JPH06510669A

JPH06510669A - 核酸伸長検定

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Publication number: JPH06510669A
Application number: JP5505883A
Authority: JP
Inventors: カーディー，ドナルド・レオナルド・ニコラス; デルナッテ，サビン・ヨランデ・ジョセフ
Original assignee: サイトセル・リミテッド
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1992-09-14
Publication date: 1994-12-01
Anticipated expiration: 2018-05-06
Also published as: EP0666927B1; DE69219627D1; DK0666927T3; ES2101116T3; DE69219627T2; CA2118913C; CA2118913A1; AU672367B2; ATE152778T1; AU2558692A; EP0666927A1; WO1993006240A1; JP3403405B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】この発明は核酸を含むある新規の組成物、関心のある核酸配列を検出する方法、およびこの発明の方法を実行するためのキットに関する。

発明の背景特定の核酸配列の直接的増幅のためのプロセスは既知であり、先行技術で説明されてきた。Ｋｌｅｐｐｅ他は、Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　５６　（１９７１）　ｐ３４１−３６１において、関心のある特定の核酸配列に隣接してハイブリッド形成する核酸プライマーの用途を開示している。プライマーは変性ＤＮＡ二重鎖の反対のストランドに対してアニールされ、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオシドトリホスフェートを使用して伸長され、オリジナルの核酸配列の２つの二重鎖分子を与える。

変性、アニーリングおよび伸長の連続サイクルは、オリジナルの核酸配列の複製物をさらに増幅するために行なわれる。

上の方法をここでは複製連鎖反応（ＰＣＲ）と呼び、この方法はＵＳ４６８３１９５およびＵＳ４６８３２０２でさらに説明され、これらの明細書においてはアニールされＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントのいずれかてもたらされる。この方法の不利な点は、反応温度を中間温度（たとえば５５−６０°Ｃ）と非常に高温（たとえば９０−９５°Ｃ）との間で交互に調整する必要かあること（高温への反復された「サーマル・サイクリング」を含む）、核酸配列の増幅を達成するために複数のサイクルの大きな温度変化のために必要とされるタイムスケールの長いこと、および長い配列領域の多重複製の間に生しるエラーにより核酸配列の増幅された複製物において配列エラーか発生することなとかある。加えて、１つ以上のさらなるプロセスか増幅された核酸配列の検出のために必ず必要とされる（たとえばゲル電気泳動）。

代替の核酸増幅プロセスは、ＷＯ３８／１０３１５　（Ｓｉｓｋａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｅｓ）ならびにＥ　Ｐ　３２９８２２　（Ｃａｎｇｅｎｅ）およびＥ　Ｐ　３７３９６０　（Ｓｉｓｋａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において開示されており、サイクリング反応は特定のＤＮＡ配列に隣接するオリゴヌクレオチドの代替ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、これらのオリゴヌクレオチドは転写プロモータおよび開始部位を含む。このように生産された特定の配列のＲＮＡ複製物、または代替的に特定のＲＮＡ配列を含む導入試料は、核酸プライマーを使用してＤＮＡストランドとして複製され、結果として生じるＲＮＡ　：　ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡは、変性によって除去される（ＷＯ８８／１０３１５）か、またはＲＮアーセ　Ｈを使用して破壊される（ＥＰ３２９８８２およびＥＰ３７３９６０）。転写プロモータを形成するオリゴヌクレオチドのアニーリングは、ＲＮＡ生産を反復するために繰り返される。増幅は主に効果的なＲＮＡポリメラーゼの使用によって達成され、各サイクルでＤＮＡ鋳型に対して過剰のＲＮＡ複製物を生産する。ＲＮアーセ　Ｈを含むこの方法の変形例は、ＰＣＲと比へて、増幅か一定の環境温度で潜在的に達成され得るという利点を有する。加えて、ＰＣＲは各サイクルでＤＮＡ複製物の倍加を結果としてもたらすか、ＤＮＡ　：　ＲＮＡサイクリングはサイクルあたりはるかに大きな増幅、たとえばＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを使用して、サイクルあたり１Ｏ−１００ＲＮＡ複製物を潜在的に達成し得る。ＥＰ３２９８２２に記載されたＤＮＡ　：　ＲＮＡサイクリング法の不利な点は、転写プロモータを作るために、オリゴヌクレオチドのアニーリングに対して既知の別々の末端を有するテスト核酸を必要とすることである。これは長いＤＮＡ分子の中のたとえば、特定の遺伝子の検出を困難にする。この方法のさらなる不利な点は、少なくとも３つの酵素かＤＮＡ　：　ＲＮＡサイクリングを行なうために必要とされるか、これには安定化、コストおよび再現性に対して潜在的に有害な結果を伴い、かつ１つ以上のさらなるプロセス（たとえばゲル電気泳動）か増幅された核酸配列の検出のために必ず必要とされることである。

上述のプロセスはすへて、特定の核酸領域が直接複製され、これらの核酸複製物がさらに複製されて増幅を達成する方法に関するものである。異なった核酸配列間の多様性のため、同じプロセスにおいて異なった配列間で増幅速度か異なりやすく、したかって特定の核酸の元の量をたとえば定量化する際に問題を与える。

他のプロセスは特定のテスト核酸の複製を必要としない。ＷＯ３７１０６２７０は、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによる増幅のための配列を含むＲＮＡプローブの使用について記載している。特に、この明細書はバクテリオファージＱ−β レプリカーゼによる自己触媒複製について記載している。自己触媒ＲＮＡ増幅のための隣接するプロモータを存する配列特異的ＲＮＡプローブの使用は、異なった核酸配列ではなく、ハイブリッド形成されたプローブそれ自体の潜在的に「同型の」増幅という利点を有するが、増幅前にハイブリッド形成されていないプローブ分子を除去する必要があることや、ハイブリッド形成シグナルか単一のハイブリッド形成のみに依存するという事実（おそらくは「バックグラウンド・ノイズ」の増大を伴う）などの不利な点がある。ＥＰ３２０３０８は、相補的な隣接してハイブリッド形成する核酸プローブ対の使用について記載しており、これらのプローブはハイブリッド形成部位で一体に連結され、より長いプローブを生産する。変性、再アニーリングおよび連結の連続サイクルにおいて、特定の標的ヌクレオチド配列および前に連結されたプローブはどちらも、付加的な連結されたプローブの形成のための鋳型として作用し得る。したがって、標的配列はそれ自体増幅されることはないか、さらなる連結のための基質としてそれ自体作用する連結されたプローブの形成をもたらす。このプロセスは、一本鎖末端の連結（「シャープエンド・ライゲーション」）の可能性という不利な点を存し、連結されたプローブ分子を検出するために、１つ以上の余分なプロセス（たとえばゲル電気泳動）を絶対的に必要とする。

発明の概要一局面において、本発明は試料中の興味のある核酸配列の存在のためのテストの方法を提供し、この方法は試料を第１のプローブおよび第２のプローブと接触させるステップを含み、これらのプローブは、プローブか互いに隣接または実質的に隣接するように興味のある配列にハイブリッド形成することか可能であり、興味のある配列に対して非相補的なプローブの部分は少なくとも部分的にアニールされ、さらにこの方法は少なくとも１つのプローブの鎖伸長を引起こすように試料を処理するステップと、伸長されたプローブを検出するステップとを含む。

上に規定した方法に従って他の具体例が見出され、この方法はさらに、第３のプローブと第４のプローブとを用いることを含み、第３および第４のプローブの他の部分か互いに対してアニールすることか可能なように、第３および第４のプローブは興味のある配列に相補的な第１および第２のプローブの配列の少なくとも一部に対してそれぞれハイブリッド形成可能てあり、この方法はさらに、第３または第４のプローブの一部を鋳型として用いて、第３のまたは第４のプローブの鎖伸長を引起こすように試料を処理するステップを含む。

一般に、第１のプローブは興味のある配列に実質的に相補的な配列を含み、かつ興味のある配列に実質的に非相補的な配列をさらに含む。典型的にこれらの配列はそれぞれ１、５−２５のヌクレオチドおよび２−ＩＯのヌクレオチドを含む。

さらに見出されることは、一般に第２のプローブは興味のある配列に実質的に相補的な配列を含み、かつ興味のある配列に実質的に非相補的であるか興味のある配列に非相補的な第１のプローブの配列の少なくとも一部に対しては実質的に相補的である配列をさらに含む。典型的にはこれらの第２のプローブの領域はそれぞれ１５−２５のヌクレオチドおよび３０−７０のヌクレオチドを含む。したかって典型的には第２のプローブは、第１のプローブよりも長く、第１のプローブの伸長のための鋳型として作用し得る。

上記のもののある特定の変形として、プローブの１つは自己相補的なヌクレオチドを含んでもよく、したがって同じプローブが鋳型として作用して伸長を自ら活性化することかできる。その後、このプローブは他のプローブへ連結されてもよい。この他のプローブは興味のある配列に対する共通のハイブリット形成により、伸長されるプローブの近くに保持されるものである。興味のある配列に非相補的なプローブの部分のアニールは、プローブ間の比較的短い相補性の領域を介して行なわれる。当業者には明らかなように、ハイブリッド形成の条件は、２つのプローブが関心のある配列（「標的」配列）に対する事前のハイブリッド形成によって互いに近接して安定化される場合にのみアニールするように、容易に選択され得る。したかって、伸長されたプローブは関心のある配列が存在する場合にのみ形成される。

伸長されたプローブの存在は、たとえば従来の方法によって（たとえば、配列特異的核酸、タンパク質もしくは他の物質を結合することによって、または伸長されたプローブについてのゲル電気泳動サイズ分析によって）直接検出することかできる。しかしなから、一般には、１つの伸長されたプローブ配列を増幅するために、この新しく合成されたＤＮＡをさらに処理することか望ましい。

伸長されたプローブを増幅するための様々な方法か考察される。これらの方法にはもちろん複製連鎖反応（ＰＣＲ）なとの従来の技術が含まれる。しかしなから、他の新しい技術もまた考えられる。

他の局面においては、本発明は上に規定するように生成される伸長されたプローブを増幅する方法を提供し、この方法は：伸長された第１のプローブの新しく合成された配列の少なくとも一部に実質的に相補的なさらなるプローブを、伸長された第１のプローブに対してハイブリッド形成するステップと、伸長された第１のプローブを鋳型として用いて、さらなるプローブを適切なポリメラーゼを用いて伸長するステップと、伸長された第１のプローブとさらなるプローブとを分離するステップとを含み、これにより、伸長されたさらなるプローブは他の第１のプローブ分子の伸長のために鋳型として作用てき、かつ伸長された第１のプローブは他のさらなるプローブ分子の伸長のために鋳型として作用することかできる。

本発明のこの局面は図１の下部分を参照して以下にさらに説明される。

一般に、さらなるプローブはオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、これはＤＮＡポリメラーゼ、典型的にはＴａｑポリメラーゼによって伸長され得る。

さらなるプローブを用いる代わりに、伸長された第１のプローブは３′末端に自己相補的配列を含んでもよい。したかって、鋳型ストランドから分離されると、伸長された第１のプローブは自己アニールし、それによりそれ自体の伸長のために自ら活性化することができる。

この方法では、アニール、伸長および変性のサイクルを繰り返すことにより、元の伸長されたプローブの増幅か行なわれる。好ましくは、変性は穏やかな加熱によって行なわれる。

１つの好ましい増幅の方法においては、新しく伸長されたプローブおよび鋳型として用いられる相補的プローブの部分は、ポリメラーゼによって、もっとも好ましくはＲＮＡ４リメラーゼによって認識される二本鎖核酸の領域を含む。その後、Ｔ７またはＳＰ６ボリポリーゼなどの効果的なＲＮＡポリメラーゼは、二本Ｍ核酸のストランドのうちの１つ（「センスコストランド）から大量のＲＮＡを生産し得る。好ましくは、新しく伸長されたプローブはセンスストランドである。

伸長されたプローブ配列を用いる場合と同じく、ＲＮＡ複製物は、たとえば従来の技術によって直接検出され得る。

代替的には、たとえば感受性を向上するためにＲＮＡ複製物をさらに増幅することか好ましい。ＲＮＡを増幅する１つの方法は図２を参照して以下にさらに説明される。この具体例においては、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ複製物に対して少なくとも部分的に相補的であり、そのため鋳型として作用することができる一本鎖ＤＮＡ分子をアニールした後に伸長される。生成される新しい二本鎖核酸分子はＲＮＡポリメラーゼのための認識部位を含む。好ましくは、この認識部位は元のＲＮＡ複製物を作るためのものとは異なるＲＮＡポリメラーゼによって認識されるべきである。これによりＲＮＡ複製物か作られる。ＲＮＡ分子に対して少なくとも部分的に相補的な一本鎖ＤＮＡ分子に対してアニールした後に、これらのＲＮＡ複製物は伸長される。生成される新しい二本鎖核酸分子はＲＮＡポリメラーゼのための認識部位を含み、好ましい具体例においてＲＮＡポリメラーゼは、プロセスを開始した元のＲＮＡ分子と同し配列を有するＲＮＡ複製物を作らせることかできるものである。これは明らかにＲＮＡ複製物を増幅するための効率的な方法である。

さらなる特定の具体例か見出され、ここでは生成される元のＲＮＡ分子はＱ−β レプリカーゼによって複製されか一つ増幅されることか可能な領域を含む。したかつて、当該分子の複数の複製物か形成され得る。

ＲＮＡ複製物か増幅されても増幅されなくても、ＲＮＡ複製物は、たとえば配列特異的な標識をつけられたプローブに対するハイブリット形成によって、または他の従来の方法によってなとの様々な方法で検出され得る。代替的に、図３を参照して以下により詳細に説明するように、ＲＮＡ複製物は、アミノ酸配列への無理のない効率的な翻訳か可能なように、必要な翻訳開始および停止シグナルを含んでもよく、そのアミノ酸配列の存在はアミノ酸配列のある特定の性質によって容易に検出することができる。

したかってさらに他の局面においては、本発明はＲＮＡ分子（翻訳開始および停止フトンを含む）の存在を検出する方法を提供し、この方法は、ＲＮＡ分子を特定の性質を有するアミノ酸配列へ翻訳し、かつ検出するステップを含む。翻訳のためのＲＮＡ配列は多くの好ましい特徴を有しその長さは好ましくは１００−２００ヌクレオチドである。

翻訳開始コドンは好ましくは５′末端から１０〜３０のヌクレオチドの間に置かれるへきてあり、その末端は好ましくはトリホスフェート結合７−メチルグアノシン残基を含む。

好ましくは、翻訳は、ウサギ網状赤血球または小麦胚芽溶解物によって与えられる成分、または翻訳効率の高い他の調製物を用いて行なわれる。

好ましくは、アミノ酸配列は酵素活性剤、補因子またはリプレッサとして作用する。好ましくは、アミノ酸配列はβ−ガラクトシダーゼのＮ３良フラグメントを含む。したかって、β−ガラクトシダーゼの残りの部分を加えることにより、酵素活性が形成される。これは当業者には公知の態様で（たとえば着色した生成物をもたらす酵素基質を用いることによって）検出することかできる。

本発明の伸長されたプローブを増幅する他の方法か見出される。これらの方法は、図４を参照して以下にさらに詳細に説明するように、２対のプローブを用いることを含む。

この具体例においては、対のうちの１つのプローブか他のプローブを鋳型として用いて伸長され得るように、第１および第２のプローブは隣接または実質的に隣接するようヌクレオチド標的配列に対してハイブリッド形成する。伸長の後は、第１のプローブおよび第２のプローブは標的配列から（たとえば熱変性によって）分離され得るか、しかしそれら自体は伸長された相補的配列によって安定したハイブリットを形成し１ｊＦ＝る。その後、第３および第４のプローブ分子は、第１のプローブおよび第２のプローブのそれぞれの標的特異的領域に相補的な配列を介して互いに隣接または実質的に隣接するように、第１／第２のプローブの安定したハイブリッドに対してハイブリッド形成され得る。

したがって、第３／第４プローブの対のうちの一方は、従来のように他方のプローブを鋳型として用いて伸長されることかできる。この伸長により第３のプローブおよび第４のプローブは安定したハイブリットを形成することかでき、この安定したハイブリットは、第１のプローブおよび第２のプローブのさらなる分子のための標的配列として作用して、ハイブリット形成および伸長をもたらす。したがって、変性および復元の連続したサイクルによって、元の伸長されたプローブ配列の増幅か行なわれる。

本発明の１つの変形として、標的ヌクレオチド配列は二本鎖であってもよく、かつ第１／第２のプローブおよび第３／第４のプローブは標的の対向するストランドへ結合する。こうして、両方の対から一方のプローブか同じサイクルの間に伸長され得る。

池の変形を図５を参照して以下に説明する。この他の具体例においては、第１のプローブおよび第２のプローブは上述のように隣接、または実質的に隣接するように興味のある配列に対してハイブリッド形成し得る。しかしながら、プローブの対のうちの一方は「ヘアピンループ」を含む。

したかってプローブの一方の伸長に続いて、プローブはＤＮＡリガーゼで処理されて一本のループ分子を生成する。

上述のように、第３のプローブおよび第４のプローブもまた存在してもよく、これらのプローブは、ヌクレオチ１へ′標的配列の他方のストランドに対して、または第１のプローブおよび第２のプローブの単一ループ分子ハイブリッドに対してのいずれかにハイブリッド形成する。ハイブリッド形成により第３のプローブおよび第４のプローブは隣接、または実質的に隣接するようになり、これにより活性化および伸長が可能となる。先に説明したのと同じ方法で、プローブ分子の一方の末端にヘアピンループを含むことにより、ＤＮＡリガーゼを用いて第３のプローブと第４のプローブの一本のループ分子のハイブリッドを形成するように処理することか可能となる。

その後、これらのハイブリッド分子はプローブの修飾されていない対に対してハイブリッド形成して、修飾されていないプローブを伸長および連結する。したかって、変性および復元の連続したサイクルによって、元の伸長されたプローブ配列の増幅か行なわれる。

池の局面においては、本発明は、興味のある核酸配列と、それに対してハイブリット形成される第１のプローブと、第１のプローブに隣接または実質的に隣接する興味のある配列に対してハイブリッド形成される第２のプローブとを含む新規な組成物を提供し、そこにおいて、第１のプローブは第２のプローブを鋳型として用いて適当なポリメラーゼにより伸長されている。

さらに他の局面において、本発明はポリメラーゼおよび使用説明書を含む本発明の方法を実行するためのキットを提供する。

好ましくは、標的配列に対してアニールするプローブ（Ｆ第１Ｊおよび「第２ノブローブ）はオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、典型的には各プローブは標的ヌクレオチド配列（つまり興味のある配列）に相補的な１５〜２５のヌクレオチドを含むか、含まれる相補的なヌクレオチドの数はこれより少なくてもまたは多くてもよい。

好ましくは、標的配列に非相補的な第２のプローブの一部は３０−７０ヌクレオチド長であり、典型的にはプローブの５′末端にある。

一般に、第１のプローブの標的非相補的な（しかし第２のプローブに相補的な）配列は２−１０ヌクレオチド長であり、典型的にはプローブの３′末端にある。

両方のプローブの非相補的配列はこれよりも長くてもよく、第２のプローブのものは短くてもよい。

本発明の本質的な特徴は、標的配列に対してハイブリッド形成される場合に、第１のプローブおよび第２のプローブか互いに隣接または実質的に隣接していることである。

「隣接Ｊという用語は、これらのプローブの相補的配列に対して塩基対合される標的配列の部分（遺伝子座Ｎｏｃｉ」）の間に塩基対合することなく残される標的配列のヌクレオチドかないことを意味すべく意図される。プローブ間か近いため、プローブの標的非相補的配列をアニールすることか可能となる。当業者には容易に明らかとなるように、標的配列からより離してプローブを互いに対しアニールすることか可能となるようにプローブを設計することにより、プローブかハイブリッド形成する標的ヌクレオチド配列中の遺伝子座の間にギャップがもたらされ得る。この状況においては、プローブは「実質的に隣接している」と呼ばれるか、これはなぜなら、プローブに対して塩基対合される標的配列の部分の間に塩基対合することなく残される標的配列のヌクレオチドかいくつかあるからである。明らかに、標的配列のその間にある対になっていないヌクレオチドの数は、プローブの設計によって変えることができる。したかって、第１のプローブと第２のプローブとが隣接するようにハイブリッド形成することが好ましい一方で、プローブは標的配列の５ヌクレオチド分まで分離されることかできる。

好ましい具体例において、第２のプローブのプライマー伸長（標的配列を鋳型として用いる）は、プローブの３′末端を「ブロックする」によって防ぐことができる。これは好ましくは、たとえばビオチニル化もしくはチオール化されたヌクレオチド、またはジデオキシヌクレオチドを３′末端に導入することによりなし得る。

好ましくは、第１のプローブおよび第２のプローブはＤＮＡであり、かつ第１のプローブはＤＮＡポリメラーゼの作用によって伸長される。適当な酵素にはＡＭＶ逆転写酵素、フレノウフラグメントのＥ、ｃｏｌｉＤＮＡボリメラーセポリまたはＴａｑボリポリーセかある。

増幅の他の方法か本発明者らによって見出される。−具体例においては、両方のプローブはＤＮＡであり、第１のプローブの伸長は新しく合成された二本ｌＤＮＡ　（ｄ　５ＤＮＡ）の生成をもたらし、このｄｓ　ＤＮＡは、ＲＮＡボリポリーセによる転写のためのプロモータおよび転写開始部位を含む。適当なＲＮＡボリポリーセ（Ｔ７またはＳ２６ポリメラーゼなと）を加える、二と（こより、ｒセンス１（＋）ストランドの第１のＲＮ　Ａ複製物を生成する。

好ましくは、伸長された第１のプローブはセンス・ストランドである。好ましくは、前記第１のＲＮＡ複製物は２０−４０のりホヌクレオチドを含むか、その数は当業者には明らかであるようにこれより少なくてもまたはこれより多くてもよい。

当業者に明らかとなるように、伸長されたプローブに対して、ＤＮＡ複製物を作るために先に説明されたような増幅工程か行なわれてもよく、その後これらのＤＮＡ複製物は、ここに説明したような方法または先行技術で公知の方法を用いてＲＮＡ分子として増幅されてもよい。

本発明の方法のプライマー伸長生成物またはそこから生成されるＲＮＡ複製物は、先行技術においてすてに公知の工程によってさらに増幅されてもよいということか理解される。たとえば、プライマー伸長生成物にはＵＳ４６８３１９５およびＵＳ４６８３２０２に説明されるＰＣＲ法が行なわれてもよく、またはＥＰ３２９８２２によって開示されるような代替ＤＮＡおよびＲＮＡサイクリングか行なわれてもよく、またはＥＰ３２０３０８にクレームされるような隣接してハイブリット形成されたプローブの連結か行なわれてもよい。

本発明の工程は、標的核酸かたとえば膜またはビーズのような固体に付着される固相て実行するか、または液相（たとえば溶液）で実行することかできる。固相は、たとえば増幅されたＲＮＡによって活性化された一本鎖ＤＮＡ分子か固相に付着されるなどのように、本発明の他の局面で用いられてもよい。本発明の方法はプライマー伸長生成物またはそこから生成されるＲＮＡ複製物のいずれかを検出するためのある範囲の方法とともに用いられてもよい。

たとえば、核酸生成物は、標識核酸プローブの／Ｘイブリッド形成によって、またはゲル電気泳動による核酸生成物のサイズ分析によって検出され得る。

本発明の工程はいかなるＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列の検出、ならびに欠失および転座なとの遺伝子物質の損傷の検出に応用可能である。小さなヌクレオチドプローブを用いることにより、本発明の方法は遺伝子物質の点変異または単塩基の多形性の検出に特に適しており、これにより通常のハイブリット形成か標的配列とプローブとの間の単塩基の不対合によって妨害されるように、厳密なハイブリット形成の状態か容易に達成され得る。本発明の方法は、微生物の検出、および遺伝子の病気に関連した遺伝子の検出のような診断医学、ならびに獣医学、農学、法医学、食物分析および分子生物学の研究なとの池の分析化学なとのあらゆる分野に応用可能である。

したかって、本発明か適用される用途によっては、「関、シ）のある配列Ｊは非常に長いかもしれず（たとえば遺伝子全体）、または短いかもしれない（たとえば点変異の検出において）。したかって、先に規定したプローブは、興味（関心）のある配列のほんの短い部分に対してのみ結合されるように標的配列に対してハイブリット形成するかもしれず、または標的配列のいくつかが本当に関心のある配列の範囲を超えるように結合されるかもしれない。

本発明の様々な局面は以下に示される例および図面を参照することによってよりよく理解され、図１−５は本発明に従う方法の概略図であり、図６−８は本発明に従う方法を用いて行なわれる実験から得られる結果のオートラジオグラフである。

具体的な実施例の説明図１に概略的に示されるこの発明の一実施例において、第１のプローブｌおよび第２のプローブ２は、標的相補配列を介して、関心のある配列３に対しく実質的にお互いに隣接して）ハイブリッド形成する。

この配列により、プローブ１はプローブ１と２との間の相補性の短い領域のためにプライマー伸長されることか可能になり、この領域は標的核酸に非相補的であり、したかって関心のある配列３に対しハイブリッド形成しない。この伸長は鋳型として２を使用し、プローブの性質に依存して、いかなる適切なＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼによってももたらされ得る。プローブ２は（その標的を鋳型として使用して）伸長することかできない。その理由はプローブ２は（たとえば末端チオヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはビオチニル化ヌクレオチドによって）その３′末端でブロックされるからである。このようにプローブｌのプライマー伸長は伸長されたプローブ４の生産を実質的に結果としてもたらす。

変性に続いて、標的ヌクレオチド配列３はプローブ１および２によるさらなるハイブリッド形成のために放出され、一方新しく加えられた修飾されていない第３のオリゴヌクレオチドプローブ５はプライマー伸長された分子４に対しハイブリッド形成し、それ自体ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、伸長された分子６を生産することが可能である。変性に続いて、分子４および６はそれぞれプローブ５および１によるさらなるハイブリッド形成のために放出さ゛れ、これらのプローブは伸長されてそれぞれ６および４のさらなる分子を生産する。これらは変性、ハイブリッド形成およびプライマー伸長のさらなるサイクルに供され得る。

このように、各サイクルで、１つの新しい分子４か１および２の標的核酸３に対するハイブリッド形成の結果として生産され、１つの新しい分子６は前のサイクルからの分子４の鋳型上での５のハイブリツド形成および伸長の結果として生産され、さらに４および６の各々１つの新しい分子か前のサイクルからの４および６の分子それぞれ上ての、５および１のそれぞれの伸長の結果として生産される。

別の特定の具体例は図２に概略的に示される。プローブｌおよび２は前に説明したように標的配列３に対しハイブリッド形成し、ＤＮＡポリメラーゼによるｌの伸長により伸長されたプローブ４を与えることを可能にし、その結果、新しい二本鎖ＤＮＡ領域が４および２から形成され、この領域はＲＮＡポリメラーゼの作用のためのプロモータおよび転写開始部位を含み、このＲＮＡポリメラーゼは次にＲＮＡ複製物５を生産することか可能である。ＲＮＡ複製物５は相補性の短い領域を介して一本鎖ＤＮＡ分子６に対してアニールして、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ分子７を与えることかでき、この分子はＲＮＡストランドからプライマー伸長され、分子８に新しい二重鎖ＤＮＡ領域を生じ、この領域はＲＮＡポリメラーゼの作用のためのプロモータおよび転写開始部位を含み、ＲＮＡポリメラーゼは次にＲＮＡ複製物９を生産する。前記ＲＮＡ複製物９は相補性の短い領域を介して第２の一本鎖ＤＮＡ分子１０に対してアニールして、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ分子１１を与えることか可能であり、この分子はＲＮＡストランドからプライマー伸長され、分子１２に新しい二本１１ＤＮＡ領域を生じることか可能であり、この領域はＲＮＡポリメラーゼの作用のためのプロモータおよび転写開始部位を含み、このＲＮＡポリメラーゼはさらなるＲＮＡ複製物５を生産し、複製物５は、ＲＮＡ　：　ＤＮＡアニーリング、プライマー伸長およびさらなるＲＮＡ複製物９および５の生産のサイクルに再び入る。

図３はこの発明の方法の結果として生産されたＲＮＡ複製物の測定のための２つの代替例を概略的に示す。１つの代替例において、ＲＮＡ複製物１３は固相１４上に固定化され、標識されたプローブ１５に対するハイブリッド形成により検出される。検出において、１３および１５のハイブリッドを生産し、かつゆえに標識の固相への結合を生じる。別の代替例において、ＲＮＡ複製物１３は翻訳開始および終止コドン、ならびに５′　トリホスフェート結合７−メチルグアノシン残基を含み、この残基はＲＮＡ複製物１３のβ−ガラクトシダーゼ１６のペプチドフラグメントへの効果的な翻訳を促進するものであり、このフラグメントは不活性酵素フラグメント１７を補って、活性β−ガラクトシダーゼ１８を産出する。明らかに、β−ガラクトシダーゼのためのスキームにおいて、他の酵素が代わりに使用され得る。

この発明の範囲内にあるさらなる具体例は図４に概略的に示される。この方法は、標的配列１９か二重鎖であり、２対のプローブ２０．２１および２２．２３か使用されることを除いては、前に説明したものと本質的に同じである。

したかって、オリゴヌクレオチドプローブ２０および２３ならびに３′ブロツクされたオリゴヌクレオチドプローブ２１および２２は、二本鎖標的ヌクレオチド配列１９上てそれぞれのパートナ−に対し実質的に隣接してノ１イブ１ノット形成し、その結果、プローブ２０および２３力八、プローブ２Ｉおよび２２とそれぞれ相補性の短い領域を介して、ＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長され、プライマー伸長゛された分子２４および２５を生産することができる。変性に続いて、標的ヌクレオチド配列１９はブローフ゛２０力）ら２３によるさらなるノへイブＩルノド形成のため（こ放出され、一方プライマー伸長された分子２４および２５は新しくｆ中長された相補性の領域のために、分子２１および２２（二対しそれぞれ再びハイブリッド形成することか可能である。

これらの再び〕＼イブリッド形成された分子２１／２４および２２／２５は、今度は分子２２／２３および２０／２１のハイブリット形成のための標的ヌクレオチド配列をそれぞれ含む。これらのハイブリント形成された分子２０および２３はＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、さらなる分子２４および２５を生産することか可能てあり、これらの分子は分子２１および２２それぞれのさらなるノ＼イブ１ノット形成のために放出され、このようにして分子２４および２５の複製のサイクルが継続される。各サイクルで、１つの新しい分子２４および２５か、２０および２１の標的核酸１９に対するハイブリッド形成の結果として生産され、２４および２５のさらなる新しい分子か、前のサイクルで形成された分子２２／２５および２１／２４の鋳型上での２０および２３のハイブリッド形成および伸長の結果としてそれぞれ生産される。

さらなる具体例が図５に概略的に示され、この具体例において、オリゴヌクレオチドプローブ２０および２３ならびに３′ブロツクされたオリゴヌクレオチドプローブ２６および２７（とちらも短い５′ヘアピンループを含む）は、二本鎖標的ヌクレオチド配列１９に対し隣接してノ＼イブリッド形成し、その結果、前記プローブ２０および２３か、プローブ２６および２７とそれぞれ相補性の短い領域を介して、ＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長され、ＤＮＡリガーゼを使用して連結されて、ループ状の分子２０／２６および２３／２７を生産することがてきる。変性に続いて、これらのさらなる分子２０／２６および２３／２７はさらなるハイブリット形成のために放出され、このようにル−プ状の分子２０／２６および２３／２７の複製のサイクルか継続される。各サイクルで、２０／２６および２３／２７の１つの新しいループ状分子が標的核酸１９に対するｌ＼イブリット形成の結果として生産され、さらに新しいル−−・′状り了１・・・＼イブ１ソド形１戊、伸長を夕よび連結の結果とし・＝４−ｙ、４　、）：　：！−，、−１ｉｉ＆’）　ｑイア　７［／　）’、［”１．「７１ｄ　＃１ｆ−ルー・ブ状（７）Ｑ＋２３　／’　２７　Ｃ’　＋トｒド？ｆ）、／　２　Ｒ−、’ＪＱ　）−７ソわぞれ２０／２６おＪ′びＱｊ／Ｑ７）′形Ｆ　、、ｊ゛る。。

さらなるｕ体１」、力１．７Ｉら（−概４的）丁され、二の、１本例（でおいて −、オリゴフルオチトブ〔７−ブ２０および２３ならびに３′二パｒす’ｙ　Ｑされたオリゴヌクレオチドプローブ２６および２７（とちらも短いＳ′ヘアピンループを含む）は、二本鎖標的ヌクレオチド配列１９に対し隣接してハイブリッド形成し、そして前記プローブ２０および２３か、プローブ２６および２７とそれぞれ相補性の短い領域を介して、ＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長され、ＤＮＡリガーゼを使用して連結されて、ループ状の分子２０／２６および２３／２７を生産することか可能である。変性に続いて、これらのさらなる分子２０／２６および２３／２７はさらなるハイブリッド形成のために放出され、このようにしてループ状の分子２０／２６および２３／２７の複製のサイクルか続けられる。したかって、各サイクルで、２０／２６および２３／２７の１つの新しいループ状の分子かハイブリッド形成、伸長および連結の結果として生産され、前のサイクルで形成されたループ状の分子２３／２７および２０／２６の鋳型上でそれぞれ２０／２６および２３／２７を形成する。

核酸プローブの生産および使用のための一般的な方法は、Ｓａ、ｍｈｒｏｏｋ− １Ｆ＋　１ｔＨｃｈ　六、）　ｖＪ　！ＪｑｎｉＢｉｐｌ−−）　−、−ｒｍ集すｔｌ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｃｒ　Ｐｒｅｓｓにより発行された（１９８９）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｉｒ＋ｒ＋ｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ１″において詳細に記述さｔｌでおり、二の文献を以下 “Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏ旧口ｇ”ど称づる。、＝れらの例で使用されるオリゴヌクレオチドは表Ｉに詳細（、説明される、１そってないと特定されない限り、すへてのオリゴヌクレオチドはＣｒｕａｅｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、　ＵＫ）によって供給される長鎖アルキルアミノＣＰＧ支持体およびヌクレオシドホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａシンセサイザで合成され、製造者の指示に従って使用されたものである。すべてのオリゴヌクレオチドは“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”に記載されたようにＨＰＬＣ精製され、最終的に凍結乾燥され、１０ピコモル／μｌで水中に溶解された。

例１−ＣＦＴＲ遺伝子に対するプローブのハイブリッド形成および伸長この例はＣＦＴＲ（嚢胞性線維症トランスレギュレータ）遺伝子に対する隣接してハイブリッド形成されたプローブの相互作用の結果としての新しい核酸ストランドの生産、および嚢胞性線維症の疾病に関連するこの遺伝子のデルタ−５０８欠失に対するハイブリッド形成の影響を示す。

■、オリゴヌクレオチドの調製オリゴｌおよび２は、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ池（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　＋５　（１９８７）　ｐ５３０５−５３２１）の方法によって３′−チオール基を使って合成されるか、または代替的に、オリゴｌは商業的に（Ｓｅｖｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｋｉｄｄｅｒｍｉｎｓｔｅｒ、ＵＫ）　３　’−ビオチン末端とともに購入され、上述のように精製された。

Ｉｌ、標的ＤＮＡの調製ＤＮＡ試料は、突然変異されていないＣＦＴＲ遺伝子に対する正常な個体のホモ接合、およびＣＦＴＲ遺伝子におけるコドン５０８のホモ接合欠失のために嚢胞性線維症を患う個体から入手されたものである。ＤＮＡは無菌の爪楊枝状針で頬の表層を穏やかに擦ることによってこれらの個体の頬の細胞から得られた。頬の細胞は次にｌ０１ｌｌの無菌水中に懸濁され、６５℃で２０分間２０μｆＯ，１Ｍ水酸化カリウムおよびＯ１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００と溶解され、２０μｆｆの０．１Ｍ　ＨＣＩおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で中和された。

ＣＦＴＲ遺伝子の領域は、次にＥ　Ｐ　２００３６２　（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）において説明されるように、複製連鎖反Ｌｉ（ＰＣＲ）処理によって増幅された。５μｌのヒトの細胞溶解産物は９４°Ｃて３分間変性され、５μｌの２０ｍＭＴｒｉｓ、ＨＣＩ　ｐＨ８，３，１００ｍＮｉ塩化カリウム、３ｍＭ塩化塩化マグネニウム０ｎｇ、／ｍｌウシ血清アルフ゛ミン（フラグ’ 、／　−ｒ　ン′Ｖ、　Ｓｉｇｍａ、　Ｐｏｏｌｅ、　ＬＩＫ）　、４００μ〜１デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）混合物（デオキシアデノシントリホスフェート、デオキシチミジントリホスフェート、デオキシグアノシントリホスフェートおよびデオキシシチジントリホスフェート（ｃｌＣＴＰ）の混合物、すへてはＰｈａｒｍａｃｉａ、　Ｍｉｌｔｏｎ　Ｋｅｙｎｅｓ、　ＵＫから入手される）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，０．０５ユニツトのサーマス・アクアチフスＤＮＡポリメラーゼ（Ｏｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏ、　ＵＳＡ）ならびに０．５μＭオリゴヌクレオチド増幅プライマー５′−ＣＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＴＴ−３’および５’　−ＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＧ−３’に混合される。増幅はサーマル・サイクラ−（Ｔｅｃｈｎｅ、モデルＰＨＣ−２）において４０サイクルで行なわれ、９３°Ｃて１分間、５５°Ｃで１．５分間および７２°Ｃて３分間の連続ステップを含んだ。さらなる０、０５ユニツトのポリメラーゼか２０サイクルステージで添加された。ＣＦＴＲ遺伝子のセグメントを含むＰＣＲ生産物は、最終的に１．６％低融点アガロースゲル中のゲル電気泳動（”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　”参照）にかけられ、ＰＣＲバンドはゲルから細かく切り分けられ、Ｅｌｕｔｉｐ−ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｄｕｓｓｅｌ、　Ｇｅｒｍａｎｙ　、製造者の指示とおり）上で精製された。最終ＰＣＲ生産物はエタノール沈澱され、１１００ｎ／ｍＩの濃度で、ｌＯｍＭＴｒｉｓ、ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ　（ＴＥ緩衝液）中に溶解された。

ＩＩ？　正常および嚢胞性線維症ＤＮＡのハイブリッドハイブリッド形成反応物は、正常または嚢胞性線維症を患う固体から得られたＤＮＡと、ＣＦＴＲおよびオリゴｌもしくは２のオリゴヌクレオチド組合せ、またはデルタ５０８ならびにオリゴＩおよび２の組合せのいずれかとの混合物を含んだ。加えて、対照はヒトのＤＮＡを含まない混合物を含んだ。ハイブリッド形成のために、２０ピコモルのオリゴヌクレオチドＣＦＴＲまたはデルタ５０８は、５％ホルムアミド、０．６Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０６Ｍクエン酸ナトリウム５０μｌ、ｐＨ７中て、２０ピコモルのオリゴｌまたは２．２ｕｌ　（２００ｎｇ）のＰＣＲ増幅されたヒトＤＮＡ　（またはＰＣＲ緩衝液ブランク）と混合された。混合物は３７° Ｃで３０分間インキュベートされた。１つの代替の反応において、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物、１２ｍＭ　ＭｇＣＩ２．８０ｍＭ　ＫＣＩ、２０ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイ）・−ル、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｏ。

Ｉｅ、　ＵＫ）および１Ｏｕｃｉ　ａ−３２ＰｄＣＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏ　ｌ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ。

ＵＫ）を含有するさらに５０μｌのＯ，ＩＭ　ＴｒｉｓＨＣ］ｐＨ８，３か添加され、その後４０ユニツトのＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）か添加され、混合物はさらに３０分間４２°Ｃでインキュベートされた。別の代替例において、２ｍＭ　ｄＮＴＰが０．２ｍＭ　ｄＮＴＰと置換され、３２ＰｄＣＴＰは省かれた。最後の代替反応において、１２ＭＭ　ｄＮＴＰ混合物、６０　ｍＭ　Ｍｇ　ＣＩ　！、＋００μＭ　ＤＴＴおよび１ｕＣｉ　ａ−３２ＰｄＣＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏ　Ｉ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）か１０ｕＣｉａ−３５Ｓ　ｄＡＴＰ　（６０００Ｃｉ／ｍｍｏ　Ｉ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）のいずれかを含有するさらに２５０μｌのｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＨｃＩ　ｐＨ７，５か添加され、その後２０ユニツトのフレノウＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）かまたは１２ユニツトのフレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｐａ１ｓｌｅｙ、　ＵＫ）のいずれがか添加され、この混合物は３０°Ｃでさらに３０分間インキュベートされた。

５μ！のアリコートの反応物が次にポリアクリルアミド配列決定ゲル分析にかけられた（“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　”参照）。図６は上述のような最後の代替反応物からの分析の典型的な結果を示し、これはα−３５ＳｄＡＴＰを含み、ＣＦＴＲおよびオリゴ１のオリゴヌクレオチド組合せを用いるものである。図６、突然変異されていないＣＦＴＲ遺伝子の存在下の、突然変異されていないＣＦＴＲ遺伝子に対して特定の修飾されていないオリゴヌクレオチドプローブの伸長（レーン２）を示す一方、ＣＦＴＲ遺伝子のデルタ５０８突然変異の存在下（レーン１）、またはＣＦＴＲ遺伝子の存在しないところ（レーン３）において、同じ修飾されていないオリゴヌクレオチドの伸長かないことを示すオートラジオグラフである。標的ＤＮＡはＰＣＲ増幅されたＣＦＴＲ遺伝子、ＰＣＲ増幅されたデルタ５０８突然変異ＣＦＴＲ遺伝子、またはブランクＰＣＲ反応の生産物のいずれかであった。これは正常のＤＮＡに対してハイブリット形成するか、デルタ５０８ＣＦＴＲ遺伝子を含むＤＮＡに対してハイブリッド形成しないことによる、標識され伸長されたオリゴ１の誘導体の予期された発現を示す。

標識された核酸は次にＴＣＡ不溶カウントの評価のためにＴＣＡ沈澱にかけられた（“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　”参照）。標識されていない核酸は１００μｌＯ，２ＭＮａＯＨを添加することによって変性され、１００μｊｌ）２Ｍ　酢酸アンモニウムを添加することによって中和された。

３００μｆ　１０ｘＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）か最後に添加され、この混合物は、「ミニホールド（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）　Ｊ　ドツトプロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）を使用して、予め湿らされた（２０ｘＳＳＣ）ニトロセルロース膜（ＢＡ８５０．４５ミクロン、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）上で濾過された。膜は真空オーブンの中で２時間８０°Ｃて焼かれた。

フィルタに対するハイブリット形成のために、ｌＯピコモルオリゴ３（表１）か、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５ｕｌ　７−３２Ｐ　ＡＴＰ（５０００Ｃｉ／ｍｍｏ　］、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　’に記載されるように、５′−末端標識され、かつゲル精製された。膜は５　ｘｓｓｃ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ試薬（”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　’参照）、１％グリシン、０．１％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡ（醸造用酵母、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｌｅｗｅｓ、　ＵＫ　）および５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７中で、６８°Ｃて２時間予めハイブリッド形成された。ハイブリッド形成は１００万Ｃｅｒｅｎｋ。

ｖｃｐｍのプローブを添加し、３７°Ｃて４時間インキュベートすることによって行なわれた。洗浄は室温て５　Ｘ５ＳＣ中て５分間２回行なわれ、４０°Ｃて３０分間１回行なわれた。フィルタは次にＫｏｄａｋ　Ｘ　Ｒ−５フイルムを使用して、−７０°Ｃて直接オートラジオグラフィーにかけられた。

表２は、逆転写酵素またはクレノウポリメラーゼによる標識の、正常なりＮＡに対しノ＼イブリッド形成される相同的にハイブリッド形成されたＣＦＴＲプローブへの組込み、または不適当な組合わせのプローブへの組込みかほとんとないデルタ５０８に対してホモ接合の個体から得られるＤＮＡにハイブリッド形成されたデルタ５０８プローブへの組込み、またはヒトＤＮＡの存在しないプローブへの組込みにおけるＴＣＡ沈澱分析の結果を示している。その結果は図７に示される。図７は２つの異なった実験からの１組のオートラジオグラフであり、図２のプライマー伸長された分子４に特異的なリン−３２標識オリゴヌクレオチドプローブの、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症トランスレギュレータ）遺伝子またはこの遺伝子のデルタ５０８誘導体に特異的なプローブのハイブリッド形成に続いて生産された核酸に対するハイブリッド形成を示し、各場合において、プライマー伸長のための鋳型として作用し得るＣＦＴＲ特異的プローブ、オリゴ２（表１）とともにハイブリッド形成されている。標的ＤＮＡはＰＣＲ増幅されたＣＦＴＲ遺伝子（「正常Ｊ）、ＰＣＲ増幅されたデルタ５０８突然変異ＣＦＴＲ遺伝子（「デルタ５０８Ｊ）またはブランクＰＣＲ反応の生産物（「なし」）のいずれかであった。逆転写酵素触媒されたプライマー伸長ＣＦＴＲまたはデルタ５０８プローブに対する２つの別々の触媒分析の結果は、表１のデータからの標識の組込みが、特異的なハイブリッド形成およびハイブリッド形成されたＣＦＴＲまたはデルタ５０８プローブの伸長によるものであることを示す。

表１は、増幅のために使用されるオリゴヌクレオチド４および５の配列を詳細に示す。これらは、上述のように合成され、精製される。

Ｉｌ、ハイブリッド形成され、伸長されたプローブの増幅オリゴヌクレオチドＣＦＴＲまたはデルタ５０８、およびオリゴ２は、例１のように、ＣＦＴＲＤＮＡに対してハイブリッド形成された。ハイブリッド形成に続いて、逆転写酵素およびＴ７　ＲＮＡポリメラーゼによって、または、クレノウポリメラーゼおよびＴ７　ＲＮＡポリメラーゼによって、プライマー伸長および増幅か行なわれた。逆転写酵素によるプライマー伸長のためには、３０ｐｍｏｌｅ　オリゴ４．３０ｐｍｏｌｅ　オリゴ５．０．ＩＭＦリスＨＣＩ　ｐＨ８，３，２ｍＭ　ｄＮＴＰ、１ｍＭ　ＮＴＰ（アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）　、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）　、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびシチジン三リン酸の混合物、すへてＰｈａｒｍａＣｉａから得た）、１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２．８０ｍＭ　ＫＣＩ、２０ｍＭ　ＤＴＴ。

１００ユニツトＲＮニーシン（ａｓｉｎ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、４０ユニツトのＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、および４０ユニツトのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む５０ｕ１の混合物が添加された。２ユニツトのＲＮＮアーゼ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が、ある実験（表３および図５に示されるものを含む）においてはオプションで添加されたが、結果にほとんと変化はなかった。ある実験においては、２０ｕＣｉ　ａ−３２Ｐ　ＵＴＰ　（３０００Ｃｉ　／　ｍ　ｍ　ｏ　１　、Ａｍｅｒｓｈａｍ）もまた、混合物に含まれた。インキュベーションか４２℃ で３時間にわたって行なわれ、この後、放射性試料か、ＴＣＡ沈５＆　（”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ“参照）、およびリポ核酸への組み込みを表わす不溶性ＴＣＡカウントの評価のため供された。非放射性試料は、１００ｕｌ　３７％ホルムアルデヒドの添加および６０℃で１５分間のインキュベーションによって変性された。例１て説明したように、２００ｕｌ　２０ＸＳＳＣか添加され、試料はＢＡ８５ニトロセルロース膜に固定化された。

上述のように（例１）、膜は３２Ｐで標識されたオリゴ３とハイブリッド形成され、洗浄されて上述のようにオートラジオグラフィにかけられた。

クレノウポリメラーゼによるプライマー伸長のためには、３０　ｐｍｏ　！　ｅ　オリゴ４．３０　ｐｍｏ　１　ｅ　オリゴ５．５０ｍＭ　トリスＨＣＩ　ｐＨ７，７５，４００μＭ　ｄＮＴＰ、５００μＭ　ＮＴＰ、５ｍＭ　ＭｇＣＬ、１ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１００ユニツトのＲＮニーシン（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）、４０ユニツトのクレノウポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、　４０　ユニットのＴ７ＲＮＡボリメラーセ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および２０ｕｃｉ　ａ−３２Ｐ　ＵＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む２５０ｕｌの混合物か添加された。インキュベーションは３７°Ｃて３時間にわたって行なわれ、その後、放射性試料か、ＴＣＡ沈澱（“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”参照）、およびリボ核酸への組み込みを表わす不溶性ＴＣＡカウントの評価のために供された。表３は、オリゴ４および５の双方を組み込み、オリゴＣＦＴＲまたはデルタ５０８に相同的にハイブリッド形成するハイブリッド形成混合物への３２Ｐ　ＵＴＰの組み込みの増加を示す。その結果はまた、オリゴ４またはオリゴ５のいずれを省略しても、３２Ｐ　ＵＴＰ合成が低減することを示す。図８は、図２のプライマー伸長された分子４（またはＲＮＡ分子５）に特異的なリン３２て標識されたオリゴヌクレオチドプローブの、核酸に対するハイブリッド形成を示すオートラジオグラフであり、核酸は、「正常なＪ　ＤＮＡ　（ＰＣＲ増幅されたＣＦＴＲ遺伝子）に対するプローブＣＦＴＲのハイブリット形成の後生成されたもの、ｒｃＦＪＤＮＡ　（ＰＣＲ増幅されたデルタ５０８ＣＦＴＰ遺伝子）に対するデルタ５０８のハイブリット形成の後生成されたもの、または「なしＪ　（ＰＣＲブランク）に対してＣＦＴＲまたはデルタ５０８のハイブリット形成なして生成されたものであり、各場合において、オリゴ２なしで、またはオリゴ２とともに、ならびに、オリゴ４（＋４）、オリゴ５　（＋５）またはオリゴ４および５の双方（＋４＋５）のいずれかて行なわれ、ここでオリゴ２．４および５は表１に規定される。

これは、オリゴ４および５の双方を増幅混合物に組み込むことによる、標識オリゴ３に相同的な核酸（ＲＮアーゼてはなく逆転写酵素によるプライマー伸長）における対応する増加を示す。

例３−ハイブリット形成されるオリゴヌクレオチドブローβ−ガラクトシダー上酵素供与体フラグメントの転写および翻訳のための鋳型は、以下のように生成される。５０ｐｍｏ　ｌ　ｅ　アリコートのオリゴヌクレオチド５および６（表１）か、９０°Ｃに５分間加熱され、ゆっくりと室温まで冷却された。２μｇ　Ｍ１３ｍｐ１８　ＤＮＡ（ＲＦ型、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）か、製造業者の使用説明書に従ってＥｃｏＲｌ（いｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で消化され、線状にされたＤＮＡが、１．８％低融点アガロースゲルでのゲル電気泳動、およびＥｌｕｔｉｐ−ｄカラムクロマトグラフィーによって精製された。ＤＮＡは最後に、エタノール沈殿され、ＴＥ緩衝液に溶解された。０、Ｉｔｔｇ　（１，ｃｚｌ）ＥｃｏＲＩ消化されたＭｌ３　ＤＮＡか、アニールされたヌクレオチド調製物と混合され、水の添加によって１５μｌにされた。４μｍの５ｘ連結緩衝液およびｌμｌ　Ｔ４ＤＮＡリガーセ（ともにＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから供給される）か添加され、混合物は１２°Ｃで１時間にわたってインキュベートされた。１ＯｎＨの混合物か、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯｌの形質転換に用いられ（“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　”参照）、組換えＭ１３クローンにおけるクローン化されたオリゴヌクレオチド５／６フラグメントか、シーケンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いてのジテオキノヌクレオチドＤＮＡシーケンシングによって確認された。Ｍ１３ｍｐ１８　ＤＮＡに関して先に説明したように、組換えＭｌ３からのＲＦ型ＤＮＡか調製され、ＥｃｏＲＩて消化され、ゲル精製された。このＥｃｏＲＩは、Ｍｌ　３ｍｐ　１８ＤＮＡを消化した。このＥｃｏＲＩ消化されたＭ１３ｍｐ　＋　８　（５／６）ＤＮＡは、ｌｏ０μｇ／ｍｌでＴＥ緩衝液において溶解された。

β−ガラクトンダダー遺伝子フラグメントは、以下のように生成された。５０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド８および９（表１）か、個々に２９μｍの水で希釈され、１０μｍの５Ｘキナーゼ緩衝液（５ｘ＝０．２５Ｍ　トリスＨＣＩ　ｐＨ７，６，５０ｍＭ　〜ｉｇＣ１２，２５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭ　スペルミジンＩ−（ＣＩ、０．５ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭ　ＡＴＰ）か添加された。さらにこの混合物に、ｌＯμＣ１（１μｍ）　５′−７３２Ｐアデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および５μＩ　Ｔ４ボリヌクレオチドキナーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）か添加された。この混合物は、３０分間３７℃でインキュベートされ、標識ヌクレオチドは、２０％変性ポリアクリルアミドゲルで精製された。精製され、標識されたオリゴヌクレオチド８および９は、次に組合わされ、オリゴヌクしオチト７および１０（表］）と最終容量２０μｌて混合された。この混合物は、９０°Ｃに加熱され、ゆっくりと室温まで冷却された。５μｍの５ｘライゲーシヨン緩衝液およびｌμｌ　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）か添加され、混合物は１晩１６°Ｃてインキュベートされた。１３０塩基対β−ガラクトシダーゼ遺伝子フラグメントが、１６％未変性ポリアクリルアミドゲルで精製され、１２μｌの水に溶解された。これに、０．１μｇ　（ｌ μｌ）旦ｃｏＲＩ−消化されたＭ１３ｍｐ１８　（５／６）ＤＮＡ、５μＩ　５ｘライゲーシヨン緩衝液、および２ｔｔｌ　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）か添加された。混合物はｌ晩１２°Ｃてインキュベートされ、上述のようにＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ細胞の形質転換に使用された。ｒＭ１３／ｂｇａｌＪ組換え体におけるβ−ガラクトシダダーフラグメントの保全性は、上述のようにシーケンシングによってチェックされ、一本ｆｆ１ＤＮＡか増幅反応のために調製された。

ハイブリッド形成されたＣＦＴＲまたはデルタ５０８プローブからの増幅は、３０ｐｍｏｌｅの一本鎖ＭＩ３／ｂｇａｌ　ＤＮＡかオリゴ５の代わりに用いられ、かつ１００μＭ　ＧＴＰおよび１ｍＭ　ｍ７Ｇ　（５’　）ｐｐｐ＋　（５′ ）Ｇ（ナトリウム塩、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）か１ｍＭ　ＧＴＰの代わりに用いられた以外は、例２と全く同じように達成された。増幅の後、混合物はフェノール／クロロホルム抽出され、エタノール沈澱された（“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　”参照）。沈澱された核酸は、４０μｌの水に溶解され、２０μｍのウサギ網状赤血球溶解物の調製物（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　、すへてのアミノ酸を含む）か添加され、３７°Ｃて１時間にわたってインキュベートされた。β−ガラクトシダダーの相補のために、この酵素のＭＩ５変異体か、Ｌａｎｇｌｅｙ他、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２５０．ｐ２５８７−２５９２の方法によって調製され、２５０ピコモル／ｍｌて５０ｒｎＭ　リン酸ナトリウム　ｐＨ７，２、および５ｍＭ　β−メルカプトエタノールに溶解された。

この翻訳混合物に、２５０μｍのＬＭ　リン酸ナトリウム　ｐＨ７，２ｍＭ　〜ＩｇＳＯ，，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　Ｎ　ａ　Ｎ　３、および０．１％Ｔｗｅｅｎ２０か添加された。２５０μｍのＭ１５調製物か、１ｍｇの０−ニトロフェノールβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ）と添加され、混合物は３７℃で１時間にわたってインキュベートされた。

試料は次に、氷上に置かれ、４１４ｎｍにおいて光学密度か記録された。この結果は表４に示され、ＣＦＴＲＤＮＡに対する核酸のハイブリッド形成、増幅および翻訳によるβ−ガラクトシダダー活性の生成を示す。

表１は、増幅のために使用されるオリゴヌクレオチド１１の配列を詳細に示す。

これは、上述のように合成され、精製された。

５　ｐｍｏ　ｌ　ｅ　オリゴヌクレオチドＣＦＴＲ１またはデルタ５０８、および５　ｐｍｏ　１　ｅ　オリゴ２が、ｌＯμ１（ｌｌｋ終）の２０ｍＭ　トリスＨ（ｌ　ｐＨ８，３，１００ｍＭＫｃ１．３ｍＭ　Ｍｇ　ＣＩ　！　、４００８Ｍ　ｄＮＴＰ混合物、０．１％トリトンＸ　−１００（Ｓｉｇｍａ）、１０μＣｉ　ａ−３２ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）および０．１ユニツトのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中で２μＩ　ＣＦＴＰ　ＤＮＡと混合された。試料は２分間９３°Ｃに加熱され、５５°Ｃて１分間、７２°Ｃて１．５分間、および９３°Ｃて１分間の２５の連続熱サイクルによって、プライマー伸長され、増幅された。例Ｉて説明したように、試料はＴＣＡ沈澱に供された。

表５は、増幅オリゴヌクレオチド１１を含むハイブリッド形成混合物への３２Ｐ　ｄＣＴＰの増加した組込みを示す。

−Ｅユゴ　レオチ目゛プローブの配列ＣＦＩＲ：　５’−−３’ テ′ルタ　５０Ｂ＝　５菅−−３’ −に氏１にと３重オリゴ３：　５’−ａＡＧｃ−αズＩ山ロー３”オノｄ’ｌｌ：　５’−ＡＴＩＩＣ−３’１は、特異的なバイブ刀ッ片形成水よｌ゛バイブ鴇７重％成之起たＣＦＴＲ！筏はチ゛ル９ＳＯＳプローブのイ中長１：よ３゜−去ユユＯＴＲ／　２　１８６５０　５８８０　１７７０テ゛ルタ５０８　／　２　１４５１０　１９０６０　８４１０２のみ　２４２０　４０３０　２０８０オリゴプローブ（２凶ピと且ユＬに倭）ＣＦｒＲ／　２　６７７０　７５０　５２０テ゛ル９５０８／２１３７ｏ２０６０　５２０２のみ　１９０　５０　庶」Ｅ」 −−ｃ　ｙｓ　３２Ｐ−ＵＴＰＣＥＴＢＪ２　＋　ｉリボ４１オソゴ５　１２８００　２０５０　Ｉ２３０ＣＦｒＢＪ２＋オリゴ５　２７７０　２４２０　５２０ＣＥＴＸ／２＋牙＼ｔ−ｉ゛４　８５０　１ａｓｏ　ｕ。

デル９５０Ｂ／２＋第１ｊゴ４／矛１ゴ５４７８０　２２０４２　３４２０デル９５０８／２　＋−１１’ｌゴ５　１２１０　１６１０　５４０ヂノしｑ　５０８／２　＋−ヤリゴ’４　５１０　９０　２９０ＣＦ？Ｒ／２　＋　すＩゴ゛　４１オゾゴ　５　６４７０　１３３０　４３０ＣＦＴｆＬ／２　／み　６ω　２１０　５０−表」＋　Ｍｎ２　ｂｔシＬｌ　Ｏ，０５１０にす３−　Ｍｎ３　ｂＧａｌ　Ｏ，００００，０１０二１」 ’−ｃ　１．．１３２Ｐ−（Ｉ　ＣＴＰｃＦｒＦＬ／２　９５０　９３０　４５チ′）しタ　５０８／２／ＩＩ　５９８５　１５５５０　６１０チリぼ５０８／２　１８０　２００　２０Ｕのみ　２５　３０　２０１−・２　’　：　’　ｌｉＥＥＬｎ℃口Σ２１５＼　・特表千６−５１０６６９　（１５）Ｆ工αＪＲＥ５１あびε６Ｆ工ＧＵＲＥ　７Ｆ工ＧＵＲＥ　８国際調査報告フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ（７２）発明者　デルナッテ、サビン・ヨランデ・ジョセフイギリス、オー・エックス・９５・ティー・ニス　オックスフォードシャー、ルーフノール、ヒル・ロード、ホーム・ファーム（番地なし）

Claims

【特許請求の範囲】

１．試料中の特定の核酸配列の存在に関してテストするための方法であって、第１のプローブおよび第２のプローブと試料を接触させるステップを含み、前記プローブのある部分は、プローブが互いに隣接するか、または実質的に隣接するように、前記特定の配列に対してハイブリッド形成することができ、そのため第１および第２のプローブの他の部分が互いに対してアニールされることができ、さらに、鋳型としてプローブの一部を用いて一方のプローブ鎖の伸長を引き起こすように試料を処理するステップと、伸長されたプローブの少なくとも一部を検出するステップとを含む、方法。
２．第３のプローブおよび第４のプローブの使用をさらに含み、前記第３および第４のプローブのある部分は、それぞれ、前記特定の配列に相補的な第１および第２のプローブの配列の少なくとも一部に対してハイブリッド形成することができ、そのため第３および第４のプローブの他の部分が互いに対してアニールすることができ、さらに、鋳型として第３または第４のプローブの一部を用いて第３または第４のプローブの領の伸長を引き起こすように試料を処理するステップを含む、請求項１に記載の方法。
３．伸長の後に、対になったプローブの連結をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
４．伸長されたプローブの少なくとも一部が増幅される、請求項１、２または３のいずれかに記載の方法。
５．伸長されたプローブの前記少なくとも一部か、さらなるプローブの使用によって増幅される、請求項４に記載の方法。
６．さらなるプローブがＤＮＡを含む、請求項５に記載の方法。
７．さらなるプローブの増幅が、アニーリング、伸長および変性のサイクルによって達成される、請求項６に記載の方法。
８．ヌクレオチド配列の伸長が、少なくともいくらかの自己相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によって自己活性化される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
９．第１のプローブの伸長された部分が、さらなる伸長のために自己活性化する、少なくともいくらかの自己相補的なヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
１０．自己活性化するヌクレオチド配列が、タンパク質のための認識部位を含む二本鎖核酸を形成するように伸長される、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
１１．タンパク質が酵素である、請求項１０に記載の方法。
１２．伸長されたプローブ配列の少なくとも一部のＲＮＡ複製物を含むＲＮＡ分子を合成するステップと、アミノ酸配列を生成するようにＲＮＡ分子の少なくとも一部を翻訳するステップと、アミノ酸配列を検出するステップとをさらに含む、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
１３．ＲＮＡ分子を増幅するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
１４．前記ＲＮＡ分子の増幅が、ＲＮＡ：ＤＮＡサイクリングを含む、請求項１３に記載の方法。
１５．アミノ酸配列を生成するようにＲＮＡ分子の少なくとも一部を翻訳するステップと、アミノ酸配列を検出するステップとを含む、請求項１２ないし１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．アミノ酸配列が、酵素を調節できるペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
１７．アミノ酸配列が、β−ガラクトシダーゼの不活性Ｎ末端フラグメントを含む、請求項１６に記載の方法。
１８．プローブがＤＮＡを含む、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
１９．第２のプローブが、５′末端領域において、前記特定の配列に非相補的であり、かつ第１のプローブの少なくとも一部に相補的である配列を含む、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
２０．第２のプローブが、前記特定の配列に非相補的でありかつ第１のプローブの少なくとも一部に相補的である３０−７０ヌクレオチド長の部分を含む、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
２１．第２のプローブの３′末端が、伸長を防ぐようにブロックされる、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
２２．第１のプローブが、３′末端領域において前記特定の配列に非相補的でありかつ第２のプローブの少なくとも一部に相補的である配列を含む、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
２３．第１のプローブが、前記特定の配列に非相補的でありかつ第２のプローブの少なくとも一部に相補的である２−１０ヌクレオチド長の部分を含む、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
２４．第１および第２のプローブが、前記特定の配列に相補的な１５−２５ヌクレオチド長の配列を含む、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
２５．サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩまたはそのクレノウフラグメント、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される酵素の使用を含む、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
２６．この発明の方法の実行によって、１塩基だけ異なる（置換、欠失または付加）ヌクレオチド配列が区別できる、先行請求項のいずれか１つに記載の方法。
２７．使用のための説明書およびポリメラーゼを含むキット。
２８．組成物であって、特定の核酸配列と、それに対してハイブリッド形成される第１のプローブと、第１のプローブに際接して、または実質的に隣接して前記特定の配列に対してハイブリッド形成される第２のプローブとを含み、そのため第１および第２のプローブの他の部分は互いに対してアニールされ、プローブのうちの一方は、鋳型としてプローブの一部を用いて鎖伸長される、組成物。