CN114990126A - 特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体及应用 - Google Patents

特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体及应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体及应用，涉及生物技术领域，该核酸适配体在应用于“温启动”Bst DNA聚合酶大片段时，在第一预设温度时，可以形成二级结构与Bst DNA聚合酶大片段的活性中心结合后，封闭Bst DNA聚合酶大片段的活性，当温度升高到第二预设温度时，核酸适配体变性，与Bst DNA聚合酶大片段解离，从而Bst DNA聚合酶大片段可以恢复活性，当温度再次降低到第一预设温度时，核酸适配体复性后可以重新与Bst DNA聚合酶大片段封闭，从而再次抑制它的活性。

Description

特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体及 应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体及应用。
背景技术
嗜热脂肪地芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus ，Bst）DNA聚合酶是DNA聚合酶A家族的另一名成员，Bst DNA聚合酶全长基因为2634bp，表达的蛋白为878个氨基酸，对应分子量为98k Da。而Bst DNA聚合酶的大片段像Klenow大片段DNA聚合酶一样具有5'→3'DNA聚合酶活性，但不具有5'→3'外切核酸酶活性，失去了N端292个氨基酸，基因长度为1758bp，编码蛋白长度为586个氨基酸，对应分子量为67k Da。
与Taq DNA聚合酶被应用于PCR技术的特点不同，Bst DNA聚合酶大片段由于其具有较强的热稳定性、链置换活性及聚合酶活性，被应用于一种等温扩增技术-环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）。LAMP是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在Bst DNA聚合酶大片段的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。
Bst DNA聚合酶大片段在60-70℃时活性最高，但是在温度较低时，活性依然存在，这就会使得在配制LAMP反应体系时，由于引物容易出现引物互搭或引物和模板非特异性配对的现象，在酶的作用下延伸，形成引物二聚体和非特异性产物，这些非特异性产物又可作为模板在以后的反应里继续扩增，这样非特异性产物不断扩增积累，就会严重干扰目的片段的扩增从而导致目的产物扩增效率低，扩增起线时间严重推迟，甚至导致特异性条带不能扩增出；或者出现引物自身的非特异扩增，导致阴性孔有扩增起线，造成假阳性。
为了避免在反应前期过程中产生引物二聚体和非特异性产物，一般会进行热启动修饰，使其在低温封闭酶活性，高温释放恢复酶活性。目前，应用最多的修饰酶的方法是通过抗体修饰和化学修饰，实现热启动形式。但是抗体修饰和化学修饰存在以下问题：一是抗体修饰和化学修饰在高温释放恢复酶活性之后具有不可逆性，不能再在低温封闭酶活性；二是Bst DNA聚合酶大片段应用于LAMP技术一般以65℃的中等温度恒定进行反应，不足以破坏抗体修饰和化学修饰的封闭作用，因此，应用于中等温度反应的Bst DNA聚合酶大片段封闭修饰不能使用抗体修饰和化学修饰。
核酸适配体(Aptamer)是一种经体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)得到的结构化的寡核苷酸序列(RNA或ssDNA)。核酸适配体与抗体功能类似，在低温或室温情况下，当形成的二级结构与酶的活性中心结合后，封闭酶的活性，当温度升高时，核酸适配体变性，与酶解离，从而酶可以发挥活性。
发明内容
本申请的目的在于提供特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体，旨在解决Bst DNA 聚合酶大片段应用于LAMP技术时不能使用抗体修饰和化学修饰进行热启动的问题以及抗体修饰和化学修饰不可重复修饰的问题。
为实现以上目的，本申请第一方面提供特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列选自以下序列：
(a):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCCACACGACTGAAAAGTCGTTCAGTAACGAATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(b):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCAAGCGGGTCGTCGTAGGTCCCGACTCGACGTCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(c):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCGTCTACGGACAGAAACAGTAGTGCCACAAATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(d):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCTCCTGGGGGCTCAGAGGGCTGAAACGATCATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(e):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCTTGCGAGGTTGGGTGGGGGGGTTGCCCGAGTCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(f):与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
优选地，所述核酸适配体的核苷酸序列上的3’端碱基被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化或巯基化。
优选地，所述核酸适配体的核苷酸序列上的5’端碱基结合有生物素、地高辛、荧光物质、放射性物质、纳米发光材料、聚乙二醇、叶酸或酶标记。
本申请第二方面还提供一种温启动DNA聚合酶，包括：Bst DNA聚合酶大片段和如上述的特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体，所述核酸适配体用于调控所述Bst DNA聚合酶大片段的活性；
所述核酸适配体在第一预设温度时结合于所述Bst DNA聚合酶大片段，以抑制所述Bst DNA聚合酶大片段的活性；所述核酸适配体在第二预设温度时脱离所述Bst DNA聚合酶大片段，以恢复所述Bst DNA聚合酶大片段的活性；其中，所述第二预设温度高于所述第一预设温度。
优选地，所述第一预设温度为0℃～30℃，所述第二预设温度为45℃～70℃。
优选地，所述Bst DNA聚合酶大片段来自于嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶的293-878残基。
本申请第三方面还提供一种温启动DNA聚合酶的制备方法，将Bst DNA聚合酶大片段和上述的特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体进行混合孵育，得到所述温启动DNA聚合酶。
优选地，所述Bst DNA聚合酶大片段与所述核酸适配体的混合比例为1U:1pmol~1U:5pmol。
本申请第四方面还提供一种混合酶，包括上述的温启动DNA聚合酶与反转录酶。
本申请第五方面还提供一种试剂盒，包括上述的温启动DNA聚合酶，或上述的混合酶。
优选地，所述试剂盒用于病原体检测、临床疾病诊断、肿瘤基因检测、原位扩增、动物胚胎鉴定、转基因食品检测或环境监测。
本申请第六方面还提供上述的温启动DNA聚合酶，或上述的混合酶，或上述的试剂盒在检测核酸的应用。
优选地，所述核酸为DNA或RNA。
优选地，所述检测的方法包括：环介导等温扩增方法或交叉引物恒温扩增检测方法。
本申请第七方面还提供一种环介导等温扩增方法，使用上述的温启动DNA聚合酶，或上述的混合酶，或上述的试剂盒用于检测核酸。
与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请提供的特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体，该核酸适配体在应用于“温启动”Bst DNA聚合酶大片段时，在第一预设温度时，可以形成二级结构与Bst DNA聚合酶大片段的活性中心结合后，封闭Bst DNA聚合酶大片段的活性，当温度升高到第二预设温度时，核酸适配体变性，与Bst DNA聚合酶大片段解离，从而Bst DNA聚合酶大片段可以恢复活性，当温度再次降低到低温或室温时，核酸适配体复性后可以重新与BstDNA聚合酶大片段封闭，从而抑制它的活性，因此核酸适配体对Bst DNA聚合酶大片段的“温启动”并不仅仅是反应初始前期的的“温启动”，而是整个反应过程中的“温启动”。
并且该核酸适配体在中等温度即可发生变性与Bst DNA聚合酶大片段分离，不需要高温条件，适用于恒温扩增技术。
另外，核酸适配体与抗体相比具有更高的亲和力与特异性，稳定性好；无免疫原性；能够化学合成，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，制作周期短，成本低；可进行标记；定性好，易于保存等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。
图1为引物延伸电泳法检测Bst DNA聚合酶大片段的封闭/恢复活性效果的原理示意图；
图2为未修饰的NEB Bst 2.0 DNA聚合酶大片段在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果图；
图3为未修饰的Biori Bst DNA聚合酶大片段在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果图；
图4为修饰的NEB Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶大片段在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果图；
图5为修饰的Bst-X-1 DNA聚合酶大片段在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果图；
图6为修饰的Bst-X-2 DNA聚合酶大片段在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果图；
图7为修饰的Bst-X-3 DNA聚合酶大片段在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果图；
图8为修饰的Bst-X-4 DNA聚合酶大片段在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果图；
图9为修饰的Bst-X-5 DNA聚合酶大片段在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果图。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK（K为任意数，表示倍数因子）。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
本申请第一方面提供特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体。
其中，Bst DNA聚合酶是来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的DNA聚合酶，具有5'→3'DNA聚合酶活性，也具有5'→3'外切核酸酶活性，可以用于聚合酶链式反应（Polymerase ChainReaction，PCR）；Bst DNA聚合酶为单链肽蛋白，其中Bst DNA聚合酶大片段为Bst DNA聚合酶的C端586个氨基酸，Bst DNA聚合酶大片段具有5'→3'DNA聚合酶活性，但不具有5'→3'外切核酸酶活性，因此，Bst DNA聚合酶的5'→3'DNA聚合酶活性由Bst DNA聚合酶大片段决定，通过封闭Bst DNA聚合酶大片段活性，即可封闭Bst DNA聚合酶的5'→3'DNA聚合酶活性，从而阻止PCR过程的链延伸。
其中，“核酸适配体”是一种经体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichme nt，SELEX)，得到的结构化的寡核苷酸序列(RNA或ssDNA)，与相应的靶标分子(蛋白质，病毒，细菌，细胞，重金属离子等)有严格的识别能力和高度的亲和力。
其中，“SELEX”是核酸适配体的筛选过程。首先是用组合化学合成DNA的方法合成随机序列的核酸库，库中的每一个成员是一个线形的寡聚物，库中分子多样性的程度取决于随机寡核苷酸的长度。理论上讲，一个30个碱基的随机序列可有430种核苷酸排列顺序。筛选过程一般包括几轮筛选，每轮筛选包括3个主要步骤：
(1)寡核苷酸随机序列库和靶标分子孵育；
(2)寡核苷酸/靶标分子复合物和未结合的寡核苷酸分离；
(3)洗脱结合的寡核苷酸序列，采取PCR扩增这些寡核苷酸序列，再进入下轮的筛选过程。
通过重复上述的筛选与扩增循环，那些与靶标分子亲和力较低的序列被洗脱掉，而与靶标分子有强亲和力的Aptamer序列被富集，最后占据序列库的多数。一般经过6-20轮的循环就可以获得特异性的Aptamer。
核酸适配体与其靶物质的结合通常是基于其核酸链的三维结构和本身的柔韧性。在与靶物质结合时，通过核酸链内某些碱基相互之间的互补配对，范德华力，静电作用和氢键作用等，核酸链会折叠形成一些适合靶物质结合的稳定的空间结构，如G-四螺旋，发夹，假结，凸环等。这样形成的核酸适配体与靶分子之间有较大的接触面积，能与靶分子紧密结合，具有高亲和力和高特异性。
核酸适配体与抗体相比具有更高的亲和力与特异性，稳定性好；无免疫原性；能够化学合成，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，制作周期短，成本低；可进行标记；定性好，易于保存等优点。
并且该核酸适配体在中等温度即可发生变性与Bst DNA聚合酶大片段分离，不需要高温条件，适用于恒温扩增技术。
优选地，本申请筛选得到的核酸适配体的核苷酸序列选自以下序列：
(a):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCCACACGACTGAAAAGTCGTTCAGTAACGAATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(b):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCAAGCGGGTCGTCGTAGGTCCCGACTCGACGTCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(c):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCGTCTACGGACAGAAACAGTAGTGCCACAAATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(d):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCTCCTGGGGGCTCAGAGGGCTGAAACGATCATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(e):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCTTGCGAGGTTGGGTGGGGGGGTTGCCCGAGTCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’。
其中，黑体加下划线的碱基序列为构成核酸库的随机寡核苷酸序列，黑体加下划线的碱基序列两端的序列分别为扩增引物。
由上述(a)至(e)所述的核苷酸序列的核酸适配体还可以得到如下序列的核酸适配体：
(f):与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
例如，可以是与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核苷酸序列具有至少85%以上同源性，或至少90%以上同源性，或至少95%以上同源性，或至少96%以上同源性，或至少98%以上同源性，或至少99%以上同源性，或至少99.9%以上同源性的核苷酸序列。
核酸适配体为一段单链的寡聚核苷酸，对其进行修饰简单容易，且不会影响它的生物活性。例如，所述核酸适配体的核苷酸序列上的3’端碱基可以被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化或巯基化修饰。核酸适配体的3’端修饰主要是为了封闭3’端，避免核酸适配体的3’端参与聚合酶作用下的延伸反应。
或者，所述核酸适配体的核苷酸序列上的5’端碱基结合有生物素、地高辛、荧光物质（如FITC等）、放射性物质、纳米发光材料、聚乙二醇、叶酸或酶标记修饰。核酸适配体的5’端标记修饰主要是为了给核酸适配体作为标记信号用于示踪检测。
可以理解，本申请的核酸适配体具有很强的特异性，能够用于与Bst DNA聚合酶大片段活性位点特异性结合，而根据不同的使用环境或条件，可以对本申请的核酸适配体进行各种修饰，以配合具体的信号显示方法或工具，例如巯基标记、氨基标记、放射性同位素标记、荧光素标记、生物素标记、毒素标记和酶标记。需要说明的是，前面提到的各种功能基团标记，其标记的获得或制备方法都是已知的，本申请将这些标记引入到本申请的核酸适配体中，使得核酸适配体具备相应的功能，进而拓展了核酸适配体的应用领域。当然，本申请的核酸适配体也可以不进行以上这些功能基团标记。以上经过修饰后的核苷酸序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可用于与Bst DNA聚合酶大片段活性位点特异性的结合。
本申请第二方面还提供一种温启动DNA聚合酶，包括：Bst DNA聚合酶大片段和如上述的特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体，所述核酸适配体用于调控所述Bst DNA聚合酶大片段的活性；
所述核酸适配体在第一预设温度时结合于所述Bst DNA聚合酶大片段，以抑制所述Bst DNA聚合酶大片段的活性；所述核酸适配体在第二预设温度时脱离所述Bst DNA聚合酶大片段，以恢复所述Bst DNA聚合酶大片段的活性；其中，所述第二预设温度高于所述第一预设温度。
该温启动DNA聚合酶用于等温扩增，Bst DNA聚合酶大片段是等温扩增的核心酶，因为它具有较强的热稳定性、链置换活性和聚合酶活性，能在恒温条件下快速、高效、特异性的扩增模板，无需PCR热变性扩增循环，1小时内完成整个实验。由于等温扩增过程不需要热变性步骤，在中等温度时核酸适配体即可脱离Bst DNA聚合酶大片段，因此该DNA聚合酶定义为“温启动”DNA聚合酶。
本申请提供的特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体在应用于等温扩增过程“温启动”Bst DNA聚合酶大片段时，可以用于制备温启动DNA聚合酶，在第一预设温度时，核酸适配体可以形成二级结构与Bst DNA聚合酶大片段的活性中心结合后，封闭Bst DNA聚合酶大片段的活性，当温度升高到第二预设温度时，核酸适配体变性，与BstDNA聚合酶大片段解离，从而Bst DNA聚合酶大片段可以恢复活性，当温度再次降低到第一预设温度时，核酸适配体复性后可以重新与Bst DNA聚合酶大片段封闭，从而抑制它的活性，因此核酸适配体对Bst DNA聚合酶大片段的“温启动”并不仅仅是反应初始前期的的“温启动”，而是整个LAMP反应过程中的“温启动”。
优选地，所述第一预设温度为0℃～30℃，例如可以为0℃～10℃，或0℃～20℃，或10℃～30℃，或20℃～30℃，更具体的，第一预设温度例如可以为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃；所述第二预设温度为45℃～70℃，例如可以为50℃～70℃，或55℃～70℃，或50℃～60℃，或60℃～70℃。优选地，所述第二预设温度为50℃～65℃，例如可以为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃。
优选地，所述Bst DNA聚合酶大片段来自于嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶的293-878残基。
本申请第三方面还提供一种温启动DNA聚合酶的制备方法，将Bst DNA聚合酶大片段和上述的特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体进行混合孵育，得到所述温启动DNA聚合酶。
具体的，混合均匀后于室温孵育30min以上，然后于-20℃储存。
优选地，所述Bst DNA聚合酶大片段与所述核酸适配体的混合比例为1U:1pmol~1U:5pmol，例如可以为1U:1pmol、1U:2pmol、1U:3pmol、1U:4pmol或1U:5pmol。
本申请第四方面还提供一种混合酶，包括上述的温启动DNA聚合酶与反转录酶。
其中，该混合酶可以是上述的温启动DNA聚合酶与反转录酶的混合，用于恒温扩增检测RNA，即RT-LAMP。
本申请第五方面还提供一种试剂盒，包括上述的温启动DNA聚合酶，或上述的混合酶。
优选地，所述试剂盒用于病原体检测、临床疾病诊断、肿瘤基因检测、原位扩增、动物胚胎鉴定、转基因食品检测或环境监测。
其中，该试剂盒用于环介导等温扩增技术检测DNA时，除了包括上述的温启动DNA聚合酶以外，还可以包括：2X LAMP Premix Buffer，10X Primers，SYBR Green I等试剂。
该试剂盒用于环介导等温扩增技术检测RNA时，除了包括上述的混合酶以外，还可以包括：2X LAMP Premix Buffer，10X Primers，SYBR Green I，辅助蛋白RNA酶抑制剂等试剂。
本申请第六方面还提供上述的温启动DNA聚合酶，或上述的混合酶，或上述的试剂盒在检测核酸的应用。
优选地，所述核酸为DNA或RNA。
优选地，所述检测的方法包括：环介导等温扩增方法或交叉引物恒温扩增检测方法。
其中，温启动DNA聚合酶用于环介导等温扩增方法检测DNA，包括温启动DNA聚合酶与反转录酶的混合酶用于反转录-环介导等温扩增方法检测RNA。
其中，交叉引物恒温扩增检测方法可以利用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶大片段、甜菜碱和交叉引物，在63℃左右条件下进行高效、快速、高特异地扩增靶序列，因此上述温启动DNA聚合酶也适用于该方法检测DNA。
本申请第七方面还提供一种环介导等温扩增方法，使用上述的温启动DNA聚合酶，或上述的混合酶，或上述的试剂盒用于检测核酸。其中，该温启动DNA聚合酶用于检测DNA，该混合酶用于检测RNA。
下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1 Bst DNA聚合酶大片段核酸适配体的筛选
1、寡核苷酸随机序列文库的合成
设计寡核苷酸随机序列文库的扩增引物序列P1：5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-3’；P2：5’-GGGAAAAGCGAATCATACACAAGA-3’。
通过公司合成中间30个碱基随机排布，5’端为扩增引物序列P1，3’端为扩增引物序列P2的寡核苷酸随机序列文库：5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-(N)30-TCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’。
靶标分子：申请人珠海宝锐生物自产的Bst DNA聚合酶大片段：Biori Bst DNA聚合酶，来自于嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶的293-878残基，具有His标签蛋白。
2、Biori Bst DNA聚合酶与寡核苷酸随机序列文库结合筛选
2.1 寡核苷酸随机序列文库与靶蛋白结合
Biori Bst DNA聚合酶与合成的寡核苷酸随机序列文库（约E12/μL）混合加入Binding Buffer补足200ul，4℃过夜，得到靶蛋白/ssDNA复合物体。
2.2 Ni磁珠预处理
将100μLHisPur™ Ni-NTA 磁珠（Thermo Scientific™货号88832，100μL Ni磁珠能结合50μg His标签蛋白）置于漩涡混匀器上充分混匀，进行磁性分离，弃上清液。
加入1 mL Binding Buffer 到上述磁珠中，进行磁性分离，移去上清液。
2.3 靶蛋白/ssDNA复合物体与Ni磁珠结合
（1）将 “靶蛋白与ssDNA过夜结合液”，加入到装有预处理磁珠的冻存管中，混匀。
（2）室温放置混合 30 min（每隔3~5min，漩涡混匀器振荡一次，重悬起磁珠）。
（3）将冻存管置于磁性分离器上进行磁性分离，移去上清液。
2.4 磁珠洗涤
（1）加入1 mL Washing Buffer 到装有磁珠的离心管中，轻轻翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，移去清洗液。重复此步骤 1次。
（2）加入1 mL Washing Buffer 到装有磁珠的离心管，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移到新的离心管（避免原离心管壁上非特异性吸附），磁性分离，移出上清液。
2.5 目标蛋白复合物洗脱
（1）加入100μL Elution Buffer，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品（靶蛋白-ssDNA复合物体）。
（2）重复上述步骤 1次，收集样品到新的离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱完全。
3、洗脱液提取纯化
将2.5得到的靶蛋白-ssDNA复合物体使用生工UNIQ-10 柱式寡聚核苷酸纯化试剂盒进行纯化，合并收集液，即为第一次筛选得到的ssDNA，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或立刻作为模板用于后续次级库扩增。
4、PCR扩增
PCR体系：100µl 体系中含有 10µl 10X 缓冲液，0.2mM dNTPs，0.5µM 上游及下游引物，10nM 模板，2U Taq DNA 聚合酶。扩增总量：400uL PCR体系。
次级库扩增引物：
上游引物F：5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-3’；
下游引物R（5端加阻碍环）：5’-GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCGGGA AAAGCGAATCATACACA-3’。
PCR条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，37℃退火30sec，58℃延伸40sec，扩增30个循环；最后58℃终延伸2min。
5、制备DNA单链次级文库
5.1 PCR产物跑变性7M尿素10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
7M尿素10%变性PAGE胶配制组分如表1所示，根据表1所示的组分制备PAGE胶。
表1 7M尿素10%变性PAGE胶配制组分
Figure P_220802104707086_086860001
400μl PCR产物加入2×变性凝胶加样缓冲液，PCR仪95℃加热10min，瞬时离心后，立即上样电泳。电泳电压为180V，电泳时间约为50min。利用茎环结构下游引物经 PCR 扩增产生了两条长度不等的正、负链产物，Goldview 染色10min，在变性胶上可明显得到分离。
5.2 PAGE胶回收纯化
通过5.1的PAGE电泳将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的胶块切下，使用生工UNIQ-10 柱式PAGE胶DNA回收试剂盒回收纯化目的DNA片段，所得到的DNA溶液即为筛选得到的DNA单链次级库，置于-20℃保存或直接用于后续筛选试验。
6、多轮筛选富集
重复上述步骤2-5，除了第1轮使用合成文库外，后续用次级库作为ssDNA文库开始，经12轮磁珠-SELEX筛选技术筛选出来的结合文库用引物P1(5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-3’)和引物P2(5’-GGGAAAAGCGAATCATACACAAGA-3’)进行扩增，将PCR扩增产物送能够进行适配体结合文库高通量测序的公司进行测序。
对上述的适配体结合文库高通量测序结果进行分析，选取被有效富集的相关序列合成相应的单链DNA，并将被富集的序列用于进行后续对Bst DNA聚合酶大片段酶活影响效果的筛选。
实施例2 通过测定酶活检测核酸适配体修饰Bst DNA聚合酶大片段的效果
实施例1通过SELEX筛选得到的核酸适配体虽然都与Bst DNA聚合酶大片段具有强的亲和力，但是由于本申请的核酸适配体的功能核心在于能够对Bst DNA聚合酶大片段具有热启动效果，因此，本申请所需的核酸适配体需要结合Bst DNA聚合酶大片段的活性位点，那些结合在蛋白其他结合位点的适配体，无论与Bst DNA聚合酶大片段的亲和力有多高也没有用，也不是本申请方案需要的核酸适配体。
因此，对于实施例1合成的被有效富集的单链DNA进行筛选，核酸适配体需要满足两个方面的功能：一是结合封闭Bst DNA聚合酶大片段的活性，二是一定温度下能够释放Bst DNA聚合酶大片段的活性。
将实施例1合成的被富集的核酸适配体分别与Biori Bst DNA聚合酶大片段进行混合孵育，以对Biori Bst DNA聚合酶大片段进行修饰，Biori Bst DNA聚合酶大片段与核酸适配体的混合比例为1U:2pmol。
分别在30℃条件下和65℃条件下，检测没有进行核酸适配体修饰的Biori BstDNA聚合酶大片段（Biori Bst）的酶活，以及使用了核酸适配体修饰的Biori Bst DNA聚合酶大片段（Bst-X-n）的酶活，从而计算核酸适配体在30℃条件下对Biori Bst DNA聚合酶大片段的活性封闭效果，以及65℃条件下对Biori Bst DNA聚合酶大片段的活性恢复效果。BST DNA聚合酶大片段的活性测定参照国标《GB/T 36755-2018 BST DNA聚合酶》检测方法进行。
同时对比检测进口NEB商品Bst“热启动”产品：Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶（货号M0538），和其对应的非“热启动”产品：NEB Bst 2.0 DNA 聚合酶（货 号M0537）。
通过上述酶活实验测定，本申请优选了5条核酸适配体，其对Biori Bst DNA聚合酶大片段的封闭效果和恢复效果均较好，其核苷酸序列分别如下：
(a):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCCACACGACTGAAAAGTCGTTCAGTAACGAATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(b):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCAAGCGGGTCGTCGTAGGTCCCGACTCGACGTCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(c):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCGTCTACGGACAGAAACAGTAGTGCCACAAATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(d):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCTCCTGGGGGCTCAGAGGGCTGAAACGATCATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(e):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCTTGCGAGGTTGGGTGGGGGGGTTGCCCGAGTCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’。
上述五条核酸适配体对Biori Bst DNA聚合酶大片段在30℃活性封闭效果如表2所示，结果显示，a~e核酸适配体修饰后的Biori Bst（依次为Bst-X-1、Bst-X-2、Bst-X-3、Bst-X-4、Bst-X-5）的活性残留百分比均低于进口NEB对照品Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶的活性残留百分比，说明本申请方案的核酸适配体对Bst DNA聚合酶大片段的封闭效果更好。
其中，核酸适配体修饰的Biori Bst DNA聚合酶大片段的活性残留百分比(%)=Bst-X活性（修饰酶活性）/Biori Bst活性（未修饰酶活性）*100；NEB商品Bst“热启动”产品的活性残留百分比(%)=NEB Bst2.0 WarmStart 活性（修饰酶活性）/NEB Bst2.0 活性（未修饰酶活性）*100。
表2 修饰Bst DNA聚合酶在30℃活性封闭效果
Figure P_220802104707149_149370001
Biori Bst DNA聚合酶大片段修饰核酸适配体后在65℃活性恢复效果如表3所示，结果显示，a~e核酸适配体修饰后的Biori Bst（依次为Bst-X-1、Bst-X-2、Bst-X-3、Bst-X-4、Bst-X-5）的活性恢复百分比均高于进口NEB对照品Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶的活性恢复百分比，说明本申请方案的核酸适配体封闭Bst DNA聚合酶大片段后的恢复效果更好。
其中，核酸适配体修饰的Biori Bst DNA聚合酶大片段的活性恢复百分比(%)=Bst-X活性（修饰酶活性）/Biori Bst活性（未修饰酶活性）*100；NEB商品Bst“热启动”产品的活性恢复百分比(%)=NEB Bst2.0 WarmStart 活性（修饰酶活性）/NEB Bst2.0 活性（未修饰酶活性）*100。
表3 修饰Bst DNA聚合酶大片段在65℃活性恢复效果
Figure P_220802104707211_211866001
实施例3 引物延伸电泳法对Bst DNA聚合酶大片段的封闭/恢复活性效果的检测
上述实施例2筛选得到的a~e核酸适配体继续采用引物延伸电泳法检测对适配体对Bst DNA聚合酶大片段的封闭/恢复活性效果，引物延伸电泳法检测原理如图1所示，带FAM荧光修饰的引物Primer，与互补单链模板配对后，在含DNA聚合酶活性的酶（如Bst DNA聚合酶大片段）的条件下，FAM荧光修饰的引物可以延伸至全长模板的长度，最后在尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示长度变大的条带（FL），Bst DNA聚合酶大片段的活性越强，则显示全长条带FL的含量越高；反之，活性越低或无活性，则显示全长条带FL的含量越低或无。
1、测试体系准备
1.1寡核苷酸序列
模板序列（S1-Temp59）：5’-TCTATTACATTCTAAGAGTTAGAGTTAGGGTCTACTCTTGCTATGCGTGGAGTGCTGAA-3’；
引物序列（S1-FAM）：5’-FAM-TTCAGCACTCCACGCATAGC-3’。
S1-Temp59干粉和带荧光标记寡核苷酸序列 S1-FAM 干粉分别按照合成单上的说明使用1×TE（10 mmol/L Tris ，1 mmol/L EDTA，pH 8.5（25℃））稀释到100μmol/L，储存于-20℃，使用时从-20℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀10 s，在微型离心机上离心数秒。
取稀释好的S1-Temp59和S1-FAM 按1:1混合，在95℃下加热 5min，然后以0 .1℃/s的速率冷却至25℃，使得S1-FAM退火到S1-Temp59上，得到检测模板50μmol/L。
2、测试体系反应
按测活结果，把各BstDNA聚合酶大片段用Bst稀释液（10 mmol/L Tris，50 mmol/LKCl，0.1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.1%（体积分数）TtitonX-100，50%（体积分数）甘油，pH 7.4（25℃））稀释到0.05U/μL，该步骤在冰上进行。
聚合反应液的配置体系如表4所示，在微量离心管中按照表4的比例配制聚合反应液（冰上配制），聚合反应液配制完成后在漩涡混匀器涡旋混匀10 s，微型离心机离心数秒。
表4 引物延伸电泳法聚合反应液的配置体系
聚合反应液组分 规格 1 个反应用 量
水 — 15. 6 μL
Bst PCR 缓冲液 1 0 × 2 μL
检测模板 溶液 50 μmol/L 0. 2 μL
dNTP 混合液 25 m m ol/L 0.2μL
各 Bst 酶 0.05U /μL 2 μL
注: 10×Bst PCR缓冲液（200mmol/L Tris，100 mmol/L硫酸铵，10 mmol/L KCl，20mmol/L MgSO4，1%（体积分数）TtitonX-100，pH 8.8（25 ℃））。
聚合反应液的反应条件：样品分别在 30℃ ；40℃； 50℃ ；65℃反应5分钟。
终止反应：反应完成后添加四倍体积的终止缓冲液(99％甲酰胺、0 .1％SDS和20mM EDTA)终止反应。
同时以不加酶的仅含Primer的样品做为空白对照。
3、聚合反应产物凝胶迁移实验
配置12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。
将终止反应的样品在95℃下煮沸5分钟。
白电泳孔点上含溴酚蓝样品缓冲液，其余样品按顺序上样8μL。
使用1×TBE电泳液，电压230V跑胶至样品跑到接近胶底结束。
通过ChampGel 5000成像系统（赛智）上使用紫外条件对引物和全长产物进行拍照，并通过配套的凝胶成像系统分析全长产物的产量占比。
4、实验结果
图2所示为未修饰的NEB Bst 2.0在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果，图3所示为未修饰的Biori Bst在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果，图4所示为修饰的NEB Bst 2.0 WarmStart在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果，图5所示为修饰的Bst-X-1在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果，图6所示为修饰的Bst-X-2在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果，图7所示为修饰的Bst-X-3在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果，图8所示为修饰的Bst-X-4在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果，图9所示为修饰的Bst-X-5在不同温度下的引物延伸电泳法检测结果。其中，图2至图9的上部分为凝胶实验结果，下部分为根据凝胶成像系统分析全长产物的产量占比统计结果，表5为由图2~图9统计得到的活性残留百分比和活性恢复百分比。
表5 引物延伸电泳法检测不同修饰Bst DNA聚合酶大片段的封闭/恢复活性效果
Figure P_220802104707291_291924001
根据表5可知，Bst-X-1到Bst-X-5的封闭效果（30℃活性残留百分比越低，封闭效果越好），均优于NEB对照品Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶（12%）。而Bst-X-1到Bst-X-5的恢复效果（65℃活性恢复百分比越高，恢复效果越好），均能恢复到90%或以上，接近或优于NEB对照品Bst 2.0 WarmStart® DNA 聚合酶（92%）。
实施例3的引物延伸电泳法检测Bst DNA聚合酶大片段的封闭/恢复活性效果的结果与实施例2的通过测定酶活检测核酸适配体修饰Bst DNA聚合酶大片段的封闭/恢复活性效果的结果具有一致性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (15)

1.特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列选自以下序列：
(a):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCCACACGACTGAAAAGTCGTTCAGTAACGAATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(b):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCAAGCGGGTCGTCGTAGGTCCCGACTCGACGTCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(c):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCGTCTACGGACAGAAACAGTAGTGCCACAAATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(d):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCTCCTGGGGGCTCAGAGGGCTGAAACGATCATCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(e):5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGCTTGCGAGGTTGGGTGGGGGGGTTGCCCGAGTCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’；
(f):与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上的3’端碱基被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化或巯基化。
3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上的5’端碱基结合有生物素、地高辛、荧光物质、放射性物质、纳米发光材料、聚乙二醇、叶酸或酶标记。
4.一种温启动DNA聚合酶，其特征在于，包括：Bst DNA聚合酶大片段和如权利要求1至3任一项所述的特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体，所述核酸适配体用于调控所述Bst DNA聚合酶大片段的活性；
所述核酸适配体在第一预设温度时结合于所述Bst DNA聚合酶大片段，以抑制所述BstDNA聚合酶大片段的活性；所述核酸适配体在第二预设温度时脱离所述Bst DNA聚合酶大片段，以恢复所述Bst DNA聚合酶大片段的活性；其中，所述第二预设温度高于所述第一预设温度。
5.根据权利要求4所述的温启动DNA聚合酶，其特征在于，所述第一预设温度为0℃～30℃，所述第二预设温度为45℃～70℃。
6.根据权利要求4所述的温启动DNA聚合酶，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶大片段来自于嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶的293-878残基。
7.一种温启动DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，将Bst DNA聚合酶大片段和权利要求1至3任一项所述的特异性结合Bst DNA聚合酶大片段活性位点的核酸适配体进行混合孵育，得到所述温启动DNA聚合酶。
8.根据权利要求7所述的温启动DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶大片段与所述核酸适配体的混合比例为1U:1pmol~1U：5pmol。
9.一种混合酶，其特征在于，包括权利要求4至6任一项所述的温启动DNA聚合酶与反转录酶。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求4至6任一项所述的温启动DNA聚合酶，或权利要求9所述的混合酶。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于病原体检测、临床疾病诊断、肿瘤基因检测、原位扩增、动物胚胎鉴定、转基因食品检测或环境监测。
12.如权利要求4至6任一项所述的温启动DNA聚合酶，或权利要求9所述的混合酶，或权利要求10至11任一项所述的试剂盒在检测核酸的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述核酸为DNA或RNA。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述检测的方法包括：环介导等温扩增方法或交叉引物恒温扩增检测方法。
15.一种环介导等温扩增方法，其特征在于，使用权利要求4至6任一项所述的温启动DNA聚合酶，或权利要求9所述的混合酶，或权利要求10至11任一项所述的试剂盒用于检测核酸。
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