含む。ベクトレット ライブラリー キ
ットはまた便利には４種類のヌクレオシド トリホスフ
ェートの各々およびヌクレオシド トリホスフェートの
重合剤をも含む。望ましい場合には、ベクトレット ラ
イブラリー キットはさらに本発明を実施するための緩
衝剤および／またはマグネシウム、カリウムおよびヌク
レオシド トリホスフェート濃度を変えるための緩衝剤
を含む。これらの後者の緩衝剤は本発明の方法の次のサ
イクルのための最適条件を決定するために望ましい。
ットは付加的にベクトレット プライマーを含み、有利
にはネステッド第１プライマー、ネステッド ベクトレ
ットプライマーおよび配列決定用プライマーから選択さ
れた一つ以上を含む。ベクトレット ライブラリー キ
ットはまた便利には４種類のヌクレオシド トリホスフ
ェートの各々およびヌクレオシド トリホスフェートの
重合剤をも含む。望ましい場合には、ベクトレット ラ
イブラリー キットはさらに本発明を実施するための緩
衝剤および／またはマグネシウム、カリウムおよびヌク
レオシド トリホスフェート濃度を変えるための緩衝剤
を含む。これらの後者の緩衝剤は本発明の方法の次のサ
イクルのための最適条件を決定するために望ましい。
【００４６】本発明はi）短い増幅生成物、例えばＰＣ
Ｒ生成物の直接ＤＮＡ配列決定によるまたはＲＮＡ転写
体からの化学的遺伝学方法によるヌクレオチド配列決定
の実施、ii）例えばハイブリッド化プローブとしてのよ
うな様々な用途のためのＲＮＡ転写体の形成、iii）ラ
イブラリー構成と化学的遺伝学「段階」とのための化学
的遺伝学方法のベクトレットの代替物提供、iv）ＲＮＡ
転写体を介した、ＰＣＲによる以外の配列増幅、v）増
幅生成物からの末端ベクトレット領域のサブクローニン
グおよびvi）ＰＣＲ生成物からのフラグメントのサブク
ローニングを可能にする。
Ｒ生成物の直接ＤＮＡ配列決定によるまたはＲＮＡ転写
体からの化学的遺伝学方法によるヌクレオチド配列決定
の実施、ii）例えばハイブリッド化プローブとしてのよ
うな様々な用途のためのＲＮＡ転写体の形成、iii）ラ
イブラリー構成と化学的遺伝学「段階」とのための化学
的遺伝学方法のベクトレットの代替物提供、iv）ＲＮＡ
転写体を介した、ＰＣＲによる以外の配列増幅、v）増
幅生成物からの末端ベクトレット領域のサブクローニン
グおよびvi）ＰＣＲ生成物からのフラグメントのサブク
ローニングを可能にする。
【００４７】本明細書の読者を助けるために、ここで用
いる用語の解釈を以下に述べる。
いる用語の解釈を以下に述べる。
【００４８】「標的核酸」なる用語はヌクレオチド配
列、一般にゲノムＤＮＡ、例えば植物または動物のゲノ
ムＤＮＡ、例えばヒトＤＮＡまたは細菌ＤＮＡを意味す
る。本発明の方法に用いるためのこのような「標的核
酸」は、通常既知配列の部分（一般に小さい部分）と未
知配列の一般に非常に大きい部分とを含む。
列、一般にゲノムＤＮＡ、例えば植物または動物のゲノ
ムＤＮＡ、例えばヒトＤＮＡまたは細菌ＤＮＡを意味す
る。本発明の方法に用いるためのこのような「標的核
酸」は、通常既知配列の部分（一般に小さい部分）と未
知配列の一般に非常に大きい部分とを含む。
【００４９】ここで用いる「標的核酸フラグメント」な
る用語は標的核酸の開裂（以下で定義）によって得られ
る標的核酸のフラグメントを意味する。従って、「標的
核酸フラグメント」なる用語は制限エンドヌクレアーゼ
の使用によって得られるようなフラグメントに限定され
ない。さらに、このようなフラグメントは例えば既知配
列の部分と未知配列の一般に非常に大きい部分とを含
む、またはフラグメントは未知配列である。フラグメン
トが未知配列である場合には、標的核酸フラグメント／
ベクトレット単位の開裂と形成とを以下に述べるように
実施する。このような場合には、非常に大きいゲノム
フラグメントから「ランダム」第１プライマーによる線
状増幅によってまたはランダム第１プライマー プラス
ベクトレット プライマーによる増幅によってランダ
ムＤＮＡプローブが形成される。特異的増幅がランダム
にフラグメントを形成し、これを精製して、セル（Ｃｅ
ｌｌ）５１、３１９−３３７（１９８７）エッチ．ドニ
スーケレー（Ｈ．Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ）等におけ
るように遺伝マップ形成に用いることができる。
る用語は標的核酸の開裂（以下で定義）によって得られ
る標的核酸のフラグメントを意味する。従って、「標的
核酸フラグメント」なる用語は制限エンドヌクレアーゼ
の使用によって得られるようなフラグメントに限定され
ない。さらに、このようなフラグメントは例えば既知配
列の部分と未知配列の一般に非常に大きい部分とを含
む、またはフラグメントは未知配列である。フラグメン
トが未知配列である場合には、標的核酸フラグメント／
ベクトレット単位の開裂と形成とを以下に述べるように
実施する。このような場合には、非常に大きいゲノム
フラグメントから「ランダム」第１プライマーによる線
状増幅によってまたはランダム第１プライマー プラス
ベクトレット プライマーによる増幅によってランダ
ムＤＮＡプローブが形成される。特異的増幅がランダム
にフラグメントを形成し、これを精製して、セル（Ｃｅ
ｌｌ）５１、３１９−３３７（１９８７）エッチ．ドニ
スーケレー（Ｈ．Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ）等におけ
るように遺伝マップ形成に用いることができる。
【００５０】ここで用いる「増幅」なる用語は、ヌクレ
オチド配列および／またはその相補的配列の非生物学的
手段による複製を意味し、標的核酸フラグメント／ベク
トレット単位の第１プライミング領域にハイブリッド化
する第１プライマーのみの使用による増幅、ハイブリッ
ド形成条件下、適当なヌクレオシド トリホスフェート
とヌクレオシド トリホスフェートの重合剤との存在下
における、変性を伴うプライマー エクステンションを
含み、プライミング、プライマー エクステンションお
よび変性のこのプロセスは目的の増幅レベルに達するま
で任意の回数繰り返される。「増幅」なる用語はまた、
第１プライマーと以下で定義するようなベクトレット
プライマーとを用いる、例えばアール．ケイ．サイキ等
のサイエンス、２３９、４８７−４９１（１９８７）お
よび米国特許第４，６８３，１９５号と第４，６８３，
２０２号に述べられているようなポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）方法による複製を含む、ここで用いるポリメ
ラーゼ連鎖反応方法またはＰＣＲ方法はこれらの参考文
献に述べられているような方法を意味する。
オチド配列および／またはその相補的配列の非生物学的
手段による複製を意味し、標的核酸フラグメント／ベク
トレット単位の第１プライミング領域にハイブリッド化
する第１プライマーのみの使用による増幅、ハイブリッ
ド形成条件下、適当なヌクレオシド トリホスフェート
とヌクレオシド トリホスフェートの重合剤との存在下
における、変性を伴うプライマー エクステンションを
含み、プライミング、プライマー エクステンションお
よび変性のこのプロセスは目的の増幅レベルに達するま
で任意の回数繰り返される。「増幅」なる用語はまた、
第１プライマーと以下で定義するようなベクトレット
プライマーとを用いる、例えばアール．ケイ．サイキ等
のサイエンス、２３９、４８７−４９１（１９８７）お
よび米国特許第４，６８３，１９５号と第４，６８３，
２０２号に述べられているようなポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）方法による複製を含む、ここで用いるポリメ
ラーゼ連鎖反応方法またはＰＣＲ方法はこれらの参考文
献に述べられているような方法を意味する。
【００５１】ここで用いる「非生物学的」なる用語は細
菌コロニーの直接クローニングおよび伸長による増幅の
みを排除する。それ故、ここで用いる増幅なる用語が例
えばＰＣＴ特許公報第ＷＯ８７／０６２７０号（または
バイオテクノロジー ６巻、１９８８年１０月号）、Ｐ
ＣＴ特許公報第ＷＯ８８／１０３１５号またはＰＣＴ特
許公報第ＷＯ８９／０１０５０号に述べられているよう
な増幅方法を含む。
菌コロニーの直接クローニングおよび伸長による増幅の
みを排除する。それ故、ここで用いる増幅なる用語が例
えばＰＣＴ特許公報第ＷＯ８７／０６２７０号（または
バイオテクノロジー ６巻、１９８８年１０月号）、Ｐ
ＣＴ特許公報第ＷＯ８８／１０３１５号またはＰＣＴ特
許公報第ＷＯ８９／０１０５０号に述べられているよう
な増幅方法を含む。
【００５２】ここで用いる「開裂」なる用語は、核酸フ
ラグメント／ベクトレット単位のいずれかの部分におけ
る特定部位での核酸の開裂を意味する。このような開裂
は制限エンドヌクレアーゼを用いて行うのが便利であ
る。
ラグメント／ベクトレット単位のいずれかの部分におけ
る特定部位での核酸の開裂を意味する。このような開裂
は制限エンドヌクレアーゼを用いて行うのが便利であ
る。
【００５３】核酸フラグメントに関して、これは既知認
識配列と開裂パターン、すなわち特定部位におけるＤＮ
Ａ開裂の特徴とを有する６ｂｐカッターであることが好
ましい。これに関して、一定標的核酸におけるこれらの
「特定部位」の位置は標的核酸における他の既知要素の
位置に対して通常知られていないが、特定部位の配列は
それらの開裂パターンと同様に知られている。従って、
得られた制限フラグメントの末端配列は判明する。従っ
て、例えば制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩは次の配
列：
識配列と開裂パターン、すなわち特定部位におけるＤＮ
Ａ開裂の特徴とを有する６ｂｐカッターであることが好
ましい。これに関して、一定標的核酸におけるこれらの
「特定部位」の位置は標的核酸における他の既知要素の
位置に対して通常知られていないが、特定部位の配列は
それらの開裂パターンと同様に知られている。従って、
得られた制限フラグメントの末端配列は判明する。従っ
て、例えば制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩは次の配
列：
【００５４】
【化１】
【００５５】を認識し、このような配列を図示するよう
に開裂して、図示する結合性端部を有する制限フラグメ
ントを生ずる。結合性端部の配列は既知であるので、以
下で「標的核酸フラグメント／ベクトレット単位」なる
表現に関して述べるように、この知識に基づいて標的核
酸フラグメント／ベクトレット単位を製造することがで
きる。
に開裂して、図示する結合性端部を有する制限フラグメ
ントを生ずる。結合性端部の配列は既知であるので、以
下で「標的核酸フラグメント／ベクトレット単位」なる
表現に関して述べるように、この知識に基づいて標的核
酸フラグメント／ベクトレット単位を製造することがで
きる。
【００５６】制限エンドヌクレアーゼ以外にも、特定部
位において標的核酸を開裂する手段を用いることができ
るが、制限エンドヌクレアーゼの使用が好ましい。便利
な制限エンドヌクレアーゼを用いることができる。
位において標的核酸を開裂する手段を用いることができ
るが、制限エンドヌクレアーゼの使用が好ましい。便利
な制限エンドヌクレアーゼを用いることができる。
【００５７】個々の制限エンドヌクレアーゼの例にはヌ
クレイック アシドス リサーチ、シーケンス増刊号、
１６巻、１９８８、ｒ２７１−ｒ３１３頁および「分子
生物学における最新プロトコール」アウスベル エフ．
エム．，ブレント アール．、キングストン アール．
イー．，ムーア デイ．デイ．，スミス ジェイ．エ
イ．，セイドマン ジェイ．ジー．およびストルール
ケイ．，編集、ウイリーインターサイエンス、セクショ
ン３、表３．１−１に詳述されているものがある。例え
ば、ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａIのような結
合性端部を有するフラグメントを製造し得る制限エンド
ヌクレアーゼは５’または３’突出部（ｏｖｅｒｈａｎ
ｇ）を有する。３’または５’突出結合性端部を有する
フラグメントを製造し得る制限エンドヌクレアーゼの使
用によると同様に、核酸フラグメント／ベクトレット単
位の製造が適当なブラントエンド（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ
ｅｄ）ベクトレット（以下で定義）と共にブラントエン
ド フラグメントを製造し得る制限エンドヌクレアーゼ
を用いても可能であることも理解されよう。標準制限エ
ンドヌクレアーゼ消化による以外の（ａ）特定部位にお
ける標的核酸の開裂手段は技術上公知であり、例えばア
ダプター−プライマーとクラスーIIＳ制限酵素の使用
［エス．シー．キム（Ｓ．Ｃ．Ｋｉｍ）等、サイエンス
２４０ ５０４−５０６（１９８８）；ダブリュ．シ
バルスキー（Ｗ．Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ），ジーン（Ｇｅ
ｎｅ），４０，１６９（１９８５）；エイ．ジェイ．ポ
ダジェスカ（Ａ．Ｊ．Ｐｏｄｈａｊｓｋａ）とダブリ
ュ．シバルスキー、ジーン、４０１７５（１９８３）］
ならびに様々な化学的アプローチ［ビー．エル．イバー
ソン（Ｂ．Ｌ．Ｉｖｅｒｓｏｎ）とピー．ビー．ダーバ
ン（Ｐ．Ｂ．Ｄｅｒｂａｎ），ジェイ．アム．ケム．ソ
ク．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）１０９、１２４
１−１２４３（１９８７）；ジー．ビー．ドレイヤー
（Ｇ．Ｂ．Ｄｒｅｙｅｒ）とピー．ビー．ダーバン、プ
ロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ，８２９６８（１
９８５）；ブイ．ブイ．ブラッソフ（Ｖ．Ｖ．Ｂｌａｓ
ｓｏｖ）等、ヌクレイック アシドス リサーチ、１
４、４０６５（１９８６）；エッチ．イー．モサー
（Ｈ．Ｅ．Ｍｏｓｅｒ）とピー．ビー．ダーバン、サイ
エンス、２３８、６４５（１９８７）；デイ．アール．
コレイ（Ｄ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ）とピー．ジー．シュルツ
（Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ），サイエンス、２３８、１
４０１（１９８７）；ジェイ．ピー．スルカ（Ｊ．Ｐ．
Ｓｌｕｋａ）等、サイエンス、２３８、１１２９（１９
８７）］を含む。
クレイック アシドス リサーチ、シーケンス増刊号、
１６巻、１９８８、ｒ２７１−ｒ３１３頁および「分子
生物学における最新プロトコール」アウスベル エフ．
エム．，ブレント アール．、キングストン アール．
イー．，ムーア デイ．デイ．，スミス ジェイ．エ
イ．，セイドマン ジェイ．ジー．およびストルール
ケイ．，編集、ウイリーインターサイエンス、セクショ
ン３、表３．１−１に詳述されているものがある。例え
ば、ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａIのような結
合性端部を有するフラグメントを製造し得る制限エンド
ヌクレアーゼは５’または３’突出部（ｏｖｅｒｈａｎ
ｇ）を有する。３’または５’突出結合性端部を有する
フラグメントを製造し得る制限エンドヌクレアーゼの使
用によると同様に、核酸フラグメント／ベクトレット単
位の製造が適当なブラントエンド（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ
ｅｄ）ベクトレット（以下で定義）と共にブラントエン
ド フラグメントを製造し得る制限エンドヌクレアーゼ
を用いても可能であることも理解されよう。標準制限エ
ンドヌクレアーゼ消化による以外の（ａ）特定部位にお
ける標的核酸の開裂手段は技術上公知であり、例えばア
ダプター−プライマーとクラスーIIＳ制限酵素の使用
［エス．シー．キム（Ｓ．Ｃ．Ｋｉｍ）等、サイエンス
２４０ ５０４−５０６（１９８８）；ダブリュ．シ
バルスキー（Ｗ．Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ），ジーン（Ｇｅ
ｎｅ），４０，１６９（１９８５）；エイ．ジェイ．ポ
ダジェスカ（Ａ．Ｊ．Ｐｏｄｈａｊｓｋａ）とダブリ
ュ．シバルスキー、ジーン、４０１７５（１９８３）］
ならびに様々な化学的アプローチ［ビー．エル．イバー
ソン（Ｂ．Ｌ．Ｉｖｅｒｓｏｎ）とピー．ビー．ダーバ
ン（Ｐ．Ｂ．Ｄｅｒｂａｎ），ジェイ．アム．ケム．ソ
ク．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）１０９、１２４
１−１２４３（１９８７）；ジー．ビー．ドレイヤー
（Ｇ．Ｂ．Ｄｒｅｙｅｒ）とピー．ビー．ダーバン、プ
ロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ，８２９６８（１
９８５）；ブイ．ブイ．ブラッソフ（Ｖ．Ｖ．Ｂｌａｓ
ｓｏｖ）等、ヌクレイック アシドス リサーチ、１
４、４０６５（１９８６）；エッチ．イー．モサー
（Ｈ．Ｅ．Ｍｏｓｅｒ）とピー．ビー．ダーバン、サイ
エンス、２３８、６４５（１９８７）；デイ．アール．
コレイ（Ｄ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ）とピー．ジー．シュルツ
（Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ），サイエンス、２３８、１
４０１（１９８７）；ジェイ．ピー．スルカ（Ｊ．Ｐ．
Ｓｌｕｋａ）等、サイエンス、２３８、１１２９（１９
８７）］を含む。
【００５８】さらに５’突出結合性端部のＤＮＡポリメ
ラーゼ仲介充てん／修復によってまたはＳｌヌクレアー
ゼ仲介一重鎖消化を用いる３’および／または５’突出
部の除去によって、標的核酸フラグメントを、これらが
制限酵素消化によって形成されたものかまたは他の、例
えば化学的、手段によって形成されたものかに関係な
く、ブランドエンドにすることができる。このようなブ
ランドエンド フラグメントを、適当なブランドエンド
ベクトレットによっての付着によって、標的核酸フラ
グメント／ベクトレット単位に再び転化することができ
る。
ラーゼ仲介充てん／修復によってまたはＳｌヌクレアー
ゼ仲介一重鎖消化を用いる３’および／または５’突出
部の除去によって、標的核酸フラグメントを、これらが
制限酵素消化によって形成されたものかまたは他の、例
えば化学的、手段によって形成されたものかに関係な
く、ブランドエンドにすることができる。このようなブ
ランドエンド フラグメントを、適当なブランドエンド
ベクトレットによっての付着によって、標的核酸フラ
グメント／ベクトレット単位に再び転化することができ
る。
【００５９】ここで用いる「第１プライミング領域」な
る表現は、開裂した、例えば制限酵素、消化された標的
核酸フラグメントの、既知ヌクレオチド配列を有し、使
用時に第１プライマーおよび任意にネステッド第１プラ
イマー（以下で定義）、例えば重複ネステッド第１プラ
イマーがハイブリッド化するような部分を意味する。従
って、例えば本発明の方法は存在する標的核酸フラグメ
ントの一つのみが、第１プライミング領域が開始プライ
ミング領域に一致する化学的遺伝学方法（前記で定義）
におけるように、第１プライミング領域を有するよう
に、実施することができる。例外は以下で定義するよう
な種々なベクトレット ライブラリーの複数の混合物の
使用である。さらに、本発明の方法は単位の各端部にベ
クトレット部分を有する標的核酸フラグメント／ベクト
レット単位を用いても実施することができる、この場合
にベクトレット部分の一つは第１プライミング領域を含
む。ここで用いる「ベクトレット プライミング領域」
なる表現は、ベクトレット自体によって定義される既知
ヌクレオチド配列を有し、使用時にベクトレットプライ
マーおよび任意にネステッド ベクトレット プライマ
ー（以下に定義）、例えば重複ネステッド ベクトレッ
ト プライマーがハイブリッド化する、標的核酸フラグ
メント／ベクトレット単位の部分を意味する。開始プラ
イミング領域を含む鎖に相補的な鎖中に、ベクトレット
プライミング領域が存在する。これに関して、使用時
にベクトレット プライマーおよび任意にネステッド
ベクトレット プライマーがハイブリッド化する「ベク
トレット プライミング領域」は連結によって製造され
た標的核酸フラグメント／ベクトレット単位中または開
始プライマーのプライマー エクステンションによって
製造された標的核酸フラグメント／ベクトレット単位中
または両方に存在する。従って、本発明の方法に用いる
ベクトレット プライマーおよび任意にネステッド ベ
クトレット プライマーが、例えば開始プライマーおよ
び任意のネステッド開始プライマーのプライマー エク
ステンションまでは形成されないベクトレット プライ
ミング領域とのハイブリッド化のために選択されること
が理解されよう。この結果、例えばベクトレット自体が
完全な自己相補性二重鎖ＤＮＡフラグメントである必要
はない。
る表現は、開裂した、例えば制限酵素、消化された標的
核酸フラグメントの、既知ヌクレオチド配列を有し、使
用時に第１プライマーおよび任意にネステッド第１プラ
イマー（以下で定義）、例えば重複ネステッド第１プラ
イマーがハイブリッド化するような部分を意味する。従
って、例えば本発明の方法は存在する標的核酸フラグメ
ントの一つのみが、第１プライミング領域が開始プライ
ミング領域に一致する化学的遺伝学方法（前記で定義）
におけるように、第１プライミング領域を有するよう
に、実施することができる。例外は以下で定義するよう
な種々なベクトレット ライブラリーの複数の混合物の
使用である。さらに、本発明の方法は単位の各端部にベ
クトレット部分を有する標的核酸フラグメント／ベクト
レット単位を用いても実施することができる、この場合
にベクトレット部分の一つは第１プライミング領域を含
む。ここで用いる「ベクトレット プライミング領域」
なる表現は、ベクトレット自体によって定義される既知
ヌクレオチド配列を有し、使用時にベクトレットプライ
マーおよび任意にネステッド ベクトレット プライマ
ー（以下に定義）、例えば重複ネステッド ベクトレッ
ト プライマーがハイブリッド化する、標的核酸フラグ
メント／ベクトレット単位の部分を意味する。開始プラ
イミング領域を含む鎖に相補的な鎖中に、ベクトレット
プライミング領域が存在する。これに関して、使用時
にベクトレット プライマーおよび任意にネステッド
ベクトレット プライマーがハイブリッド化する「ベク
トレット プライミング領域」は連結によって製造され
た標的核酸フラグメント／ベクトレット単位中または開
始プライマーのプライマー エクステンションによって
製造された標的核酸フラグメント／ベクトレット単位中
または両方に存在する。従って、本発明の方法に用いる
ベクトレット プライマーおよび任意にネステッド ベ
クトレット プライマーが、例えば開始プライマーおよ
び任意のネステッド開始プライマーのプライマー エク
ステンションまでは形成されないベクトレット プライ
ミング領域とのハイブリッド化のために選択されること
が理解されよう。この結果、例えばベクトレット自体が
完全な自己相補性二重鎖ＤＮＡフラグメントである必要
はない。
【００６０】ここで用いる「プライマー」なる用語は、
精製制限消化物中に自然に生じるかまたは合成物に製造
されるかのいずれかであるオリゴヌクレオチドであり、
核酸鎖に対して相補的であるプライマー エクステンシ
ョン生成物の合成が誘導されるような条件下、すなわち
適当な緩衝剤（「緩衝剤」はｐＨ、イオン強度、補因子
等を含む）中におよび適当な温度における適当なヌクレ
オシド トリホスフェートおよびヌクレオシド トリホ
スフェートの重合剤の存在下において、合成の開始点と
して作用しうる。
精製制限消化物中に自然に生じるかまたは合成物に製造
されるかのいずれかであるオリゴヌクレオチドであり、
核酸鎖に対して相補的であるプライマー エクステンシ
ョン生成物の合成が誘導されるような条件下、すなわち
適当な緩衝剤（「緩衝剤」はｐＨ、イオン強度、補因子
等を含む）中におよび適当な温度における適当なヌクレ
オシド トリホスフェートおよびヌクレオシド トリホ
スフェートの重合剤の存在下において、合成の開始点と
して作用しうる。
【００６１】プライマーはエクステンションにおいて最
大効率を示すように一重鎖であることが好ましいが、こ
の代りに二重鎖であることもできる。二重鎖である場合
には、エクステンション生成物の製造に用いる前に、プ
ライマーを最初に処理してその鎖を分離させる。プライ
マーは重合剤の存在下でエクステンション生成物の合成
を開始させるために十分に長くなければならない。プラ
イマーの正確な長さは、温度、プライマーのソースおよ
び方法の使用を含めた、多くの要素に依存する。例え
ば、標的配列の複雑さ（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）に依存
して、第１プライマーとベクトレット プライマーは典
型的に１５−３５ヌクレオチドを含むが、これより多い
または少ないヌクレオチドを含むこともできる。短いプ
ライマー分子は一般に、鋳型による十分い安定なハイブ
リッド複合体を形成するために低温を必要とする。
大効率を示すように一重鎖であることが好ましいが、こ
の代りに二重鎖であることもできる。二重鎖である場合
には、エクステンション生成物の製造に用いる前に、プ
ライマーを最初に処理してその鎖を分離させる。プライ
マーは重合剤の存在下でエクステンション生成物の合成
を開始させるために十分に長くなければならない。プラ
イマーの正確な長さは、温度、プライマーのソースおよ
び方法の使用を含めた、多くの要素に依存する。例え
ば、標的配列の複雑さ（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）に依存
して、第１プライマーとベクトレット プライマーは典
型的に１５−３５ヌクレオチドを含むが、これより多い
または少ないヌクレオチドを含むこともできる。短いプ
ライマー分子は一般に、鋳型による十分い安定なハイブ
リッド複合体を形成するために低温を必要とする。
【００６２】ここで用いる「第１プライマー」なる用語
は前記で定義した第１プライミング領域とハイブリッド
化しうるプライマーを意味する。例えば、完全ヒト ゲ
ノムＤＮＡから製造されるベクトレット単位との使用時
に、「第１プライマー」が第１プライミング領域の配列
と偶然一致するヒト ゲノム中の配列にハイブリッド化
し、ランダムにプライミングすることを避けるために、
１５−１７ヌクレオチドよりも長いことが好ましい。
は前記で定義した第１プライミング領域とハイブリッド
化しうるプライマーを意味する。例えば、完全ヒト ゲ
ノムＤＮＡから製造されるベクトレット単位との使用時
に、「第１プライマー」が第１プライミング領域の配列
と偶然一致するヒト ゲノム中の配列にハイブリッド化
し、ランダムにプライミングすることを避けるために、
１５−１７ヌクレオチドよりも長いことが好ましい。
【００６３】ここで用いる「ベクトレット プライマ
ー」なる用語は標的核酸フラグメント／ベクトレット単
位のベクトレット プライミング領域にハイブリッド化
しうるプライマーを意味する。「ベクトレット プライ
マー」は、その補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）からの分
離後に開始プライマー エクステンション生成物にハイ
ブリッド化するようなヌクレオチド配列を有する、これ
によって開始プライマーエクステンション生成物はベク
トレット プライマーのエクステンション生成物の合成
の鋳型として役立ち、増幅を促進することができる。一
般に、本発明の方法は標的核酸フラグメント／ベクトレ
ット単位の一つのみが開始プライミング領域を有するよ
うに実施されるので、その部分のみが増幅されることに
なる。開始プライミング領域を有さないような標的核酸
フラグメント／ベクトレット単位はＰＣＲ増幅すること
ができない、この理由はベクトレット プライマー エ
クステンション生成物の形成は可能であるとしても、開
始プライミング領域が存在しないので、開始プライマー
はベクトレット プライマー エクステンション生成物
にハイブリッド化できず、従ってＰＣＲ増幅が不可能で
あるからである。
ー」なる用語は標的核酸フラグメント／ベクトレット単
位のベクトレット プライミング領域にハイブリッド化
しうるプライマーを意味する。「ベクトレット プライ
マー」は、その補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）からの分
離後に開始プライマー エクステンション生成物にハイ
ブリッド化するようなヌクレオチド配列を有する、これ
によって開始プライマーエクステンション生成物はベク
トレット プライマーのエクステンション生成物の合成
の鋳型として役立ち、増幅を促進することができる。一
般に、本発明の方法は標的核酸フラグメント／ベクトレ
ット単位の一つのみが開始プライミング領域を有するよ
うに実施されるので、その部分のみが増幅されることに
なる。開始プライミング領域を有さないような標的核酸
フラグメント／ベクトレット単位はＰＣＲ増幅すること
ができない、この理由はベクトレット プライマー エ
クステンション生成物の形成は可能であるとしても、開
始プライミング領域が存在しないので、開始プライマー
はベクトレット プライマー エクステンション生成物
にハイブリッド化できず、従ってＰＣＲ増幅が不可能で
あるからである。
【００６４】使用時に、ベクトレット プライマー増幅
生成物の合成が開始プライマーのエクステンション生成
物の初期合成に依存することが好ましい。これによっ
て、反応混合物中に有効なヌクレオシドトリホスフェー
トまたは他の補因子を不利に欠失させると予想される、
多数の増幅不能なベクトレット プライマー エクステ
ンション生成物の形成が回避される。
生成物の合成が開始プライマーのエクステンション生成
物の初期合成に依存することが好ましい。これによっ
て、反応混合物中に有効なヌクレオシドトリホスフェー
トまたは他の補因子を不利に欠失させると予想される、
多数の増幅不能なベクトレット プライマー エクステ
ンション生成物の形成が回避される。
【００６５】ここで用いる「ネステッド プライマー」
なる用語は開始プライマーの５’末端から３’方向にお
いてまたはこのような開始プライマーとベクトレット
プライマーとの両方の５’末端から３’方向において一
つ以上の塩基対が置換したプライマーを意味する。
なる用語は開始プライマーの５’末端から３’方向にお
いてまたはこのような開始プライマーとベクトレット
プライマーとの両方の５’末端から３’方向において一
つ以上の塩基対が置換したプライマーを意味する。
【００６６】ネステッド プライマーの配列が既知開始
プライミング領域またはベクトレット プライミング領
域に対して、またはこのような両方の領域に対して相補
的配列から選択される必要があることは理解されよう。
プライミング領域またはベクトレット プライミング領
域に対して、またはこのような両方の領域に対して相補
的配列から選択される必要があることは理解されよう。
【００６７】ここでもちいる「標的核酸フラグメント／
ベクトレット単位」（「ベクトレット単位」ともここで
は呼ぶ）なる用語は、標的核酸フラグメントと、一重鎖
形において、前記で定義したベクトレット プライマー
にハイブリッド化しうるような既知ヌクレオチド配列部
分、例えばＤＮＡ配列部分とを含むヌクレオチド配列、
例えばＤＮＡ配列を意味する。
ベクトレット単位」（「ベクトレット単位」ともここで
は呼ぶ）なる用語は、標的核酸フラグメントと、一重鎖
形において、前記で定義したベクトレット プライマー
にハイブリッド化しうるような既知ヌクレオチド配列部
分、例えばＤＮＡ配列部分とを含むヌクレオチド配列、
例えばＤＮＡ配列を意味する。
【００６８】これに関して、「標的核酸フラグメント／
ベクトレット単位」が、ベクトレット プライマーの配
列に実質的に相補的である既知ヌクレオチド配列部分の
前記単位中の存在によって、または鋳型としての前記単
位の一つの鎖に基づく、第１プライマー エクステンシ
ョン生成物がベクトレット プライマーの配列に実質的
に相補的であるヌクレオチド配列を含みうることによっ
てベクトレット プライマーにハイブリッド化しうるこ
とが理解されよう。これに関して、「標的核酸フラグメ
ント／ベクトレット単位」が一つの鎖にベクトレット
プライマーと少なくとも一部において実質的に同じ配列
を有するようなものであることが理解されよう。この鎖
は第１プライミング領域をも含む。「標的核酸フラグメ
ント／ベクトレット単位」なる用語が状況が可能である
場合には、各フラグメントの５’末端と３’末端にベク
トレット部分を有する標的核酸フラグメントを含むヌク
レオチド配列、例えばＤＮＡ配列をも含むことが理解さ
れよう。このような場合に、ベクトレット単位は一重鎖
形において第１プライミング領域をも含むベクトレット
部分の一つを有する。
ベクトレット単位」が、ベクトレット プライマーの配
列に実質的に相補的である既知ヌクレオチド配列部分の
前記単位中の存在によって、または鋳型としての前記単
位の一つの鎖に基づく、第１プライマー エクステンシ
ョン生成物がベクトレット プライマーの配列に実質的
に相補的であるヌクレオチド配列を含みうることによっ
てベクトレット プライマーにハイブリッド化しうるこ
とが理解されよう。これに関して、「標的核酸フラグメ
ント／ベクトレット単位」が一つの鎖にベクトレット
プライマーと少なくとも一部において実質的に同じ配列
を有するようなものであることが理解されよう。この鎖
は第１プライミング領域をも含む。「標的核酸フラグメ
ント／ベクトレット単位」なる用語が状況が可能である
場合には、各フラグメントの５’末端と３’末端にベク
トレット部分を有する標的核酸フラグメントを含むヌク
レオチド配列、例えばＤＮＡ配列をも含むことが理解さ
れよう。このような場合に、ベクトレット単位は一重鎖
形において第１プライミング領域をも含むベクトレット
部分の一つを有する。
【００６９】既知ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列
の部分は都合のよいいずれのソースからも、ベクトレッ
ト プライマーにその一重鎖形においてハイブリッド化
しうるという上記要件を満たすならば、誘導される。従
って、例えば、ベクトレットをＤＮＡシンセサイザーを
用いて別に製造し、得られたベクトレットを核酸フラグ
メントに連結して、標的核酸フラグメント／ベクトレッ
ト単位を得ることもできる。これに関して、ベクトレッ
トはベクトレット上の結合性端部とハイブリッド化しう
る核酸フラグメント、例えば核酸フラグメント上の結合
性端部に連結して、前記で定義したようなベクトレット
単位を形成することが便利である、またはブランドエン
ド標的核酸フラグメントがブランドエンド ベクトレッ
トに連結して前記で定義したベクトレット単位を形成す
ることもできる。しかし、標的核酸フラグメントとの連
結前にベクトレットを予め形成することは、これは望ま
しいとしても、必要ではない。従って、例えば前記単位
は、適当な場合には、一重鎖ＤＮＡの標的核酸フラグメ
ントへの連結によって形成される、例えば結合性端の突
出部を利用して第１の一重鎖ＤＮＡをそれに固定し、次
に第２の一重鎖ＤＮＡを連結させて、目的の単位を形成
することができる。
の部分は都合のよいいずれのソースからも、ベクトレッ
ト プライマーにその一重鎖形においてハイブリッド化
しうるという上記要件を満たすならば、誘導される。従
って、例えば、ベクトレットをＤＮＡシンセサイザーを
用いて別に製造し、得られたベクトレットを核酸フラグ
メントに連結して、標的核酸フラグメント／ベクトレッ
ト単位を得ることもできる。これに関して、ベクトレッ
トはベクトレット上の結合性端部とハイブリッド化しう
る核酸フラグメント、例えば核酸フラグメント上の結合
性端部に連結して、前記で定義したようなベクトレット
単位を形成することが便利である、またはブランドエン
ド標的核酸フラグメントがブランドエンド ベクトレッ
トに連結して前記で定義したベクトレット単位を形成す
ることもできる。しかし、標的核酸フラグメントとの連
結前にベクトレットを予め形成することは、これは望ま
しいとしても、必要ではない。従って、例えば前記単位
は、適当な場合には、一重鎖ＤＮＡの標的核酸フラグメ
ントへの連結によって形成される、例えば結合性端の突
出部を利用して第１の一重鎖ＤＮＡをそれに固定し、次
に第２の一重鎖ＤＮＡを連結させて、目的の単位を形成
することができる。
【００７０】本発明の１実施態様では、標的核酸フラグ
メント／ベクトレット単位が阻止ベクトレット部分を含
む。ここで用いる「阻止ベクトレット」なる用語は、一
方のまたは両方の自由末端塩基が修飾された形で、それ
に対するヌクレオチド連結を阻止するまたは例えばハイ
ブリッド形成条件下の適当な ヌクレオシド トリホス
フェートとヌクレオシド トリホスフェートの重合剤と
の存在下において、プライマー エクステンションを阻
止するような、ベクトレットまたは標的核酸フラグメン
ト／ベクトレット単位のベクトレット部分を意味する。
このような修飾はそれ自体公知であり、例えばジデオキ
シヌクレオシドの存在を含む。従って例えば、二重鎖阻
止ベクトレットは例えばジデオキシアデノシン（ｄｄ
Ａ）のような３’末端ジデオキシヌクレオシドを含みう
る。このような修飾は、リボースのジオールが例えば過
ヨウ素酸塩（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）によって開裂された
リボヌクレオシドをも含みうる。または、３’−デオキ
シヌクレオシド、例えば３’−デオキシアデノシン残基
を、例えばコルジセピン トリホスフェートと末端トラ
ンスフェラーゼとを用いて、３’−末端に加えることも
できる。他の代替手段としては、３’−アミノまたは
３’−チオ官能基をそれ自体公知の方法によって３’末
端に化学的に導入することができる。
メント／ベクトレット単位が阻止ベクトレット部分を含
む。ここで用いる「阻止ベクトレット」なる用語は、一
方のまたは両方の自由末端塩基が修飾された形で、それ
に対するヌクレオチド連結を阻止するまたは例えばハイ
ブリッド形成条件下の適当な ヌクレオシド トリホス
フェートとヌクレオシド トリホスフェートの重合剤と
の存在下において、プライマー エクステンションを阻
止するような、ベクトレットまたは標的核酸フラグメン
ト／ベクトレット単位のベクトレット部分を意味する。
このような修飾はそれ自体公知であり、例えばジデオキ
シヌクレオシドの存在を含む。従って例えば、二重鎖阻
止ベクトレットは例えばジデオキシアデノシン（ｄｄ
Ａ）のような３’末端ジデオキシヌクレオシドを含みう
る。このような修飾は、リボースのジオールが例えば過
ヨウ素酸塩（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）によって開裂された
リボヌクレオシドをも含みうる。または、３’−デオキ
シヌクレオシド、例えば３’−デオキシアデノシン残基
を、例えばコルジセピン トリホスフェートと末端トラ
ンスフェラーゼとを用いて、３’−末端に加えることも
できる。他の代替手段としては、３’−アミノまたは
３’−チオ官能基をそれ自体公知の方法によって３’末
端に化学的に導入することができる。
【００７１】本発明の他の特に好ましい実施態様では、
ベクトレットまたはベクトレット部分がこのようなベク
トレットによってベクトレット プライマー エクステ
ンションが行われないような、非相補性度を有する、二
つの部分的に加水分解された一重鎖配列を含み、非相補
性領域の核酸配列はその二重鎖相補形または一重鎖形に
おいて蛋白質によって結合されうる。
ベクトレットまたはベクトレット部分がこのようなベク
トレットによってベクトレット プライマー エクステ
ンションが行われないような、非相補性度を有する、二
つの部分的に加水分解された一重鎖配列を含み、非相補
性領域の核酸配列はその二重鎖相補形または一重鎖形に
おいて蛋白質によって結合されうる。
【００７２】ここでもちいる「ヌクレオシド トリホス
フェート」なる用語はＤＮＡまたはＲＮＡに存在するヌ
クレオシドのトリホスフェートを意味し、従って塩基と
してアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラ
シル有するヌクレオシドを含み、糖部分はデオキシリボ
ースかまたはリボースである。一般に、デオキシリボヌ
クレオシドはＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて用いら
れる。しかし、通常の塩基のアデニン、シトシン、グア
ニン、チミンおよびウラシルの一つと塩基対を形成しう
る他の修飾塩基も使用可能であることは理解されよう。
このような修飾塩基には例えばクーデアザグアニンおよ
びヒポキサンチンがある。
フェート」なる用語はＤＮＡまたはＲＮＡに存在するヌ
クレオシドのトリホスフェートを意味し、従って塩基と
してアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラ
シル有するヌクレオシドを含み、糖部分はデオキシリボ
ースかまたはリボースである。一般に、デオキシリボヌ
クレオシドはＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて用いら
れる。しかし、通常の塩基のアデニン、シトシン、グア
ニン、チミンおよびウラシルの一つと塩基対を形成しう
る他の修飾塩基も使用可能であることは理解されよう。
このような修飾塩基には例えばクーデアザグアニンおよ
びヒポキサンチンがある。
【００７３】ここで用いる「ヌクレオチド」なる用語は
ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在するヌクレオチドを意味
し、従って塩基としてアデニン、シトニン、グアニン、
チミンおよびウラシルを有するヌクレオチドを含み、糖
部分はデオキシリボースまたはリボースである。通常の
塩基アデニン、シトニン、グアニン、チミンおよびウラ
シルと塩基対を形成しうる他の修飾塩基も、本発明に用
いる開始プライマーおよびベクトレット プライマーに
使用可能であることは理解されよう。このような修飾塩
基は例えば７−デアザグアニンおよびヒポキサンチンを
含む。
ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在するヌクレオチドを意味
し、従って塩基としてアデニン、シトニン、グアニン、
チミンおよびウラシルを有するヌクレオチドを含み、糖
部分はデオキシリボースまたはリボースである。通常の
塩基アデニン、シトニン、グアニン、チミンおよびウラ
シルと塩基対を形成しうる他の修飾塩基も、本発明に用
いる開始プライマーおよびベクトレット プライマーに
使用可能であることは理解されよう。このような修飾塩
基は例えば７−デアザグアニンおよびヒポキサンチンを
含む。
【００７４】ヌクレオチド トリホスフェートの重合剤
は酵素を含めた、プライマー エクステンション生成物
の合成を達成させるように作用する化合物または系であ
る。このための適当な酵素は例えば大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼI［リチャードソンシー．シー．（Ｒｉｃｈａｒ
ｄｓｏｎ Ｃ．Ｃ．）等、ジェイ．バイオル．ケム．
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）２３９，２２２（１９６
４）］、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIのクレノフ フラ
グメント［ヤコブセン エッチ．（Ｊａｃｏｂｓｅｎ
Ｈ．）等、ヨウル．ジェイ．バイオケム（Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ）４５、６２３−６２７（１９７
４）］、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ［パネット エイ．
（Ｐａｎｅｔ Ａ．）等、バイオケミストリー（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１２、５０４５−５０５０（１９
７３）］、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ［タバー エス
（Ｔａｂｏｒ Ｓ．）とリチャードセン シー．シ
ー．、プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ８４，４
７６７−４７７１（１９８７）］、その他の有効なＤＮ
Ａポリメラーゼ、逆転写酵素、および熱安定性酵素を含
めた他の酵素である。ここでもちいる「熱安定性酵素」
なる用語は、熱に対して比較的編んでいであり、耐熱性
であり、ヌクレオチドの組み合わせを適当に触媒作用
（促進）して、各核酸鎖に相補的であるプライマー エ
クステンション生成物を形成させる酵素を意味する。一
般に、この合成は各プライマーの３’末端で開始され、
合成が停止して、一般に異なる長さの分子が生成される
まで、５’−方向に鋳型鎖に沿って進行する。本発明に
関して、合成は一般に標的核酸開裂部位によて決定され
る位置で停止するもので、同じ長さの分子が生成する。
しかし、５’末端において合成を開始し、上記と同じプ
ロセスを用いて、他の方向に進行させる、熱安定性酵素
を含めた酵素も存在する。本発明の方法に用いる好まし
い熱安定性酵素を、ヨーロッパ特許公報第２３７，３６
２号（ヨーロッパ特許公報第２５８，０１７号おも参照
のこと）に述べられているように、サーマス アクアチ
カス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から抽出
して、精製する、これは約８６，０００−９０，０００
ダルトンの分子量を有する。サーマス アクアチカス株
ＶＴｌはアメリカン タイプ カルチャー コレクショ
ン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）（１２３０１ パークローン ドラ
イブ、ロックヴィル、メリーランド、米国）からＡＴＣ
Ｃ２５，１０４として無制限に入手可能である。
は酵素を含めた、プライマー エクステンション生成物
の合成を達成させるように作用する化合物または系であ
る。このための適当な酵素は例えば大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼI［リチャードソンシー．シー．（Ｒｉｃｈａｒ
ｄｓｏｎ Ｃ．Ｃ．）等、ジェイ．バイオル．ケム．
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）２３９，２２２（１９６
４）］、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIのクレノフ フラ
グメント［ヤコブセン エッチ．（Ｊａｃｏｂｓｅｎ
Ｈ．）等、ヨウル．ジェイ．バイオケム（Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ）４５、６２３−６２７（１９７
４）］、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ［パネット エイ．
（Ｐａｎｅｔ Ａ．）等、バイオケミストリー（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１２、５０４５−５０５０（１９
７３）］、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ［タバー エス
（Ｔａｂｏｒ Ｓ．）とリチャードセン シー．シ
ー．、プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ８４，４
７６７−４７７１（１９８７）］、その他の有効なＤＮ
Ａポリメラーゼ、逆転写酵素、および熱安定性酵素を含
めた他の酵素である。ここでもちいる「熱安定性酵素」
なる用語は、熱に対して比較的編んでいであり、耐熱性
であり、ヌクレオチドの組み合わせを適当に触媒作用
（促進）して、各核酸鎖に相補的であるプライマー エ
クステンション生成物を形成させる酵素を意味する。一
般に、この合成は各プライマーの３’末端で開始され、
合成が停止して、一般に異なる長さの分子が生成される
まで、５’−方向に鋳型鎖に沿って進行する。本発明に
関して、合成は一般に標的核酸開裂部位によて決定され
る位置で停止するもので、同じ長さの分子が生成する。
しかし、５’末端において合成を開始し、上記と同じプ
ロセスを用いて、他の方向に進行させる、熱安定性酵素
を含めた酵素も存在する。本発明の方法に用いる好まし
い熱安定性酵素を、ヨーロッパ特許公報第２３７，３６
２号（ヨーロッパ特許公報第２５８，０１７号おも参照
のこと）に述べられているように、サーマス アクアチ
カス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から抽出
して、精製する、これは約８６，０００−９０，０００
ダルトンの分子量を有する。サーマス アクアチカス株
ＶＴｌはアメリカン タイプ カルチャー コレクショ
ン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）（１２３０１ パークローン ドラ
イブ、ロックヴィル、メリーランド、米国）からＡＴＣ
Ｃ２５，１０４として無制限に入手可能である。
【００７５】すぐれたまたは有利な性質を有するＤＮＡ
ポリメラーゼがこれらの蛋白質を表現するクローンのラ
ンダム突然変異によって得られることは明らかである。
例えば、５’−エキソヌクレアーゼ活性の欠失のような
すぐれた性質を有する蛋白質の表現を生ずるＴａｇＤＮ
Ａポリメラーゼをコード化する二重鎖ＤＮＡの突然変異
体を得ることが明らかに望ましい。
ポリメラーゼがこれらの蛋白質を表現するクローンのラ
ンダム突然変異によって得られることは明らかである。
例えば、５’−エキソヌクレアーゼ活性の欠失のような
すぐれた性質を有する蛋白質の表現を生ずるＴａｇＤＮ
Ａポリメラーゼをコード化する二重鎖ＤＮＡの突然変異
体を得ることが明らかに望ましい。
【００７６】このような好ましい突然変異体を得る方法
は周知であり、平均的分子生物学者の熟練の範囲に十分
入るものである。ヌクレオチドに関してここで用いる
「相補的」なる用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ中に含まれ
る場合に他の特定ヌクレオチドと塩基対を形成しうるヌ
クレオチドを意味する。従って、デオキシアデノシント
リホスフェートはチミジン トリホスフェートに相補的
であり、デオキシグアノシン トリホスフェートはデオ
キシシチジン トリホスフェートに相補的であるが、デ
オキシグアノシン トリホスフェートはチミジン トリ
ホスフェートに相補的ではない。これに関して、チミジ
ン トリホスフェートとデオキシグアノシン トリホス
フェートがある一定条件下では塩基対を形成するが、こ
れらはこの明細書の目的に対しては相補的と見なされな
いことが明らかである。
は周知であり、平均的分子生物学者の熟練の範囲に十分
入るものである。ヌクレオチドに関してここで用いる
「相補的」なる用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ中に含まれ
る場合に他の特定ヌクレオチドと塩基対を形成しうるヌ
クレオチドを意味する。従って、デオキシアデノシント
リホスフェートはチミジン トリホスフェートに相補的
であり、デオキシグアノシン トリホスフェートはデオ
キシシチジン トリホスフェートに相補的であるが、デ
オキシグアノシン トリホスフェートはチミジン トリ
ホスフェートに相補的ではない。これに関して、チミジ
ン トリホスフェートとデオキシグアノシン トリホス
フェートがある一定条件下では塩基対を形成するが、こ
れらはこの明細書の目的に対しては相補的と見なされな
いことが明らかである。
【００７７】ここでのプライマーはエクステンションま
たは増幅すべき各特定配列の異なる鎖に実質的に相補性
であるように選択する。このことは、プライマーがそれ
らの各鎖にハイブリッド化するためには十分に相補的で
なければならないことを意味する。それ故、プライマー
配列がそれらの鋳型の正確な配列を表すことは、通常は
好ましいとしても、必要ではない。
たは増幅すべき各特定配列の異なる鎖に実質的に相補性
であるように選択する。このことは、プライマーがそれ
らの各鎖にハイブリッド化するためには十分に相補的で
なければならないことを意味する。それ故、プライマー
配列がそれらの鋳型の正確な配列を表すことは、通常は
好ましいとしても、必要ではない。
【００７８】ここで用いる「ベクトレット ライブラリ
ー」なる用語は、標的核酸が含む一定の制限エンドヌク
レアーゼに関して、全ての可能な開裂部位において標的
核酸を開裂した後、標的核酸フラグメントの全混合物か
ら、適当に適応するベクトレット部分への連結サイクル
によって（および必要に応じて開裂をくり返して）標的
核酸フラグメント／ベクトレット単位を形成することに
よって得られる複数の標的核酸フラグメント／ベクトレ
ット単位を意味する。一般に、一定ベクトレット ライ
ブラリーの単一ベクトレット単位のみが問題の第１プラ
イミング領域を有する。特異的６ｂｐ配列を認識する制
限エンドヌクレアーゼ（６ｂｐカッター）によって開裂
したヒト ゲノム ＤＮＡの場合には生成する標的核酸
フラグメントの平均サイズは４０９６ｂｐであり、標的
核酸はこのようなフラグメント約１０6を形成する。従
って、６ｂｐカッター制限エンドヌクレアーゼによって
開裂したヒト ゲノム ＤＮＡから約１０6の標的核酸
フラグメント／ベクトレット単位を含むベクトレット
ライブラリーが得られ、この全ヒト ベクトレットライ
ブラリーの中のこのようなベクトレット単位の一つのみ
がハイブリッド形成条件下、開始プライマー、ベクトレ
ット プライマー（任意）、適当なヌクレオシド トリ
ホスフェートおよびヌクレオシド トリホスフェートの
重合剤の存在下において増幅を開始しうる一定第１プラ
イミング領域を含む。
ー」なる用語は、標的核酸が含む一定の制限エンドヌク
レアーゼに関して、全ての可能な開裂部位において標的
核酸を開裂した後、標的核酸フラグメントの全混合物か
ら、適当に適応するベクトレット部分への連結サイクル
によって（および必要に応じて開裂をくり返して）標的
核酸フラグメント／ベクトレット単位を形成することに
よって得られる複数の標的核酸フラグメント／ベクトレ
ット単位を意味する。一般に、一定ベクトレット ライ
ブラリーの単一ベクトレット単位のみが問題の第１プラ
イミング領域を有する。特異的６ｂｐ配列を認識する制
限エンドヌクレアーゼ（６ｂｐカッター）によって開裂
したヒト ゲノム ＤＮＡの場合には生成する標的核酸
フラグメントの平均サイズは４０９６ｂｐであり、標的
核酸はこのようなフラグメント約１０6を形成する。従
って、６ｂｐカッター制限エンドヌクレアーゼによって
開裂したヒト ゲノム ＤＮＡから約１０6の標的核酸
フラグメント／ベクトレット単位を含むベクトレット
ライブラリーが得られ、この全ヒト ベクトレットライ
ブラリーの中のこのようなベクトレット単位の一つのみ
がハイブリッド形成条件下、開始プライマー、ベクトレ
ット プライマー（任意）、適当なヌクレオシド トリ
ホスフェートおよびヌクレオシド トリホスフェートの
重合剤の存在下において増幅を開始しうる一定第１プラ
イミング領域を含む。
【００７９】同じ標的核酸から異なる制限エンドヌクレ
アーゼによる開裂と適当に適応するベクトレット部分の
結合とによって標的核酸フラグメント／ベクトレット単
位を形成することによって、異なるベクトレット ライ
ブラリーが得られる。この方法には全ての利用可能な制
限エンドヌクレアーゼを任意に用いることができ、その
範囲内でベクトレット部分は標的核酸中の全ての制限酵
素認識部位において標的核酸フラグメントと結合するこ
とができる。一定ベクトレット ライブラリーの問題の
第１プライマー領域はベクトレット部分の付着部位から
１００ｂｐ以上離れることが理想的であるので、この特
徴は必ずしも好ましいとは限らない。この理由は、これ
より小さい第１プライマー エクステンション生成物ま
たは第１プライマー／ベクトレット プライマー増幅生
成物は本発明の実施において、長いヌクレオチド配列の
効果的な配列決定のために殆ど価値のないような小さい
配列情報を形成するからである。さらに、このような小
生成物のヌクレオチド配列はベクトレット部分付着部位
から第１プライマーがさらに離れた、ベクトレットライ
ブラリーを用いて得られた生成物に含まれる。特定第１
プライマーとの複数の異なるベクトレット ライブラリ
ーの使用はエクステンション生成物または増幅生成物が
配列決定のために便利なサイズであるようなライブラリ
ーの確認を可能にする。例えば、特定ベクトレット ラ
イブラリーと一定第１プライマーとから得られる約２０
０ｂｐ、４００ｂｐ、６００ｂｐ、８００ｂｐ、１００
０ｂｐ等第１プライマー エクステンションまたは増幅
生成物を選択することが特に便利である。一定第１プラ
イマーに対して偶然生じた、ベクトレット ライブラリ
ーからのこのような生成物の、ベクトレットまたはネス
テッド ベクトレット配列決定用プライマーとそれ自体
公知である方法とを用いた配列決定は、第１プライマー
の３’側までの大きな領域に関する重複配列データを生
じがちである。一定第１プライマーによる複数のベクト
レット ライブラリーの１ラウンドの分析で得られる配
列データ量は、実際に得られる第１プライマー エクス
テンションまたは増幅生成物のサイズおよび／または複
数のベクトレット ライブラリー中に示される最も遠い
制限エンドヌクレアーゼまでの距離（第１プライマー領
域から）によってのみ限定される。
アーゼによる開裂と適当に適応するベクトレット部分の
結合とによって標的核酸フラグメント／ベクトレット単
位を形成することによって、異なるベクトレット ライ
ブラリーが得られる。この方法には全ての利用可能な制
限エンドヌクレアーゼを任意に用いることができ、その
範囲内でベクトレット部分は標的核酸中の全ての制限酵
素認識部位において標的核酸フラグメントと結合するこ
とができる。一定ベクトレット ライブラリーの問題の
第１プライマー領域はベクトレット部分の付着部位から
１００ｂｐ以上離れることが理想的であるので、この特
徴は必ずしも好ましいとは限らない。この理由は、これ
より小さい第１プライマー エクステンション生成物ま
たは第１プライマー／ベクトレット プライマー増幅生
成物は本発明の実施において、長いヌクレオチド配列の
効果的な配列決定のために殆ど価値のないような小さい
配列情報を形成するからである。さらに、このような小
生成物のヌクレオチド配列はベクトレット部分付着部位
から第１プライマーがさらに離れた、ベクトレットライ
ブラリーを用いて得られた生成物に含まれる。特定第１
プライマーとの複数の異なるベクトレット ライブラリ
ーの使用はエクステンション生成物または増幅生成物が
配列決定のために便利なサイズであるようなライブラリ
ーの確認を可能にする。例えば、特定ベクトレット ラ
イブラリーと一定第１プライマーとから得られる約２０
０ｂｐ、４００ｂｐ、６００ｂｐ、８００ｂｐ、１００
０ｂｐ等第１プライマー エクステンションまたは増幅
生成物を選択することが特に便利である。一定第１プラ
イマーに対して偶然生じた、ベクトレット ライブラリ
ーからのこのような生成物の、ベクトレットまたはネス
テッド ベクトレット配列決定用プライマーとそれ自体
公知である方法とを用いた配列決定は、第１プライマー
の３’側までの大きな領域に関する重複配列データを生
じがちである。一定第１プライマーによる複数のベクト
レット ライブラリーの１ラウンドの分析で得られる配
列データ量は、実際に得られる第１プライマー エクス
テンションまたは増幅生成物のサイズおよび／または複
数のベクトレット ライブラリー中に示される最も遠い
制限エンドヌクレアーゼまでの距離（第１プライマー領
域から）によってのみ限定される。
【００８０】本発明の方法の有利な実施態様では、標的
核酸フラグメントから連結によって標的核酸フラグメン
ト／ベクトレット単位が形成されるが、ベクトレットは
形成された標的核酸フラグメント／ベクトレット単位か
ら、標的核酸フラグメントを得るために標的核酸の開裂
に用いる同じ作用剤によって開裂されない。標的核酸を
制限エンドヌクレアーゼによって開裂して、ベクトレッ
トへの結合のための標的核酸フラグメントを得ることが
特に好ましい、例えば前記ＥｃｏＲＩの場合にベクトレ
ットの配列は前記制限エンドヌクレアーゼの制限エンド
ヌクレアーゼ認識配列が標的核酸フラグメント／ベクト
レット単位中に存在しないように選択することが好まし
い。
核酸フラグメントから連結によって標的核酸フラグメン
ト／ベクトレット単位が形成されるが、ベクトレットは
形成された標的核酸フラグメント／ベクトレット単位か
ら、標的核酸フラグメントを得るために標的核酸の開裂
に用いる同じ作用剤によって開裂されない。標的核酸を
制限エンドヌクレアーゼによって開裂して、ベクトレッ
トへの結合のための標的核酸フラグメントを得ることが
特に好ましい、例えば前記ＥｃｏＲＩの場合にベクトレ
ットの配列は前記制限エンドヌクレアーゼの制限エンド
ヌクレアーゼ認識配列が標的核酸フラグメント／ベクト
レット単位中に存在しないように選択することが好まし
い。
【００８１】
【化２】
【００８２】式中ＸはＣ以外のヌクレオチドであり、Ｙ
はその相補的ヌクレオシドである。本発明がさらに完全
に理解されるために、以下では例を用い、添付図を参照
して説明する：図１（ａ）は化学的遺伝学方法（前記で
定義）に用いるための阻止ベクトレット部分を示し、図
１（ｂ）は図１（ａ）の阻止ベクトレット部分への化学
的遺伝学方法の適用の概略図を示す。図１（ａ）と
（ｂ）はその二重鎖相補形または一重鎖形のいずれかに
おいて本発明によって蛋白質によって結合されうる核酸
配列の相対的位置を示す。
はその相補的ヌクレオシドである。本発明がさらに完全
に理解されるために、以下では例を用い、添付図を参照
して説明する：図１（ａ）は化学的遺伝学方法（前記で
定義）に用いるための阻止ベクトレット部分を示し、図
１（ｂ）は図１（ａ）の阻止ベクトレット部分への化学
的遺伝学方法の適用の概略図を示す。図１（ａ）と
（ｂ）はその二重鎖相補形または一重鎖形のいずれかに
おいて本発明によって蛋白質によって結合されうる核酸
配列の相対的位置を示す。
【００８３】図２（ａ）は化学的遺伝学方法（前記で定
義）に用いるための非相補的ベクトレット部分を示し、
図２（ｂ）は図２（ａ）の非相補的ベクトレット部分へ
の本発明の適用の概略図である。図２（ａ）と２（ｂ）
はその二重鎖相補形またはその一重鎖形において本発明
によって蛋白質によって結合されうる核酸配列の相対的
位置を示す。
義）に用いるための非相補的ベクトレット部分を示し、
図２（ｂ）は図２（ａ）の非相補的ベクトレット部分へ
の本発明の適用の概略図である。図２（ａ）と２（ｂ）
はその二重鎖相補形またはその一重鎖形において本発明
によって蛋白質によって結合されうる核酸配列の相対的
位置を示す。
【００８４】図３は本発明によるベクトレットとプライ
マーとの構造的デザインを示す。
マーとの構造的デザインを示す。
【００８５】図４はＣ．トラコーマチスのＭＯＭＰ（主
要外層膜蛋白質）領域に関するＭＯＭＰ．４．Ｘｂａ
Ｉ，ＭＯＭＰ６．ベクトレット（ヨーロッパ特許第１９
８，０８３号）とシステイン富化外層膜蛋白質（ＣＲ
Ｐ）座に関するＣＲＰ９．８［クラーク．アイ．エヌ等
（１９８８）ジーン７１、３０７−３１４頁］との相対
的位置を示す。
要外層膜蛋白質）領域に関するＭＯＭＰ．４．Ｘｂａ
Ｉ，ＭＯＭＰ６．ベクトレット（ヨーロッパ特許第１９
８，０８３号）とシステイン富化外層膜蛋白質（ＣＲ
Ｐ）座に関するＣＲＰ９．８［クラーク．アイ．エヌ等
（１９８８）ジーン７１、３０７−３１４頁］との相対
的位置を示す。
【００８６】図５は前記で定義した化学的遺伝学方法と
本発明の方法とによるＰＣＲによって得られた増幅フラ
グメントのアガロース ゲル分析の比較を示し、図６は
種々なベクトレット ライブラリーに対してプライマー
６と１を用いてＰＣＲを実施することによって得られた
バンドを示す。
本発明の方法とによるＰＣＲによって得られた増幅フラ
グメントのアガロース ゲル分析の比較を示し、図６は
種々なベクトレット ライブラリーに対してプライマー
６と１を用いてＰＣＲを実施することによって得られた
バンドを示す。
【００８７】図７は本発明の方法によってＭＯＭＰ６．
ベクトレット（ＣｌａＩ）からＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡ
ＴＳサブフラグメントのＰＣＲによる増幅を示す［ここ
で用いる（ＤＥＶＩＡＴＳ」なる用語は交互転写部位を
含む二重鎖ベクトレットを意味する）。
ベクトレット（ＣｌａＩ）からＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡ
ＴＳサブフラグメントのＰＣＲによる増幅を示す［ここ
で用いる（ＤＥＶＩＡＴＳ」なる用語は交互転写部位を
含む二重鎖ベクトレットを意味する）。
【００８８】図８は６−ＣｌａＩベクトレット段階から
のＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメントの配列
から誘導される２プライマーと共にプライマー６を用い
る、クラミジア感染および非感染マクコイ細胞のＰＣＲ
による増幅を示す。
のＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメントの配列
から誘導される２プライマーと共にプライマー６を用い
る、クラミジア感染および非感染マクコイ細胞のＰＣＲ
による増幅を示す。
【００８９】図９は９−ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴＳから
の標識ＲＮＡ転写体によってハイブリッド化したクラミ
ジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザン ブロットのオ
ートラジオグラフを示す。
の標識ＲＮＡ転写体によってハイブリッド化したクラミ
ジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザン ブロットのオ
ートラジオグラフを示す。
【００９０】図１０は８−ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴＳか
らの標識ＲＮＡ転写体によってハイブリッド化したクラ
ミジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザンブロットのオ
ートラジオグラフを示す。
らの標識ＲＮＡ転写体によってハイブリッド化したクラ
ミジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザンブロットのオ
ートラジオグラフを示す。
【００９１】図１１はＥｃｏＲＩベクトレットとＤＥＶ
ＩＡＴＳクラミジアル ライブラリーと共に特異的プラ
イマーを用いたＰＣＲによる増幅を示す。
ＩＡＴＳクラミジアル ライブラリーと共に特異的プラ
イマーを用いたＰＣＲによる増幅を示す。
【００９２】図１２はＭ１３ｍｐ１８−ＸｂａＩ ＤＥ
ＶＩＡＴＳに対する単一サイクルプライマー エクステ
ンション後のＲＮＡ転写体発生を示す。
ＶＩＡＴＳに対する単一サイクルプライマー エクステ
ンション後のＲＮＡ転写体発生を示す。
【００９３】図１３は例６によって得られたＭＯＭＰ
６．のＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメントか
らの配列を示す。
６．のＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメントか
らの配列を示す。
【００９４】図１４はベクトレット２配列の制限部位の
消化と再結合とを示す。
消化と再結合とを示す。
【００９５】さらに詳しく説明すると、図１（ａ）は開
裂標的ＤＮＡ中に生じた相補的末端にアニール化するた
めの結合性末端（１）を有する阻止ベクトレットを示
す。
裂標的ＤＮＡ中に生じた相補的末端にアニール化するた
めの結合性末端（１）を有する阻止ベクトレットを示
す。
【００９６】上部鎖の３’末端は修飾され（Ｘ）、この
末端からの５’--３’エクステンションは既知ポリメラ
ーゼ、例えばクレノフ フラグメント、Ｔ７ ＤＮＡポ
リメラーゼ（配列）またはＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼ
のいずれかを用いて実施される。この修飾末端は例えば
ジデオキシヌクレオシドまたは３’−デオキシヌクレオ
シド（例えばコルジセピン）のような修飾塩基の使用を
含む。３’糖残基は任意にそれ自体公知の化学的方法に
よって修飾される。阻止ベクトレットの下部鎖の３’末
端と上部鎖の５’末端とは開裂標的ＤＮＡの相補的末端
にアニール化するように設計される、他だし、ベクトレ
ットと標的ＤＮＡとの連結後に、標的ＤＮＡの開裂に最
初に用いた制限エンドヌクレアーゼの認識配列は破壊さ
れ、この部位での開裂はもはや不可能になる。
末端からの５’--３’エクステンションは既知ポリメラ
ーゼ、例えばクレノフ フラグメント、Ｔ７ ＤＮＡポ
リメラーゼ（配列）またはＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼ
のいずれかを用いて実施される。この修飾末端は例えば
ジデオキシヌクレオシドまたは３’−デオキシヌクレオ
シド（例えばコルジセピン）のような修飾塩基の使用を
含む。３’糖残基は任意にそれ自体公知の化学的方法に
よって修飾される。阻止ベクトレットの下部鎖の３’末
端と上部鎖の５’末端とは開裂標的ＤＮＡの相補的末端
にアニール化するように設計される、他だし、ベクトレ
ットと標的ＤＮＡとの連結後に、標的ＤＮＡの開裂に最
初に用いた制限エンドヌクレアーゼの認識配列は破壊さ
れ、この部位での開裂はもはや不可能になる。
【００９７】本発明によって用いる阻止ベクトレットは
付加的にその二重鎖相補形または一重鎖形において蛋白
質によって結合されうる核酸配列を含み、このような配
列は図１（ａ）の２によって示す領域に存在する。
付加的にその二重鎖相補形または一重鎖形において蛋白
質によって結合されうる核酸配列を含み、このような配
列は図１（ａ）の２によって示す領域に存在する。
【００９８】図１（ｂ）は図１（ａ）のベクトレット部
分への本発明の適用の概略図である。ゲノム標的ＤＮＡ
は単一制限エンドヌクレアーゼによって完全に消化され
て（i）に示すようなフラグメントを生ずる。阻止ベク
トレット部分［図１（ｂ）（ｉ）の３］はＤＮＡリガー
ゼの存在下において各開裂ゲノム標的ＤＮＡフラグメン
ト（ii）の末端に連結する。次に、変性後に例えばＴａ
ｇポリメラーゼの存在下において既知ヌクレオチド配列
ＸとＹのプライマーを用いて増幅が行われる。 従っ
て、図１（ｂ）（iii）では、Ｘは第１プライマーを表
し、鎖１のＦＰ標識領域（第１プライマー）と同じまた
は少なくとも実質的に同じ配列を有する。Ｘは鎖２の第
１プライミング領域（ＦＰＲ）にハイブリッド化しう
る。第１プライミング領域（ＦＰＲ）を含む鎖２はま
た、ベクトレット プライマー（ＶＰ）のヌクレオチド
配列と同じまたは少なくとも実質的に同じであるヌクレ
オチド配列の一部を含む。使用時に、Ｘのプライマー
エクステンションがプライマーＹによって表されるベク
トレット プライミング領域（ＶＰＲ）を含む鎖を生ず
る。単一鎖１はベクトレット プライミング領域自体は
有さず、重合阻止部分の存在のためにプライマー エク
ステンションを実施することができない、鎖２もベクト
レット プライミング領域を有さず、開始プライマーの
プライマー エクステンションによってベクトレット
プライミング領域が形成されるまで、ベクトレット プ
ライマーのプライマー エクステンションが行われな
い。
分への本発明の適用の概略図である。ゲノム標的ＤＮＡ
は単一制限エンドヌクレアーゼによって完全に消化され
て（i）に示すようなフラグメントを生ずる。阻止ベク
トレット部分［図１（ｂ）（ｉ）の３］はＤＮＡリガー
ゼの存在下において各開裂ゲノム標的ＤＮＡフラグメン
ト（ii）の末端に連結する。次に、変性後に例えばＴａ
ｇポリメラーゼの存在下において既知ヌクレオチド配列
ＸとＹのプライマーを用いて増幅が行われる。 従っ
て、図１（ｂ）（iii）では、Ｘは第１プライマーを表
し、鎖１のＦＰ標識領域（第１プライマー）と同じまた
は少なくとも実質的に同じ配列を有する。Ｘは鎖２の第
１プライミング領域（ＦＰＲ）にハイブリッド化しう
る。第１プライミング領域（ＦＰＲ）を含む鎖２はま
た、ベクトレット プライマー（ＶＰ）のヌクレオチド
配列と同じまたは少なくとも実質的に同じであるヌクレ
オチド配列の一部を含む。使用時に、Ｘのプライマー
エクステンションがプライマーＹによって表されるベク
トレット プライミング領域（ＶＰＲ）を含む鎖を生ず
る。単一鎖１はベクトレット プライミング領域自体は
有さず、重合阻止部分の存在のためにプライマー エク
ステンションを実施することができない、鎖２もベクト
レット プライミング領域を有さず、開始プライマーの
プライマー エクステンションによってベクトレット
プライミング領域が形成されるまで、ベクトレット プ
ライマーのプライマー エクステンションが行われな
い。
【００９９】それ故、第１増幅サイクルにおいては、プ
ライマーＸのみが阻止ベクトレット（iii）の鎖２の末
端まで伸長するエクステンション生成物を製造すること
ができることが理解されよう。プライマーＹは第１サイ
クルではリダンダント（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）である、
この理由はハイブリッド化してエクステンション生成物
を製造するためのこれに対して相補的配列が存在しない
からである。プライマーＹの配列は、ベクトレット形に
おいて一重鎖である鎖２の５’部分内からの塩基と正確
に同じである。第２サイクル以降（v）と（vi）では、
プライマーＹはプライマーＸのエクステンション生成物
とハイブリッド化することができ、このエクステンショ
ン生成物（iv）の相補的合成が進行する。従って、プラ
イマーＹは（iii）に示すような連結生成物のいずれと
もハイブリッド化することができない。これは問題の座
の既知ヌクレオチド配列であるプライマーＸの本質的に
完全に伸長した生成物Ｘにのみハイブリッド化すること
ができる。従って、プライマーＸ、未知ヌクレオチド配
列ＺおよびプライマーＹを含む増幅生成物のみが製造さ
れる。Ｚのヌクレオチド配列は両末端からプライマーＸ
とＹとを配列決定用プライマーとして用いて決定され
る。または、「ネステッド」配列決定用プライマーＸ’
とＹ’を製造することもできる。これらは図１（ｂ）に
おいてプライマーＸの配列３’またはプライマーＹの
３’を含む。
ライマーＸのみが阻止ベクトレット（iii）の鎖２の末
端まで伸長するエクステンション生成物を製造すること
ができることが理解されよう。プライマーＹは第１サイ
クルではリダンダント（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）である、
この理由はハイブリッド化してエクステンション生成物
を製造するためのこれに対して相補的配列が存在しない
からである。プライマーＹの配列は、ベクトレット形に
おいて一重鎖である鎖２の５’部分内からの塩基と正確
に同じである。第２サイクル以降（v）と（vi）では、
プライマーＹはプライマーＸのエクステンション生成物
とハイブリッド化することができ、このエクステンショ
ン生成物（iv）の相補的合成が進行する。従って、プラ
イマーＹは（iii）に示すような連結生成物のいずれと
もハイブリッド化することができない。これは問題の座
の既知ヌクレオチド配列であるプライマーＸの本質的に
完全に伸長した生成物Ｘにのみハイブリッド化すること
ができる。従って、プライマーＸ、未知ヌクレオチド配
列ＺおよびプライマーＹを含む増幅生成物のみが製造さ
れる。Ｚのヌクレオチド配列は両末端からプライマーＸ
とＹとを配列決定用プライマーとして用いて決定され
る。または、「ネステッド」配列決定用プライマーＸ’
とＹ’を製造することもできる。これらは図１（ｂ）に
おいてプライマーＸの配列３’またはプライマーＹの
３’を含む。
【０１００】図２（ａ）は垂直線がハイブリッド化を示
す、非相補的ベクトレットを示す。結合性末端（１）は
図１（ａ）に関して述べた通りである。領域（５）はベ
クトレットの非相補的領域であり、この非相補性度は、
領域５の鎖３にハイブリッド化しうるプライマーが同じ
領域の鎖４には同じ条件下でハイブリッド化しないよう
な程度である。本発明に用いるための非相補性ベクトレ
ットは領域５においてその二重鎖相補形または一重鎖に
おいて蛋白質によって結合されうる核酸配列を含む。こ
のような配列は鎖３または鎖４中に存在する、または異
なる、このような配列が鎖３と４の各々に存在しうる。
す、非相補的ベクトレットを示す。結合性末端（１）は
図１（ａ）に関して述べた通りである。領域（５）はベ
クトレットの非相補的領域であり、この非相補性度は、
領域５の鎖３にハイブリッド化しうるプライマーが同じ
領域の鎖４には同じ条件下でハイブリッド化しないよう
な程度である。本発明に用いるための非相補性ベクトレ
ットは領域５においてその二重鎖相補形または一重鎖に
おいて蛋白質によって結合されうる核酸配列を含む。こ
のような配列は鎖３または鎖４中に存在する、または異
なる、このような配列が鎖３と４の各々に存在しうる。
【０１０１】図２（ｂ）は図２（ａ）の非相補的ベクト
レットへの本発明の方法の適用を説明する。
レットへの本発明の方法の適用を説明する。
【０１０２】図１はベクトレット部分が重合阻止部分を
含む標的核酸フラグメント／ベクトレット単位を参照す
ることによって、本発明の方法を説明する。ベクトレッ
ト部分が前述しかつ図２（ａ）の例によって説明したよ
うな非相補性領域を少なくとも一つ含む場合にも同じ考
察が通用する。このように、図２（ｂ）では図２（ａ）
に示したような、本発明に用いるためのベクトレット
（Ａ）が例えば化学的遺伝学方法によって得られるよう
な核酸フラグメント／ベクトレット（Ｂ）に連結する。
Ｂは化学的遺伝学ベクトレット（ｂ）に連結した未知ヌ
クレオチド配列（Ｚ）から成り、領域７は（Ａ）の二重
鎖領域５に対して二重鎖相補的配列である。領域（７）
は第１プライミング領域として役立ち、Ｘは第１プライ
マーである。図２（ｂ）（iii）に示すようなＸのプラ
イマー エクステンションは、プライマーＹがハイブリ
ッド化して、ＰＣＲによって未知配列（Ｚ）を増幅する
ようなエクステンション生成物を生ずる。領域５におけ
る鎖３と４の間の非相補性のために、プライマーＹは鎖
３と４のいずれにもハイブリッド化できないが、プライ
マーＸのエクステンション生成物にのみハイブリッッド
化する。図２（ａ）と（ｂ）では、１個の結合性端部と
１個のブランドエンドを有するものとしてベクトレット
（Ａ）を示す。ベクトレットの各末端が例えば図３に示
すような結合性端部を有し、各端部が例えば個となる開
裂部分（例えばＥｃｏＲＩとＸｂａＩ開裂部位）を有す
る核酸鎖への連結に適していることは理解されよう。非
相補性領域は任意に蛋白質（例えばＳＰ６ ＲＮＡポリ
メラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼ）によって結合さ
れうる一つの鎖を有し、他方の鎖は異なる蛋白質（例え
ばＴ７ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラー
ゼ）によって結合される。従って図３では、ＥｃｏＲＩ
連結がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合を生じ、ＸｂａＩ
連結がＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ結合の使用を生ず
る。
含む標的核酸フラグメント／ベクトレット単位を参照す
ることによって、本発明の方法を説明する。ベクトレッ
ト部分が前述しかつ図２（ａ）の例によって説明したよ
うな非相補性領域を少なくとも一つ含む場合にも同じ考
察が通用する。このように、図２（ｂ）では図２（ａ）
に示したような、本発明に用いるためのベクトレット
（Ａ）が例えば化学的遺伝学方法によって得られるよう
な核酸フラグメント／ベクトレット（Ｂ）に連結する。
Ｂは化学的遺伝学ベクトレット（ｂ）に連結した未知ヌ
クレオチド配列（Ｚ）から成り、領域７は（Ａ）の二重
鎖領域５に対して二重鎖相補的配列である。領域（７）
は第１プライミング領域として役立ち、Ｘは第１プライ
マーである。図２（ｂ）（iii）に示すようなＸのプラ
イマー エクステンションは、プライマーＹがハイブリ
ッド化して、ＰＣＲによって未知配列（Ｚ）を増幅する
ようなエクステンション生成物を生ずる。領域５におけ
る鎖３と４の間の非相補性のために、プライマーＹは鎖
３と４のいずれにもハイブリッド化できないが、プライ
マーＸのエクステンション生成物にのみハイブリッッド
化する。図２（ａ）と（ｂ）では、１個の結合性端部と
１個のブランドエンドを有するものとしてベクトレット
（Ａ）を示す。ベクトレットの各末端が例えば図３に示
すような結合性端部を有し、各端部が例えば個となる開
裂部分（例えばＥｃｏＲＩとＸｂａＩ開裂部位）を有す
る核酸鎖への連結に適していることは理解されよう。非
相補性領域は任意に蛋白質（例えばＳＰ６ ＲＮＡポリ
メラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼ）によって結合さ
れうる一つの鎖を有し、他方の鎖は異なる蛋白質（例え
ばＴ７ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラー
ゼ）によって結合される。従って図３では、ＥｃｏＲＩ
連結がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合を生じ、ＸｂａＩ
連結がＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ結合の使用を生ず
る。
【０１０３】本発明の他の実施態様によると、非相補性
領域を有する二重鎖核酸を含むベクトレットを形成す
る、この領域は第１鎖に、その二重鎖相補形またはその
一重鎖形において蛋白質（例えばＳＰ６ ＲＮＡポリメ
ラーゼのような、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ）に
よって結合される核酸配列を有し、また第２鎖にはこの
二重鎖相補形またはその一重鎖相補形において、第１鎖
の核酸配列に結合するものとは異なる蛋白質（異なるＤ
ＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼ）によって結合されうる核酸配列を有する。
非相補性領域は相補性領域間にはさまれたものであるこ
とが望ましい。ベクトレットはブラントエンドまたは好
ましくは結合性端部あるいはブラントエンド１個と結合
性端部１個とを有しうる。
領域を有する二重鎖核酸を含むベクトレットを形成す
る、この領域は第１鎖に、その二重鎖相補形またはその
一重鎖形において蛋白質（例えばＳＰ６ ＲＮＡポリメ
ラーゼのような、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ）に
よって結合される核酸配列を有し、また第２鎖にはこの
二重鎖相補形またはその一重鎖相補形において、第１鎖
の核酸配列に結合するものとは異なる蛋白質（異なるＤ
ＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ＲＮＡポ
リメラーゼ）によって結合されうる核酸配列を有する。
非相補性領域は相補性領域間にはさまれたものであるこ
とが望ましい。ベクトレットはブラントエンドまたは好
ましくは結合性端部あるいはブラントエンド１個と結合
性端部１個とを有しうる。
【０１０４】本発明を次に、以下に詳述する下記オリゴ
ヌクレオチドを用いる下記実施例に言及して説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない、ここに
述べる各ヌクレオチド配列は、他に述べないかぎり、通
常の５'--３’の意味で読取るべきである： Ａ） ベクトレットＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチド１ ＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡ
ＴＣＧＣＴ Ｂ） ベクトレット配列決定用プライマーオリゴヌクレオチド２ ＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴ これは５’未満に付加的な５ヌクレオチドを有する延長
ベクトレット配列決定用プライマーである。
ヌクレオチドを用いる下記実施例に言及して説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない、ここに
述べる各ヌクレオチド配列は、他に述べないかぎり、通
常の５'--３’の意味で読取るべきである： Ａ） ベクトレットＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチド１ ＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡ
ＴＣＧＣＴ Ｂ） ベクトレット配列決定用プライマーオリゴヌクレオチド２ ＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴ これは５’未満に付加的な５ヌクレオチドを有する延長
ベクトレット配列決定用プライマーである。
【０１０５】オリゴヌクレオチド２Ａ ＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴ これはベクトレット配列決定用プライマーである。
【０１０６】Ｃ） クラミジア トラコーマチス（Ｃｈ
ｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（オリゴヌ
クレオチドの位置の確立に関しては、ヨーロッパ特許公
報第１９２，０３３号参照）：オリゴヌクレオチド３ ＣＴＧＣＴＣＡＣＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＴＴＣＣＧ
− 位置２４４１〜２４６５オリゴヌクレオチド４ ＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＡＴＴＡＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＣ
− 位置１３０１〜１３２５オリゴヌクレオチド５ ＧＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣＴＣ
− 位置２４５８〜２４３４オリゴヌクレオチド６ ＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＣＡＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＴ
− 位置１３１〜１０８オリゴヌクレオチド７ ＣＡＡＧＧＣＡＴＡＡＣＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＧＴＧ
− 位置３１３３（末端ＥｃｏＲＩ）から下流約２００
ｂｐ Ｄ） クラミジアトラコーマチスのＣＲＰ座に特異的な
オリゴヌクレオチド［クラーケ（Ｃｌａｒｋｅ）等（１
９８８）ジーン（Ｇｅｎｅ）７１、３０７−３１４
頁］：オリゴヌクレオチド８ ＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴ
− 位置２４０２−２３７８オリゴヌクレオチド９ ＣＴＴＣＣＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＴＴＣＣＡＧＴ
− 位置１７２２〜１７４６ Ｅ）２３ｓ ｒＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド
（ヨーロッパ特許広報第２７２００９号、４２頁参照）オリゴヌクレオチド１０ ＣＧＴＴＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＡＣＧＧＡＣ − 配
列７，２３ｓ ｒＲＮＡジーン中に約１１８０ｂｐ Ｆ） Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオ
チド［ジーンバンクデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄ
ａｔａｂａｓｅ）から得られる配列］オリゴヌクレオチド１１ ＴＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＴＴＡ
− 位置５７５７〜５７８１オリゴヌクレオチド１２ ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡＧＴＧＡＴ
− 位置５２５１〜５２７５オリゴヌクレオチド１３ ＡＴＴＣＧＣＣＴＣＴＧＣＧＣＧＡＴＴＴＴＧＴＡＡＣ
− 位置４３０２〜４３２６オリゴヌクレオチド１４ ＴＧＴＧＡＡＴＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＧＴＣＴＧ
− 位置２２３３〜２２５７ Ｇ） 下記オリゴヌクレオチドを用いて、図３に示すよ
うに交互転写部位（ＤＥＶＩＡＴＳ）を含む、ダブルエ
ンド（ｄｏｕｂｌｅ−ｅｎｄｅｄ）ベクトレットを構成
した。
ｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（オリゴヌ
クレオチドの位置の確立に関しては、ヨーロッパ特許公
報第１９２，０３３号参照）：オリゴヌクレオチド３ ＣＴＧＣＴＣＡＣＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＴＴＣＣＧ
− 位置２４４１〜２４６５オリゴヌクレオチド４ ＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＡＴＴＡＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＣ
− 位置１３０１〜１３２５オリゴヌクレオチド５ ＧＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣＴＣ
− 位置２４５８〜２４３４オリゴヌクレオチド６ ＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＣＡＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＴ
− 位置１３１〜１０８オリゴヌクレオチド７ ＣＡＡＧＧＣＡＴＡＡＣＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＧＴＧ
− 位置３１３３（末端ＥｃｏＲＩ）から下流約２００
ｂｐ Ｄ） クラミジアトラコーマチスのＣＲＰ座に特異的な
オリゴヌクレオチド［クラーケ（Ｃｌａｒｋｅ）等（１
９８８）ジーン（Ｇｅｎｅ）７１、３０７−３１４
頁］：オリゴヌクレオチド８ ＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴ
− 位置２４０２−２３７８オリゴヌクレオチド９ ＣＴＴＣＣＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＣＴＧＴＴＣＣＡＧＴ
− 位置１７２２〜１７４６ Ｅ）２３ｓ ｒＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド
（ヨーロッパ特許広報第２７２００９号、４２頁参照）オリゴヌクレオチド１０ ＣＧＴＴＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＴＡＣＧＧＡＣ − 配
列７，２３ｓ ｒＲＮＡジーン中に約１１８０ｂｐ Ｆ） Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオ
チド［ジーンバンクデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄ
ａｔａｂａｓｅ）から得られる配列］オリゴヌクレオチド１１ ＴＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＴＴＡ
− 位置５７５７〜５７８１オリゴヌクレオチド１２ ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡＧＴＧＡＴ
− 位置５２５１〜５２７５オリゴヌクレオチド１３ ＡＴＴＣＧＣＣＴＣＴＧＣＧＣＧＡＴＴＴＴＧＴＡＡＣ
− 位置４３０２〜４３２６オリゴヌクレオチド１４ ＴＧＴＧＡＡＴＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＧＴＣＴＧ
− 位置２２３３〜２２５７ Ｇ） 下記オリゴヌクレオチドを用いて、図３に示すよ
うに交互転写部位（ＤＥＶＩＡＴＳ）を含む、ダブルエ
ンド（ｄｏｕｂｌｅ−ｅｎｄｅｄ）ベクトレットを構成
した。
【０１０７】オリゴヌクレオチド１５ ＡＡＴＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧ
ＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＧオリゴヌクレオチド１６ ＣＴＡＧＣＧＣＣＧＴＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ
ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣオリゴヌクレオチド１７ ＧＡＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧ
ＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＧオリゴヌクレオチド１８ ＣＧＣＧＣＣＧＴＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣ Ｈ） 増幅のためのＤＥＶＩＡＴＳプライマーとして役
立つオリゴヌクレオチド ａ） 制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩとＣｌａＩによ
って消化されるＤＮＡとの併用のために：オリゴヌクレオチド１９ ＡＣＣＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣ ｂ）制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ，Ｓａｕ３ＡＩ
およびＢａｍＨＩによって消化されるＤＮＡとの併用の
ために：オリゴヌクレオチド２０ ＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＤＥＶＩＡＴＳは等モル量の２オリゴヌクレオチド（図
３に示すように、オリゴヌクレオチド１５と１６または
オリゴヌクレオチド１７と１８）を混合し、この混合物
を９４℃に５分間加熱し、室温にまで徐冷して両ストラ
ンドをアニールすることによって構成された。
ＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＧオリゴヌクレオチド１６ ＣＴＡＧＣＧＣＣＧＴＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ
ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣオリゴヌクレオチド１７ ＧＡＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧ
ＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＧＧＣＧオリゴヌクレオチド１８ ＣＧＣＧＣＣＧＴＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣ Ｈ） 増幅のためのＤＥＶＩＡＴＳプライマーとして役
立つオリゴヌクレオチド ａ） 制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩとＣｌａＩによ
って消化されるＤＮＡとの併用のために：オリゴヌクレオチド１９ ＡＣＣＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣ ｂ）制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ，Ｓａｕ３ＡＩ
およびＢａｍＨＩによって消化されるＤＮＡとの併用の
ために：オリゴヌクレオチド２０ ＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＤＥＶＩＡＴＳは等モル量の２オリゴヌクレオチド（図
３に示すように、オリゴヌクレオチド１５と１６または
オリゴヌクレオチド１７と１８）を混合し、この混合物
を９４℃に５分間加熱し、室温にまで徐冷して両ストラ
ンドをアニールすることによって構成された。
【０１０８】Ｉ） ベクトレットとして役立つオリゴヌ
クレオチド ａ） 制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩによって消化
されるＤＮＡとの併用のために：オリゴヌクレオチド２１ ＧＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴ
ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡ
ＡＧＧＧＡＧＡＧオリゴヌクレオチド２２ ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴ
ＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣ
ＴＴＣ ｂ） 制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩによって消化さ
れるＤＮＡとの併用のために：−オリゴヌクレオチド２
２（前記で定義）；およびオリゴヌクレオチド２３ ＣＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＧ
ＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧ
ＧＡＧＡＧ ｃ） 制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩによって
消化されるＤＮＡとの併用のために： オリゴヌクレオチド２２（前記で定義）；およびオリゴヌクレオチド２４ ＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴ
ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ
ＧＧＧＡＧＡＧ ｄ） 制限エンドヌクレアーゼＸｂａｌＩによって消化
されるＤＮＡとの併用のために：オリゴヌクレオチド２
２（前記で定義）；およびオリゴヌクレオチド２５ ＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴ
ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ
ＧＧＧＡＧＡＧ ｅ） 制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩによって消化さ
れるＤＮＡとの併用のために： オリゴヌクレオチド２２（前記で定義）；およびオリゴヌクレオチド２６ ＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴ
ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ
ＧＧＧＡＧＡＧ ｆ） 制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩによって消化さ
れるＤＮＡとの併用のために：オリゴヌクレオチド２７ ＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＧＡＡ
ＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡ
ＧＡＧオリゴヌクレオチド２８ ３’ ＡＣＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＡ
ＡＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＡＧＣＴ
ＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣ ５’ ｇ） 制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩによって消化さ
れるＤＮＡとの併用のために： オリゴヌクレオチド２７（前記で定義）；およびオリゴヌクレオチド２９ ３’ ＴＣＧＡＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＡ
ＡＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＡＧＣＴ
ＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣ ５’オリゴヌクレオチド３０ ＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡ ＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴ ＴＣＧ
ＧＧＡＴＧＡＴ ＧＣＴＴＧＣＴＡＧＡ ＴＧＴＡＧＡ
ＡＴＡＣ ＧＧＣＧオリゴヌクレオチド３１ ＣＧＣＣＧＴＡＴＴＣ ＴＡＧＴＡＣＴＴＣＧ ＡＡＣ
ＣＴＴＡＡＧＣ ＣＣＴＡＧＧＴＧＣＡ ＧＧＧＴＴＣ
ＴＴＣＣ ＴＧＣ オリゴヌクレオチド３０と３１を用いて、ＣｌａＩによ
って消化されるＤＮＡと併用するための開裂ベクトレッ
ト２単位を構成する。
クレオチド ａ） 制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩによって消化
されるＤＮＡとの併用のために：オリゴヌクレオチド２１ ＧＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴ
ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡ
ＡＧＧＧＡＧＡＧオリゴヌクレオチド２２ ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴ
ＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣ
ＴＴＣ ｂ） 制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩによって消化さ
れるＤＮＡとの併用のために：−オリゴヌクレオチド２
２（前記で定義）；およびオリゴヌクレオチド２３ ＣＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＧ
ＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧ
ＧＡＧＡＧ ｃ） 制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩによって
消化されるＤＮＡとの併用のために： オリゴヌクレオチド２２（前記で定義）；およびオリゴヌクレオチド２４ ＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴ
ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ
ＧＧＧＡＧＡＧ ｄ） 制限エンドヌクレアーゼＸｂａｌＩによって消化
されるＤＮＡとの併用のために：オリゴヌクレオチド２
２（前記で定義）；およびオリゴヌクレオチド２５ ＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴ
ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ
ＧＧＧＡＧＡＧ ｅ） 制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩによって消化さ
れるＤＮＡとの併用のために： オリゴヌクレオチド２２（前記で定義）；およびオリゴヌクレオチド２６ ＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴ
ＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ
ＧＧＧＡＧＡＧ ｆ） 制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩによって消化さ
れるＤＮＡとの併用のために：オリゴヌクレオチド２７ ＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＧＡＡ
ＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡ
ＧＡＧオリゴヌクレオチド２８ ３’ ＡＣＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＡ
ＡＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＡＧＣＴ
ＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣ ５’ ｇ） 制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩによって消化さ
れるＤＮＡとの併用のために： オリゴヌクレオチド２７（前記で定義）；およびオリゴヌクレオチド２９ ３’ ＴＣＧＡＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＡ
ＡＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＡＧＣＴ
ＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣ ５’オリゴヌクレオチド３０ ＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡ ＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴ ＴＣＧ
ＧＧＡＴＧＡＴ ＧＣＴＴＧＣＴＡＧＡ ＴＧＴＡＧＡ
ＡＴＡＣ ＧＧＣＧオリゴヌクレオチド３１ ＣＧＣＣＧＴＡＴＴＣ ＴＡＧＴＡＣＴＴＣＧ ＡＡＣ
ＣＴＴＡＡＧＣ ＣＣＴＡＧＧＴＧＣＡ ＧＧＧＴＴＣ
ＴＴＣＣ ＴＧＣ オリゴヌクレオチド３０と３１を用いて、ＣｌａＩによ
って消化されるＤＮＡと併用するための開裂ベクトレッ
ト２単位を構成する。
【０１０９】オリゴヌクレオチド３２ ＣＴＴＣＧＡＡＣＣＴ ＴＡＡＧＣＣＣＴＡＧ ＧＴＧ
ＣＡ 増幅にベクトレット２単位と併用するためのプライマーオリゴヌクレオチド３３ ＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧ ＴＧＡＡＴＧＴＡＣＡ ＴＡＡ
ＣＧ クラミジア１６ＳリボゾームＲＮＡジーン５’フランキ
ング領域に特異的なプライマー 全てのオリゴヌクレオチドはアプライド バイオシステ
ム３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓｅｒ）で、シアノエチル ホスホラミジトの化学を用
いて、製造者の提示に従って調製した。または、オリゴ
ヌクレオチドはアトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ）とス
ミス（Ｓｍｉｔｈ）の「オリゴヌクレオチド合成、実用
的アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ）」（エム・ジェイ・ガイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉ
ｔ）編集、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ、オックスフ
ォード、３５−８１頁）に述べられているマニュアル方
法によって製造される。
ＣＡ 増幅にベクトレット２単位と併用するためのプライマーオリゴヌクレオチド３３ ＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧ ＴＧＡＡＴＧＴＡＣＡ ＴＡＡ
ＣＧ クラミジア１６ＳリボゾームＲＮＡジーン５’フランキ
ング領域に特異的なプライマー 全てのオリゴヌクレオチドはアプライド バイオシステ
ム３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓｅｒ）で、シアノエチル ホスホラミジトの化学を用
いて、製造者の提示に従って調製した。または、オリゴ
ヌクレオチドはアトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ）とス
ミス（Ｓｍｉｔｈ）の「オリゴヌクレオチド合成、実用
的アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ）」（エム・ジェイ・ガイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉ
ｔ）編集、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ、オックスフ
ォード、３５−８１頁）に述べられているマニュアル方
法によって製造される。
【０１１０】参考例 １ クラミジアルＤＮＡの調製 クラミジア トラコーマチス （Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔ
ｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）セロバール（ｓｅｒｏｖａｒ）
Ｌ２をマクコイ細胞（ＭｃＣｏｙ ｃｅｌｌ）中で培養
し、基本小体を回収し、カルドウエル エッチ．ディ．
（Ｃａｌｄｗｅｌｌ Ｈ．Ｄ．）等（１９８１）インフ
ェクト．イムノル．（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．）３１，１１６１−１１７６頁に述べられている方
法を用いて精製した。付加工程はマクコイ細胞ＤＮＡに
よる汚染を減ずるための最終洗浄工程前のＤＮアーゼ
（５μｇ／ｍｌ）による基本小体の処理を含んだ。
ｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）セロバール（ｓｅｒｏｖａｒ）
Ｌ２をマクコイ細胞（ＭｃＣｏｙ ｃｅｌｌ）中で培養
し、基本小体を回収し、カルドウエル エッチ．ディ．
（Ｃａｌｄｗｅｌｌ Ｈ．Ｄ．）等（１９８１）インフ
ェクト．イムノル．（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．）３１，１１６１−１１７６頁に述べられている方
法を用いて精製した。付加工程はマクコイ細胞ＤＮＡに
よる汚染を減ずるための最終洗浄工程前のＤＮアーゼ
（５μｇ／ｍｌ）による基本小体の処理を含んだ。
【０１１１】精製Ｃ．トラコーマチスＤＮＡを得るため
に、基本小体を６５℃、２０分間１％ＳＤＳ、５ｍＭ
ＤＴＴによって、３７℃、２０分間ＤＮアーゼを含まな
いＲＮアーゼ１０μｇ／ｍｌによって、５０℃、一晩プ
ロティナーゼＫ２０μｇ／ｍｌによって処理した。クラ
ミジアルＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈降さ
せ、１０ｍＭＴｒｉｓ．Ｈｃｌ（ｐＨ７．６）中に再溶
解し、１ｍＭ ＥＤＴＡアリコート化し、−２０℃にお
いて貯蔵した。参考例２ クラミジアルＤＮＡのヴェクトレット（Ｖｅｃｔｏｒｅ
ｔｔｅ）とＤＥＶＩＡＴＳライブラリーの調製 ヴェクトレット クラミジアルＤＮＡライブラリーは次
の８制限酵素に対して製造した： ＥｃｏＲＩ ＢａｍＨＩ ＣｌａＩ ＨｉｎｄＩＩＩ ＸｂａＩ ＳａｌＩ ＰｓｔＩ ＳａｃＩ 各ライブラリーに対して、３７℃の５０μｌ容量中で高
濃度酵素（４０〜７０単位）１μｌによってクラミジア
ルＤＮＡ１５０μｇを消化させた。制限されたＤＮＡを
２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴおよびＴＡ ＤＮＡリ
ガーゼ１単位を含む溶液の添加によって各制限酵素に対
して適当な緩衝液の存在下でヴェクトレット オリゴヌ
クレオチド２００ｆｍｏｌに連結させた。連結条件は２
０℃／６０分と３７℃／３０分との３サイクルであっ
た。使用のために、ライブラリーのアリコートを、水で
１：１０に希釈し、−２０℃に保存した。同じ条件と材
料とを用いてＥｃｏＲＩデヴィエイトス クラミジアル
ライブラリーを調製した。さらに、同じ８制限酵素に
よって消化されたクラミジアルＤＮＡ調製物をアガロー
スゲル中で電気泳動させ、サザンブロットを制限分析の
ための標識フラグメントとのハイブリッド形成のために
用意した。
に、基本小体を６５℃、２０分間１％ＳＤＳ、５ｍＭ
ＤＴＴによって、３７℃、２０分間ＤＮアーゼを含まな
いＲＮアーゼ１０μｇ／ｍｌによって、５０℃、一晩プ
ロティナーゼＫ２０μｇ／ｍｌによって処理した。クラ
ミジアルＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈降さ
せ、１０ｍＭＴｒｉｓ．Ｈｃｌ（ｐＨ７．６）中に再溶
解し、１ｍＭ ＥＤＴＡアリコート化し、−２０℃にお
いて貯蔵した。参考例２ クラミジアルＤＮＡのヴェクトレット（Ｖｅｃｔｏｒｅ
ｔｔｅ）とＤＥＶＩＡＴＳライブラリーの調製 ヴェクトレット クラミジアルＤＮＡライブラリーは次
の８制限酵素に対して製造した： ＥｃｏＲＩ ＢａｍＨＩ ＣｌａＩ ＨｉｎｄＩＩＩ ＸｂａＩ ＳａｌＩ ＰｓｔＩ ＳａｃＩ 各ライブラリーに対して、３７℃の５０μｌ容量中で高
濃度酵素（４０〜７０単位）１μｌによってクラミジア
ルＤＮＡ１５０μｇを消化させた。制限されたＤＮＡを
２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴおよびＴＡ ＤＮＡリ
ガーゼ１単位を含む溶液の添加によって各制限酵素に対
して適当な緩衝液の存在下でヴェクトレット オリゴヌ
クレオチド２００ｆｍｏｌに連結させた。連結条件は２
０℃／６０分と３７℃／３０分との３サイクルであっ
た。使用のために、ライブラリーのアリコートを、水で
１：１０に希釈し、−２０℃に保存した。同じ条件と材
料とを用いてＥｃｏＲＩデヴィエイトス クラミジアル
ライブラリーを調製した。さらに、同じ８制限酵素に
よって消化されたクラミジアルＤＮＡ調製物をアガロー
スゲル中で電気泳動させ、サザンブロットを制限分析の
ための標識フラグメントとのハイブリッド形成のために
用意した。
【０１１２】参考例３ ＰＣＲによる増幅に用いられる一般条件 ＰＣＲ反応は、１００μｌ容量中で軽鉱油［シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）］５０μｌでオーバーレイした。最終反応混
合物には、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｈｃｌ（ｐＨ８．
５）、１６．６ｍＭ（ＮＨ4)2ＳＯ4、２ｍＭ ＭｇＣｌ
2、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１７０μｇ
ｍｌ-1牛血清アルブミン、４０μＭの各デオキシネクレ
オチド（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰ）１μ
Ｍの各オリゴヌクレオチド プライマー及び標的ＤＮＡ
ライブラリー溶液（通常１０ｎｇ以下）１−１０μｌを
含んでいた。タグＤＮＡポリメラーゼ［パーキンーエル
マー／セタス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕ
ｓ）］１単位添加前に上記反応混合物を９４℃まで３〜
５分間加熱した。次に、１サイクルにつき９４℃、０．
７分間；６４℃、０．７分間；７２℃、１．５分間の３
５サイクルをヒーティングブロック［テクネＰＨＣ−１
プログラマブル ドリーブロック（ＴＥＣＨＮＥＰＨ
Ｃ−１ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｄｒｉ−ｂｌｏｃ
ｋ）］上で行った。
ｉｇｍａ）］５０μｌでオーバーレイした。最終反応混
合物には、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｈｃｌ（ｐＨ８．
５）、１６．６ｍＭ（ＮＨ4)2ＳＯ4、２ｍＭ ＭｇＣｌ
2、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１７０μｇ
ｍｌ-1牛血清アルブミン、４０μＭの各デオキシネクレ
オチド（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰ）１μ
Ｍの各オリゴヌクレオチド プライマー及び標的ＤＮＡ
ライブラリー溶液（通常１０ｎｇ以下）１−１０μｌを
含んでいた。タグＤＮＡポリメラーゼ［パーキンーエル
マー／セタス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕ
ｓ）］１単位添加前に上記反応混合物を９４℃まで３〜
５分間加熱した。次に、１サイクルにつき９４℃、０．
７分間；６４℃、０．７分間；７２℃、１．５分間の３
５サイクルをヒーティングブロック［テクネＰＨＣ−１
プログラマブル ドリーブロック（ＴＥＣＨＮＥＰＨ
Ｃ−１ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｄｒｉ−ｂｌｏｃ
ｋ）］上で行った。
【０１１３】例１ ＭＯＭＰ．４．ＸｂａＩ（ＸｂａＩベクトレッテライブ
ラリーからの図４参照）はオリゴヌクレオチド４及びベ
クトレッテプライマー１（前記で定義）を用いるＰＣＲ
及び参考例３で述べた一般ＰＣＲ条件によって増幅され
た。増幅反応からのアリコート（１０μｌ）を結果分析
のためにアガロースゲル上にのせた（図５のレーン１参
照）。増幅生成物の残りは、エタノールで沈降させ、洗
浄し、乾燥し、滅菌蒸留水２０μｌに再懸濁した。さら
に増幅した生成物（５μｌ）を６０分間３７℃でＥｃｏ
ＲＩとＳａｕ３ＡＩを用いて５０μｌ容量において別に
消化させた。次にＳａｕ３ＡＩ消化物を６５℃で１０分
間熱不活化した。ＥｃｏＲＩ制限酵素を不活化しなかっ
た。得られたフラグメントをアガロースゲル上で調べた
（図５のレーン２と３参照）。
ラリーからの図４参照）はオリゴヌクレオチド４及びベ
クトレッテプライマー１（前記で定義）を用いるＰＣＲ
及び参考例３で述べた一般ＰＣＲ条件によって増幅され
た。増幅反応からのアリコート（１０μｌ）を結果分析
のためにアガロースゲル上にのせた（図５のレーン１参
照）。増幅生成物の残りは、エタノールで沈降させ、洗
浄し、乾燥し、滅菌蒸留水２０μｌに再懸濁した。さら
に増幅した生成物（５μｌ）を６０分間３７℃でＥｃｏ
ＲＩとＳａｕ３ＡＩを用いて５０μｌ容量において別に
消化させた。次にＳａｕ３ＡＩ消化物を６５℃で１０分
間熱不活化した。ＥｃｏＲＩ制限酵素を不活化しなかっ
た。得られたフラグメントをアガロースゲル上で調べた
（図５のレーン２と３参照）。
【０１１４】望ましい場合には、制限酵素消化の前又は
後に、低融点［ヌシーブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）（ＦＭ
Ｃ）］アガロースゲルから切断できる。いずれの場合に
も、ゲルスライスは７０℃で１０分間融解し、次に３７
℃で平衡化する；連結のために必要なアリコートを除去
できる。
後に、低融点［ヌシーブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）（ＦＭ
Ｃ）］アガロースゲルから切断できる。いずれの場合に
も、ゲルスライスは７０℃で１０分間融解し、次に３７
℃で平衡化する；連結のために必要なアリコートを除去
できる。
【０１１５】消化されたフラグメントを連結した。従っ
て、消化されたフラグメントにＡＴＰ及びＤＴＴ（各々
最終濃度２ｍＭまで）、適当なＤＥＶＩＡＴＳ（適当な
１．５倍最小モル過剰）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（１単
位）を加えた。ＥｃｏＲＩ消化物に関してはオリゴヌク
レオチド１５及び１６を用い、Ｓａｕ３ＡＩ消化物に関
してはオリゴヌクレオチド１７及び１８を用いた。次に
連結ＥｃｏＲＩミックスを１サイクルにつき２０℃６０
分間及び３７℃３０分間の３サイクルでインキュベート
した；Ｓａｕ３ＡＩはＤＥＶＩＡＴＳへの連結のため
に、２０℃４．５時間インキュベートした。連結後、量
を滅菌蒸留水で１００μｌに調節し、連結サンプルをー
２０℃で保存した。
て、消化されたフラグメントにＡＴＰ及びＤＴＴ（各々
最終濃度２ｍＭまで）、適当なＤＥＶＩＡＴＳ（適当な
１．５倍最小モル過剰）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（１単
位）を加えた。ＥｃｏＲＩ消化物に関してはオリゴヌク
レオチド１５及び１６を用い、Ｓａｕ３ＡＩ消化物に関
してはオリゴヌクレオチド１７及び１８を用いた。次に
連結ＥｃｏＲＩミックスを１サイクルにつき２０℃６０
分間及び３７℃３０分間の３サイクルでインキュベート
した；Ｓａｕ３ＡＩはＤＥＶＩＡＴＳへの連結のため
に、２０℃４．５時間インキュベートした。連結後、量
を滅菌蒸留水で１００μｌに調節し、連結サンプルをー
２０℃で保存した。
【０１１６】ＤＥＶＩＡＴＳサブーフラグメントのＰＣ
Ｒ増幅のために、連結物質を反応あたりに用いる。オリ
ゴヌクレオチド２（ベクトレッテプライマー）と共にＤ
ＥＶＩＡＴＳ ＰＣＲプライマー２０を用い、ＰＣＲの
アニーリング段階を６４℃０．７分間から４５℃０．７
分間へ減じた。ＰＣＲ生成物（各ＰＣＲ生成物１０μ
ｌ）を図５に示すようにアガロースゲル上で分析した。
図５には、プライマー１と４によって生じた全長ＰＣＲ
生成物（ＭＯＭＰ．４．ＸｂａＩ，約１１００ｂｐ）が
レーン１に見られる。少数の非特異性結合も見られる。
ＥｃｏＲＩによる消化によって、１２３，１３１，３６
１及び４９８ｂｐの４フラグメント（レーン２）を生じ
た；３６１ｂｐフラグメントにはＸｂａＩ−末端ベクト
レッテを含む。Ｓａｕ３ＡＩによる消化によって、９〜
３５２ｂｐ（レーン３）のサイズ範囲の７フラグメント
を生じた。３５２ｂｐフラグメントにはＣｌａＩ−末端
ベクトレッテを含む。これらの消化物へのＤＥＶＩＡＴ
Ｓ連結後に、ＤＥＶＩＡＴＳとベクトレッテプライマー
を用いるＰＣＲ増幅によってベクトレッテ末端フラグメ
ント（レーン４と５）の特異性増幅を生じた。これらは
塩基配列特異性プライマー４によって生じたＭＯＭＰ
４．ＸｂａＩの末端から遠位のフラグメントである。
Ｒ増幅のために、連結物質を反応あたりに用いる。オリ
ゴヌクレオチド２（ベクトレッテプライマー）と共にＤ
ＥＶＩＡＴＳ ＰＣＲプライマー２０を用い、ＰＣＲの
アニーリング段階を６４℃０．７分間から４５℃０．７
分間へ減じた。ＰＣＲ生成物（各ＰＣＲ生成物１０μ
ｌ）を図５に示すようにアガロースゲル上で分析した。
図５には、プライマー１と４によって生じた全長ＰＣＲ
生成物（ＭＯＭＰ．４．ＸｂａＩ，約１１００ｂｐ）が
レーン１に見られる。少数の非特異性結合も見られる。
ＥｃｏＲＩによる消化によって、１２３，１３１，３６
１及び４９８ｂｐの４フラグメント（レーン２）を生じ
た；３６１ｂｐフラグメントにはＸｂａＩ−末端ベクト
レッテを含む。Ｓａｕ３ＡＩによる消化によって、９〜
３５２ｂｐ（レーン３）のサイズ範囲の７フラグメント
を生じた。３５２ｂｐフラグメントにはＣｌａＩ−末端
ベクトレッテを含む。これらの消化物へのＤＥＶＩＡＴ
Ｓ連結後に、ＤＥＶＩＡＴＳとベクトレッテプライマー
を用いるＰＣＲ増幅によってベクトレッテ末端フラグメ
ント（レーン４と５）の特異性増幅を生じた。これらは
塩基配列特異性プライマー４によって生じたＭＯＭＰ
４．ＸｂａＩの末端から遠位のフラグメントである。
【０１１７】従って、図５のレーン１〜６はＭＯＭＰ
４．ＸｂａＩに関係し、次のように表される： レーン１： 全長ＰＣＲ生成物 ２： ＥｃｏＲＩフラグメント ３： Ｓａｕ３ＡＩフラグメント ４： ＥｃｏＲＩ−ＤＥＶＩＡＴＳ−プライマー４によ
るＰＣＲ ５： Ｓａｕ３ＡＩ−ＤＥＶＩＡＴＳ−プライマー４に
よるＰＣＲ ６： Ｏｘ１７４ＨａｅIIIサイズマーカー例２ クラミジアルＤＮＡ調製（参考例１参照）からのＣＲ
Ｐ．９．８（図４参照）をオリゴヌクレオチド９及び８
（前記で定義）を用いるＰＣＲ及び参考例３で述べた一
般ＰＣＲ条件によって増幅にした。増幅反応からのアリ
コート（１０μｌ）を結果分析のためにアガロースゲル
上でランした（図５のレーン７参照）。増幅生成物の残
りをエタノールによって沈降させ、洗浄し、乾燥し、滅
菌蒸留水２０μｌに再懸濁した。次にこれらの増幅フラ
グメントのアリコート（５μｌ）を３７℃６０分間Ｘｂ
ａＩ又はＣｌａＩによって５０μｌ容量で別に消化し
た。制限酵素は不活化しなかった。次に消化されたフラ
グメントを連結した。従って、消化されたフラグメント
にＡＴＰ及びＤＴＴ（各々最終濃度２ｍＭまで）、適当
なＤＥＶＩＡＴＳ（約１．５倍最小モル過剰まで）及び
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１単位）を加えた。ＸｂａＩ消
化に関して、オリゴヌクレオチド１５及び１６を用い、
ＣｌａＩ消化に関して、オリゴヌクレオチド１７及び１
８を用いた。次に連結／制限酵素ミックスを１サイクル
につき、２０℃６０分間３７℃３０分間３サイクル イ
ンキュベートした。連結後、容量を滅菌蒸留水で１００
μｌに調節し、連結したサンプルをー２０℃で保存し
た。
４．ＸｂａＩに関係し、次のように表される： レーン１： 全長ＰＣＲ生成物 ２： ＥｃｏＲＩフラグメント ３： Ｓａｕ３ＡＩフラグメント ４： ＥｃｏＲＩ−ＤＥＶＩＡＴＳ−プライマー４によ
るＰＣＲ ５： Ｓａｕ３ＡＩ−ＤＥＶＩＡＴＳ−プライマー４に
よるＰＣＲ ６： Ｏｘ１７４ＨａｅIIIサイズマーカー例２ クラミジアルＤＮＡ調製（参考例１参照）からのＣＲ
Ｐ．９．８（図４参照）をオリゴヌクレオチド９及び８
（前記で定義）を用いるＰＣＲ及び参考例３で述べた一
般ＰＣＲ条件によって増幅にした。増幅反応からのアリ
コート（１０μｌ）を結果分析のためにアガロースゲル
上でランした（図５のレーン７参照）。増幅生成物の残
りをエタノールによって沈降させ、洗浄し、乾燥し、滅
菌蒸留水２０μｌに再懸濁した。次にこれらの増幅フラ
グメントのアリコート（５μｌ）を３７℃６０分間Ｘｂ
ａＩ又はＣｌａＩによって５０μｌ容量で別に消化し
た。制限酵素は不活化しなかった。次に消化されたフラ
グメントを連結した。従って、消化されたフラグメント
にＡＴＰ及びＤＴＴ（各々最終濃度２ｍＭまで）、適当
なＤＥＶＩＡＴＳ（約１．５倍最小モル過剰まで）及び
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１単位）を加えた。ＸｂａＩ消
化に関して、オリゴヌクレオチド１５及び１６を用い、
ＣｌａＩ消化に関して、オリゴヌクレオチド１７及び１
８を用いた。次に連結／制限酵素ミックスを１サイクル
につき、２０℃６０分間３７℃３０分間３サイクル イ
ンキュベートした。連結後、容量を滅菌蒸留水で１００
μｌに調節し、連結したサンプルをー２０℃で保存し
た。
【０１１８】ＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメントのＰＣＲ
増幅のために、連結物質１μｌを反応あたりに用いる。
オリゴヌクレオチド２（ベクトレッテプライマー）と共
にＤＥＶＩＡＴＳ ＰＣＲプライマー１９を用い、ＰＣ
Ｒのアニーリングステップを６４℃０．７分間から４５
℃０．７分間に減じた。ＰＣＲ生成物（各ＰＣＲ生成物
１０μｌ）を図５に示すようにアガロースゲル上で分析
した。図５には、６８０ｂｐ全長ＰＣＲ生成物をレーン
７に示す。ＸｂａＩによる消化によって３０、１６０及
び４９０ｂｐのフラグメント（レーン８）を生じ；１６
０ｂｐフラグメントはその５’末端でオリゴヌクレオチ
ド９を有する。ＣｌａＩによる消化によって６８、１１
３及び４９９ｂｐのフラグメント（レーン９）を生じ；
６８ｂｐフラグメントはその５’末端でオリゴヌクレオ
チド９を有する。
増幅のために、連結物質１μｌを反応あたりに用いる。
オリゴヌクレオチド２（ベクトレッテプライマー）と共
にＤＥＶＩＡＴＳ ＰＣＲプライマー１９を用い、ＰＣ
Ｒのアニーリングステップを６４℃０．７分間から４５
℃０．７分間に減じた。ＰＣＲ生成物（各ＰＣＲ生成物
１０μｌ）を図５に示すようにアガロースゲル上で分析
した。図５には、６８０ｂｐ全長ＰＣＲ生成物をレーン
７に示す。ＸｂａＩによる消化によって３０、１６０及
び４９０ｂｐのフラグメント（レーン８）を生じ；１６
０ｂｐフラグメントはその５’末端でオリゴヌクレオチ
ド９を有する。ＣｌａＩによる消化によって６８、１１
３及び４９９ｂｐのフラグメント（レーン９）を生じ；
６８ｂｐフラグメントはその５’末端でオリゴヌクレオ
チド９を有する。
【０１１９】これらの消化物へのＤＥＶＩＡＴＳ連結後
に、プライマー９（特異性）及び１９（ＤＥＶＩＡＴ
Ｓ）を用いるＰＣＲ増幅は、プライマー９末端フラグメ
ントの特異性増幅を生じた（各々今やＤＥＶＩＡＴＳの
一部の増幅によりサイズ３０ｂｐまでに増大；レーン１
０及び１１）。
に、プライマー９（特異性）及び１９（ＤＥＶＩＡＴ
Ｓ）を用いるＰＣＲ増幅は、プライマー９末端フラグメ
ントの特異性増幅を生じた（各々今やＤＥＶＩＡＴＳの
一部の増幅によりサイズ３０ｂｐまでに増大；レーン１
０及び１１）。
【０１２０】従って、図５のレーン６〜１１は次のよう
である： レーン６： Ｏｘ１７４ＨａｅIIIサイズマーカー ７： 全長ＰＣＲ生成物（６８０ｂｐ） ８： ＸｂａＩフラグメント ９： ＣｌａＩフラグメント １０： プライマー９によるＸｂａＩ−ＤＥＶＩＡＴＳ
ＰＣＲ １１： プライマー９によるＣｌａＩ−ＤＥＶＩＡＴＳ
ＰＣＲ例３ 各ベクトレッテライブラリー（ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、
ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、Ｓａ
ｌＩ及びＸｂａＩベクトレッテライブラリー）からのＭ
ＯＭＰ座上流の非特性化ベクトレッテフラグメントはオ
リゴヌクレオチド１及び６（下記で定義）を用いるＰＣ
Ｒ及び参考例３で述べた一般ＰＣＲ条件によって増幅さ
れた。ベクトレッテを構成するオロゴヌクレオチドは下
記で定義したようなオリゴヌクレオチド２１−２９であ
る。
である： レーン６： Ｏｘ１７４ＨａｅIIIサイズマーカー ７： 全長ＰＣＲ生成物（６８０ｂｐ） ８： ＸｂａＩフラグメント ９： ＣｌａＩフラグメント １０： プライマー９によるＸｂａＩ−ＤＥＶＩＡＴＳ
ＰＣＲ １１： プライマー９によるＣｌａＩ−ＤＥＶＩＡＴＳ
ＰＣＲ例３ 各ベクトレッテライブラリー（ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、
ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、Ｓａ
ｌＩ及びＸｂａＩベクトレッテライブラリー）からのＭ
ＯＭＰ座上流の非特性化ベクトレッテフラグメントはオ
リゴヌクレオチド１及び６（下記で定義）を用いるＰＣ
Ｒ及び参考例３で述べた一般ＰＣＲ条件によって増幅さ
れた。ベクトレッテを構成するオロゴヌクレオチドは下
記で定義したようなオリゴヌクレオチド２１−２９であ
る。
【０１２１】このようなＰＣＲ増幅を実施することによ
って生じた帯を示す。
って生じた帯を示す。
【０１２２】トラックＮｏ： １及び１０：Ｏｘ１７４、ＨａｅIIIサイズマーカー ２ ＥｃｏＲＩベクトレッテライブラリー ３ ＢａｍＨＩベクトレッテライブラリー ４ ＣｌａＩベクトレッテライブラリー ５ ＨｉｎｄIIIベクトレッテライブラリー ６ ＸｂａＩベクトレッテライブラリー ７ ＳａｌＩベクトレッテライブラリー ８ ＰｓｔＩベクトレッテライブラリー ９ ＳａｃＩベクトレッテライブラリー 生成物を次のライブラリーで生成した：ＢａｍＨＩ（１
２０ｂｐ）；ＣｌａＩ（１３００ｂｐ）；ＨｉｎｄIII
（２００ｂｐ）；ＰｓｔＩ（１５０ｂｐ）；ＳａｃＩ
（５００ｂｐ）。ＣｌａＩＰＣＲからのフラグメントを
次の研究のために選択した。
２０ｂｐ）；ＣｌａＩ（１３００ｂｐ）；ＨｉｎｄIII
（２００ｂｐ）；ＰｓｔＩ（１５０ｂｐ）；ＳａｃＩ
（５００ｂｐ）。ＣｌａＩＰＣＲからのフラグメントを
次の研究のために選択した。
【０１２３】このフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、
適当なＤＥＶＩＡＴＳへ連結させた。オリゴヌクレオチ
ド２と２０によって形成されるこれらは約５８０ｂｐの
生成物を生じた。連結生成物は非対称的なＰＣＲ（５０
ｐｍｏｌｅプライマー２０と０．５ｐｍｏｌｅプライマ
ー２）によっておよび標準ＰＣＲによって再増幅させ、
プライマーの一つはｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ消
化後の配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のための材料
を製造するためにキナーゼ処理した（図７以下参照）。
図７においてトラックは次の通りである： トラックＮｏ：１と７、Ｏｘ１７４、ＨａｅIIIサイズ
マーカー ２ ＡＰＣｒ（５０ｐｍｏｌｅ プライマー ２０；
０．５ｐｍｏｌｅ プライマー２） ３ ＰＣＲ（１００ｐｍｏｌｅ プライマー ２０−
ｐ；１００ｐｍｏｌｅｓ プライマー２） ４ ＰＣＲ（１００ｐｍｏｌｅ プライマー ２０−
ｐ；１００ｐｍｏｌｅｓ プライマー２Ａ） ５ ＰＣＲ（１００ｐｍｏｌｅ プライマー ２０；１
００ｐｍｏｌｅｓ プライマー２） ６ ＰＣＲ（１００ｐｍｏｌｅ プライマー２０；１０
０ｐｍｏｌｅｓ プライマー２Ａ） （ＡＰＣｒは非対称ＰＣＲを意味し、−Ｐはプライマー
が５’ー末端においてホスホリル化されることを意味す
る)配列決定は上記のように実施した。生成した一致配
列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用いて、
他の２ＰＣＲプライマーを設計し、これをプライマー６
とのＰＣＲ反応に用いた、標的としてクラミジア感染お
よび非感染マックコイ細胞から製造された物質を用い
た。結果は図８に示す。これは得られた配列がプライマ
ー６の下流のクラミジア トラコーマチスＬ2から誘導
されたものであることを確証する。
適当なＤＥＶＩＡＴＳへ連結させた。オリゴヌクレオチ
ド２と２０によって形成されるこれらは約５８０ｂｐの
生成物を生じた。連結生成物は非対称的なＰＣＲ（５０
ｐｍｏｌｅプライマー２０と０．５ｐｍｏｌｅプライマ
ー２）によっておよび標準ＰＣＲによって再増幅させ、
プライマーの一つはｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ消
化後の配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のための材料
を製造するためにキナーゼ処理した（図７以下参照）。
図７においてトラックは次の通りである： トラックＮｏ：１と７、Ｏｘ１７４、ＨａｅIIIサイズ
マーカー ２ ＡＰＣｒ（５０ｐｍｏｌｅ プライマー ２０；
０．５ｐｍｏｌｅ プライマー２） ３ ＰＣＲ（１００ｐｍｏｌｅ プライマー ２０−
ｐ；１００ｐｍｏｌｅｓ プライマー２） ４ ＰＣＲ（１００ｐｍｏｌｅ プライマー ２０−
ｐ；１００ｐｍｏｌｅｓ プライマー２Ａ） ５ ＰＣＲ（１００ｐｍｏｌｅ プライマー ２０；１
００ｐｍｏｌｅｓ プライマー２） ６ ＰＣＲ（１００ｐｍｏｌｅ プライマー２０；１０
０ｐｍｏｌｅｓ プライマー２Ａ） （ＡＰＣｒは非対称ＰＣＲを意味し、−Ｐはプライマー
が５’ー末端においてホスホリル化されることを意味す
る)配列決定は上記のように実施した。生成した一致配
列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅ）を用いて、
他の２ＰＣＲプライマーを設計し、これをプライマー６
とのＰＣＲ反応に用いた、標的としてクラミジア感染お
よび非感染マックコイ細胞から製造された物質を用い
た。結果は図８に示す。これは得られた配列がプライマ
ー６の下流のクラミジア トラコーマチスＬ2から誘導
されたものであることを確証する。
【０１２４】図８はＢａｍＨＩ−プライマー６のＤＥＶ
ＩＡＴＳサブフラグメントーＣｌａＩベクトレット段階
の配列から誘導された２プライマーと共にオリゴヌクレ
オチド６を用いた、クラミジア感染および非感染マック
コイ細胞のＰＣＲ反応の生成物を示す；図８において トラックＮｏ：１と８ Ｏｘ１７４、ＨａｅIIIサイズ
マーカー ２ ＰＣＲ：プライマー１と６；Ｃ．トラコーマチスＬ
2に感染したマックコイ細胞 ４ ＰＣＲ：プライマー２と６；Ｃ．トラコーマチスＬ
2に感染したマックコイ細胞 ５ ＰＣＲ：プライマー１と６；非感染マックコイ細胞 ７ ＰＣＲ：プライマー２と６；非感染マックコイ細胞例４ ＭＯＭＰ４．ＸｂａＩのＥｃｏＲＩとＳａｕ３ＡＩ Ｄ
ＥＶＩＡＴＳサブフラグメント（図４参照）の配列決定 ａ）ＤＮＡ鋳型の調製 配列決定用のＤＮＡサブフラグメント（図４参照）を非
対称ＰＣＲと、５’ホスホリル化ストランドのＬａｍｂ
ｄａエキソヌクレアーゼ選択的消化を伴うＰＣＲとの両
方によって調製した。
ＩＡＴＳサブフラグメントーＣｌａＩベクトレット段階
の配列から誘導された２プライマーと共にオリゴヌクレ
オチド６を用いた、クラミジア感染および非感染マック
コイ細胞のＰＣＲ反応の生成物を示す；図８において トラックＮｏ：１と８ Ｏｘ１７４、ＨａｅIIIサイズ
マーカー ２ ＰＣＲ：プライマー１と６；Ｃ．トラコーマチスＬ
2に感染したマックコイ細胞 ４ ＰＣＲ：プライマー２と６；Ｃ．トラコーマチスＬ
2に感染したマックコイ細胞 ５ ＰＣＲ：プライマー１と６；非感染マックコイ細胞 ７ ＰＣＲ：プライマー２と６；非感染マックコイ細胞例４ ＭＯＭＰ４．ＸｂａＩのＥｃｏＲＩとＳａｕ３ＡＩ Ｄ
ＥＶＩＡＴＳサブフラグメント（図４参照）の配列決定 ａ）ＤＮＡ鋳型の調製 配列決定用のＤＮＡサブフラグメント（図４参照）を非
対称ＰＣＲと、５’ホスホリル化ストランドのＬａｍｂ
ｄａエキソヌクレアーゼ選択的消化を伴うＰＣＲとの両
方によって調製した。
【０１２５】非対称ＰＣＲはインニス（ｉｌｎｎｉｓ）
等（１９８８）プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８
５、９４３６−９４４０の方法によって実施した。簡単
に説明すると、ＤＥＶＩＡＴＳプライマーは他の使用プ
ライマー（特異的プライマーまたはベクトレットプライ
マー０．５ｐｍｏｌ／反応）よりも過剰に存在する（５
０ｐｍｏｌ／反応）。この他のＰＣＲ条件は通常通りで
ある。反応後に、混合物をセファロデックスＧ−５０カ
ラムに塗布することによって、ヌクレオチド、プライマ
ーおよびＴａｇポリメラーゼを除去する。配列決定用鋳
型もヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）とオクマン（Ｏｃｈｍａ
ｎ）（１９８９）ヌクレイック アシドス リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１
７、５８６５の方法によって調製した。簡単に説明する
と、プライマーの一つを５’−ホスフェート基を用いて
調製する。ＰＣＲは前記と同様に実施する。生成物をフ
ェノール／クロロホルム抽出によって精製し、エタノー
ル沈降後、６７ｍＭグリシン、１０ｍＭ塩化マグネシウ
ム（ｐＨ９．０）中に再懸濁し、３７℃においてＬａｍ
ｂｄａエキソヌクレアーゼによって１５分間処理する。
一重鎖ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、その後
のエタノール沈降および水中再懸濁によって精製する。
等（１９８８）プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８
５、９４３６−９４４０の方法によって実施した。簡単
に説明すると、ＤＥＶＩＡＴＳプライマーは他の使用プ
ライマー（特異的プライマーまたはベクトレットプライ
マー０．５ｐｍｏｌ／反応）よりも過剰に存在する（５
０ｐｍｏｌ／反応）。この他のＰＣＲ条件は通常通りで
ある。反応後に、混合物をセファロデックスＧ−５０カ
ラムに塗布することによって、ヌクレオチド、プライマ
ーおよびＴａｇポリメラーゼを除去する。配列決定用鋳
型もヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）とオクマン（Ｏｃｈｍａ
ｎ）（１９８９）ヌクレイック アシドス リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１
７、５８６５の方法によって調製した。簡単に説明する
と、プライマーの一つを５’−ホスフェート基を用いて
調製する。ＰＣＲは前記と同様に実施する。生成物をフ
ェノール／クロロホルム抽出によって精製し、エタノー
ル沈降後、６７ｍＭグリシン、１０ｍＭ塩化マグネシウ
ム（ｐＨ９．０）中に再懸濁し、３７℃においてＬａｍ
ｂｄａエキソヌクレアーゼによって１５分間処理する。
一重鎖ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、その後
のエタノール沈降および水中再懸濁によって精製する。
【０１２６】ｂ）このように調製したＤＮＡ鋳型を、Ｔ
ａｇ ＤＮＡポリメラーゼ（合衆国生化学製品Ｎｏ．７
１０６０）を用いるジデオキシ塩基配列決定法（サンガ
ー、エフ（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．）等のプロク．ナトル．
アカド．サイ．ＵＳＡ７４、５４６３−５４６７）によ
って配列決定した。
ａｇ ＤＮＡポリメラーゼ（合衆国生化学製品Ｎｏ．７
１０６０）を用いるジデオキシ塩基配列決定法（サンガ
ー、エフ（Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．）等のプロク．ナトル．
アカド．サイ．ＵＳＡ７４、５４６３−５４６７）によ
って配列決定した。
【０１２７】配列決定用プライマーをガンマ32Ｐ ｄＡ
ＴＰによって標識した。
ＴＰによって標識した。
【０１２８】ｃ）全長ＭＯＭＰ４．ＸｂａＩ（図４と５
参照）は約１１００ｂｐ長さであり、標準直接配列決定
法（ニュートン シー．アール．（Ｎｅｗｔｏｎ Ｃ．
Ｒ．）等（１９８８）、ヌクレイック アシドス リサ
ーチ１６ ８２３３−８２４３では読取り可能な配列を
生じなかった。しかし、ＥｃｏＲＩとＳａｕ３ＡＩ Ｄ
ＥＶＩＡＴＳサブフラグメントの各々（図４参照）はヨ
ーロッパ特許公報第１９２，０３３号に述べられている
ように読取り可能な配列を生じた。
参照）は約１１００ｂｐ長さであり、標準直接配列決定
法（ニュートン シー．アール．（Ｎｅｗｔｏｎ Ｃ．
Ｒ．）等（１９８８）、ヌクレイック アシドス リサ
ーチ１６ ８２３３−８２４３では読取り可能な配列を
生じなかった。しかし、ＥｃｏＲＩとＳａｕ３ＡＩ Ｄ
ＥＶＩＡＴＳサブフラグメントの各々（図４参照）はヨ
ーロッパ特許公報第１９２，０３３号に述べられている
ように読取り可能な配列を生じた。
【０１２９】例５ ＣＲＰ９．８のＸｂａＩ−ＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメ
ントの配列決定 ＤＮＡ鋳型を製造し、例４（ａ）と（ｂ）に述べたよう
に配列を決定した。
ントの配列決定 ＤＮＡ鋳型を製造し、例４（ａ）と（ｂ）に述べたよう
に配列を決定した。
【０１３０】全長ＣＲＰ９．８は標準直接配列決定法
（ニュートン等１９８８、ヌクレイック アシドス リ
サーチ １６ ８２３３−８２４３）において全体とし
て約２００ｂｐの読取り可能な不連続配列を生じた。し
かし、この配列内にはおそらく二重鎖鋳型の存在のため
に多義的な（ｅｑｕｉｖｏｃａｌ）領域が存在する。こ
れに比べて、ＣＲＰ．９．８のＸｂａＩ−ＤＥＶＩＡＴ
Ｓサブフラグメント（図４）はその全長に沿って読取り
可能な連続配列を生じ、多重バンド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｂａｎｄｉｎｇ）は発生しなかった。得られた配列は
公開配列［クラーク アイ．エヌ（Ｃｌａｒｋｅ Ｉ．
Ｎ．）（１９８８）ジーン ７１、３０７−３１４頁参
照］と１００％一致した。
（ニュートン等１９８８、ヌクレイック アシドス リ
サーチ １６ ８２３３−８２４３）において全体とし
て約２００ｂｐの読取り可能な不連続配列を生じた。し
かし、この配列内にはおそらく二重鎖鋳型の存在のため
に多義的な（ｅｑｕｉｖｏｃａｌ）領域が存在する。こ
れに比べて、ＣＲＰ．９．８のＸｂａＩ−ＤＥＶＩＡＴ
Ｓサブフラグメント（図４）はその全長に沿って読取り
可能な連続配列を生じ、多重バンド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｂａｎｄｉｎｇ）は発生しなかった。得られた配列は
公開配列［クラーク アイ．エヌ（Ｃｌａｒｋｅ Ｉ．
Ｎ．）（１９８８）ジーン ７１、３０７−３１４頁参
照］と１００％一致した。
【０１３１】例６ ＭＯＭ６のＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメン
ト（図４参照）の配列決定 ＭＯＭＰ６．ベクトレット（例３参照）は配列決定のた
めの鋳型として作用するために十分な量で製造すること
ができなかった。しかし、ＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡＴＳ
サブフラグメント（図４）を用い、非対称ＰＣＲとＬａ
ｍｂｄａエキソヌクレアーゼ処理ＰＣＲ生成物とからの
結果（例４参照）を組み合わせることによって、４００
ｂｐ以上を容易に配列決定することができた；この配列
は図１３に示す。
ト（図４参照）の配列決定 ＭＯＭＰ６．ベクトレット（例３参照）は配列決定のた
めの鋳型として作用するために十分な量で製造すること
ができなかった。しかし、ＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡＴＳ
サブフラグメント（図４）を用い、非対称ＰＣＲとＬａ
ｍｂｄａエキソヌクレアーゼ処理ＰＣＲ生成物とからの
結果（例４参照）を組み合わせることによって、４００
ｂｐ以上を容易に配列決定することができた；この配列
は図１３に示す。
【０１３２】例７ ＭＯＭＰ４．ＸｂａＩからのＥｃｏＲＩとＳａｕ３ＡＩ
ＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメントの使用によるＤＥＶ
ＩＡＴＳ ＲＮＡ転写体の配列決定 ａ）ＲＮＡ鋳型の調製 ＰＣＲ後のＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメントからＳＰ６
またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて（ＤＥＶＩＡＴ
Ｓの配向に依存）、ＲＮＡを転写した。ＲＮＡをフェノ
ール／クロロホルム抽出、エタノール沈降およびジエチ
ルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水中への再懸濁に
よって精製した。
ＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメントの使用によるＤＥＶ
ＩＡＴＳ ＲＮＡ転写体の配列決定 ａ）ＲＮＡ鋳型の調製 ＰＣＲ後のＤＥＶＩＡＴＳサブフラグメントからＳＰ６
またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて（ＤＥＶＩＡＴ
Ｓの配向に依存）、ＲＮＡを転写した。ＲＮＡをフェノ
ール／クロロホルム抽出、エタノール沈降およびジエチ
ルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水中への再懸濁に
よって精製した。
【０１３３】ｂ）ＲＮＡ配列決定 ＲＮＡ転写体をＡＭＶ（トリ骨髄芽球腫ウィルス）逆ト
ランスクリプターゼとジデオキシ配列決定法（サンガー
エフ．等プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ ７
４ ５４６３−５４６７）を用いて配列決定した。
ランスクリプターゼとジデオキシ配列決定法（サンガー
エフ．等プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ ７
４ ５４６３−５４６７）を用いて配列決定した。
【０１３４】ｃ）ＤＥＶＩＡＴＳ ＲＮＡ転写体の配列決定 ＭＯＭＰ４．ＸｂａＩからのＤＥＶＩＡＴＳサブフラグ
メントを用いて、ＲＮＡ転写体から約１４０ｂｐを配列
決定した。この配列はすでに公開された配列（ヨーロッ
パ特許公報第１９２０３３号参照）とＰＣＲ生成物の直
接ＤＮＡ塩基配列決定によって得られた配列（例４〜６
参照）の両方と１００％一致した。
メントを用いて、ＲＮＡ転写体から約１４０ｂｐを配列
決定した。この配列はすでに公開された配列（ヨーロッ
パ特許公報第１９２０３３号参照）とＰＣＲ生成物の直
接ＤＮＡ塩基配列決定によって得られた配列（例４〜６
参照）の両方と１００％一致した。
【０１３５】例８ ＤＥＶＩＡＴＳ誘導ＲＮＡ転写体の調製とプローブとし
ての使用 ａ）ＲＮＡ転写体の調製 サブフラグメント（ａ）プライマー９−ＣｌａＩ ＤＥ
ＶＩＡＴＳ （ｂ）プライマー８−ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴＳ を上記で定義したような標的ＤＮＡ溶液１μｌを含む１
００μｌ反応中のＤＥＶＩＡＴＳプライマー９に加えて
特異的プライマー９および８をそれぞれ用いて、ＰＣＲ
によって増幅した。得られたＰＣＲ生成物をモレキュラ
ーシーブ（セファデックスＧ５０スパン カラム）によ
って精製し、エタノール沈降させ、ＤＥＰＣ処理水１０
μｌ中に再溶解し、使用するまでー２０℃に保存した。
ての使用 ａ）ＲＮＡ転写体の調製 サブフラグメント（ａ）プライマー９−ＣｌａＩ ＤＥ
ＶＩＡＴＳ （ｂ）プライマー８−ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴＳ を上記で定義したような標的ＤＮＡ溶液１μｌを含む１
００μｌ反応中のＤＥＶＩＡＴＳプライマー９に加えて
特異的プライマー９および８をそれぞれ用いて、ＰＣＲ
によって増幅した。得られたＰＣＲ生成物をモレキュラ
ーシーブ（セファデックスＧ５０スパン カラム）によ
って精製し、エタノール沈降させ、ＤＥＰＣ処理水１０
μｌ中に再溶解し、使用するまでー２０℃に保存した。
【０１３６】２ＤＥＶＩＡＴＳフラグメントの標識ＲＮ
Ａ転写体をＳＰ６ポリメラーゼを用いるアルファ32Ｐ−
ＡＴＰ［アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］によって
調製した。対照として、ＲＮＡ転写体を活性ＳＰ６プロ
モーター配列を含むプラスミド フラグメントから並行
して製造した［メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）等（１９８
４）ヌクレイック アシドス リサーチ１２ ７０３５
−５６］。
Ａ転写体をＳＰ６ポリメラーゼを用いるアルファ32Ｐ−
ＡＴＰ［アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］によって
調製した。対照として、ＲＮＡ転写体を活性ＳＰ６プロ
モーター配列を含むプラスミド フラグメントから並行
して製造した［メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）等（１９８
４）ヌクレイック アシドス リサーチ１２ ７０３５
−５６］。
【０１３７】製造した転写体をモレキュラーシーブ（例
えばセファデックスＧ５０スパンカラム）を用いて非色
含標識を除去することによって精製した；精製の前後に
アリコートを回収し、チェレンコフ計数（Ｃｈｅｒｅｎ
ｋｏｖ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）によって放射能を測定し、
包含率を算出した。プライマー９ＣｌａＩとプライマー
８ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴＳフラグメントのＲＮＡ転写
体を２部分に分割し、ＲＮＡ合成の確認とＲＮＡプロー
ブとしての有用性とに関して別々に試験した［下記ｃ）
参照］。ｂ）ＲＮＡ合成の確認 α32Ｐ標識ヌクレオチドがＲＮＡ転写体に包含されたこ
とを確認するために、ＴＣＡ沈降実験を（ａ）非処理転
写体、（ｂ）ＤＮアーゼ処理転写体および（ｃ）ＲＮア
ーゼ処理転写体に対して実施した。リトル（Ｌｉｔｔｌ
ｅ）とジャックソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）の方法（１９８
７）「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）」III巻、１〜４２頁、グローバー エイ．エム
（ＧｌｏｖｅｒＡ．Ｍ．）編集、ＩＲＬプレス、オクス
フォードを用いた。各標識ＲＮＡ転写体サンプルプライ
マー９−ＣｌａＩ、プライマー８−ＣｌａＩおよび対照
を等しい３アリコートに分割した。第１アリコートにＲ
ＮＡアーゼを含まないＤＮアーゼ１単位を加え、第２ア
リコートにＤＮアーゼを含まないＲＮアーゼ１０μｇを
加え、第３アリコートは非処理対照として用い、３アリ
コートの全てを３７℃において３０分間インキュベート
した。各アリコートを二重のろ紙（ホワットマンＤＥ８
１）に吸収させ、乾燥させ、放射能をチェレンコフ計数
法によって測定した。このろ紙をＴＣＡ溶液２０ｍｌで
９回洗浄してから、乾燥し、再計数した。各処理数に残
留するＴＣＡ沈降可能なカウントの割合を算出した（下
記表参照）。
えばセファデックスＧ５０スパンカラム）を用いて非色
含標識を除去することによって精製した；精製の前後に
アリコートを回収し、チェレンコフ計数（Ｃｈｅｒｅｎ
ｋｏｖ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）によって放射能を測定し、
包含率を算出した。プライマー９ＣｌａＩとプライマー
８ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴＳフラグメントのＲＮＡ転写
体を２部分に分割し、ＲＮＡ合成の確認とＲＮＡプロー
ブとしての有用性とに関して別々に試験した［下記ｃ）
参照］。ｂ）ＲＮＡ合成の確認 α32Ｐ標識ヌクレオチドがＲＮＡ転写体に包含されたこ
とを確認するために、ＴＣＡ沈降実験を（ａ）非処理転
写体、（ｂ）ＤＮアーゼ処理転写体および（ｃ）ＲＮア
ーゼ処理転写体に対して実施した。リトル（Ｌｉｔｔｌ
ｅ）とジャックソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）の方法（１９８
７）「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）」III巻、１〜４２頁、グローバー エイ．エム
（ＧｌｏｖｅｒＡ．Ｍ．）編集、ＩＲＬプレス、オクス
フォードを用いた。各標識ＲＮＡ転写体サンプルプライ
マー９−ＣｌａＩ、プライマー８−ＣｌａＩおよび対照
を等しい３アリコートに分割した。第１アリコートにＲ
ＮＡアーゼを含まないＤＮアーゼ１単位を加え、第２ア
リコートにＤＮアーゼを含まないＲＮアーゼ１０μｇを
加え、第３アリコートは非処理対照として用い、３アリ
コートの全てを３７℃において３０分間インキュベート
した。各アリコートを二重のろ紙（ホワットマンＤＥ８
１）に吸収させ、乾燥させ、放射能をチェレンコフ計数
法によって測定した。このろ紙をＴＣＡ溶液２０ｍｌで
９回洗浄してから、乾燥し、再計数した。各処理数に残
留するＴＣＡ沈降可能なカウントの割合を算出した（下
記表参照）。
【０１３８】ｃ）ＲＮＡ転写体の合成の確認 ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ処理後のＲＮＡポリメラー
ゼ反応生成物のＴＣＡ沈降は、生成した標識フラグメン
トがＲＮＡであることを確証した(下記表参照)。
ゼ反応生成物のＴＣＡ沈降は、生成した標識フラグメン
トがＲＮＡであることを確証した(下記表参照)。
【０１３９】
【表１】
【０１４０】ｄ）プローブとしてのＲＮＡ転写体 ８制限酵素によって消化させたクラミジアルＤＮＡ（例
２参照）のサザン ブロットを密封ハイブリット化バッ
グ内でハイブリッド化緩衝液Ｎ［ハイブリッド化緩衝液
Ｎについては、ディヴィス エル．ジー．（Ｄａｖｉｓ
Ｌ．Ｇ）等（１９８６）分子バイオロジーの基本的方
法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、エルセヴィール（Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ）、ロンドンを参照］１０ｍｌによって、６０℃
において１時間プレハイブリッド化した。２種類の標識
ＲＮＡ転写体サンプル（プライマー９−ＣｌａＩとプラ
イマー８−ＣｌａＩ）を９４℃に加熱し、新しいＨＢＮ
１０ｍｌに加え、ブロットをこれらのサンプルにより密
封ハイブリッド化バッグ内で４２℃において一晩ハイブ
リッド化した。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回お
よび０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（５５℃）中で１
回洗浄した後、ハイブリッド化ブロットをハイブリッド
化バッグ内に密封し、強化スクリーン（ｉｎｔｅｎｓｉ
ｆｙｉｎｇｓｃｒｅｅｎ）を用いてー８０℃において４
８時間オートラジオグラフィーした。 ＤＥＶＩＡＴＳ
９−ＣｌａＩ（図４）と８−ＣｌａＩから転写し、Ｃ．
トラコーマチスＬ2ＤＮＡの制限酵素消化物のサザンブ
ロットにハイブリッッド化されたＲＮＡプローブは、良
好なシグナル：ノイズ比を示した（図９と１０）。両プ
ローブは公開制限マップ（図４）から予想されるよう
に、異なるＣｌａＩとＸｂａＩフラグメントによってハ
イブリッド化した。図９は９−ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴ
Ｓからの標識ＲＮＡ転写体とハイブリッド化したクラミ
ジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザン ブロットのオ
ートラジオグラフを示す。オートラジオグラフの側面に
サイズマーカーの大体の位置（ｂｐ）を示す。トラック
はＣ．トラコーマチスＬ2ＤＮＡの消化に用いた制限酵
素によって標識されたものである：Ｓａｃ（Ｓａｃ
Ｉ），Ｐ（ＰｓｔＩ），Ｓａｌ（ＳａｌＩ），ｘ（Ｘｂ
ａＩ），Ｈ（ＨｉｎｄIII），Ｃ（ＣｌａＩ），Ｂ（Ｂ
ａｍＨＩ）およびＥ（ＥｃｏＲＩ）。図１０は８−Ｃｌ
ａＩ ＤＥＶＩＡＴＳからの標識ＲＮＡ転写体によって
ハイブリッド化した、クラミジアルＤＮＡの制限酵素消
化物のサザンブロットのオートラジオグラフを示す。サ
イズマーカーの大体の位置（ｂｐ）をオートラジオグラ
フの側面に示す。トラックはＣ．トラコーマチスＬ2Ｄ
ＮＡの消化に用いた制限酵素によって標識されたもので
ある：Ｓａｃ（ＳａｃＩ），Ｐ（ＰｓｔＩ），Ｓａｌ
（ＳａｌＩ），ｘ（ＸｂａＩ），Ｈ（ＨｉｎｄIII），
Ｃ（ＣｌａＩ），Ｂ（ＢａｍＨＩ）およびＥ（ＥｃｏＲ
Ｉ）。
２参照）のサザン ブロットを密封ハイブリット化バッ
グ内でハイブリッド化緩衝液Ｎ［ハイブリッド化緩衝液
Ｎについては、ディヴィス エル．ジー．（Ｄａｖｉｓ
Ｌ．Ｇ）等（１９８６）分子バイオロジーの基本的方
法（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、エルセヴィール（Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ）、ロンドンを参照］１０ｍｌによって、６０℃
において１時間プレハイブリッド化した。２種類の標識
ＲＮＡ転写体サンプル（プライマー９−ＣｌａＩとプラ
イマー８−ＣｌａＩ）を９４℃に加熱し、新しいＨＢＮ
１０ｍｌに加え、ブロットをこれらのサンプルにより密
封ハイブリッド化バッグ内で４２℃において一晩ハイブ
リッド化した。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回お
よび０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（５５℃）中で１
回洗浄した後、ハイブリッド化ブロットをハイブリッド
化バッグ内に密封し、強化スクリーン（ｉｎｔｅｎｓｉ
ｆｙｉｎｇｓｃｒｅｅｎ）を用いてー８０℃において４
８時間オートラジオグラフィーした。 ＤＥＶＩＡＴＳ
９−ＣｌａＩ（図４）と８−ＣｌａＩから転写し、Ｃ．
トラコーマチスＬ2ＤＮＡの制限酵素消化物のサザンブ
ロットにハイブリッッド化されたＲＮＡプローブは、良
好なシグナル：ノイズ比を示した（図９と１０）。両プ
ローブは公開制限マップ（図４）から予想されるよう
に、異なるＣｌａＩとＸｂａＩフラグメントによってハ
イブリッド化した。図９は９−ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴ
Ｓからの標識ＲＮＡ転写体とハイブリッド化したクラミ
ジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザン ブロットのオ
ートラジオグラフを示す。オートラジオグラフの側面に
サイズマーカーの大体の位置（ｂｐ）を示す。トラック
はＣ．トラコーマチスＬ2ＤＮＡの消化に用いた制限酵
素によって標識されたものである：Ｓａｃ（Ｓａｃ
Ｉ），Ｐ（ＰｓｔＩ），Ｓａｌ（ＳａｌＩ），ｘ（Ｘｂ
ａＩ），Ｈ（ＨｉｎｄIII），Ｃ（ＣｌａＩ），Ｂ（Ｂ
ａｍＨＩ）およびＥ（ＥｃｏＲＩ）。図１０は８−Ｃｌ
ａＩ ＤＥＶＩＡＴＳからの標識ＲＮＡ転写体によって
ハイブリッド化した、クラミジアルＤＮＡの制限酵素消
化物のサザンブロットのオートラジオグラフを示す。サ
イズマーカーの大体の位置（ｂｐ）をオートラジオグラ
フの側面に示す。トラックはＣ．トラコーマチスＬ2Ｄ
ＮＡの消化に用いた制限酵素によって標識されたもので
ある：Ｓａｃ（ＳａｃＩ），Ｐ（ＰｓｔＩ），Ｓａｌ
（ＳａｌＩ），ｘ（ＸｂａＩ），Ｈ（ＨｉｎｄIII），
Ｃ（ＣｌａＩ），Ｂ（ＢａｍＨＩ）およびＥ（ＥｃｏＲ
Ｉ）。
【０１４１】例９ 化学遺伝学のためのベクトレットの代替物としてのＤＥ
ＶＩＡＴＳ ＭＯＭＰ特異性プライマー（４、５、３または７）また
は２３ｓ ｒＲＮＡ−特異性プライマー（１０）をＥｃ
ｏＲＩベクトレットおよびＥｃｏＲＩ ＤＥＶＩＡＴＳ
クラミジアル ライブラリーと共に用いたＰＣＲは図１
１に示すように同じ生成物を生じた。図１１は特異性プ
ライマーとＥｃｏＲＩベクトレットおよびＤＥＶＩＡＴ
Ｓクラミジアル ライブラリーとを用いたＰＣＲによる
増幅を示す、図１１において、 トラック１ プライマー４ ２ プライマー５ ３ プライマー３ ＋ ＥｃｏＲＩ ＤＥＶＩＡＴＳク
ラミジアル ライブラリー ４ プライマー７ ５ プライマー１０ ６ プライマー Ｏｘ１７４ ＨａｅIII サイズマー
カー ７ プライマー４ ８ プライマー５ ９ プライマー３ ＋ ＥｃｏＲＩ Ｖｅｃｔｏｒｅｔ
ｔｅクラミジアル ライブラリー １０ プライマー７ １１ プライマー１０例１０ Ｍ１３ｍｐ１８ ＲＦ ＤＮＡ １μｇをＸｂａＩによ
って切断し、ＸｂａＩＤＥＶＩＡＴＳに連結した。各々
連結ＤＮＡ約１２５ｎｇを含む４アリコートを４個の特
異性プライマー、Ｎｏ．１１、１２、１３および１４の
一つにＤＥＶＩＡＴＳ−連結ＤＮＡの一端からそれぞれ
５００、１０００、２０００または４０００ｂｐにおい
てアニールした。単一プライマー延長（４分間、７２
℃）をＰＣＲ緩衝液中でＴａｇＤＮＡポリメラーゼを用
いて実施し、反応をフェノール抽出によって停止させ、
ＤＮＡを反応成分からモレキュラーシーブ（セファデッ
クスＧ−５０）によって分離した。ＲＮＡ転写体をＳＰ
６ＲＮＡポリメラーゼによって製造し、α32Ｐ−ＡＴＰ
の包含レベルをＴＣＡ沈降によって測定した。結果は４
プライマーの全てが機械的ＲＮＡポリメラーゼ プロモ
ーターの製造に成功したことを示す。包含レベルはＰＣ
Ｒ増幅が存在しないために、予想通りに非常に低かっ
た、ＴＣＡ沈降カウントと包含％とを下記の表に示す。
ＶＩＡＴＳ ＭＯＭＰ特異性プライマー（４、５、３または７）また
は２３ｓ ｒＲＮＡ−特異性プライマー（１０）をＥｃ
ｏＲＩベクトレットおよびＥｃｏＲＩ ＤＥＶＩＡＴＳ
クラミジアル ライブラリーと共に用いたＰＣＲは図１
１に示すように同じ生成物を生じた。図１１は特異性プ
ライマーとＥｃｏＲＩベクトレットおよびＤＥＶＩＡＴ
Ｓクラミジアル ライブラリーとを用いたＰＣＲによる
増幅を示す、図１１において、 トラック１ プライマー４ ２ プライマー５ ３ プライマー３ ＋ ＥｃｏＲＩ ＤＥＶＩＡＴＳク
ラミジアル ライブラリー ４ プライマー７ ５ プライマー１０ ６ プライマー Ｏｘ１７４ ＨａｅIII サイズマー
カー ７ プライマー４ ８ プライマー５ ９ プライマー３ ＋ ＥｃｏＲＩ Ｖｅｃｔｏｒｅｔ
ｔｅクラミジアル ライブラリー １０ プライマー７ １１ プライマー１０例１０ Ｍ１３ｍｐ１８ ＲＦ ＤＮＡ １μｇをＸｂａＩによ
って切断し、ＸｂａＩＤＥＶＩＡＴＳに連結した。各々
連結ＤＮＡ約１２５ｎｇを含む４アリコートを４個の特
異性プライマー、Ｎｏ．１１、１２、１３および１４の
一つにＤＥＶＩＡＴＳ−連結ＤＮＡの一端からそれぞれ
５００、１０００、２０００または４０００ｂｐにおい
てアニールした。単一プライマー延長（４分間、７２
℃）をＰＣＲ緩衝液中でＴａｇＤＮＡポリメラーゼを用
いて実施し、反応をフェノール抽出によって停止させ、
ＤＮＡを反応成分からモレキュラーシーブ（セファデッ
クスＧ−５０）によって分離した。ＲＮＡ転写体をＳＰ
６ＲＮＡポリメラーゼによって製造し、α32Ｐ−ＡＴＰ
の包含レベルをＴＣＡ沈降によって測定した。結果は４
プライマーの全てが機械的ＲＮＡポリメラーゼ プロモ
ーターの製造に成功したことを示す。包含レベルはＰＣ
Ｒ増幅が存在しないために、予想通りに非常に低かっ
た、ＴＣＡ沈降カウントと包含％とを下記の表に示す。
【０１４２】
【表２】
【０１４３】それ故、ＤＥＶＩＡＴＳを用いて上記で説
明したように、特異性配列を増幅する本発明の実施には
ＰＣＲの使用が不要であることが明らかである。
明したように、特異性配列を増幅する本発明の実施には
ＰＣＲの使用が不要であることが明らかである。
【０１４４】例１１ クラミジアルＤＮＡのベクトレット ライブラリーを参
考例２に述べた制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩと、オ
リゴヌクレオチド３０、３１とを用いて製造した。この
ライブラリーのアリコートを参考例３に述べた条件下
で、増幅プライマーとしてオリゴヌクレオチド３２と３
３を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増
幅した。ＰＣＲ反応生成物１０μｌをＢａｍＨＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ１０単位と共にインキュベートした。
これに、制限緩衝液（酵素製造者の指示による）中でＢ
ａｍＨＩとＰｓｔＩとによって予め消化させた、ｐＡＴ
１５３プラスミドＤＮＡ１μｇを含む混合物５μｌを加
えた。ｐＡＴ１５３とＰＣＲ生成物とを含む溶液を７０
℃において１０分間加熱した。アデノシン トリホスフ
ェート（ＡＴＰ）とジチオスレイトール（ＤＴＴ）とを
最終濃度１ｍＭまで加え、次にＴ４ ＤＮＡリガーゼ１
０単位を加えた。これを１時間インキュベートした。次
にサンプルを１％アガロースゲル上で電気泳動によって
分析した。結果は図１４に示す。
考例２に述べた制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩと、オ
リゴヌクレオチド３０、３１とを用いて製造した。この
ライブラリーのアリコートを参考例３に述べた条件下
で、増幅プライマーとしてオリゴヌクレオチド３２と３
３を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増
幅した。ＰＣＲ反応生成物１０μｌをＢａｍＨＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ１０単位と共にインキュベートした。
これに、制限緩衝液（酵素製造者の指示による）中でＢ
ａｍＨＩとＰｓｔＩとによって予め消化させた、ｐＡＴ
１５３プラスミドＤＮＡ１μｇを含む混合物５μｌを加
えた。ｐＡＴ１５３とＰＣＲ生成物とを含む溶液を７０
℃において１０分間加熱した。アデノシン トリホスフ
ェート（ＡＴＰ）とジチオスレイトール（ＤＴＴ）とを
最終濃度１ｍＭまで加え、次にＴ４ ＤＮＡリガーゼ１
０単位を加えた。これを１時間インキュベートした。次
にサンプルを１％アガロースゲル上で電気泳動によって
分析した。結果は図１４に示す。
【０１４５】トラック１はＢａｍＨＩとＰｓｔＩによっ
て消化されたｐＡＴ１５３を示す。トラック２はｐＡＴ
１５３、ＰｓｔＩとＢａｍＨＩ消化物、およびＰＣＲ生
成物ＢａｍＨＩ消化物を含む連結混合物を示す。トラッ
ク３はＰｈｉｘ１７４ ＨａｅIII消化物（マーカー）
を示す。結果はベクトレット２配列（オリゴヌクレオチ
ド３０と３１を用いて製造）中の制限部位が消化され、
再連結されることを示す。
て消化されたｐＡＴ１５３を示す。トラック２はｐＡＴ
１５３、ＰｓｔＩとＢａｍＨＩ消化物、およびＰＣＲ生
成物ＢａｍＨＩ消化物を含む連結混合物を示す。トラッ
ク３はＰｈｉｘ１７４ ＨａｅIII消化物（マーカー）
を示す。結果はベクトレット２配列（オリゴヌクレオチ
ド３０と３１を用いて製造）中の制限部位が消化され、
再連結されることを示す。
【０１４６】配列リスト （１） 一般情報 i）出願人：インペリアル ケミカル インダストリー
ＰＬＣ（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉｅｓ ＰＬＣ） ii）発明の名称：増幅方
法 iii）配列数：３４ iv）通信アドレス： Ａ）受信人：法務省特許局 Ｂ）町：ベッセマーロード（Ｂｅｓｓｅｍｅｒ Ｒｏａ
ｄ） Ｃ）市：ヴェルヴィン ガーデン シティ（Ｗｅｌｗｉ
ｎ ＧａｒｄｅｎＣｉｔｙ） Ｄ）州：ハートフォードシア（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉ
ｒｅ） Ｅ）国：英国 Ｆ）郵便番号：ＧＢ−ＡＬ７ １ＨＤ v）コンピューター読取り可能な形式： Ａ）媒体型：ディスケット、５．２５ｉｎｃｈ、１．２
ＮｂストレージＢ）コンピューター：タンドン（Ｔａｎ
ｄｏｎ） Ｃ）操作系：ＰＣ−ＤＯＳ３．２０ Ｄ）ソフトウェア：ＷＰＳ−ＰＬＵＳからのＡＳＣII vi）最新出願データ： Ａ）出願称号： Ｂ）出願国： vii）先行出願データ： Ａ）出願称号 第９００１７６４．１号 Ｂ）出願日：１９９０年１月２５日 Ａ）出願称号 第９０２５２８３．４号 Ｂ）出願日：１９９０年１１月２１日 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １ 配列長さ： ３０ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡ ＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣ ＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴ ３０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２ 配列長さ： ２０ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧ ＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴ ２０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２ａ 配列長さ： １５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣ ＴＣＣＴＴ １５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＧＣＴＣＡＣＧＴ ＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡ ＴＴＣＣＧ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴ ＡＴＴＡＧＴＧＴＴＴ ＧＣＣＧＣ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ５ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＴＧＣＡＴＴＴＡＣ ＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴ ＣＴＣＴＣ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ６ 配列長さ： ２４ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣ ＧＣＡＣＡＧＴＡＧＣ ＴＧＡＴ ２４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ７ 配列長さ： ２４ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＡＡＧＧＣＡＴＡＡ ＣＧＴＧＴＴＧＡＴＴ ＧＧＴＧ ２４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣ ＣＡＣＣＡＧＡＣＴＡ ＴＴＴＣＴ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ９ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＴＣＣＧＡＴＡＣ ＡＴＴＧＡＣＴＧＴＴ ＣＣＡＧＴ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １０ 配列長さ： ２１ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＴＴＣＴＣＡＴＣ ＧＣＴＣＴＡＣＧＧＡ Ｃ ２１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １１ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＴＴＧＡＣＧＴＴＧＧ ＡＧＴＣＣＡＧＧＴＴ ＣＴＴＴＡ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １２ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴ ＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡ ＧＴＣＡＴ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １３ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＴＴＣＧＣＣＴＣＴ ＧＣＧＣＧＡＴＴＴＴ ＧＴＡＡＣ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １４ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＴＧＴＧＡＡＴＡＴＣ ＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣ ＧＴＣＴＧ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １５ 配列長さ： ４３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＡＴＴＧＣＡＧＧＡ ＧＡＡＣＣＣＡＴＴＴ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴ ＡＴＡ ＧＡＡＴＡＣＧ ＧＣＧ ４３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １６ 配列長さ： ４３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＡＧＣＧＣＣＧＴ ＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣ ＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ ＡＧＧ ＧＴＴＣＴＣＣ ＴＧＣ ４３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １７ 配列長さ： ４３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＡＴＣＧＣＡＧＧＡ ＧＡＡＣＣＣＡＴＴＴ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴ ＡＴＡ ＧＡＡＴＡＣＧ ＧＣＧ ４３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８ 配列長さ： ４１ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＣＧＣＣＧＴＡＴ ＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡ ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ ＧＧＴ ＴＣＴＣＣＴＧ Ｃ ４１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １９ 配列長さ： １７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＣＣＣＡＴＴＴＡＧ ＧＴＧＡＣＡＣ １７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２０ 配列長さ： １７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧ ＡＣＴＣＡＣＴ １７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１ 配列長さ： ５８ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＡＴＣＧＡＡＧＧＡ ＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧ ＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＧＧＡＡＣ ＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡ ＡＧＧＧＡＧＡＧ ５８ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２２ 配列長さ： ５３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣ ＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡ ＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡ ＣＧＡ ＧＡＡＴＣＧＣ ＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣ ＴＴＣ ５３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２３ 配列長さ： ５５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＧＡＡＧＧＡＧＡ ＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣ ＴＧＴＣＧＡＡＧＧＴ ＡＡＧ ＧＡＡＣＧＧＡ ＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧ ＧＡＧＡＧ ５５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２４ 配列長さ： ５７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡ ＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧ ＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧ ＧＴＡ ＡＧＧＡＡＣＧ ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ ＧＧＧＡＧＡＧ ５７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２５ 配列長さ： ５７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡ ＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧ ＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧ ＧＴＡ ＡＧＧＡＡＣＧ ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ ＧＧＧＡＧＡＧ ５７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２６ 配列長さ： ５７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡ ＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧ ＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧ ＧＴＡ ＡＧＧＡＡＣＧ ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ ＧＧＧＡＧＡＧ ５７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２７ 配列長さ： ５３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧ ＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧ ＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡ ＧＧＡ ＡＣＧＧＡＧＧ ＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡ ＧＡＧ ５３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２８ 配列長さ： ５７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣ ＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡ ＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡ ＣＧＡ ＧＡＡＴＣＧＣ ＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣ ＴＴＴＴＧＣＡ ５７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２９ 配列長さ： ５７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣ ＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡ ＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡ ＣＧＡ ＧＡＡＴＣＧＣ ＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣ ＴＴＴＡＧＣＴ ５７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３０ 配列長さ： ５４ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡ ＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴ ＴＣＧＧＧＡＴＧＡＴ ＧＣＴ ＴＧＣＴＡＧＡ ＴＧＴＡＧＡＡＴＡＣ ＧＧＣＧ ５４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３１ 配列長さ： ５３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＣＣＧＴＡＴＴＣ ＴＡＧＴＡＣＴＴＣＧ ＡＡＣＣＴＴＡＡＧＣ ＣＣＴ ＡＧＧＴＧＣＡ ＧＧＧＴＴＣＴＴＣＣ ＴＧＣ ５３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＴＣＧＡＡＣＣＴ ＴＡＡＧＣＣＣＴＡＧ ＧＴＧＣＡ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３３ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧ ＴＧＡＡＴＧＴＡＣＡ ＴＡＡＣＧ ２５
ＰＬＣ（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉｅｓ ＰＬＣ） ii）発明の名称：増幅方
法 iii）配列数：３４ iv）通信アドレス： Ａ）受信人：法務省特許局 Ｂ）町：ベッセマーロード（Ｂｅｓｓｅｍｅｒ Ｒｏａ
ｄ） Ｃ）市：ヴェルヴィン ガーデン シティ（Ｗｅｌｗｉ
ｎ ＧａｒｄｅｎＣｉｔｙ） Ｄ）州：ハートフォードシア（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉ
ｒｅ） Ｅ）国：英国 Ｆ）郵便番号：ＧＢ−ＡＬ７ １ＨＤ v）コンピューター読取り可能な形式： Ａ）媒体型：ディスケット、５．２５ｉｎｃｈ、１．２
ＮｂストレージＢ）コンピューター：タンドン（Ｔａｎ
ｄｏｎ） Ｃ）操作系：ＰＣ−ＤＯＳ３．２０ Ｄ）ソフトウェア：ＷＰＳ−ＰＬＵＳからのＡＳＣII vi）最新出願データ： Ａ）出願称号： Ｂ）出願国： vii）先行出願データ： Ａ）出願称号 第９００１７６４．１号 Ｂ）出願日：１９９０年１月２５日 Ａ）出願称号 第９０２５２８３．４号 Ｂ）出願日：１９９０年１１月２１日 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １ 配列長さ： ３０ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡ ＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣ ＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴ ３０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２ 配列長さ： ２０ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧ ＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴ ２０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２ａ 配列長さ： １５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣ ＴＣＣＴＴ １５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＧＣＴＣＡＣＧＴ ＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡ ＴＴＣＣＧ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴ ＡＴＴＡＧＴＧＴＴＴ ＧＣＣＧＣ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ５ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＴＧＣＡＴＴＴＡＣ ＧＴＧＡＧＣＡＧＣＴ ＣＴＣＴＣ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ６ 配列長さ： ２４ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣ ＧＣＡＣＡＧＴＡＧＣ ＴＧＡＴ ２４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ７ 配列長さ： ２４ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＡＡＧＧＣＡＴＡＡ ＣＧＴＧＴＴＧＡＴＴ ＧＧＴＧ ２４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣ ＣＡＣＣＡＧＡＣＴＡ ＴＴＴＣＴ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ９ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＴＣＣＧＡＴＡＣ ＡＴＴＧＡＣＴＧＴＴ ＣＣＡＧＴ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １０ 配列長さ： ２１ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＴＴＣＴＣＡＴＣ ＧＣＴＣＴＡＣＧＧＡ Ｃ ２１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １１ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＴＴＧＡＣＧＴＴＧＧ ＡＧＴＣＣＡＧＧＴＴ ＣＴＴＴＡ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １２ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴ ＡＣＴＣＡＧＧＣＡＡ ＧＴＣＡＴ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １３ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＴＴＣＧＣＣＴＣＴ ＧＣＧＣＧＡＴＴＴＴ ＧＴＡＡＣ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １４ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＴＧＴＧＡＡＴＡＴＣ ＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣ ＧＴＣＴＧ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １５ 配列長さ： ４３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＡＴＴＧＣＡＧＧＡ ＧＡＡＣＣＣＡＴＴＴ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴ ＡＴＡ ＧＡＡＴＡＣＧ ＧＣＧ ４３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １６ 配列長さ： ４３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＡＧＣＧＣＣＧＴ ＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣ ＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ ＡＧＧ ＧＴＴＣＴＣＣ ＴＧＣ ４３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １７ 配列長さ： ４３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＡＴＣＧＣＡＧＧＡ ＧＡＡＣＣＣＡＴＴＴ ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴ ＡＴＡ ＧＡＡＴＡＣＧ ＧＣＧ ４３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １８ 配列長さ： ４１ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＣＧＣＣＧＴＡＴ ＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡ ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ ＧＧＴ ＴＣＴＣＣＴＧ Ｃ ４１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １９ 配列長さ： １７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＣＣＣＡＴＴＴＡＧ ＧＴＧＡＣＡＣ １７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２０ 配列長さ： １７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧ ＡＣＴＣＡＣＴ １７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２１ 配列長さ： ５８ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＡＴＣＧＡＡＧＧＡ ＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧ ＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧ ＧＴＡ ＡＡＧＧＡＡＣ ＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡ ＡＧＧＧＡＧＡＧ ５８ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２２ 配列長さ： ５３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣ ＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡ ＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡ ＣＧＡ ＧＡＡＴＣＧＣ ＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣ ＴＴＣ ５３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２３ 配列長さ： ５５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＧＡＡＧＧＡＧＡ ＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣ ＴＧＴＣＧＡＡＧＧＴ ＡＡＧ ＧＡＡＣＧＧＡ ＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧ ＧＡＧＡＧ ５５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２４ 配列長さ： ５７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡ ＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧ ＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧ ＧＴＡ ＡＧＧＡＡＣＧ ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ ＧＧＧＡＧＡＧ ５７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２５ 配列長さ： ５７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡ ＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧ ＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧ ＧＴＡ ＡＧＧＡＡＣＧ ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ ＧＧＧＡＧＡＧ ５７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２６ 配列長さ： ５７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡ ＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧ ＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧ ＧＴＡ ＡＧＧＡＡＣＧ ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ ＧＧＧＡＧＡＧ ５７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２７ 配列長さ： ５３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧ ＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧ ＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡ ＧＧＡ ＡＣＧＧＡＧＧ ＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡ ＧＡＧ ５３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２８ 配列長さ： ５７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣ ＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡ ＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡ ＣＧＡ ＧＡＡＴＣＧＣ ＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣ ＴＴＴＴＧＣＡ ５７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２９ 配列長さ： ５７ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣ ＴＣＧＡＡＴＣＧＴＡ ＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡ ＣＧＡ ＧＡＡＴＣＧＣ ＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣ ＴＴＴＡＧＣＴ ５７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３０ 配列長さ： ５４ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡ ＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴ ＴＣＧＧＧＡＴＧＡＴ ＧＣＴ ＴＧＣＴＡＧＡ ＴＧＴＡＧＡＡＴＡＣ ＧＧＣＧ ５４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３１ 配列長さ： ５３ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＧＣＣＧＴＡＴＴＣ ＴＡＧＴＡＣＴＴＣＧ ＡＡＣＣＴＴＡＡＧＣ ＣＣＴ ＡＧＧＴＧＣＡ ＧＧＧＴＴＣＴＴＣＣ ＴＧＣ ５３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３２ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＣＴＴＣＧＡＡＣＣＴ ＴＡＡＧＣＣＣＴＡＧ ＧＴＧＣＡ ２５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３３ 配列長さ： ２５ 配列型： ヌクレオチド 鎖構造： 一重鎖 トポロジー： 線状 ＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧ ＴＧＡＡＴＧＴＡＣＡ ＴＡＡＣＧ ２５
【図１】（ａ） 阻止ベクトレット部分を示す （ｂ） 阻止ベクトレット部分への化学的遺伝学方法の
適用を説明する
適用を説明する
【図２】（ａ） 非相補的ベクトレット部分を示す （ｂ） 非相補的ベクトレット部分への本発明の方法の
適用を説明する
適用を説明する
【図３】本発明によるベクトレットとプライマーとの構
造的デザインを示す
造的デザインを示す
【図４】ＭＯＭＰ４．ＸｂａＩ，ＭＯＭＰ６．ベクトレ
ットとＣＲＰ９．８との相対的位置を示す
ットとＣＲＰ９．８との相対的位置を示す
【図５】化学的遺伝学方法と本発明の方法とによるＰＣ
Ｒによって得られた増幅フラグメントのアガロース ゲ
ル分析を示す。
Ｒによって得られた増幅フラグメントのアガロース ゲ
ル分析を示す。
【図６】ＰＣＲによって得られたバンドを示す
【図７】ＭＯＭＰ．６ベクトレット（ＣｌａＩ）からの
ＰＣＲによる増幅を示す
ＰＣＲによる増幅を示す
【図８】クラミジア感染または非感染のマクコイ細胞の
ＰＣＲによる増幅を示す
ＰＣＲによる増幅を示す
【図９】９−ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴＳからのハイブリ
ッド化クラミジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザンブ
ロットのオートラジオグラフを示す
ッド化クラミジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザンブ
ロットのオートラジオグラフを示す
【図１０】８−ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴＳからのハイブ
リッド化クラミジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザン
ブロットのオートラジオグラフを示す
リッド化クラミジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザン
ブロットのオートラジオグラフを示す
【図１１】ＥｃｏＲＩベクトレットとＤＥＶＩＡＴＳク
ラミジアル ライブラリーと特異的プライマーによるＰ
ＣＲ増幅を示す
ラミジアル ライブラリーと特異的プライマーによるＰ
ＣＲ増幅を示す
【図１２】単一サイクル プライマー エクステンショ
ン後のＲＮＡ転写体発生を示す
ン後のＲＮＡ転写体発生を示す
【図１３】ＭＯＭＰ６．のＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡＴＳ
サブフラグメントからの配列を示す
サブフラグメントからの配列を示す
【図１４】ベクトレット２配列の制限部位の商科と再結
合を示す
合を示す
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１２月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ａ）は阻止ベクトル部分を示す図であり、ｂ）
の（ｉ）〜（ｉｉｉ）は阻止ベクトル部分への化学的遺
伝学方法の適用を説明する図である。
の（ｉ）〜（ｉｉｉ）は阻止ベクトル部分への化学的遺
伝学方法の適用を説明する図である。
【図２】ａ）は相補的ベクトレット部分を示す図であ
り、ｂ）の（ｉ）〜（ｖ）は非相補的ベクトレット部分
への本発明の方法の適用を説明する図である。
り、ｂ）の（ｉ）〜（ｖ）は非相補的ベクトレット部分
への本発明の方法の適用を説明する図である。
【図３】本発明によるベクトレットとプライマーとの構
造的デザインを示す図である。
造的デザインを示す図である。
【図４】ＭＯＭＰ４．ＸｂａＩ，ＭＯＭＰ６．ベクトレ
ットとＣＲＰ９．８との相対的位置を示す図である。
ットとＣＲＰ９．８との相対的位置を示す図である。
【図５】化学的遺伝学方法と本発明の方法とによるＰＣ
Ｒによって得られた増幅フラグメントのアガロース・ゲ
ル分析の結果を示す電気泳動写真である。
Ｒによって得られた増幅フラグメントのアガロース・ゲ
ル分析の結果を示す電気泳動写真である。
【図６】ＰＣＲによって得られたバンドを示す電気泳動
写真である。
写真である。
【図７】ＭＯＭＰ．６ベクトレット（ＣｌａＩ）からの
ＰＣＲによる増幅を示す電気泳動写真である。
ＰＣＲによる増幅を示す電気泳動写真である。
【図８】クラミジア感染または非感染のマクコイ細胞の
ＰＣＲによる増幅を示す電気泳動写真である。
ＰＣＲによる増幅を示す電気泳動写真である。
【図９】９−ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴＳからのハイブリ
ッド化クラミジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザンブ
ロットのオートラジオグラフを示す電気泳動写真であ
る。
ッド化クラミジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザンブ
ロットのオートラジオグラフを示す電気泳動写真であ
る。
【図１０】８−ＣｌａＩ ＤＥＶＩＡＴＳからのハイブ
リッド化クラミジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザン
ブロットのオートラジオグラフを示す電気泳動写真であ
る。
リッド化クラミジアルＤＮＡの制限酵素消化物のサザン
ブロットのオートラジオグラフを示す電気泳動写真であ
る。
【図１１】ＥｃｏＲＩベクトレットとＤＥＶＩＡＴＳク
ラミジアル・ライブラリーと特異的プライマーによるＰ
ＣＲ増幅を示す電気泳動写真である。
ラミジアル・ライブラリーと特異的プライマーによるＰ
ＣＲ増幅を示す電気泳動写真である。
【図１２】単一サイクル・プライマー・エクステンショ
ン後のＲＮＡ転写体発生を示す図である。
ン後のＲＮＡ転写体発生を示す図である。
【図１３】ＭＯＭＰ６．のＢａｍＨＩ ＤＥＶＩＡＴＳ
サブフラグメントからの配列を示す図である。
サブフラグメントからの配列を示す図である。
【図１４】ベクレット２配列の制限部位の消化と再結合
を示す電気泳動写真である。
を示す電気泳動写真である。
フロントページの続き (72)発明者 ジョン・クレイグ・スミス イギリス国チェシャー，ニアー・ナッツフ ォード，プラムレイ，アスコル・ドライブ 14 (72)発明者 ウィリアム・レシュマン・マクフィート イギリス国チェシャー，コングレトン，ボ ーリン・ドライブ ４ (72)発明者 ラシダ・アンウァー イギリス国チェシャー，ノースウィッチ, ウィンチャム，シェリー・アベニュー 34 (72)発明者 アレクサンダー・フレッド・マーカム イギリス国チェシャー，クレウィー，ゴー ストレイ，ボース・ベッド・レーン 25
Claims (18)
- 【請求項１】 （i）未知配列、（ii）第１プライマー
によるハイブリッド化のための既知ヌクレオチド配列の
第１プライミング領域および（iii）その少なくとも一
つの鎖がその二重鎖相補形またはその一重鎖形において
蛋白質によって結合されうる核酸配列を有するベクトレ
ット部分を含む標的核酸フラグメント／ベクトレット単
位の少なくとも一部分の増幅方法において、第１プライ
ミング領域のエクステンション生成物が第１プライミン
グ領域に対して実質的に相補的であるように選択された
第１プライマーがハイブリッド化する第１プライミング
領域を有する一重鎖標的核酸／ベクトレット単位に相補
的に合成されるが、このようなエクステンション生成物
がこのような第１プライミング領域を有さない一重鎖標
的核酸フラグメント／ベクトレット単位に相補的に合成
されないように、標的核酸フラグメント／ベクトレット
単位をハイブリッド形成条件において適当なヌクレオシ
ド トリホスフェートおよびヌクレオシド トリホスフ
ェートの重合剤によって同時にまたは連続的に処理する
ことから成る方法。 - 【請求項２】 ベクトレット単位の少なくとも一部を
（ａ）（i）未知配列と（ii）プロモーター配列とを含
む核酸配列の第１プライミング領域にハイブリット化す
る第１プライマーのプライマーエクステンションと、そ
の後の（ｂ）前記プロモーター配列の制御下での核酸配
列の反復発生とによって増幅する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ベクトレット プライマー増幅生成物の
合成が開始プライマーのエクステンション生成物の初期
合成に依存する請求項１または請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 標的核酸フラグメント／ベクトレット単
位の少なくとも１ベクトレット部分が第１鎖と第２鎖と
を有する二重鎖部分を含み、第１鎖は末端重合阻止部分
を有し、第２鎖は二重鎖相補形もしくは一重鎖形で蛋白
質によって結合されうる核酸配列を含む一重鎖部分を有
し、第２鎖が第１プライマーとのハイブリッド形成のた
めの第１プライミング領域を含む標的核酸フラグメント
の鎖に連結し、末端重合阻止部分が適当なヌクレオシド
トリホスフェートとヌクレオシド トリホスフェート
の重合剤との存在下、ハイブリッド形成条件下における
第２鎖の前記一重鎖部分への補体を形成する第１鎖のエ
クステンションの阻止に効果的である請求項１〜３のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 標的核酸フラグメント／ベクトレット単
位のベクトレット部分が第１鎖と第２鎖とを含む二重鎖
部分を有し、ベクトレット部分の第２鎖が開始プライミ
ング領域を含む標的核酸フラグメントの鎖に連結し、第
１鎖、第２鎖およびベクトレット プライマーのヌクレ
オチド配列が、ベクトレット プライマーが第２鎖の補
体にハイブリッド化しうるか、同じハイブリッド形成条
件下で第１鎖にはハイブリッド化し得ないことを特徴と
する請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 同一開始プライマーとの使用のために、
標的核酸の種々な開裂部位における開裂によって形成さ
れる核酸フラグメントとの連結によって得られる標的核
酸フラグメント／ベクトレット単位からなる多数の種々
なベクトレットライブラリーを製造し、各ベクトレット
ライブラリーをハイブリット形成条件下で適当なヌク
レオシド トリホスフェートとヌクレオシド トリホス
フェートの重合剤で別々にまたは同時に処理することに
よって、同一開始プライマーの使用に基づいて多数の開
始プライマーエクステンション生成物を得ることから成
る請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 核酸配列がその二重鎖相補形である場合
にのみ蛋白質によって結合されうる請求項１〜６のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項８】 核酸配列が制限酵素によって結合されう
る請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 核酸配列がＤＮＡまたはＲＮＡポリメラ
ーゼを結合しうる請求項１〜７のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１０】 核酸配列がＳＰ６またはＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼを結合しうる請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 各末端にベクトレット部分を有する標
的核酸フラグメント／ベクトレット単位の製造方法であ
って、標的核酸フラグメント／ベクトレット単位を前記
ベクトレット単位の標的核酸フラグメント部分の未知配
列領域において開裂し、得られた開裂標的核酸部分にベ
クトレットを連結して、各末端にベクトレット部分を有
するベクトレット単位を形成することから成る方法。 - 【請求項１２】 ベクトレットが請求項１〜１０のいず
れかに記載された通りのものである請求項２記載の方
法。 - 【請求項１３】 非相補性領域を有する二重鎖核酸を含
むベクトレットであって、この領域が、第１鎖にその二
重鎖相補形またはその一重鎖形において１種類の蛋白質
によって結合されうる核酸配列を有し、かつこの領域が
第２鎖にその二重鎖相補形または一重鎖形において第１
鎖の核酸配列を結合しうる蛋白質とは異なる蛋白質によ
って結合されうる核酸配列を有するベクトレット。 - 【請求項１４】 請求項７〜１０のいずれかに記載の核
酸配列を含むことから成る請求項１３記載のベクトレッ
ト。 - 【請求項１５】 プライマー エクステンションによる
未知配列核酸フラグメントの増幅用キットであって、次
の要素：標的核酸フラグメントへの連結用または標的核
酸フラグメント／ベクトレット単位への連結用のベクト
レット、前記フラグメントまたはベクトレット単位は使
用時に単一末端ベクトレットを有するかまたは標的核酸
フラグメントの各末端にベクトレットを有する標的フラ
グメント／ベクトレット単位を形成する標的核酸開裂手
段によって得られたものであり、前記ベクトレットはそ
の少なくとも一つの鎖がその二重鎖相補形または一重鎖
形において蛋白質によって結合され得る核酸配列を有す
るようなベクトレットである；書かれたまたは印刷され
たキットの使用説明書；および下記任意要素の一つ以
上；（ａ）核酸配列を結合しうる適当な蛋白質、（ｂ）
特異的部位において標的核酸を開裂して標的核酸フラグ
メントを得るかまたは標的核酸フラグメント／ベクトレ
ット単位を得る手段、（ｃ）４種類のヌクレオシド ト
リホスフェートの各々、（ｄ）（ｃ）におけるヌクレオ
シド トリホスフェートの重合剤、（ｅ）適当な第１プ
ライマーおよび／またはベクトレットプライマー、およ
び（ｆ）適当な緩衝剤、を含むキット。 - 【請求項１６】 下記要素：第１プライマー、ネステッ
ド（ｎｅｓｔｅｄ）ベクトレット プライマー、ネステ
ッド第１プライマー、配列決定用プライマー、本発明の
方法を実施するための緩衝液、ならびにマグネシウム、
カリウムおよびヌクレオシド トリホスフェートの濃度
を変えるための緩衝液の一つ以上を含む請求項１５記載
のキット。 - 【請求項１７】 プライマーエクステンションによる未
知配列の核酸フラグメントの増幅用のベクトレット ラ
イブラリー キットであって、次の要素： （１）動物、植物または微生物の種の個体要素のヌクレ
オシド配列から得られた標的核酸フラグメント／ベクト
レット単位のセットからなり、各単位は１個または２個
の末端ベクトレット部分を有する標的核酸を含み、前記
部分の少なくとも一つがその二重鎖相補形もしくはその
一重鎖形において蛋白質によって結合され得る核酸配列
を含む少なくとも一つの鎖を有する少なくとも一つのベ
クトレット ライブラリー；および （２）標的核酸フラグメント／ベクトレット単位の第１
プライミング領域にハイブリッド化する１個又は２個以
上の第１プライマー、から成るキット。 - 【請求項１８】 ベクトレットが請求項７〜１０のいず
れかに記載の核酸配列を含む請求項１５〜１６のいずれ
かまたは請求項１７記載のキットまたはベクトレット
ライブラリー キット。
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