JP3403405B2

JP3403405B2 - 核酸伸長検定

Info

Publication number: JP3403405B2
Application number: JP50588393A
Authority: JP
Inventors: カーディー，ドナルド・レオナルド・ニコラス; デルナッテ，サビン・ヨランデ・ジョセフ
Original assignee: サイトセル・リミテッド
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1992-09-14
Publication date: 2003-05-06
Anticipated expiration: 2018-05-06
Also published as: AU2558692A; DK0666927T3; AU672367B2; WO1993006240A1; CA2118913C; DE69219627T2; EP0666927B1; ES2101116T3; CA2118913A1; EP0666927A1; DE69219627D1; ATE152778T1; JPH06510669A

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野この発明は核酸を含むある新規の組成物、関心のある
核酸配列を検出する方法、およびこの発明の方法を実行
するためのキットに関する。

発明の背景特定の核酸配列の直接的増幅のためのプロセスは既知
であり、先行技術で説明されてきた。Kleppe他は、J.Mo
l.Biol.56（1971）p341−361において、関心のある特定
の核酸配列に隣接してハイブリッド形成する核酸プライ
マーの用途を開示している。プライマーは変性DNA二重
鎖の反対のストランドに対してアニールされ、DNAポリ
メラーゼおよびヌクレオシドトリホスフェートを使用し
て伸長され、オリジナルの核酸配列の２つの二重鎖分子
を与える。変性、アニーリングおよび伸長の連続サイク
ルは、オリジナルの核酸配列の複製物をさらに増幅する
ために行なわれる。

上の方法をここでは複製連鎖反応（PCR）と呼び、こ
の方法はUS4683195およびUS4683202でさらに説明され、
これらの明細書においてはアニールされた核酸プライマ
ーの伸長はサーマス・アクアチクス（Thermus aquaticu
s）（Taq）DNAポリメラーゼ、またはDNAポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントのいずれかでもたらされる。こ
の方法の不利な点は、反応温度を中間温度（たとえば55
−60℃）と非常に高温（たとえば90−95℃）との間で交
互に調整する必要があること（高温への反復された「サ
ーマル・サイクリング」を含む）、核酸配列の増幅を達
成するために複数のサイクルの大きな温度変化のために
必要とされるタイムスケールの長いこと、および長い配
列領域の多重複製の間に生じるエラーにより核酸配列の
増幅された複製物において配列エラーが発生することな
どがある。加えて、１つ以上のさらなるプロセスが増幅
された核酸配列の検出のために必ず必要とされる（たと
えばゲル電気泳動）。

代替の核酸増幅プロセスは、WO88−10315（Siska Dia
gnostics）ならびにEP329822（Cangene）およびEP37396
0（Siska Diagnostics）において開示されており、サイ
クリング反応は特定のDNA配列に隣接するオリゴヌクレ
オチドの代替DNAおよびRNAを含み、これらのオリゴヌク
レオチドは転写プロモータおよび開始部位を含む。この
ように生産された特定の配列のRNA複製物、または代替
的に特定のRNA配列を含む導入試料は、核酸プライマー
を使用してDNAストランドとして複製され、結果として
生じるRNA:DNAハイブリッドからのRNAは、変性によって
除去される（WO88/10315）か、またはRNアーゼＨを使
用して破壊される（EP329882およびEP373960）。転写プ
ロモータを形成するオリゴヌクレオチドのアニーリング
は、RNA生産を反復するために繰り返される。増幅は主
に効果的なRNAポリメラーゼの使用によって達成され、
各サイクルでDNA鋳型に対して過剰のRNA複製物を生産す
る。RNアーゼＨを含むこの方法の変形例は、PCRと比
べて、増幅が一定の環境温度で潜在的に達成され得ると
いう利点を有する。加えて、PCRは各サイクルでDNA複数
物の倍加を結果としてもたらすが、DNA:RNAサイクリン
グはサイクルあたりはるかに大きな増幅、たとえばT7
RNAポリメラーゼを使用して、サイクルあたり10−100RN
A複製物を潜在的に達成し得る。EP329822に記載されたD
NA:RNAサイクリング法の不利な点は、転写プロモータを
作るために、オリゴヌクレオチドのアニーリングに対し
て既知の別々の末端を有するテスト核酸を必要とするこ
とである。これは長いDNA分子の中のたとえば、特定の
遺伝子の検出を困難にする。この方法のさらなる不利な
点は、少なくとも３つの酵素がDNA:RNAサイクリングを
行なうために必要とされるが、これには安定化、コスト
および再現性に対して潜在的に有害な結果を伴い、かつ
１つ以上のさらなるプロセス（たとえばゲル電気泳動）
が増幅された核酸配列の検出のために必ず必要とされる
ことである。

上述のプロセスはすべて、特定の核酸領域が直接複製
され、これらの核酸複製物がさらに複製されて増幅を達
成する方法に関するものである。異なった核酸配列間の
多様性のため、同じプロセスにおいて異なった配列間で
増幅速度が異なりやすく、したがって特定の核酸の元の
量をたとえば定量化する際に問題を与える。他のプロセ
スは特定のテスト核酸の複製を必要としない。WO87/062
70は、RNA依存RNAポリメラーゼによる増幅のための配列
を含むRNAプローブの使用について記載している。特
に、この明細書はバクテリオファージＱ−βレプリカー
ゼによる自己触媒複製について記載している。自己触媒
RNA増幅のための隣接するプロモータを有する配列特異
的RNAプローブの使用は、異なった核酸配列ではなく、
ハイブリッド形成されたプローブそれ自体の潜在的に
「同型の」増幅という利点を有するが、増幅前にハイブ
リッド形成されていないプローブ分子を除去する必要が
あることや、ハイブリッド形成シグナルが単一のハイブ
リッド形成のみに依存するという事実（おそらくは「バ
ックグラウンド・ノイズ」の増大を伴う）などの不利な
点がある。EP320308は、相補的な隣接してハイブリッド
形成する核酸プローブ対の使用について記載しており、
これらのプローブはハイブリッド形成部位で一体に連結
され、より長いプローブを生産する。変性、再アニーリ
ングおよび連結の連続サイクルにおいて、特定の標的ヌ
クレオチド配列および前に連結されたプローブはどちら
も、付加的な連結されたプローブの形成のための鋳型と
して作用し得る。したがって、標的配列はそれ自体増幅
されることはないが、さらなる連結のための基質として
それ自体作用する連結されたプローブの形成をもたら
す。このプロセスは、一本鎖末端の連結（「シャープエ
ンド・ライゲーション」）の可能性という不利な点をを
有し、連結されたプローブ分子を検出するために、１つ
以上の余分なプロセス（たとえばゲル電気泳動）を絶対
的に必要とする。

発明の概要一局面において、本発明は試料中の興味のある核酸配
列の存在のためのテストの方法を提供し、この方法は試
料を第１のプローブおよび第２のプローブと接触させる
ステップを含み、これらのプローブは、プローブが互い
に隣接または実質的に隣接するように興味のある配列に
ハイブリッド形成することが可能であり、興味のある配
列に対して非相補的なプローブの部分は少なくとも部分
的にアニールされ、さらにこの方法は少なくとも１つの
プローブの鎖伸長を引起こすように試料を処理するステ
ップと、伸長されたプローブを検出するステップとを含
む。

上に規定した方法に従って他の具体例が見出され、こ
の方法はさらに、第３のプローブと第４のプローブとを
用いることを含み、第３および第４のプローブの他の部
分が互いに対してアニールすることが可能なように、第
３および第４のプローブは興味のある配列に相補的な第
１および第２のプローブの配列の少なくとも一部に対し
てそれぞれハイブリッド形成可能であり、この方法はさ
らに、第３または第４のプローブの一部を鋳型として用
いて、第３のまたは第４のプローブの鎖伸長を引起こす
ように試料を処理するステップを含む。

一般に、第１のプローブは興味のある配列に実質的に
相補的な配列を含み、かつ興味のある配列に実質的に非
相補的な配列をさらに含む。典型的にこれらの配列はそ
れぞれ15−25のヌクレオチドおよび２−10のヌクレオチ
ドを含む。さらに見出されることは、一般に第２のプロ
ーブは興味のある配列に実質的に相補的な配列を含み、
かつ興味のある配列に実質的に非相補的であるが興味の
ある配列に非相補的な第１のプローブの配列の少なくと
も一部に対しては実質的に相補的である配列をさらに含
む。典型的にはこれらの第２のプローブの領域はそれぞ
れ15−25のヌクレオチドおよび30−70のヌクレオチドを
含む。したがって典型的には第２のプローブは、第１の
プローブよりも長く、第１のプローブの伸長のための鋳
型として作用し得る。

上記のもののある特定の変形として、プローブの１つ
は自己相補的なヌクレオチドを含んでもよく、したがっ
て同じプローブが鋳型として作用して自己プライミング
して伸長することができる。その後、このプローブは他
のプローブへ連結されてもよい。この他のプローブは興
味のある配列に対する共通のハイブリッド形成により、
伸長されるプローブの近くに保持されるものである。興
味のある配列に非相補的なプローブの部分のアニール
は、プローブ間の比較的短い相補性の領域を介して行な
われる。当業者には明らかなように、ハイブリッド形成
の条件は、２つのプローブが関心のある配列（「標的」
配列）に対する事前のハイブリッド形成によって互いに
近接して安定化される場合にのみアニールするように、
容易に選択され得る。したがって、伸長されたプローブ
は関心のある配列が存在する場合にのみ形成される。

伸長されたプローブの存在は、たとえば従来の方法に
よって（たとえば、配列特異的核酸、タンパク質もしく
は他の物質を結合することによって、または伸長された
プローブについてのゲル電気泳動サイズ分析によって）
直接検出することができる。しかしながら、一般には、
１つの伸長されたプローブ配列を増幅するために、この
新しく合成されたDNAをさらに処理することが望まし
い。

伸長されたプローブを増幅するための様々な方法が考
察される。これらの方法にはもちろん複製連鎖反応（PC
R）などの従来の技術が含まれる。しかしながら、他の
新しい技術もまた考えられる。

他の局面においては、本発明は上に規定するように生
成される伸長されたプローブを増幅する方法を提供し、
この方法は：伸長された第１のプローブの新しく合成された配列の
少なくとも一部に実質的に相補的なさらなるプローブ
を、伸長された第１のプローブに対してハイブリッド形
成するステップと、伸長された第１のプローブを鋳型と
して用いて、さらなるプローブを適切なポリメラーゼを
用いて伸長するステップと、伸長された第１のプローブ
とさらなるプローブとを分離するステップとを含み、こ
れにより、伸長されたさらなるプローブは他の第１のプ
ローブ分子の伸長のために鋳型として作用でき、かつ伸
長された第１のプローブは他のさらなるプローブ分子の
伸長のために鋳型として作用することができる。

本発明のこの局面は図１の下部分を参照して以下にさ
らに説明される。

一般に、さらなるプローブはオリゴデオキシリボヌク
レオチドであり、これはDNAポリメラーゼ、典型的にはT
aqポリメラーゼによって伸長され得る。

さらなるプローブを用いる代わりに、伸長された第１
のプローブは３′末端に自己相補的配列を含んでもよ
い。したがって、鋳型ストランドから分離されると、伸
長された第１のプローブは自己アニールし、それにより
それ自体の伸長のために自己プライミングすることがで
きる。

この方法では、アニール、伸長および変性のサイクル
を繰り返すことにより、元の伸長されたプローブの増幅
が行なわれる。好ましくは、変性は穏やかな加熱によっ
て行なわれる。

１つの好ましい増幅の方法においては、新しく伸長さ
れたプローブおよび鋳型として用いられる相補的プロー
ブの部分は、ポリメラーゼによって、もっとも好ましく
はRNAポリメラーゼによって認識される二本鎖核酸の領
域を含む。その後、T7またはSP6ポリメラーゼなどの効
果的なRNAポリメラーゼは、二本鎖核酸のストランドの
うちの１つ（「センス」ストランド）から大量のRNAを
生産し得る。好ましくは、新しく伸長されたプローブは
センスストランドである。

伸長されたプローブ配列を用いる場合と同じく、RNA
複製物は、たとえば従来の技術によって直接検出され得
る。代替的には、たとえば感受性を向上するためにRNA
複製物をさらに増幅することが好ましい。RNAを増幅す
る１つの方法は図２を参照して以下にさらに説明され
る。この具体例においては、RNA分子は、RNA複製物に対
して少なくとも部分的に相補的であり、そのため鋳型と
して作用することができる一本鎖DNA分子をアニールし
た後に伸長される。生成される新しい二本鎖核酸分子は
RNAポリメラーゼのための認識部位を含む。好ましく
は、この認識部位は元のRNA複製物を作るためのものと
は異なるRNAポリメラーゼによって認識されるべきであ
る。これによりRNA複製物が作られる。RNA分子に対して
少なくとも部分的に相補的な一本鎖DNA分子に対してア
ニールした後に、これらのRNA複製物は伸長される。生
成される新しい二本鎖核酸分子はRNAポリメラーゼのた
めの認識部位を含み、好ましい具体例においてRNAポリ
メラーゼは、プロセスを開始した元のRNA分子と同じ配
列を有するRNA複製物を作らせることができるものであ
る。これは明らかにRNA複製物を増幅するための効率的
な方法である。

さらなる特定の具体例が見出され、ここでは生成され
る元のRNA分子はＱ−βレプリカーゼによって複製され
かつ増幅されることが可能な領域を含む。したがって、
当該分子の複製の複製物が形成され得る。

RNA複製物が増幅されても増幅されなくても、RNA複製
物は、たとえば配列特異的な標識をつけられたプローブ
に対するハイブリッド形成によって、または他の従来の
方法によってなどの様々な方法で検出され得る。代替的
に、図３を参照して以下により詳細に説明するように、
RNA複製物は、アミノ酸配列への無理のない効率的な翻
訳が可能なように、必要な翻訳開始および停止シグナル
を含んでもよく、そのアミノ酸配列の存在はアミノ酸配
列のある特定の性質によって容易に検出することができ
る。

したがってさらに他の局面においては、本発明はRNA
分子（翻訳開始および停止コドンを含む）の存在を検出
する方法を提供し、この方法は、RNA分子を特定の性質
を有するアミノ酸配列へ翻訳し、かつ検出するステップ
を含む。翻訳のためのRNA配列は多くの好ましい特徴を
有しその長さは好ましくは100−200ヌクレオチドであ
る。翻訳開始コドンは好ましくは５′末端から10〜30の
ヌクレオチドの間に置かれるべきであり、その末端は好
ましくはトリホスエート結合７−メチルグアノシン残基
を含む。

好ましくは、翻訳は、ウサギ網状赤血球または小麦胚
芽溶解物によって与えられる成分、または翻訳効率の高
い他の調製物を用いて行なわれる。

好ましくは、アミノ酸配列は酵素活性剤、補因子また
はリプレッサとして作用する。好ましくは、アミノ酸配
列はβ−ガラクトシダーゼのＮ末端フラグメントを含
む。したがって、β−ガラクトシダーゼの残りの部分を
加えることにより、酵素活性が形成される。これは当業
者には公知の態様で（たとえば着色した生成物をもたら
す酵素基質を用いることによって）検出することができ
る。

本発明の伸長されたプローブを増幅する他の方法が見
出される。これらの方法は、図４を参照して以下にさら
に詳細に説明するように、２対のプローブを用いること
を含む。この具体例においては、対のうちの１つのプロ
ーブが他のプローブを鋳型として用いて伸長され得るよ
うに、第１および第２のプローブは隣接または実質的に
隣接するようヌクレオチド標的配列に対してハイブリッ
ド形成する。伸長の後は、第１のプローブおよび第２の
プローブは標的配列から（たとえば熱変性によって）分
離され得るが、しかしそれら自体は伸長された相補的配
列によって安定したハイブリッドを形成し得る。その
後、第３および第４のプローブ分子は、第１のプローブ
および第２のプローブのそれぞれの標的特異的領域に相
補的な配列を介して互いに隣接または実質的に隣接する
ように、第1/第２のプローブの安定したハイブリッドに
対してハイブリッド形成され得る。したがって、第3/第
４プローブの対のうちの一方は、従来のように他方のプ
ローブを鋳型として用いて伸長されることができる。こ
の伸長により第３のプローブおよび第４のプローブは安
定したハイブリッドを形成することができ、この安定し
たハイブリッドは、第１のプローブおよび第２のプロー
ブのさらなる分子のための標的配列として作用して、ハ
イブリッド形成および伸長をもたらす。したがって、変
性および復元の連続したサイクルによって、元の伸長さ
れたプローブ配列の増幅が行なわれる。

本発明の１つの変形として、標的ヌクレオチド配列は
二本鎖であってもよく、かつ第1/第２のプローブおよび
第3/第４のプローブは標的の対向するストランドへ結合
する。こうして、両方の対から一方のプローブが同じサ
イクルの間に伸長され得る。

他の変形を図５を参照して以下に説明する。この他の
具体例においては、第１のプローブおよび第２のプロー
ブは上述のように隣接、または実質的に隣接するように
興味のある配列に対してハイブリッド形成し得る。しか
しながら、プローブの対のうちの一方は「ヘアピンルー
プ」を含む。したがってプローブの一方の伸長に続い
て、プローブはDNAリガーゼで処理されて一方のループ
分子を生成する。上述のように、第３のプローブおよび
第４のプローブもまた存在してもよく、これらのプロー
ブは、ヌクレオチド標的配列の他方のストランドに対し
て、または第１のプローブおよび第２のプローブの単一
ループ分子ハイブリッドに対してのいずれかにハイブリ
ッド形成する。ハイブリッド形成により第３のプローブ
および第４のプローブは隣接、または実質的に隣接する
ようになり、これによりプライミングおよび伸長が可能
となる。先に説明したのと同じ方法で、プローブ分子の
一方の末端にヘアピンループを含むことにより、DNAリ
ガーゼを用いて第３のプローブと第４のプローブの一本
のループ分子のハイブリッドを形成するように処理する
ことが可能となる。

その後、これらのハイブリッド分子はプローブの修飾
されていない対に対してハイブリッド形成して、修飾さ
れていないプローブを伸長および連結する。したがっ
て、変性および復元の連続したサイクルによって、元の
伸長されたプローブ配列の増幅が行なわれる。

他の局面においては、本発明は、興味のある拡散配列
と、それに対してハイブリッド形成される第１のプロー
ブと、第１のプローブに隣接または実質的に隣接する興
味のある配列に対してハイブリッド形成される第２のプ
ローブとを含む新規な組成物を提供し、よって第１およ
び第２のプローブの他の部分は互いに対してアニールす
るようになり、そこにおいて、プローブの１つはプロー
ブの一部を鋳型として用いて鎖伸長されている。

さらに他の局面において、本発明はポリメラーゼおよ
び使用説明書を含む本発明の方法を実行するためのキッ
トを提供する。

好ましくは、標的配列に対してアニールするプローブ
（「第１」および「第２」プローブ）はオリゴデオキシ
リボヌクレオチドであり、典型的には各プローブは標的
ヌクレオチド配列（つまり興味のある配列）に相補的な
15〜25のヌクレオチドを含むが、含まれる相補的なヌク
レオチドの数はこれより少なくてもまた多くてもよい。

好ましくは、標的配列に非相補的な第２のプローブの
一部は30−70ヌクレオチド長であり、典型的にはプロー
ブの５′末端にある。

一般に、第１のプローブの標的非相補的な（しかし第
２のプローブに相補的な）配列は２−10ヌクレオチド長
であり、典型的にはプローブの３′末端にある。両方の
プローブの非相補的配列はこれよりも長くてもよく、第
２のプローブのものは短くてもよい。

本発明の本質的な特徴は、標的配列に対してハイブリ
ッド形成される場合に、第１のプローブおよび第２のプ
ローブが互いに隣接または実質的に隣接していることで
ある。「隣接」という用語は、これらのプローブの相補
的配列に対して塩基対合される標的配列の部分（遺伝子
座「loci」）の間に塩基対合することなく残される標的
配列のヌクレオチドがないことを意味すべく意図され
る。プローブ間が近いため、プローブの標的非相補的配
列をアニールすることが可能となる。当業者には容易に
明らかとなるように、標的配列からより離してプローブ
を互いに対しアニールすることが可能となるようにプロ
ーブを設計することにより、プローブがハイブリッド形
成する標的ヌクレオチド配列中の遺伝子座の間にギャッ
プがもたらされ得る。この状況においては、プローブは
「実質的に隣接している」と呼ばれるが、これはなぜな
ら、プローブに対して塩基対合される標的配列の部分の
間に塩基対合することなく残される標的配列のヌクレオ
チドがいくつかあるからである。明らかに、標的配列の
その間にある対になっていないヌクレオチドの数は、プ
ローブの設計によって変えることができる。したがっ
て、第１のプローブと第２のプローブとが隣接するよう
にハイブリッド形成することが好ましい一方で、プロー
ブは標的配列の５ヌクレオチド分まで分離されることが
できる。

好ましい具体例において、第２のプローブのプライマ
ー伸長（標的配列を鋳型として用いる）は、プローブの
３′末端を『ブロックする』によって防ぐことができ
る。これは好ましくは、たとえばビオチニル化もしくは
チオール化されたヌクレオチド、またはジデオキシヌク
レオチドを３′末端に導入することによりなし得る。

好ましくは、第１のプローブおよび第２のプローブは
DNAであり、かつ第１のプローブはDNAポリメラーゼの作
用によって伸長される。適当な酵素にはAMV逆転写酵
素、クレノウフラグメントのE.coliDNAポリメラーゼ
Ｉ、またはTaqポリメラーゼがある。

増幅の他の方法が本発明者らによって見出される。一
具体例においては、両方のプローブはDNAであり、第１
のプローブの伸長は新しく合成された二本鎖DNA（ds D
NA）の生成をもたらし、このds DNAは、RNAポリメラー
ゼによる転写のためのプロモータおよび転写開始部位を
含む。適当なRNAポリメラーゼ（T7またはSP6ポリメラー
ゼなど）を加えることにより、『センス』（＋）ストラ
ンドの第１のRNA複製物を生成する。

好ましくは、伸長された第１のプローブはセンス・ス
トランドである。好ましくは、前記第１のRNA複製物は2
0−40のリボヌクレオチドを含むが、その数は当業者に
は明らかであるようにこれより少なくてもまたはこれよ
り多くてもよい。

当業者に明らかとなるように、伸長されたプローブに
対して、DNA複製物を作るために先に説明されたような
増幅工程が行なわれてもよく、その後これらのDNA複製
物は、ここに説明したような方法または先行技術で公知
の方法を用いてRNA分子として増幅されてもよい。

本発明の方法のプライマー伸長生成物またはそこから
生成されるRNA複製物は、先行技術においてすでに公知
の工程によってさらに増幅されてもよいということが理
解される。たとえば、プライマー伸長生成物にはUS4683
195およびUS4683202に説明されるPCR法が行なわれても
よく、またはEP329822によって開示されるような代替DN
AおよびRNAサイクリングが行なわれてもよく、またはEP
320308にクレームされるような隣接してハイブリッド形
成されたプローブの連結が行なわれてもよい。

本発明の工程は、標的核酸がたとえば膜またはビーズ
のような固体に付着される固相で実行するか、または液
相（たとえば溶液）で実行することができる。固相は、
たとえば増幅されたRNAによってプライミングされた一
本鎖DNA分子が固相に付着されるなどのように、本発明
の他の局面で用いられてもよい。本発明の方法はプライ
マー伸長生成物またはそこから生成されるRNA複製物の
いずれかを検出するためのある範囲の方法とともに用い
られてもよい。たとえば、核酸生成物は、標識核酸プロ
ーブのハイブリッド形成によって、またはゲル電気泳動
による核酸生成物のサイズ分析によって検出され得る。

本発明の工程はいかなるDNAまたはRNA標的配列の検
出、ならびに欠失および転座などの遺伝子物質の損傷の
検出に応用可能である。小さなヌクレオチドプローブを
用いることにより、本発明の方法は遺伝子物質の点変異
または単塩基の多形性の検出に特に適しており、これに
より通常のハイブリッド形成が標的配列とプローブとの
間の単塩基の不対合によって妨害されるように、厳密な
ハイブリッド形成の状態が容易に達成され得る。本発明
の方法は、微生物の検出、および遺伝子の病気に関連し
た遺伝子の検出のような診断医学、ならびに獣医学、農
学、法医学、食物分析および分子生物学の研究などの他
の分析化学などのあらゆる分野に応用可能である。

したがって、本発明が適用される用途によっては、
「関心のある配列」は非常に長いかもしれず（たとえば
遺伝子全体）、または短いかもしれない（たとえば点変
異の検出において）。したがって、先に規定したプロー
ブは、興味（関心）のある配列のほんの短い部分に対し
てのみ結合されるように標的配列に対してハイブリッド
形成するかもしれず、または標的配列のいくつかが本当
に関心のある配列の範囲を超えるように結合されるかも
しれない。

本発明の様々な局面は以下に示される例および図面を
参照することによってよりよく理解され、図１−５は本発明に従う方法の概略図であり、図６−８は本発明に従う方法を用いて行なわれる実験
から得られる結果のオートラジオグラフである。

具体的な実施例の説明図１に概略的に示されるこの発明の一実施例におい
て、第１のプローブ１および第２のプローブ２は、標的
相補配列を介して、関心のある配列３に対し（実質的に
お互いに隣接して）ハイブリッド形成する。

この配列により、プローブ１はプローブ１と２との間
の相補性の短い領域のためにプライマー伸長されること
が可能になり、この領域は標的核酸に非相補的であり、
したがって関心のある配列３に対しハイブリッド形成し
ない。この伸長は鋳型として２を使用し、プローブの性
質に依存して、いかなる適切なRNAまたはDNAポリメラー
ゼによってももたらされ得る。プローブ２は（その標的
を鋳型として使用して）伸長することができない。その
理由はプローブ２は（たとえば末端チオヌクレオチド、
デオキシリボヌクレオチドまたはビオチニル化ヌクレオ
チドによって）その３′末端でブロックされるからであ
る。このようにプローブ１のプライマー伸長は伸長され
たプローブ４の生産を実質的に結果としてもたらす。

変性に続いて、標的ヌクレオチド配列３はプローブ１
および２によるさらなるハイブリッド形成のために放出
され、一方新しく加えられた修飾されていない第３のオ
リゴヌクレオチドプローブ５はプライマー伸長された分
子４に対しハイブリッド形成し、それ自体DNAポリメラ
ーゼによって伸長され、伸長された分子６を生産するこ
とが可能である。変性に続いて、分子４および６はそれ
ぞれプローブ５および１によるさらなるハイブリッド形
成のために放出され、これらのプローブは伸長されてそ
れぞれ６および４のさらなる分子を生産する。これらは
変性、ハイブリッド形成およびプライマー伸長のさらな
るサイクルに供され得る。このように、各サイクルで、
１つの新しい分子４が１および２の標的核酸３に対する
ハイブリッド形成の結果として生産され、１つの新しい
分子６は前のサイクルからの分子４の鋳型上での５のハ
イブリッド形成および伸長の結果として生産され、さら
に４および６の各々１つの新しい分子が前のサイクルか
らの４および６の分子それぞれ上での、５および１のそ
れぞれの伸長の結果として生産される。

別の特定の具体例は図２に概略的に示される。プロー
ブ１および２は前に説明したように標的配列３に対しハ
イブリッド形成し、DNAポリメラーゼによる１の伸長に
より伸長されたプローブ４を与えることを可能にし、そ
の結果、新しい二本鎖DNA領域が４および２から形成さ
れ、この領域はRNAポリメラーゼの作用のためのプロモ
ータおよび転写開始部位を含み、このRNAポリメラーゼ
は次にRNA複製物５を生産することが可能である。RNA複
製物５は相補性の短い領域を介して一本鎖DNA分子６に
対してアニールして、ハイブリッドRNA/DNA分子７を与
えることができ、この分子はRNAストランドからプライ
マー伸長され、分子８に新しい二重鎖DNA領域を生じ、
この領域はRNAポリメラーゼの作用のためのプロモータ
および転写開始部位を含み、RNAポリメラーゼは次にRNA
複製物９を生産する。前記RNA複製物９は相補性の短い
領域を介して第２の一本鎖DNA分子10に対してアニール
して、ハイブリッドRNA/DNA分子11を与えることが可能
であり、この分子はRNAストランドからプライマー伸長
され、分子12に新しい二本鎖DNA領域を生じることが可
能であり、この領域はRNAポリメラーゼの作用のための
プロモータおよび転写開始部位を含み、このRNAポリメ
ラーゼはさらなるRNA複製物５を生産し、複製物５は、R
NA:DNAアニーリング、プライマー伸長およびさらなるRN
A複製物９および５の生産のサイクルに再び入る。

図３はこの発明の方法の結果として生産されたRNA複
製物の測定のための２つの代替例を概略的に示す。１つ
の代替例において、RNA複製物13は固相14上に固定化さ
れ、標識されたプローブ15に対するハイブリッド形成に
より検出される。検出において、13および15のハイブリ
ッドを生産し、かつゆえに標識の固相への結合を生じ
る。別の代替例において、RNA複製物13は翻訳開始およ
び終止コドン、ならびに５′トリホスフェート結合７−
メチルグアノシン残基を含み、この残基はRNA複製物13
のβ−ガラクトシダーゼ16のペプチドフラグメントへの
効果的な翻訳を促進するものであり、このフラグメント
は不活性酵素フラグメント17を補って、活性β−ガラク
トシダーゼ18を産出する。明らかに、β−ガラクトシダ
ーゼのためのスキームにおいて、他の酵素が代わりに使
用され得る。

この発明の範囲内にあるさらなる具体例は図４に概略
的に示される。この方法は、標的配列19が二重鎖であ
り、２対のプローブ20、21および22、23が使用されるこ
とを除いては、前に説明したものと本質的に同じであ
る。

したがって、オリゴヌクレオチドプローブ20および23
ならびに３′ブロックされたオリゴヌクレオチドプロー
ブ21および22は、二本鎖標的ヌクレオチド配列19上でそ
れぞれのパートナーに対し実質的に隣接してハイブリッ
ド形成し、その結果、プローブ20および23が、プローブ
21および22とそれぞれ相補性の短い領域を介して、DNA
ポリメラーゼを使用して伸長され、プライマー伸長され
た分子24および25を生産することができる。変性に続い
て、標的ヌクレオチド配列19はプローブ20から23による
さらなるハイブリッド形成のために放出され、一方プラ
イマー伸長された分子24および25は新しく伸長された相
補性の領域のために、分子21および22に対しそれぞれ再
びハイブリッド形成することが可能である。これらの再
びハイブリッド形成された分子21/24および22/25は、今
度は分子22/23および20/21のハイブリッド形成のための
標的ヌクレオチド配列をそれぞれ含む。これらのハイブ
リッド形成された分子20および23はDNAポリメラーゼに
よって伸長され、さらなる分子24および25を生産するこ
とが可能であり、これらの分子は分子21および22それぞ
れのさらなるハイブリッド形成のために放出され、この
ようにして分子24および25の複製のサイクルが継続され
る。各サイクルで、１つの新しい分子24および25が、20
および21の標的核酸19に対するハイブリッド形成の結果
として生産され、24および25のさらなる新しい分子が、
前のサイクルで形成された分子22/25および21/24の鋳型
上での20および23のハイブリッド形成および伸長の結果
としてそれぞれ生産される。

さらなる具体例が図５に概略的に示され、この具体例
において、オリゴヌクレオチドプローブ20および23なら
びに３′ブロックされたオリゴヌクレオチドプローブ26
および27（どちらも短い５′ヘアピンループを含む）
は、二本鎖標的ヌクレオチド配列19に対し隣接してハイ
ブリッド形成し、その結果、前記プローブ20および23
が、プローブ26および27とそれぞれ相補性の短い領域を
介して、DNAポリメラーゼを使用して伸長され、DNAリガ
ーゼを使用して連結されて、ループ状の分子20/26およ
び23/27を生産することができる。変性に続いて、これ
らのさらなる分子20/26および23/27はさらなるハイブリ
ッド形成のために放出され、このようにループ状の分子
20/26および23/27の複製のサイクルが継続される。各サ
イクルで、20/26および23/27の１つの新しいループ状分
子が標的核酸19に対するハイブリッド形成の結果として
生産され、さらに新しいループ状分子がハイブリッド形
成、伸長および連結の結果として生産され、前のサイク
ルで形成されたループ状の分子23/27および20/26の鋳型
上でそれぞれ20/26および23/27を形成する。

さらなる具体例が図５に概略的に示され、この具体例
において、オリゴヌクレオチドプローブ20および23なら
びに３′ブロックされたオリゴヌクレオチドプローブ26
および27（どちらも短い５′ヘアピンループを含む）
は、二本鎖標的ヌクレオチド配列19に対し隣接してハイ
ブリッド形成し、そして前記プローブ20および23が、プ
ローブ26および27とそれぞれ相補性の短い領域を介し
て、DNAポリメラーゼを使用して伸長され、DNAリガーゼ
を使用して連結されて、ループ状の分子20/26および23/
27を生産することが可能である。変性に続いて、これら
のさらなる分子20/26および23/27はさらなるハイブリッ
ド形成のために放出され、このようにしてループ状の分
子20/26および23/27の複製のサイクルが続けられる。し
たがって、各サイクルで、20/26および23/27の１つの新
しいループ状の分子がハイブリッド形成、伸長および連
結の結果として生産され、前のサイクルで形成されたル
ープ状の分子23/27および20/26の鋳型上でそれぞれ20/2
6および23/27を形成する。

例核酸プローブの生産および使用のための一般的な方法
は、Sambrook、FritschおよびManiatisによって編集さ
れ、Cold Spring Harbor Pressにより発行された（198
9）、“Molecular Cloning,A Laboratory Manual"にお
いて詳細に記述されており、この文献を以下“Molecula
r Cloning"と称する。これらの例で使用されるオリゴヌ
クレオチドは表１に詳細に説明される。そうでないと特
定されない限り、すべてのオリゴヌクレオチドはCruach
em（Glasgow,UK）によって供給される長鎖アルキルアミ
ノCPG支持体およびヌクレオシドホスホルアミダイト（p
hosphoramidite）を使用して、Applied Biosystems 380
Aシンセサイザで合成され、製造者の指示に従って使用
されたものである。すべてのオリゴヌクレオチドは“Mo
lecular Cloning"に記載されたようにHPLC精製され、最
終的に凍結乾燥され、10ピコモル／μで水中に溶解さ
れた。

例１−CFTR遺伝子に対するプローブのハイブリッド形成
および伸長この例はCFTR（嚢胞性線維症トランスレギュレータ）
遺伝子に対する隣接してハイブリッド形成されたプロー
ブの相互作用の結果としての新しい核酸ストランドの生
産、および嚢胞性線維症の疾病に関連するこの遺伝子の
デルタ−508欠失に対するハイブリッド形成の影響を示
す。

I.オリゴヌクレオチドの調製オリゴ１および２は、Zuckermann他（Nucleic Acids
Research,15（1987）p5305−5321）の方法によって３′
−チオール基を使って合成されるか、または代替的に、
オリゴ１は商業的に（Severn Biotech,Kidderminster,U
K）３′−ビオチン末端とともに購入され、上述のよう
に精製された。

II.標的DNAの調製 DNA試料は、突然変異されていないCFTR遺伝子に対す
る正常な個体のホモ接合、およびCFTR遺伝子におけるコ
ドン508のホモ接合欠失のために嚢胞性線維症を患う個
体から入手されたものである。DNAは無菌の爪楊枝状針
で頬の表層を穏やかに擦ることによってこれらの個体の
頬の細胞から得られた。頬の細胞は次に10μの無菌水
中に懸濁され、65℃で20分間20μ 0.1M水酸化カリウ
ムおよび0.1％Triton−Ｘ−100と溶解され、20μの0.
1M HClおよび0.1％Triton−Ｘ−100で中和された。

CFTR遺伝子の領域は、次にEP200362（Cetus Corporat
ion）において説明されるように、複製連鎖反応（PCR）
処理によって増幅された。５μのヒトの細胞溶解産物
は94℃で３分間変性され、５μの20mM Tris.HCl pH
8.3、100mM塩化カリウム、3mM塩化マグネシウム、20ng/
mlウシ血清アルブミン（フラクションＶ、Sigma,Poole,
UK）、400μＭデオキシリボヌクレオチド（dNTP）混合
物（デオキシアデノシントリホスフェート、デオキシチ
ミジントリホスフェート、デオキシグアノシントリホス
フェートおよびデオキシシチジントリホスフェート（dC
TP）の混合物、すべてはPharmacia,Milton Keynes,UKか
ら入手される）、0.1％Triton−Ｘ−100、0.05ユニット
のサーマス・アクアチクスDNAポリメラーゼ（United St
ates Biochemicals,Cleveland,Ohio,USA）ならびに0.5
μＭオリゴヌクレオチド増幅プライマー５′−CAGTGGAA
GAATGGCATTCTGTT−３′および５′−GGCATGCTTTGATGACG
CTTCTG−３′に混合される。増幅はサーマル・サイクラ
ー（Techne、モデルPHC−２）において40サイクルで行
なわれ、93℃で１分間、55℃で1.5分間および72℃で３
分間の連続ステップを含んだ。さらなる0.05ユニットの
ポリメラーゼが20サイクルステージで添加された。CFTR
遺伝子のセグメントを含むPCR生産物は、最終的に1.6％
低融点アガロースゲル中のゲル電気泳動（“Molecular
Cloning"参照）にかけられ、PCRバンドはゲルから細か
く切り分けられ、Elutip−ｄカラム（Schleicher and S
chuell,Dussel,Germany、製造者の指示どおり）上で精
製された。最終PCR生産物はエタノール沈澱され、100ng
/mlの濃度で、10mM Tris.HCl（pH7.5）、1mM EDTA（T
E緩衝液）中に溶解された。

III.正常および嚢胞性線維症DNAのハイブリッド形成分
析ハイブリッド形成反応物は、正常または嚢胞性線維症
を患う固体から得られたDNAと、CFTRおよびオリゴ１も
しくは２のオリゴヌクレオチド組合せ、またはデルタ50
8ならびにオリゴ１および２の組合せのいずれかとの混
合物を含んだ。加えて、対照はヒトのDNAを含まない混
合物を含んだ。ハイブリッド形成のために、20ピコモル
のオリゴヌクレオチドCFTRまたはデルタ508は、５％ホ
ルムアミド、0.6M塩化ナトリウムおよび0.06Mクエン酸
ナトリウム50μ、pH7中で、20ピコモルのオリゴ１ま
たは２、２μ（200ng）のPCR増幅されたヒトDNA（ま
たはPCR緩衝液ブランク）と混合された。混合物は37℃
で30分間インキュベートされた。１つの代替の反応にお
いて、0.2mM dNTP混合物、12mM MgCl₂、80mM KCl、2
0mM DTT（ジチオトレイトール、Sigma Chemicals,Pool
e,UK）および10uCi α−32PdCTP（3000 Ci/mmol,Amers
ham International,Amersham,UK）を含有するさらに50
μの0.1M TrisHCl pH8.3が添加され、その後40ユニ
ットのAMV逆転写酵素（Pharmacia）が添加され、混合物
はさらに30分間42℃でインキュベートされた。別の代替
例において、2mM dNTPが0.2mM dNTPと置換され、32Pd
CTPは省かれた。最後の代替反応において、12μＭ dNT
P混合物、60mM MgCl₂、100μＭ DTTおよびluCi α−
32PdCTP（3000 Ci/mmol,Amersham）か10uCi α−35Sd
ATP（6000 Ci/mmol,Amersham）のいずれかを含有する
さらに250μの10mM Tris.HCl pH7.5が添加され、そ
の後20ユニットのクレノウDNAポリメラーゼＩ（United
States Biochemicals）かまたは12ユニットのクレノウD
NAポリメラーゼ（Life Technologies,Paisley,UK）のい
ずれかが添加され、この混合物は30℃でさらに30分間イ
ンキュベートされた。

５μのアリコートの反応物が次にポリアクリルアミ
ド配列決定ゲル分析にかけられた（“Molecular Clonin
g"参照）。図６は上述のような最後の代替反応物からの
分析の典型的な結果を示し、これはα−35SdATPを含
み、CFTRおよびオリゴ１のオリゴヌクレオチド組合せを
用いるものである。図６、突然変異されていないCFTR遺
伝子の存在下の、突然変異されていないCFTR遺伝子に対
して特定の修飾されていないオリゴヌクレオチドプロー
ブの伸長（レーン２）を示す一方、CFTR遺伝子のデルタ
508突然変異の存在下（レーン１）、またはCFTR遺伝子
の存在しないところ（レーン３）において、同じ修飾さ
れていないオリゴヌクレオチドの伸長がないことを示す
オートラジオグラフである。標的DNAはPCR増幅されたCF
TR遺伝子、PCR増幅されたデルタ508突然変異CFTR遺伝
子、またはブランクPCR反応の生産物のいずれかであっ
た。これは正常のDNAに対してハイブリッド形成する
が、デルタ508CFTR遺伝子を含むDNAに対してハイブリッ
ド形成しないことによる、標識され伸長されたオリゴ１
の誘導体の予期された発現を示す。

標識された核酸は次にTCA不溶カウントの評価のため
にTCA沈澱にかけられた（“Molecular Cloning"参
照）。標識されていない核酸は100μ0.2M NaOHを添
加することによって変性され、100μ 2M酢酸アンモ
ニウムを添加することによって中和された。300μ 1
0×SSC（SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム
である）が最後に添加され、この混合物は、「ミニホー
ルド（Minifold）」ドットブロット装置（Schleicher a
nd Schuell）を使用して、予め湿らされた（20×SSC）
ニトロセルロース膜（BA85 0.45ミクロン、Schleicher
and Schuell）上で濾過された。膜は真空オーブンの中
で２時間80℃で焼かれた。

フィルタに対するハイブリッド形成のために、10ピコ
モルオリゴ３（表１）が、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
（Life Technologies）および５μ γ−32P ATP（5
000Ci/mmol,Amersham）を使用して、“Molecular Cloni
ng"に記載されるように、５′−末端標識され、かつゲ
ル精製された。膜は５×SSC、５×Denhardt試薬（“Mol
ecular Cloning"参照）、１％グリシン、0.1％SDS、250
μg/ml tRNA（醸造用酵母、Boehringer,Lewes,UK）お
よび50mMリン酸ナトリウムpH7中で、68℃で２時間予め
ハイブリッド形成された。ハイブリッド形成は100万Cer
enkov cpmのプローブを添加し、37℃で４時間インキュ
ベートすることによって行なわれた。洗浄は室温で５×
SSC中で５分間２回行なわれ、40℃で30分間１回行なわ
れた。フィルタは次にKodak XR−５フィルムを使用し
て、−70℃で直接オートラジオグラフィーにかけられ
た。

表２は、逆転写酵素またはクレノウポリメラーゼによ
る標識の、正常なDNAに対しハイブリッド形成される相
同的にハイブリッド形成されたCFTRプローブへの組込
み、または不適当な組合わせのプローブへの組込みがほ
とんどないデルタ508に対してホモ接合の個体から得ら
れるDNAにハイブリッド形成されたデルタ508プローブへ
の組込み、またはヒトDNAの存在しないプローブへの組
込みにおけるTCA沈澱分析の結果を示している。その結
果は図７に示される。図７は２つの異なった実験からの
１組のオートラジオグラフであり、図２のプライマー伸
長された分子４に特異的なリン−32標識オリゴヌクレオ
チドプローブの、CFTR（嚢胞性線維症トランスレギュレ
ータ）遺伝子またはこの遺伝子のデルタ508誘導体に特
異的なプローブのハイブリッド形成に続いて生産された
核酸に対するハイブリッド形成を示し、各場合におい
て、プライマー伸長のための鋳型として作用し得るCFTR
特異的プローブ、オリゴ２（表１）とともにハイブリッ
ド形成されている。標的DNAはPCR増幅されたCFTR遺伝子
（「正常」）、PCR増幅されたデルタ508突然変異CFTR遺
伝子（「デルタ508」）またはブランクPCR反応の生産物
（「なし」）のいずれかであった。逆転写酵素触媒され
たプライマー伸長CFTRまたはデルタ508プローブに対す
る２つの別々の触媒分析の結果は、表１のデータからの
標識の組込みが、特異的なハイブリッド形成およびハイ
ブリッド形成されたCFTRまたはデルタ508プローブの伸
長によるものであることを示す。

例２−RNAの増幅およびハイブリッド形成検出 I.オリゴヌクレオチドの調製表１は、増幅のために使用されるオリゴヌクレオチド
４および５の配列を詳細に示す。これらは、上述のよう
に合成され、精製される。

II.ハイブリッド形成され、伸長されたプローブの増幅オリゴヌクレオチドCFTRまたはデルタ508、およびオ
リゴ２は、例１のように、CFTR DNAに対してハイブリ
ッド形成された。ハイブリッド形成に続いて、逆転写酵
素およびT7 RNAポリメラーゼによって、または、クレ
ノウポリメラーゼおよびT7 RNAポリメラーゼによっ
て、プライマー伸長および増幅が行なわれた。逆転写酵
素によるプライマー伸長のためには、30pmole オリゴ
４、30pmole オリゴ５、0.1MトリスHCl pH8.3、2mM
dNTP、1mM NTP（アデノシン三リン酸（ATP）、ウリジ
ン三リン酸（UTP）、グアノシン三リン酸（GTP）および
シチジン三リン酸の混合物、すべてPharmaciaから得
た）、12mM MgCl₂、80mM KCl、20mM DTT、100ユニッ
トRNエーシン（asin）（Pharmacia）、40ユニットのAMV
逆転写酵素（Pharmacia）、および40ユニットのT7 RNA
ポリメラーゼ（Life Technologies）を含む50ulの混合
物が添加された。２ユニットのRNアーゼＨ（Life Techn
ologies）が、ある実験（表３および図５に示されるも
のを含む）においてはオプションで添加されたが、結果
にほとんど変化はなかった。ある実験においては、20uC
i α−32P UTP（3000 Ci/mmol、Amersham）もまた、
混合物に含まれた。インキュベーションが42℃で３時間
にわたって行なわれ、この後、放射性試料が、TCA沈澱
（“Molecular Cloning"参照）、およびリボ核酸への組
み込みを表わす不溶性TCAカウントの評価のため供され
た。非放射性試料は、100ul 37％ホルムアルデヒドの
添加および60℃で15分間のインキュベーションによって
変性された。例１で説明したように、200ul 20×SSCが
添加され、試料はBA85ニトロセルロース膜に固定化され
た。上述のように（例１）、膜は32Pで標識されたオリ
ゴ３とハイブリッド形成され、洗浄されて上述のように
オートラジオグラフィにかけられた。

クレノウポリメラーゼによるプライマー伸長のために
は、30pmole オリゴ４、30pmole オリゴ５、50mM ト
リスHCl pH7.75、400μＭ dNTP、500μＭ NTP、5mM
MgCl₂、1mM ２−メルカプトエタノール、100ユニッ
トのRNエーシン（Pharmacia）、40ユニットのクレノウ
ポリメラーゼ（United States Biochemicals）、40ユニ
ットのT7 RNAポリメラーゼ（Life Technologies）、お
よび20uCi α−32P UTP（3000 Ci/mmol、Amersham）
を含む250ulの混合物が添加された。インキュベーショ
ンは37℃で３時間にわたって行なわれ、その後、放射性
試料が、TCA沈澱（“Molecular Cloning"参照）、およ
びリボ核酸への組み込みを表わす不溶性TCAカウントの
評価のために供された。表３は、オリゴ４および５の双
方を組み込み、オリゴCFTRまたはデルタ508に相同的に
ハイブリッド形成するハイブリッド形成混合物への32P
UTPの組み込みの増加を示す。その結果はまた、オリ
ゴ４またはオリゴ５のいずれを省略しても、32P UTP合
成が低減することを示す。図８は、図２のプライマー伸
長された分子４（またはRNA分子５）に特異的なリン32
で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの、核酸に対
するハイブリッド形成を示すオートラジオグラフであ
り、核酸は、「正常な」DNA（PCR増幅されたCFTR遺伝
子）に対するプローブCFTRのハイブリッド形成の後生成
されたもの、「CF」DNA（PCR増幅されたデルタ508CFTR
遺伝子）に対するデルタ508のハイブリッド形成の後生
成されたもの、または「なし」（PCRブランク）に対し
てCFTRまたはデルタ508のハイブリッド形成なしで生成
されたものであり、各場合において、オリゴ２なしで、
またはオリゴ２とともに、ならびに、オリゴ４（＋
４）、オリゴ５（＋５）またはオリゴ４および５の双方
（＋４＋５）のいずれかで行なわれ、ここでオリゴ２、
４および５は表１に規定される。

これは、オリゴ４および５の双方を増幅混合物に組み
込むことによる、標識オリゴ３に相同的な核酸（RNアー
ゼではなく逆転写酵素によるプライマー伸長）における
対応する増加を示す。

例３−ハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドプロ
ーブの増幅および翻訳に媒介される検出 I. M13転写／翻訳鋳型の調製 β−ガラクトシダーゼ酵素供与体フラグメントの転写
および翻訳のための鋳型は、以下のように生成される。
50pmoleアリコートのオリゴヌクレオチド５および６
（表１）が、90℃に５分間加熱され、ゆっくりと室温ま
で冷却された。2ug M13mp18 DNA（RF型、Life Techno
logies）が、製造業者の使用説明書に従ってEcoR1（Lif
e Technologies）で消化され、線状にされたDNAが、1.8
％低融点アガロースゲルでのゲル電気泳動、およびElut
ip−ｄカラムクロマトグラフィーによって精製された。
DNAは最後に、エタノール沈殿され、TE緩衝液に溶解さ
れた。0.1μｇ（１μｌ）EcoR I消化されたM13 DNA
が、アニールされたヌクレオチド調製物と混合され、水
の添加によって15μｌにされた。４μｌの5x連結緩衝液
および１μｌ T4DNAリガーゼ（ともにLife Technologi
esから供給される）が添加され、混合物は12℃で１時間
にわたってインキュベートされた。10ngの混合物が、E.
coli JM101の形質転換に用いられ（“Molecular Cloni
ng"参照）、組換えM13クローンにおけるクローン化され
たオリゴヌクレオチド5/6フラグメントが、シーケンシ
ングキット（Amersham International）を用いてのジデ
オキシヌクレオチドDNAシーケンシングによって確認さ
れた。M13mp18 DNAに関して先に説明したように、組換
えM13からのRF型DNAが調製され、EcoR Iで消化され、ゲ
ル精製された。このEcoR Iは、M13mp18 DNAを消化し
た。このEcoR I消化されたM13mp18（5/6）DNAは、100μ
g/mlでTE緩衝液において溶解された。

β−ガラクトシダーゼ遺伝子フラグメントは、以下の
ように生成された。50pmoleのオリゴヌクレオチド８お
よび９（表１）が、個々に29μｌの水で希釈され、10μ
ｌの5xキナーゼ緩衝液（5x＝0.25M トリス HCl pH7.
6、50mM MgCl₂、25mM DTT、0.5mM スペルミジンCH
l、0.5mM EDTAおよび1mM ATP）が添加された。さらに
この混合物に、10μCi（１μｌ）５′−γ32Pアデノシ
ン三リン酸（Amersham International、5000Ci/mmol）
および５μｌ T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Life Tec
hnologies）が添加された。この混合物は、30分間37℃
でインキュベートされ、標識ヌクレオチドは、20％変性
ポリアクリルアミドゲルで精製された。精製され、標識
されたオリゴヌクレオチド８および９は、次に組合わさ
れ、オリゴヌクレオチド７および10（表１）と最終容量
20μｌで混合された。この混合物は、90℃に加熱され、
ゆっくりと室温まで冷却された。５μｌの5xライゲーシ
ョン緩衝液および１μｌ T4 DNAリガーゼ（Life Tech
nologies）が添加され、混合物は１晩16℃でインキュベ
ートされた。130塩基対β−ガラクトシダーゼ遺伝子フ
ラグメントが、16％未変性ポリアクリルアミドゲルで精
製され、12μｌの水に溶解された。これに、0.1μｇ
（１μｌ）EcoR I−消化されたM13mp18（5/6）DNA、５
μｌ 5xライゲーション緩衝液、および２μｌ T4 DN
Aリガーゼ（Life Technologies）が添加された。混合物
は１晩12℃でインキュベートされ、上述のようにE.coli
JM101細胞の形質転換に使用された。「M13/bgal」組
換え体におけるβ−ガラクトシダーゼフラグメントの保
全性は、上述のようにシーケンシングによってチェック
され、一本鎖DNAが増幅反応のために調製された。

II.ハイブリッド形成されたプローブの増幅および翻訳ハイブリッド形成されたCFTRまたはデルタ508プロー
ブからの増幅は、30pmoleの一本鎖M13/bgal DNAがオリ
ゴ５の代わりに用いられ、かつ100μＭ GTPおよび1mM
m7G（５′）ppp（５′）Ｇ（ナトリウム塩、Pharmaci
a）が1mM GTPの代わりに用いられた以外は、例２と全
く同じように達成された。増幅の後、混合物はフェノー
ル／クロロホルム抽出され、エタノール沈澱された
（“Molecular Cloning"参照）。沈澱された核酸は、40
μｌの水に溶解され、20μｌのウサギ網状赤血球溶解物
の調製物（Life Technologies、すべてのアミノ酸を含
む）が添加され、37℃で１時間にわたってインキュベー
トされた。β−ガラクトシダーゼの相補のために、この
酵素のM15変異体が、Langley他、J.Biol.Chem.、250、p
2587−2592の方法によって調製され、250ピコモル/mlで
50mM リン酸ナトリウム pH7.2、および5mM β−メル
カプトエタノールに溶解された。この翻訳混合物に、25
0μｌの1M リン酸ナトリウム pH7、2mM MgSO₄、2mM
EDTA、0.02％ NaN3、および0.1％Tween20が添加され
た。250μｌのM15調製物が、1mgのＯ−ニトロフェノー
ルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Sigma）と添加され、
混合物は37℃で１時間にわたってインキュベートされ
た。試料は次に、氷上に置かれ、414nmにおいて光学密
度が記録された。この結果は表４に示され、CFTR DNA
に対する核酸のハイブリッド形成、増幅および翻訳によ
るβ−ガラクトシダーゼ活性の生成を示す。

例４−DNAの増幅 I.オリゴヌクレオチドの調製表１は、増幅のために使用されるオリゴヌクレオチド
11の配列を詳細に示す。これは、上述のように合成さ
れ、精製された。

II.ハイブリッド形成され、伸長されたプローブの増幅 5pmole オリゴヌクレオチドCFTR、またはデルタ50
8、および5pmole オリゴ２が、10μｌ（最終）の20mM
トリスHCl pH8.3、100mM KCl、3mM MgCl₂、400μ
Ｍ dNTP混合物、0.1％トリトンＸ−100（Sigma）、10
μCi α−32PdCTP（3000Ci/mmol、Amersham）および0.
1ユニットのTaq DNAポリメラーゼ（United States Bio
chemicals）中で２μｌ CFTR DNAと混合された。試料
は２分間93℃に加熱され、55℃で１分間、72℃で1.5分
間、および93℃で１分間の25の連続熱サイクルによっ
て、プライマー伸長され、増幅された。例１で説明した
ように、試料はTCA沈澱に供された。

表５は、増幅オリゴヌクレオチド11を含むハイブリッ
ド形成混合物への32P dCTPの増加した組込みを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者カーディー，ドナルド・レオナルド・ニコラスイギリス、エヌ・エヌ・11 ６・ユー・エフノーサンプトンシャー、アストン・ル・ウォールズ、ブラックスミスズ・レーン、“トリンラン”（番地なし) (72)発明者デルナッテ，サビン・ヨランデ・ジョセフイギリス、オー・エックス・９５・ティー・エスオックスフォードシャー、ルークノール、ヒル・ロード、ホーム・ファーム（番地なし) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の特定の核酸配列の存在に関してテ
ストするための方法であって、第１のプローブおよび第
２のプローブと試料を接触させるステップを含み、前記
プローブの前記特定の配列と相補的な部分は、プローブ
が互いに隣接するように、前記特定の配列に対してハイ
ブリッド形成することができ、そのため第１および第２
のプローブの他の部分が互いに対してアニールされるこ
とができ、ここで、該プローブは、標的配列の５ヌクレ
オチド分まで分離されることができ、さらに、鋳型とし
てプローブの一部を用いて一方のプローブ鎖の伸長を引
き起こすように試料を処理するステップと、伸長された
プローブの少なくとも一部を検出するステップとを含
む、方法。
【請求項２】第３のプローブおよび第４のプローブの使
用をさらに含み、前記第３および第４のプローブの、前
記第１および第２のプローブと相補的な部分は、それぞ
れ、前記特定の配列に相補的な第１および第２のプロー
ブの配列の少なくとも一部に対してハイブリッド形成す
ることができ、そのため第３および第４のプローブの他
の部分が互いに対してアニールすることができ、さら
に、鋳型として第３または第４のプローブの一部を用い
て第３または第４のプローブの鎖の伸長を引き起こすよ
うに試料を処理するステップを含む、請求項１に記載の
方法。
【請求項３】伸長の後に、対になったプローブの連結を
さらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】伸長されたプローブの少なくとも一部が増
幅される、請求項１、２または３のいずれかに記載の方
法。
【請求項５】伸長されたプローブの前記少なくとも一部
が、さらなるプローブの使用によって増幅される、請求
項４に記載の方法。
【請求項６】さらなるプローブがDNAを含む、請求項５
に記載の方法。
【請求項７】さらなるプローブの増幅が、アニーリン
グ、伸長および変性のサイクルによって達成される、請
求項６に記載の方法。
【請求項８】ヌクレオチド配列の伸長が、少なくともい
くらかの自己相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド
配列によって自己プライミングされる、請求項１−７の
いずれかに記載の方法。
【請求項９】第１のプローブの伸長された部分が、さら
なる伸長のために自己プライミングする、少なくともい
くらかの自己相補的なヌクレオチドを含む、請求項８に
記載の方法。
【請求項１０】自己プライミングするヌクレオチド配列
が、タンパク質のための認識部位を含む二本鎖核酸を形
成するように伸長される、請求項８または９のいずれか
１つに記載の方法。
【請求項１１】タンパク質が酵素である、請求項10に記
載の方法。
【請求項１２】伸長されたプローブ配列の少なくとも一
部のRNA複製物を含むRNA分子を合成するステップと、ア
ミノ酸配列を生成するようにRNA分子の少なくとも一部
を翻訳するステップと、アミノ酸配列を検出するステッ
プとをさらに含む、請求項１−11のいずれか１つに記載
の方法。
【請求項１３】RNA分子を増幅するステップをさらに含
む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】前記RNA分子の増幅が、RNA:DNAサイクリ
ングを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】アミノ酸配列を生成するようにRNA分子
の少なくとも一部を翻訳するステップと、アミノ酸配列
を検出するステップとを含む、請求項12−14のいずれか
１つに記載の方法。
【請求項１６】アミノ酸配列が、酵素を調節できるペプ
チドを含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】アミノ酸配列が、β−ガラクトシダーゼ
の不活性Ｎ末端フラグメントを含む、請求項16に記載の
方法。
【請求項１８】プローブがDNAを含む、請求項１−17の
いずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】第２のプローブが、５′末端領域におい
て、前記特定の配列に非相補的であり、かつ第１のプロ
ーブの少なくとも一部に相補的である配列を含む、請求
項１−18のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】第２のプローブが、前記特定の配列に非
相補的でありかつ第１のプローブの少なくとも一部に相
補的である30−70ヌクレオチド長の部分を含む、請求項
１−19のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】第２のプローブの３′末端が、伸長を防
ぐようにブロックされる、請求項１−20のいずれか１つ
に記載の方法。
【請求項２２】第１のプローブが、３′末端領域におい
て前記特定の配列に非相補的でありかつ第２のプローブ
の少なくとも一部に相補的である配列を含む、請求項１
−21のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】第１のプローブが、前記特定の配列に非
相補的でありかつ第２のプローブの少なくとも一部に相
補的である２−10ヌクレオチド長の部分を含む、請求項
１−22のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】第１および第２のプローブが、前記特定
の配列に相補的な15−25ヌクレオチド長の配列を含む、
請求項１−23のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】サーマス・アクアチクス（Thermus aqua
ticus）（Taq）ポリメラーゼ、E.coliDNAポリメラーゼ
Ｉまたはそのクレノウフラグメント、AMV逆転写酵素、T
7 RNAポリメラーゼおよびSP6 RNAポリメラーゼからな
る群から選択される酵素の使用を含む、請求項１−24の
いずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】この発明の方法の実行によって、１塩基
だけ異なる（置換、欠失または付加）ヌクレオチド配列
が区別できる、請求項１−25のいずれか１つに記載の方
法。
【請求項２７】請求項１から26のいずれか１つにの方法
に従って、使用のための説明書およびポリメラーゼを含
むキット。
【請求項２８】請求項１〜26のいずれかに記載の方法に
用いるための検出用組成物であって、特定の核酸配列
と、それに対してハイブリッド形成される第１のプロー
ブと、第１のプローブに隣接して、または実質的に隣接
して前記特定の配列に対してハイブリッド形成される第
２のプローブとを含み、そのため第１および第２のプロ
ーブの他の部分は互いに対してアニールされ、プローブ
のうちの一方は、鋳型としてプローブの一部を用いて鎖
伸長される、検出用組成物。