CN113897366A - 一种核酸配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)及其应用。本发明所述核酸配体是在分子内形成互补配对的单个核酸分子或核酸分子类似物，或者是在分子间形成互补配对的单个或两个核酸分子或核酸分子类似物；所述核酸配体3’端具有抑制其延伸的修饰；本发明提供的核酸配体，当扩增反应混合物保持或低于一定的温度时，核酸聚合酶的酶活被核酸配体抑制，没有残余酶活。而当加热反应混合物时，核酸聚合酶从所述核酸配体上脱离下来，发挥活性，形成引物延伸产物，从而达到抑制非特异性扩增的作用。本发明核酸配体适用于所有的聚合酶，可以广泛应用于核酸扩增领域，从而减少非特异性扩增。

Description

一种核酸配体及其应用
本申请要求于2020年6月22日提交中国专利局、申请号为202010576818.3、发明名称为“一种核酸配体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
虽然PCR技术已经在生物医药领域得到广泛应用，但由于PCR副反应导致的非特异性扩增常常带来较大问题。特别是在临床诊断领域，需要在大量背景DNA下扩增微量的目的DNA，此时的非特异性扩增会导致假阳性。而非特异性扩增产生的很大原因，是由于酶在室温下延伸了非特异性退火的引物。因此，抑制聚合酶在室温条件下的活力，可以很大程度上减少非特异性扩增。
为了减少甚至避免操作过程中产生非特异性扩增，人们发明了热启动聚合酶链式反应，开发并使用了热启动聚合酶，热启动酶是能够通过热启动的方式避免低温下体系中发生错配，原理就是采用化学修饰或者抗体修饰的方法封闭酶的活性中心，化学修饰是利用一些分子基团和酶活性中心结合，温度到达一定温度时(一般是退火温度之前)，小分子离开酶的活性中心，酶活性中心暴露，此时发挥活性，指导体系扩增，但化学修饰热启动酶性能不稳定；而抗体修饰是以所修饰的聚合酶为抗原免疫实验动物产生相对应的抗体，经过一系列的筛选后，通过单克隆抗体技术大规模制备该抗体，并利用抗体的蛋白生物活性使其在PCR反应高温条件下失活、脱落，从而达到热启动的效果，但特定抗体的产生需要非常长的筛选周期，而且抗体修饰易带来外源DNA的污染。
美国专利(US6183967、US6020130)公开了与热稳定Taq酶，Tth酶，和TZ05酶特异性结合的寡核苷酸适配体，这些适配体能在室温下封闭聚合酶的活性。筛选适配体的过程一般包括五个基本的步骤，即：结合、分离、洗脱、扩增和调节，再通过迭代循环得到目标适配体，整个筛选需要非常长的周期，过程相对较慢和复杂。并且由特定方法筛选的适配体对相应的配体(聚合酶)具有高度专一性，因此不同的聚合酶需要不同的适配体。
因此需要一种更简便的可逆抑制核酸聚合酶的方法，使抑制核酸聚合酶酶活的核酸配体更具通用性，能适用于所有的核酸聚合酶。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种核酸配体，也可以称为核酸聚合酶底物类似物，使其能够有效减少室温下核酸聚合酶导致的非特异性扩增产物，并且适用于所有类型的核酸聚合酶，通用性更强；
本发明的另外一个目的在于提供上述核酸配体在核酸扩增、在核酸扩增试剂盒制备中以及在制备核酸延伸反应混合物中的应用；
本发明的另外一个目的在于提供含有上述核酸配体的核酸扩增试剂盒和核酸延伸反应混合物；
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
本发明所述核酸配体是在分子内形成互补配对的单个核酸分子或核酸分子类似物，或者是在分子间形成互补配对的单个或两个核酸分子或核酸分子类似物；所述核酸配体3’端具有抑制其延伸的修饰，当保持或低于一定温度时与核酸聚合酶形成稳定结构，此时核酸聚合酶的酶活被抑制，当高于所述一定温度时，核酸聚合酶从所述核酸配体上脱离下来，发挥活性。
本发明所述核酸配体通过模拟与核酸聚合酶结合的底物，与核酸聚合酶结合，因此也可以称为核酸聚合酶底物类似物。其能在温度控制下，使核酸聚合酶失去或恢复活性，所述核酸配体能适用于所有核酸聚合酶。
其中，所述核酸配体是分子内形成互补配对的单个核酸分子或核酸分子类似物，与核酸聚合酶作用的示意图见图1；所述核酸配体是分子间形成互补配对的单个或两个核酸分子或核酸分子类似物的示意图见图2。
作为优选，所述一定温度是所述核酸聚合酶发挥活性的温度；在本发明具体实施方式中，所述一定温度应显著低于反应温度。比如：对用于PCR的热稳定DNA聚合酶该温度为50℃。
作为优选，所述互补配对的个数为8-35，或10-30，或10-20；在本发明具体实施方式中，分子内互补配对的个数为8-20，分子间的互补配对的个数为10-32。
作为优选，所述核酸分子或核酸分子类似物的3’端抑制其延伸的修饰包括双脱氧修饰、或磷酸化修饰、或氨基修饰等。
本发明核酸配体适用于所有的聚合酶，包括DNA聚合酶和RNA聚合酶。所述核酸聚合酶来自Family A，如Thermus aquaticus、Thermus thermophilus、Thermus filiformis、Thermus flavu、Bacillus stearothermophilus等，以及来自Family B，如Pyrococcusfuriosus、Thermococcus Kodakaraensis等，所述RNA聚合酶来自AMV、MMLV等家族的逆转录酶。
采用本发明核酸配体对目标基因进行扩增，与未加入核酸配体的对照相比，能够显著抑制非特异性扩增，因此本发明还提供了所述核酸配体在核酸扩增、在制备核酸扩增试剂盒或在制备核酸延伸反应混合物中的应用。
根据上述应用，本发明提供了一种核酸扩增的方法，包括：
步骤1、将含有靶核酸的待测样品与以下扩增反应试剂接触，形成反应混合物；
a)可与靶核酸杂交的引物；
b)核酸聚合酶；
c)本发明所述核酸配体；
d)核苷三磷酸；
步骤2、加热所述反应混合物使所述核酸配体的配对核苷酸解离成单链，核酸聚合酶从所述核酸配体上脱离下来，发挥活性，形成引物延伸产物。
作为优选，所述核苷三磷酸包括dUTP、dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
作为优选，所述扩增待测样品中靶核酸的方法，进一步包括检测引物延伸产物。
此外，本发明还提供了一种核酸扩增试剂盒，包括本发明所述核酸配体。同时也提供了一种核酸延伸反应混合物，包含本发明所述核酸配体、核酸聚合酶、至少一种引物、核酸模板和三磷酸核苷。
由以上技术方案可知，本发明提供了一种核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)，当扩增反应混合物保持或低于一定的温度时，核酸聚合酶的酶活被核酸配体抑制，没有残余酶活。而当加热反应混合物时，核酸聚合酶从所述核酸配体上脱离下来，发挥活性，形成引物延伸产物，从而达到抑制非特异性扩增的作用。本发明核酸配体适用于所有的聚合酶，可以广泛应用于核酸扩增领域，从而减少非特异性扩增。
附图说明
图1所示为本发明核酸配体(分子内互补配对)与核酸聚合酶作用的示意图；
图2所示为本发明核酸配体(分子间互补配对)与核酸聚合酶作用的示意图；
图3所示为测试方法中对照酶酶活标准曲线图；
图4所示为70℃等温延伸扩增结果；其中左图为加入核酸配体(上为扩增曲线，下为反应温度)，右图为不加入核酸配体(上为扩增曲线，下为反应温度)；
图5所示为60℃等温延伸扩增结果；其中左图为加入核酸配体(上为扩增曲线，下为反应温度)，右图为不加入核酸配体(上为扩增曲线，下为反应温度)；
图6所示为50℃等温延伸扩增结果；其中左图为加入核酸配体(上为扩增曲线，下为反应温度)，右图为不加入核酸配体(上为扩增曲线，下为反应温度)；
图7所示为40℃等温延伸扩增结果；其中左图为加入核酸配体(上为扩增曲线，下为反应温度)，右图为不加入核酸配体(上为位扩增曲线，下为反应温度)；
图8所示为核酸配体3'端修饰与不修饰的扩增对比结果；
图9所示为本发明核酸配体(分子内不同碱基数量互补配对/不同温度稳定性)对酶活的抑制效果；
图10所示为本发明核酸配体(分子间互补配对)对Taq酶酶活的抑制效果；
图11所示为本发明核酸配体(分子间互补配对)对KOD DNA聚合酶酶活的抑制效果；
图12所示为模板量为0.025ng、0.05ng的人基因组9948的扩增结果；其中，从上至下依次为不加核酸配体的0.025ng模板量扩增结果、加核酸配体的0.025ng模板量扩增结果、不加核酸配体的0.05ng模板量扩增结果、加核酸配体的0.05ng模板量扩增结果；
图13所示为模板量为0.1ng、0.2ng的人基因组9948的扩增结果；其中，从上至下依次为不加核酸配体的0.1ng模板量扩增结果、加核酸配体的0.1ng模板量扩增结果、不加核酸配体的0.2ng模板量扩增结果、加核酸配体的0.2ng模板量扩增结果；
图14所示为45℃等温延伸扩增结果；其中上为扩增曲线，下为反应温度，扩增曲线末端从上至下依次代表未添加核酸配体(即3'端未修饰)、3'端氨基修饰、3'端磷酸化修饰和3'端双脱氧修饰的曲线；
图15所示为所示为70℃等温延伸扩增结果；其中上为扩增曲线，下为反应温度，扩增曲线末端从上至下依次代表未添加核酸配体(即3'端未修饰)、3'端氨基修饰、3'端磷酸化修饰和3'端双脱氧修饰的曲线。
具体实施方式
本发明公开了一种核酸配体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述核酸配体及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述核酸配体及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所提供的对比试验各处理组所采用的原料均相同，且各组除去应有的区别外其他试验条件保持一致。本发明所涉及原料、试剂等，如无特殊说明均可通过市售途径获得。
除非特别定义，本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。以下的文献中本领域中大部分专业名词的一般定义，本专利中所使用的专业名词与上述文献中对该专业名词描述一致。
名词“核苷酸”一般指的是一个核苷通过酯键与一个酸性分子或基团相连而形成的化合物，例如，核苷的磷酸酯，通常有一个、两个或三个磷酸基团共价连接在核苷的糖基团的5号位上。在一些情况下，核苷酸的定义还包括一些典型核苷酸的同系物或类似物。
名词“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，DNA-RNA杂交体，寡聚核苷酸，适配体(aptamers)，肽核酸(PNAs)，PNA-DNA杂交体，PNA-RNA杂交体等等。包括一切线性形式(单链或双链)或分支状形式的共价相连的核苷酸。一个典型的核酸通常是单链或者双链的，并包含磷酸二脂键。
名词“扩增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下数目变多的过程，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，核酸序列基础扩增(NASBA))等。
在本发明实施例中，扩增指的是聚合酶链式反应(PCR)。模板变性解链，寡聚核苷酸引物与模板退火杂交，伴随着核苷酸加入的延伸，如此反复循环一定轮数，实现目的核苷酸片段的增多。
名词“嗜热酶”指的是对于加热是稳定的促进核苷酸的聚合以形成多核苷酸延伸产物。通常，在热循环过程中嗜热稳定的聚合酶是常用的，在PCR循环过程中通过高温95℃使双链核苷酸变性。本文描述的有效用于PCR扩增反应的嗜热酶满足至少一个标准，当经受升高的温度为实现双链核苷酸变性所必需的时间时，该酶没有被变性。在一些实验体系中，90℃---100℃嗜热酶将不会变性。
如本文所用，“核酸配体”(核酸聚合酶底物类似物)是对核酸聚合酶具有期望作用的非天然存在的核酸。
本文中用的核酸配体，通过模拟核酸聚合酶的底物与核酸聚合酶结合，是能在分子内或分子间形成互补配对的单个或两个核酸分子或核酸分子类似物，这些核酸分子或核酸分子类似物的3’端进行双脱氧修饰，起到终止聚合酶延伸的作用，其结构在保持或低于一定温度时稳定，当在加热状态下(55℃～95℃)，配对的核苷酸解离成单链，核酸聚合酶从核酸配体中脱离下来，让核酸聚合酶发挥其应有的作用。
“核酸”是指DNA，RNA，单链或双链及其任何化学修饰。修饰包括但不限于那些提供其他化学基团的修饰，这些化学基团将附加电荷，极化性，氢键，静电相互作用和对核酸配体碱基或整个核酸配体的通量掺入。此类修饰包括但不限于2'-位糖修饰，5-位嘧啶修饰，8-位嘌呤修饰，环外胺上的修饰，4-硫尿苷的取代，5-溴或5-碘-的取代。尿嘧啶，主链修饰，甲基化，不同寻常的碱基配对组合，例如异碱基异胞苷和异胍等。修饰还可以包括3'和5'修饰，例如封端。
“等温延伸测酶活”方法涉及选择核酸配体的性能评估，所述核酸配体以理想的方式与聚合酶相互作用。在本发明中，采用等温延伸测酶活方法来验证核酸聚合酶的核酸配体。
如本文所用，“对于核酸配体”是通过等温延伸方法鉴定的核酸配体，其基于温度参数调节对其taq酶的亲和力大小。在优选的实施方案中，主要考参数是温度，并且核酸配体在升高的温度下对其taq酶的亲和力降低。
如本文所用，“核酸聚合酶”是指通过使用DNA或RNA(逆转录酶)作为模板通过将脱氧核糖核苷酸单元添加至DNA链来催化DNA合成的任何酶。
“开关”是指根据某些特定的反应条件起开启或关闭反应作用的任何化合物。在本发明中，核酸配体的功能是根据以下情况将PCR“打开”或“关闭”。
在本发明具体实施方式中，本发明提供了多种核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)，其中分子内互补配对的核酸配体序列如SEQ ID NO:1-11所示，分子间互补配对的核酸配体其中一条链的序列如SEQ ID NO:12所示，另外一条链的序列如SEQ ID NO:13-20所示。本发明在具体实施方式中主要用了Taq聚合酶和KOD聚合酶进行说明，但是实际上本发明所述的核酸配体可以适用于所有的核酸聚合酶，及核酸扩增反应。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：核酸配体抑制聚合酶酶活的测定方法
利用单链延伸方法检测，使用购买的NEB M13单链DNA及相关引物进行测活，荧光定量方法实时检测，本发明使用的仪器为罗氏LC480II。
引物M13R序列和扩增体系如下：
M13R引物1ACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTAT
表1
组分 浓度 每份加入体积ul
10x Buffer A 10x 2.5
MgCl<sub>2</sub> 250mM 0.5
SG 100x 0.4
M13ssDNA 0.73mg/ml 0.45
dNTP 100mM 0.2
M13R 100uM 0.1
taq酶 / 1
ddH2O / 19.85
其中10X bufferA为30mM，Tris 8.0；50mM KCl；TWEEN20 0.05％；10mM巯基乙醇配制成的Buffer。此反应体系在原酶酶量0.04-0.008U区间有重复性很高的准确度。
等温延伸反应的反应程序为：(72℃，30s)*22循环，反应体系设为25ul。
聚合酶从0.04U-0.008U稀释如下表：
表2
Figure BDA0003126314700000091
如图3结果所示，R2>0.99，符合线性理论，此反应可以足够灵敏的测出在不同温度范围内对DNA聚合酶的封闭作用。
实施例2：聚合酶的封闭实验(选择最优的等温延伸条件筛选核酸配体)
按照实施例1的方法进行70℃、60℃、50℃、40℃延伸来筛选哪些核酸配体达到预期的效果，例如以下核酸配体：
核酸配体1(核酸聚合酶底物类似物)：TCGAACGGTATATATATTAATATATATATAC(SEQID NO:1所示)，3’端双脱氧修饰。
先把6U DNA酶与上面核酸配体1混合，再按照100uM 0.05ul体系约加入6U DNA酶混合，-20度过夜测试。同时将不加核酸配体的作为对照体系。按照实施例1的测活方法，分别测试两组体系的酶活情况。
由图4-7可以看出，不加入核酸配体的体系，聚合酶在40℃，50℃的信号有明显提升，而在加入核酸配体的体系中，聚合酶部分活性受到抑制，特别在50℃以下时完全没有活力。并且在PCR实验中一般6U的原酶加入量是偏大的，实际PCR实验的加入量都会远小于6U。此体系在温度50℃以下时，可以完全封闭聚合酶活性，使其没有残余酶活，从而达到抑制非特异性扩增的作用。
所以最终确认以下实施例在50℃条件下进行实验测试，来筛选测试核酸配体。
实施例3：聚合酶的封闭实验
核酸分子或核酸分子类似物的3'端修饰可以采用常用的阻止扩增形式(双脱氧修饰、磷酸化修饰、氨基修饰等)，本实施例选择双脱氧方法进行终止终端延伸。同时把3'端不修饰的核酸分子作为对照，测试不修饰核酸分子是否也能抑制酶活。实验方法参考实施例1，两种核酸配体序列如下：
核酸配体1(核酸聚合酶底物类似物)：TCGAACGGTATATATATTAATATATATATAC(SEQID NO:1所示)，3'端双脱氧修饰；
对照核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)：TCGAACGGTATATATATTAATATATATATAC，3'端未修饰；
将6U DNA聚合酶分别与上面核酸分子2和核酸分子3混合的酶体系进行实验。按照100uM 0.05ul体系约加入6U DNA酶混合，-20度过夜测试。
结果如图8所示，加入对照核酸配体的酶活保持完全活力，增加很快；而加入经修饰的核酸配体1的体系，酶活被大部分抑制，达到预期的结果，可以封闭体系。此实验说明核酸配体3'修饰(不限于双脱氧修饰，一切3'修饰后可以阻止DNA酶继续延伸的修饰)对于本发明非常重要。
实施例4：聚合酶结合序列筛选(分子内)
以下核酸配体(核酸聚合酶底物类似物，序列依次如SEQ ID NO:2-11所示)3’端最后一个碱基进行修饰，本实施例采用3'端双脱氧修饰。
核酸配体2：TCGAACGGGTATACC；
核酸配体3：TCGAACGGGATATATCC；
核酸配体4：TCGAACGGGATTATAATCC；
核酸配体5：TCGAACGGGATATATATATCC；
核酸配体6：TCGAACGGGATATACTATAGTATATCC；
核酸配体7：TCGAAGTGTATATACTATAGTATATACAC；
核酸配体8：TCGGAGTGTATATACTATAGTATATACACTC；
核酸配体9：TCGGAGTGTATATACTATAGTATATACACTCC；
核酸配体10：TGAGAGTGTATATACTATAGTATATACACTCTC；
核酸配体11：GGAGAGTGTATATACTATAGTATATACACTCTCC；
本实施例用一系列具有分子内发夹结构的核酸分子作为DNA聚合酶的核酸分子，来检测对DNA聚合酶的抑制效果，这些核酸配体从4个核苷酸互补到所有核苷酸完全互补(下划线为互补配对碱基)。采用实施例1的方法，在50℃分析这些核酸分子对DNA聚合酶封闭作用。
由图9可以看出，从核酸配体2～11，随着配对的碱基数量增加，对酶活的抑制会逐渐增加随之降低。当碱基配对数从4～80(但不限于此互补对数)时，都对酶有一定的抑制作用但抑制效果不相同，本实施例的图上只放了有代表规律的数据，此实验中优选碱基配对数为8-20配对数。
实施例5：聚合酶结合序列筛选(分子间)
本实施例将两个分子间能形成互补配对的3’修饰核酸分子作为DNA聚合酶的核酸配体，来检测对DNA聚合酶的抑制效果。
以下核酸分子(核酸聚合酶底物类似物)都进行3’修饰(双脱氧修饰)
核酸分子14：GAGGAGTTCAGTAGCATGAGCTGTGTAGACGTATATAC；
核酸分子15：TATATACGTC；
核酸分子16：TATATACGTCTAC；
核酸分子17：TATATACGTCTACAC；
核酸分子18：TATATACGTCTACACAGC；
核酸分子19：TATATACGTCTACACAGCTC；
核酸分子20：TATATACGTCTACACAGCTCATGC；
核酸分子21：TATATACGTCTACACAGCTCATGCTAC；
核酸分子22：TATATACGTCTACACAGCTCATGCTACTGAAC；
将核酸分子15～22分别与核酸分子14混合，制成10uM与10uM混合，制成最后终浓度为5uM的核酸分子混合物，做为实验对象(即核酸配体12-19)。按照实施例2的混合比例，参照实施例1反应加入量，测试50℃下DNA聚合酶的酶活变化，本次使用的是A家族的DNA聚合酶Taq及去除3-5’外切活性的B家族酶KOD聚合酶。
如图10所示，随着两个核酸分子配对的核苷酸数量增加，酶活不断下降达到最低后又增加，说明两个核酸分子的部分核苷酸形成配对后，需要一定数量的配对碱基才可以发挥抑制酶活的作用，在此选择10-32个配对的碱基，都可以达到抑制酶活的作用，只是抑制作用大小不一样。
如图11所示，对KOD酶抑制的效果与对Taq酶的类似，规律一致，随着配对序列增加，酶活不断下降而后又增加。在一定区间内可以完全封闭酶活。
实施例6：功能性实验测试
将本发明所述的扩增待测靶核酸的方法，用于扩增不同模板量的人基因组模板的18个片段。在其中一组反应体系中加入核酸配体6，将另一组不加核酸配体的反应体系设为对照，分别测试扩增目的片段的效果。
反应体系为：
2ul 18位点引物；
5ul buffer(Tris-HCl 8.8 30mM、NaCl 30mM、MgCl2 2.0mM、BSA 1mg/ml、brij580.5％、proclin950 0.05％)；
dATP:dTTP:dCTP:dGTP为0.2mM:0.2mM:0.2mM:0.2mM；
0.4ul Taq酶10U/ul
5uM核酸配体6(TCGAACGGGATATACTATAGTATATCC)
1ul 0.025ng/ul、0.05ng/ul、0.1ng/ul和0.2ng/ul 9948(模板)；
水补足到10ul；
反应条件：95℃，10分；30cycles(95℃，10s；59度90S single)60度10分；
图12、13是当模板量分别是0.025ng、0.05ng、0.1ng、0.2ng时，加核酸配体和不加核酸配体时的扩增结果，可以看出,当在低模板浓度范围内0.025和0.05ng模板扩增时，没有加入核酸配体的体系，前面圆圈部位出现一些非特异扩增条带，影响实验判读准确性；而加入核酸配体的体系，非特异性扩增条带明显减少。本实施例说明加入核酸配体，可以极大减少非特异扩增。
实施例7：核酸配体3’端不同修饰对比
本实施例中，分别对核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)1的3’端最后一个碱基进行双脱氧修饰、磷酸化修饰和氨基修饰。测试3’端不同修饰在45℃，70℃等温延伸时能否抑制酶活。
核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)1：TCGAACGGTATATATATTAATATATATATAC(SEQID NO:1所示)，3'端双脱氧修饰、磷酸化修饰、氨基修饰；
对照核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)：TCGAACGGTATATATATTAATATATATATAC，3'端未修饰；
反应体系：
表3
Figure BDA0003126314700000131
从图14看出，加入对照核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)的酶活保持完全活力，增加很快；而加入3’端经过双脱氧修饰或磷酸化修饰或氨基修饰的核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)，在45℃等温延伸时，能有效抑制聚合酶的活力。
从图15看出，加入3’端经过双脱氧修饰或磷酸化修饰或氨基修饰的核酸配体(核酸聚合酶底物类似物)，在70℃等温延伸时，能100％释放聚合酶活力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州新海生物科技股份有限公司
<120> 一种核酸配体及其应用
<130> MP21016427
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgaacggta tatatattaa tatatatata c 31
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgaacgggt atacc 15
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgaacggga tatatcc 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgaacggga ttataatcc 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgaacggga tatatatatc c 21
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgaacggga tatactatag tatatcc 27
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgaagtgta tatactatag tatatacac 29
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcggagtgta tatactatag tatatacact c 31
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcggagtgta tatactatag tatatacact cc 32
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgagagtgta tatactatag tatatacact ctc 33
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggagagtgta tatactatag tatatacact ctcc 34
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggagttca gtagcatgag ctgtgtagac gtatatac 38
<210> 13
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tatatacgtc 10
<210> 14
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tatatacgtc tac 13
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tatatacgtc tacac 15
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tatatacgtc tacacagc 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tatatacgtc tacacagctc 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tatatacgtc tacacagctc atgc 24
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tatatacgtc tacacagctc atgctac 27
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tatatacgtc tacacagctc atgctactga ac 32

Claims (11)

1.一种核酸配体，其特征在于，所述核酸配体是在分子内形成互补配对的单个核酸分子或核酸分子类似物，或者是在分子间形成互补配对的单个或两个核酸分子或核酸分子类似物；所述核酸配体3’端具有抑制其延伸的修饰，当保持或低于一定温度时与核酸聚合酶形成稳定结构，此时核酸聚合酶的酶活被抑制，当高于所述一定温度时，核酸聚合酶从所述核酸配体上脱离下来，发挥活性。
2.根据权利要求1所述核酸配体，其特征在于，所述一定温度是所述核酸聚合酶发挥活性的温度。
3.根据权利要求1所述核酸配体，其特征在于，所述互补配对的个数为8-35。
4.根据权利要求1所述核酸配体，其特征在于，所述修饰为双脱氧修饰、磷酸化修饰或氨基修饰。
5.根据权利要求1所述核酸配体，其特征在于，所述核酸聚合酶为DNA聚合酶或RNA聚合酶。
6.根据权利要求5所述核酸配体，其特征在于，所述DNA聚合酶选自Family A或FamilyB的聚合酶。
7.根据权利要求5所述核酸配体，其特征在于，所述RNA聚合酶选自AMV家族或MMLV家族的逆转录酶。
8.权利要求1-7任意一项所述核酸配体在核酸扩增、在制备核酸扩增试剂盒或在制备核酸延伸反应混合物中的应用。
9.一种核酸扩增的方法，其特征在于，包括：
步骤1、将含有靶核酸的待测样品与以下扩增反应试剂接触，形成反应混合物；
a)可与靶核酸杂交的引物；
b)核酸聚合酶；
c)权利要求1-7任意一项所述核酸配体；
d)核苷三磷酸；
步骤2、加热所述反应混合物使所述核酸配体的配对核苷酸解离成单链，核酸聚合酶从所述核酸配体上脱离下来，发挥活性，形成引物延伸产物。
10.一种核酸扩增试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-7任意一项所述核酸配体。
11.一种核酸延伸反应混合物，其特征在于，包含权利要求1-7任意一项所述核酸配体、核酸聚合酶、至少一种引物、核酸模板和三磷酸核苷。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114990126A (zh) * 2022-08-03 2022-09-02 珠海宝锐生物科技有限公司 特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6020130A (en) * 1995-06-07 2000-02-01 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands that bind to and inhibit DNA polymerases
US6183967B1 (en) * 1995-06-07 2001-02-06 Nexstar Pharmaceuticals Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
CN1973048A (zh) * 2003-02-05 2007-05-30 通用电气医疗集团生物科学公司 末端磷酸根标记的核苷酸和使用方法
CN104845967A (zh) * 2015-04-15 2015-08-19 苏州新海生物科技有限公司 寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6194141B1 (en) * 1998-03-31 2001-02-27 The Research Foundation Of State University Of New York Inhibition of picornavirus genome replication by interference with VPg-nucleotidylylation and elongation
US20090325169A1 (en) * 2008-04-30 2009-12-31 Integrated Dna Technologies, Inc. Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6020130A (en) * 1995-06-07 2000-02-01 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands that bind to and inhibit DNA polymerases
US6183967B1 (en) * 1995-06-07 2001-02-06 Nexstar Pharmaceuticals Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
CN1973048A (zh) * 2003-02-05 2007-05-30 通用电气医疗集团生物科学公司 末端磷酸根标记的核苷酸和使用方法
CN104845967A (zh) * 2015-04-15 2015-08-19 苏州新海生物科技有限公司 寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
P KAINZ等: "Specificity-Enhanced Hot-Start PCR: Addition of Double-Stranded DNA Fragments Adapted to the Annealing Temperature", 《BIOTECHNIQUES》, vol. 28, no. 2, pages 278, XP002202181 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114990126A (zh) * 2022-08-03 2022-09-02 珠海宝锐生物科技有限公司 特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体及应用
CN114990126B (zh) * 2022-08-03 2022-11-18 珠海宝锐生物科技有限公司 特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体及应用

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