CN114364813B

CN114364813B - 多重等温扩增核酸序列的方法

Info

Publication number: CN114364813B
Application number: CN202080063161.9A
Authority: CN
Inventors: 托比·奥斯特
Original assignee: Dnae Diagnostics Ltd
Current assignee: Dnae Diagnostics Ltd
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2040-08-07
Also published as: EP4010493A1; CA3148587A1; US20230183792A1; WO2021028665A1; JP2022544217A; CN114364813A; GB201911421D0

Abstract

本申请公开了一种用于等温扩增核酸分子的方法，所述核酸分子任选地在固体支持物上。该方法使用在3'端和5'端两者处都具有共用/通用发夹区域的单链核酸或其延伸产物。

Description

多重等温扩增核酸序列的方法

技术领域

本申请公开了一种用于等温扩增核酸的方法。本申请公开了允许能够在溶液中或固体支持物上进行环介导扩增的形式的构建体、方法和试剂盒。

背景技术

环辅助等温扩增(LAMP)是Notomi等人在2000年首次报道的技术(Nucleic AcidsRes.2000；28(12):E63)，并且是一种快速且有效的用于等温扩增核酸方法。该技术采用链置换DNA聚合酶(通常为Bst聚合酶)和设计用于靶模板DNA的六个不同区域的一组4个特异性寡核苷酸引物，并且该技术通常能够可靠地在短反应时间内(例如，在65℃约60分钟)将低模板输入量扩增为约10⁹拷贝。

LAMP由于其敏感性、特异性和得到结果的时间迅速而被用作多种感染和疾病的许多诊断分析的基础。等温方法意味着它可以在现场使用而不需要复杂的热循环设备，因此它理想地适合于即时(point-of-care)应用。

用于下一代核酸测序的方法可以包括大量序列的平行扩增。通常在固体支持物或珠粒群上进行扩增，使得不同序列的链在物理分离的情况下扩增，即所谓的克隆扩增。

LAMP具有使其作为克隆扩增方法有吸引力的几个特征，即：

高扩增速度；尽可能快地生成输入模板的多份拷贝至关重要。每个亲代模板分子的绝对拷贝数也是使检测信号最大化的关键。

等温过程；这简化了工作流程和组分的层析能力(cartridge-ability)。不需要复杂的热循环硬件以运行测定。

高保真度；确保扩增产生多种特征，当测序时，这些特征尽可能显示出起始模板的同一性。

低复杂度反应；支持扩增所需的反应组分很少，确保了稳定和可再现的性能。

商品成本低；该方法的实施廉价。

然而，常规LAMP具有使其作为克隆扩增方法不具有吸引力的几个缺点，即：

在单管反应中难以使样品和基因座多重化，并且这是复杂的；由于每个扩增子都需要一组独特的4个引物，LAMP反应通常限于单重或双重测定。增加单个反应的重数增加了错误引发和脱靶扩增的风险。多重常规LAMP的唯一其他可行地方式是平行进行多个不同的单重反应。

通常，通过实时法或终点法(通常为浊度或随扩增而增加的荧光)检测LAMP扩增的进程或LAMP反应的产物。虽然LAMP产物由于其低多重能力和其在低成本分析中的典型应用而适合于DNA测序技术，但是它们与DNA测序组合的应用限于确认正确扩增，而不使用DNA测序本身作为诊断读出。

LAMP扩增的产物是由本专利模板链的几个反向重复多联体拷贝形成的高分子量结构体。根据反应条件，这些结构体可以是线性的，或更复杂的、分支的、花椰菜样的结构体。

虽然存在多种LAMP扩增检测方法，但是这些方法倾向于依赖于实时或终点溶液扩增产物的检测。迄今为止没有报道使用LAMP以产生表面结合的等温扩增。

本发明的发明人设计了能够在溶液中和在固体支持物上这两种情况中进行环介导扩增的方法。

发明内容

本发明人已经开发了改进的等温扩增方法。该方法在溶液中和在表面上的两种情况中都起作用，从而使其适合作为克隆扩增方法，并且在这样做时保留了许多有益特征，并且补救了在溶液-LAMP等温扩增中遇到的许多不利特征。

该方法依赖于工程化以在3'端和5'端这两者上都包括发夹区域的单链核酸分子。发夹的3'端能够进行聚合酶延伸，从而产生具有一个为“开放”钝端的末端的双链物质，该末端通过中央发夹连接。因此，在完全变性的条件下扩增的物质是单链分子，其具有通过中央衔接头以及还在5'端和3'端的衔接头连接在一起的正义链和反义链这两者，在末端的衔接头互补。

当为双链形式时，3'端为钝端，因此没有模板。当为单链形式时，末端自互补，因此可以自引发。使用与中央环杂交的引物进行扩增，从而延伸半条链。因此第一引物延伸产生了具有一半双链和一半单链的物质。单链3'端可以自引发，从而产生复制双链产物的分子。双链多联体的一端也是“开放”钝端，该钝端由中央发夹连接，也具有中央已知的双链衔接头区域。

引物与中央环的杂交及其延伸再次产生这样的分子，其中一半链是单链，并且一半是双链。单链区域的3'端可以再次自退火并延伸。以这种方式，使用与单链环互补的引物和释放的3'端的自延伸，可以实现多联体扩增。对于每个“循环”，由于置换链可以产生整条链的拷贝，因此由聚合酶产生3'端的分子的长度有效地加倍。

如本文所述，通过将一种引物固定在固体支持物上，可以实现克隆扩增。

附图说明

图1示出一般性LAMPlate结构。该分子具有单链中央区段，其两侧为位于3'端和5'端这两者上的发夹。3'端可以延伸以得到图4所示的构建体。延伸可以是扩增的起始阶段，或者可以作为单独的“预扩增”步骤进行。

图2示出如何仅通过将LP1和LP2衔接头同时连接到单链模板分子上从而产生LAMPlate。

图3示出如何通过使用具有5'茎环结构的基因座特异性PCR引物经PCR产生LAMPlate。

图4示出从内部3'端进行分子内自引发延伸后的LAMPlate。延伸经链置换打开发夹，以到达序列的5'端，而不需要任何其他引物。延伸可以是扩增的起始阶段，使得使用图1的构建体引发扩增，或者可以作为单独的“预扩增”步骤进行，在这种情况下，经扩增的物质如图4所示。

图5示出从与内部单链环杂交的第一引物(引物LP1，与LP1杂交)的延伸。延伸后，分子是半单链和半双链。置换的3'端具有可自引发的发夹茎(LP2')，从而产生多联体并置换延伸引物。经置换的延伸引物也具有可自引发的自互补端，LP2'亦是如此。因此，第一引物产生双链模板的“单”拷贝和双拷贝，“单”拷贝和双拷贝各自具有钝端和闭环端(LP2')。两个中央环是相同序列的单链区域。

图6示出从与新形成的内部单链环杂交的第二引物(引物P2，与LP2'杂交)的延伸。引物延伸后，分子仍然是半单链和半双链。经置换的3'端具有可自引发的发夹茎(仍然是LP2')，从而产生多联体并置换延伸引物。经置换的延伸引物也具有可自引发的自互补端。因此，第一引物产生双链模板的“单”拷贝和双拷贝，“单”拷贝和双拷贝各自具有钝端和闭环端(LP2')。两个中央环都是相同序列(LP2')的单链区域，该环具有与来自扩增的第一阶段的环相同的序列。P2引物可重复杂交和延伸，从而产生长度增加的多个拷贝。

图7至图9示出与图4相当的结果，仅用固定化扩增引物LP1。LAMPlate的自引发3'端和固定化引物的3'端这两者都可进行延伸。延伸的物质采取双链区段和单链区段的形式(图7)。单链区段具有自引发3'端，该自引发3'端可以进行延伸，从而将其自身从固体支持物移至溶液中(图8)。经置换的物质是“死的”，并且在支持物上没有互补引物。然而，置换释放了固定化产物的3'端，该3'端可以自引发并延伸以使固定化物质完全双链化而远离中央环(图9)。

图10至图12示出使用与固定化环杂交的液相引物的置换。与环杂交的引物可以延伸，从而置换固定化分子的3'端。经置换的3'端可以自引发从而延伸。然而，经置换的3'端也释放与固定化引物互补的游离单链环。该环可与定位引物杂交，从而延伸其自身的定位拷贝(图10)。与溶液中的单环和双环类似，表面上的每个扩增子目前都具有位于固定化核酸的长度范围内的单环和双环(图11)。来自未固定化引物的延伸产物可以在溶液中形成双链分子。固定化引物LP1可与环杂交，从而使进一步的扩增在空间上位于固定化模板的范围内。因此，链可以局部扩增。

图13：非变性琼脂糖凝胶图像示出INS01 LAMPlate连接产物，可由仅衔接头、单衔接-INS01和双衔接-INS01清楚地观察到分子量移动趋势。泳道(Lane)1和13为分子量梯带。泳道2为仅有插入物。泳道3至6为两种设计(v1和v2)和两种浓度(L3、L4，每个衔接头280pmol或L5、L6，每个衔接头660pmol)的衔接头对LP1和LP2。泳道7至10为单衔接头连接。泳道11至12为v1和v2衔接头设计的完全连接。

图14：非变性琼脂糖凝胶图像示出使用环状PCR引物的5个单独的基因座特异性PhiX-174 PCR扩增子，清晰的条带示出了预期分子量的产物的扩增。泳道1和7为分子量梯带。泳道2至6为区域LAMP_PhiX_01-05的扩增子。PCR_F和PCR_R引物的5'环在插入物长度上额外增加了103nt，因此预期的分子量移动超过预期的扩增子插入物长度。

图15：非变性琼脂糖凝胶图像示出LAMP扩增DNA的典型条带的图案。分子量增加的条带的梯带与该方法的串联重复多联体扩增指标一致。泳道1和6为分子量梯带。泳道2至3和4至5为分别以1E8和1E10拷贝通过全长超聚物LAMPlate LAMP_T01_v1的溶液LAMP扩增产生的LAMPlicon。

图16：通过连接制备单LAMPlate的溶液LAMP扩增

非变性琼脂糖凝胶图像示出各种单LAMPlicon构建体的LAMP扩增的典型条带的图案。凝胶清楚地示出了扩增的特异性。只有完全双连接的LAMPlate支持扩增。认为v1衔接头设计优于v2设计。泳道1、15为分子量梯带。泳道2为进行溶液LAMP扩增反应的仅SHRK_INS01插入物。泳道3、4为进行溶液LAMP扩增反应的衔接头对(分别为v1和v2)。泳道5、6为进行溶液LAMP扩增反应的v1-单衔接插入物。泳道7、8为进行溶液LAMP扩增反应的v2-单衔接插入物。泳道9、10为进行溶液LAMP扩增反应的完全双衔接LAMPlate(分别为v1和v2)。泳道11、12为进行溶液LAMP扩增反应的完全双衔接LAMPlate(分别为v1和v2)的无连接酶对照。泳道13、14为使用错误溶液引物(分别为v2和v1引物)进行溶液LAMP扩增反应的完全双衔接LAMPlate(分别为v1和v2)。

图17：通过连接制备单LAMPlate的溶液LAMP扩增

非变性琼脂糖凝胶图像示出具有各种构建体的LAMP扩增DNA的典型条带的图案。凝胶清楚地示出了扩增的特异性。只有完全双连接的LAMPlate支持扩增。泳道1、18、19和30为分子量梯带。泳道2至8、20至21为进行溶液LAMP扩增反应的仅ssDNA插入物。泳道9至16为进行溶液LAMP扩增反应的7重连接产生的LAMPlate池(1E7、1E8和1E9拷贝输入)的一系列稀释物。泳道22、23为进行溶液LAMP扩增反应的仅衔接头。泳道24、25为进行溶液LAMP扩增反应的LP1-单衔接插入物(分别为插入物SBL_T01和SBL-T02)。泳道26、27为进行溶液LAMP扩增反应的LP2-单衔接插入物(分别为插入物SBL_T01和SBL-T02)。泳道28、29为进行溶液LAMP扩增反应的无连接酶对照(分别为插入物SBL_T01和SBL-T02)。

具体实施方式

将发夹环(称为LP1和LP2)添加到靶模板DNA片段的末端以产生能够支持LAMP扩增的文库分子，因此称为“LAMPlate”。图1给出了一般性LAMPlate结构。这对发夹衔接头对于给定池中的全部LAMPlate文库分子可以相同，因此为通用衔接头。这种特征使得池中的全部文库分子都能够被查询，并用对这些通用发夹衔接头具有特异性的一组常见引物进行扩增，而不管插入序列情况如何。本发明的这一方面提供了在一锅法反应中原位扩增的高倍多重的LAMPlate分子的途径，这是用标准等温LAMP扩增难以实现或不可能实现的。

通用衔接头的DNA序列具有平台特异性，并且可以容易地定制以适合需要。唯一的限制是各衔接头的茎区域需要为互补DNA双链体，而环区域需要连接茎的两个臂并具有与茎不同的序列以防止错误杂交。茎臂的长度和GC含量可能对于分子内发夹环的有效形成以及因此所得扩增的效率而言是关键的。茎臂的长度可在15bp长和30bp长之间，并且Tm可在45℃至55℃的范围内。

环的长度和GC含量可能对于实现扩增引物的有效杂交以及因此所得扩增的效率和特异性是关键的。环的长度可在15bp长和30bp长之间，并且Tm(当与其互补扩增引物退火时)可在55℃至65℃的范围内。需要LP1和LP2发夹衔接头的DNA序列彼此足够不同，以促进所得LAMPlate扩增的特异性和效率。预期该对衔接头将向靶插入物添加约90nt至180nt的序列。

茎双链体可被设计为编码一个或多个限制性或切口核酸内切酶基序，该基序可用于扩增LAMPlate的扩增后加工。

不期望可衔接的插入物的长度受到限制，但对于实际目的而言，50个至200个核苷酸大小的插入物对于LAMPlate扩增效率而言可为最佳的，并且不可能需要大于1000个核苷酸的插入物。

LAMPlate可仅通过将LP1和LP2衔接头同时连接到单链模板分子而产生(图2)，或通过使用具有5'茎环结构的基因座特异性PCR引物经由PCR产生(图3)。

模板适合于扩增，其形成多联体。使用链置换聚合酶进行扩增。发夹茎自互补，使得当由聚合酶置换成为单链时，释放的单链3'端可以自退火并延伸。因此，可以使用拷贝分子作为其自身的模板从而有效地进行扩增。

本申请公开了长度为至少50个核苷酸的单链核酸分子(ss1)的群体，其中该单链具有不同序列且该单链各自具有在3'端的共用发夹区域(LP1)和在5'端的共用发夹区域(LP2)，其中各发夹具有长度在15个碱基对至30个碱基对之间的杂交茎臂，该茎臂的Tm在45℃至55℃的范围内。

单链核酸源可为基因组多核苷酸。源材料可以是真核的、原核的或古细菌的。可以提供一种或多种源材料。核酸源可以代表基因组的片段；例如，单个染色体或单个基因组基因座(例如，用于等位基因多态性的快速测序)。在特定的实施例中，扩增可以对样品中的致病物质具有特异性。例如，扩增可以选择存在于人类样本中的细菌或病毒的核酸。模板可为DNA、RNA或它们的cDNA拷贝。

病毒核酸可以源自冠状病毒。冠状病毒是一组在哺乳动物和鸟类中引发疾病的相关的RNA病毒。冠状病毒引起呼吸道感染，例如普通感冒、严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)，也称为COVID-19。

SARS-CoV-2是造成COVID-19全球流行的冠状病毒株，它是正义单链RNA病毒。各SARS-CoV-2病毒的直径为50纳米至200纳米，其具有被称为刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核壳蛋白(N)的四种结构蛋白。N蛋白具有RNA基因组，并且S、E和M蛋白一起产生病毒包膜。

因此，在一个实施方案中，扩增可以选择编码SARS-CoV-2的各结构蛋白的一种或以上病毒核酸。

在一个实施方案中，扩增可以选择一种或以上核酸，所述核酸的存在表明在宿主中有活性SARS-CoV-2感染。在一个实施方案中，扩增可以选择一种或以上核酸，所述核酸的存在表明在宿主中先前有SARS-CoV-2感染。这些核酸可以是由宿主产生的作为对SARS-CoV-2感染的免疫应答的一部分的核酸。

在一个实施方案中，各单链核酸分子(ss1)在茎臂之间具有单链环(L)，环的长度为15个至30个核苷酸，并且当与互补引物退火时，Tm的范围为55℃至65℃。

在一个实施方案中，单链核酸分子的长度为50个至200个核苷酸。在一个实施方案中，单链核酸分子的长度为100个至200个核苷酸。

在一个实施方案中，群体的单链核酸分子的总长度在190至380之间，并且在低于45℃的温度，3'端和5'端具有15个至30个碱基对的双链序列。

本申请公开了用于多联体扩增多个核酸序列的方法，其包括获取根据本发明的前述实施方案中的任一项所述的核酸分子的群体和包含链置换聚合酶、核苷酸单体和扩增引物的反应混合物，其中扩增引物中的至少一者(P1')与LP1的环(L)的至少一部分互补，并且扩增引物中的一者(P2)包括与LP2(LP2')的环的拷贝的至少一部分相同的序列。

本申请公开了一种用于多联体扩增多种核酸序列的方法，包括，

a)取长度为至少50个核苷酸的不同单链核酸分子(ss1)的群体，其中单链具有不同序列，并且单链各自具有在3'端的共用发夹区域(LP1)和在5'端的共用发夹区域(LP2)，其中各发夹具有长度在15个碱基对和30个碱基对之间的杂交茎臂，茎臂的Tm范围为45℃至55℃；以及

b)使用包含链置换聚合酶、核苷酸单体和扩增引物的反应混合物扩增不同单链核酸分子(ss1)的群体，其中扩增引物中的至少一者(P1')与LP1的环(L)的至少一部分互补，并且扩增引物中的一者(P2)包括与LP2(LP2')的环的拷贝的至少一部分相同的序列。

在该方法的一个实施方案中，将茎臂的3'端延伸以产生长度为至少50个核苷酸的单链核酸分子的完整拷贝(ss1')和序列LP2的完整拷贝(称为LP2')。延伸可为扩增反应的起始部分。可供选择地，可以将茎臂的3'端延伸以产生长度为至少50个核苷酸的单链核酸分子的完整拷贝(ss1')和序列LP2的完整拷贝(称为LP2')，然后将延伸的分子置于扩增反应混合物中。

在该方法的其他实施方案中，P1'与LP1的环杂交并延伸以进行链置换，从而分离LP2和LP2'。链置换产生ss'和LP2'的互补拷贝(即，ss的复制品和LP2的复制品)。

在该方法的其他实施方案中，LP2'的末端的茎臂可以自引发以延伸并产生全部ss1'、LP1、ss1和LP2的完整拷贝。

在该方法的其他实施方案中，扩增引物P2与LP2'的环杂交，并延伸以置换全部ss1'、LP1、ss1和LP2。

在该方法的其他实施方案中，释放的末端LP2'可以重复自引发以拷贝多联体ss1'、LP1和ss1。

在该方法的其他实施方案中，扩增引物P1附接到固体支持物。

在该方法的其他实施方案中，扩增引物P2处于溶液中。

可以想到，扩增方法可用于产生表面结合的扩增产物，特别是根据图7至图12所示的方案的克隆表面结合的扩增产物。

将其序列与LAMPlate的LP1环互补的DNA寡核苷酸引物(称为LP1RC)固定至固体支持物(例如，载玻片、芯片或珠粒的表面)。该功能化表面可以在包含稀浓度(例如1pM至1000pM)的LAMPlate溶液的存在下，在合适的杂交缓冲液中，在特定温度下孵育特定时间。这使得LAMPlate通过与单链LAMPlate LP1环区域互补的序列退火至固定化引物。这种方法可称为“LAMPlate接种”。

一旦接种，就可洗掉过量的LAMPlate，仅留下原位表面引物杂交的分子。在适当的反应缓冲液中添加链置换DNA聚合酶(例如Bst或Phi29聚合酶)和dNTP将使得从LAMPlate的游离-3'端延伸，同时从与LAMPlate环LP1杂交的表面引物的游离-3'端延伸。这种表面引物延伸引起延伸的LAMPlate双链体链的置换，从而形成部分为单链且部分为双链的分子，其通过较短链的5'端固定。

因此，LAMPlate的延伸3'端为单链，并能够自引发。自引发端可延伸以产生完整拷贝，并且在此过程中将其自身从固定化链上置换。由此置换到本体溶液中的物质除了单个环之外都是完全自互补的，该环具有与杂交到表面的环不同的序列，因此本体溶液中的物质在扩增中不起进一步的作用。

这种置换引起在固定化拷贝的3'端处的分子内LP2'环的自发再形成，这可以自引发并延伸以产生具有远离表面的LP2'发夹的表面结合双链体。因此，固定化物质除了一个内部环LP2'之外，大部分是双链。

任选地，为了除去置换出的物质，可以在这时改变流体试剂，从而防止这种物质的任何进一步扩增，这种物质的扩增会污染扩增过程或仅消耗扩增试剂。

表面上的扩增需要与固定化单链环互补的未固定化引物(即与LP2'杂交的引物)。与固定化双链体产物的LP2'环互补的溶液寡核苷酸引物(称为LP2)可与LP2'环退火并延伸。这种LP2-引物延伸产生一半固定化双链体的可靠拷贝，同时置换与拷贝链互补的链的3'端。置换的3'端自发地重新形成LP1分子内发夹，其能够自引发并通过单链环与固定化引物LP1RC的其他拷贝杂交。因此，两个新的可延伸3'端是可用的。

一条链从一个拷贝到相邻表面引物的桥接从而形成新的增殖性相互作用的过程称为“模板步移”。随后以及同时从杂交的LP1环的游离-3'端和从步移模板链的LP1环和第二LP1RC表面引物之间新形成的双链体的游离-3'端进行双延伸，使得能够通过延伸、链置换和自引发的互补延伸产生两个表面固定化发夹双链体。第一双链体是具有远离表面的LP1环的起始LAMPlate的双多联体(即ss和ss'的四个连续双链集合)，并且第二双链体是具有远离表面的发夹环LP1和单个多联体的双链体(即ss和ss'的两个重复序列)(示于图12)。

现在两个固定化双链体都具有与LP1RC表面引物互补的单链环。因此，表面引物可与固定化链的中央部分杂交。延伸置换了具有环LP1的固定化3'端。LP1的重新形成产生了自身引物端和环，其可以被固定至引物LP1RC的其他拷贝。这形成了两个新的可延伸的3'端，一个是自引发的，并且一个是在固定化引物上。因此，扩增通过与支持物杂交的循环而自身持续，从而引起置换和自引发延伸。

引物杂交、延伸、置换和模板步移的这种连续过程在扩增反应的持续时间内持续进行，或者直到反应中的试剂被消耗完为止，以先发生者为准。这些扩增和模板步移循环的产物是产生的原始接种的LAMPlate的多个可靠的表面结合的拷贝，作为空间上与原始接种的LAMPlate紧密接近的分子内多联体重复双链体。多个此类紧密接近的可靠双链体拷贝可称为克隆、或簇或集落，因此接种的LAMPlate的原始单链部分可称为已经被“克隆扩增”。

本申请还公开了一种方法，其中确定是否存在核酸扩增产物、或确定核酸扩增产物的序列。

本申请还公开了一种用于扩增多个核酸序列的装置，包括具有固定化扩增引物的固体支持物，该固定化扩增引物与本文所述的核酸分子的群体杂交。

本申请还公开了一种用于扩增多种核酸序列的试剂盒，包括，

a.第一发夹衔接头，其具有长度在15个碱基对和30个碱基对之间的杂交茎臂，茎臂的Tm范围为45℃至55℃，并且单链环(L)处于茎臂之间，环的长度为15个至30个核苷酸，并且当与互补引物退火时Tm的范围为55℃至65℃；

b.第二发夹衔接头，其具有长度在15个碱基对和30个碱基对之间的杂交茎臂，茎臂的Tm范围为45℃至55℃，并且单链环(L)处于茎臂之间，环的长度为15个至30个核苷酸，并且当与互补引物退火时Tm的范围为55℃至65℃；

c.具有固定化扩增引物的固体支持物，其中引物与第一发夹衔接头的环L的至少一部分互补；以及

d.核酸聚合酶和核苷三磷酸。

方法

通过连接制备LAMPlate(A69_SBLAMP_E001)

材料

-LP1寡核苷酸(LAMP_LP1_v1)

-LP2寡核苷酸(LAMP_LP2_v1)

-模板寡核苷酸(INS01)

-T4 DNA连接酶2000U/uL(NEB，M0202T)

-Zymo寡核苷酸净化和浓缩纯化柱

-EB缓冲液(10mM Tris.HCl pH 8.0)

寡核苷酸序列

方法

通常，通过将LP1和LP2衔接头寡核苷酸以等摩尔比(各衔接头为280pmol)与模板寡核苷酸INS01(130pmol)在1X连接缓冲液中混合从而进行连接反应。通过涡旋使反应物短暂混合。所得的寡核苷酸在95℃热变性3分钟，然后在热循环仪上用缓慢冷却斜坡退火(以-0.1℃/sec退火至15℃)。通过添加2000U T4 DNA连接酶(1uL的2000U/uL T4连接酶储液)引发连接反应，短暂涡旋从而混合，然后在15℃孵育30分钟。通过在75℃持续5分钟的热杀法灭活连接酶，并用使用Zymo寡核苷酸净化和浓缩物旋转柱纯化。最后在EB缓冲液中洗脱。样品在3％TBE琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶红染色以可视化。

图13文字说明

非变性琼脂糖凝胶图像示出INS01 LAMPlate连接产物，可由仅衔接头、单衔接-INS01和双衔接-INS01清楚地观察到分子量移动趋势。泳道1和13为分子量梯带。泳道2为仅有插入物。泳道3至6为两种设计(v1和v2)和两种浓度(L3、L4，每个衔接头280pmol或L5、L6，每个衔接头660pmol)的衔接头对LP1和LP2。泳道7至10为单衔接头连接。泳道11至12为v1和v2衔接头设计的完全连接。

通过环状PCR制备LAMPlate(A69_SBLAMP_E022)

材料

-环状PCR_F引物

-环状PCR_R引物

-模板基因组DNA(噬菌体PhiX-174，NEB，N3022L)

-PCR缓冲液(5X缓冲液组分，Thermo F122S)

-Phire II HS DNA聚合酶(聚合酶组分，Thermo F122S)

-10mM dNTP混合物

-Qiagen PCR纯化柱

-EB缓冲液(10mM Tris.HCl pH 8.0)

寡核苷酸

方法

使用SBL_PHIX PCR引物对为各PhiX扩增子制备单独的PCR扩增反应物质。由1XPhire PCR缓冲液中的10ng PhiX-174基因组DNA、各为20pmol的PCR_F和PCR_R引物、10nmol的dNTP混合物、1uL的Phire II HS DNA聚合酶组成各50uL PCR反应物质。反应混合物在98℃变性2分钟，然后进行25个依次的变性循环(95℃持续30秒)、退火(60℃持续20秒)以及延伸(72℃持续20秒)。使用Qiagen PCR净化柱纯化扩增子，并且最后在EB缓冲液中洗脱。样品在3％TBE琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶红染色以可视化。

图14文字说明

非变性琼脂糖凝胶图像示出使用环状PCR引物的5个单独的基因座特异性PhiX-174PCR扩增子，清晰的条带示出了预期分子量的产物的扩增。泳道1和7为分子量梯带。泳道2至6为区域LAMP_PhiX_01-05的扩增子。PCR_F和PCR_R引物的5'环在插入物长度上额外增加了103nt，因此预期的分子量移动超过预期的扩增子插入物长度。

使用全长超聚物LAMPlate寡核苷酸的溶液进行LAMP扩增

材料

-LAMPlate超聚物模板寡核苷酸(LAMP_T01_v1)

-溶液LAMP扩增引物(LP1rc_v1和LP2_v1)

-热启动LAMP扩增试剂盒(NEB，E1700S)

-Zymo寡核苷酸净化和浓缩纯化柱

-EB缓冲液(10mM Tris.HCl pH 8.0)

寡核苷酸

方法

通过用超聚物LAMPlate LAMP_T01_v1(0.25fmol至2.5fmol)、LAMP引物LP1rc_INV_v1(230pmol)和LP2_INV_v1(230pmol)、以及超纯水(MilliQ water)稀释12.5uL的2XLAMP主混合物(包含缓冲液、Bst2.0热启动DNA聚合酶和dNTP)从而制备示例性25uL溶液LAMP扩增反应物质。通过加热至65℃并将反应物质孵育60分钟从而引发反应。通过添加3uL500mM EDTA终止反应，或者直接通过Qiagen PCR净化柱纯化。样品在3％TBE琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶红染色以可视化。

图15文字说明

非变性琼脂糖凝胶图像示出LAMP扩增DNA的典型条带的图案。分子量增加的条带的梯带与该方法的串联重复多联体扩增指标一致。泳道1和6为分子量梯带。泳道2至3和4至5为分别以1E8和1E10拷贝通过全长超聚物LAMPlate LAMP_T01_v1的溶液LAMP扩增产生的LAMPlicon。

使用单连接制备的LAMPlate的溶液LAMP扩增

材料

-经纯化连接制备的LAMPlate(SHRK_INS01)

-LAMP衔接头(LP1_v1、LP2_v1、LP1_v2和LP2_v2)

-溶液LAMP扩增引物(LP1rc_v1、LP2_v1、LP1rc_v2和LP2_v2)

-热启动LAMP扩增试剂盒(NEB，E1700S)

-Zymo寡核苷酸净化和浓缩纯化柱

-EB缓冲液(10mM Tris.HCl pH 8.0)

寡核苷酸

方法

通过具有单独的经连接制备的LAMPlate(如实施例1所述，使用v1或v2衔接头设计以及插入物SHRK_INS01)、LAMP引物LP1rc_INV_v*(230pmol、*＝v1或v2)和LP2_INV_v*(230pmol、*＝v1或v2)、以及超纯水稀释12.5uL的2X LAMP主混合物(包含缓冲液、Bst2.0热启动DNA聚合酶和dNTP)，从而制备示例性25uL溶液LAMP扩增反应物质。如图4所示测试一系列条件。通过加热至65℃并将反应物质孵育60分钟从而引发反应。通过添加3uL 500mMEDTA终止反应，或直接通过Qiagen PCR净化柱纯化。样品在3％TBE琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶红染色以可视化。

图16文字说明：通过连接制备单LAMPlate的溶液LAMP扩增

非变性琼脂糖凝胶图像示出各种单LAMPlicon构建体的LAMP扩增的典型条带的图案。凝胶清楚地示出了扩增的特异性。只有完全双连接的LAMPlate支持扩增。认为v1衔接头设计似乎优于v2设计。泳道1、15为分子量梯带。泳道2为进行溶液LAMP扩增反应的仅SHRK_INS01插入物。泳道3、4为进行溶液LAMP扩增反应的衔接头对(分别为v1和v2)。泳道5、6为进行溶液LAMP扩增反应的v1-单衔接插入物。泳道7、8为进行溶液LAMP扩增反应的v2-单衔接插入物。泳道9、10为进行溶液LAMP扩增反应的完全双衔接LAMPlate(分别为v1和v2)。泳道11、12为进行溶液LAMP扩增反应的完全双衔接LAMPlate(分别为v1和v2)的无连接酶对照。泳道13、14为使用错误溶液引物(分别为v2和v1引物)进行溶液LAMP扩增反应的完全双衔接LAMPlate(分别为v1和v2)。

使用多个连接制备的LAMPlate的池的溶液LAMP扩增

材料

-LAMPlate插入物(SBL_T01-7)

-LAMP衔接头(LP1_v1和LP2_v1)

-溶液LAMP扩增引物(LP1rc_v1和LP2_v1)

-热启动LAMP扩增试剂盒(NEB，E1700S)

-Qiagen PCR纯化柱

-EB缓冲液(10mM Tris.HCl pH 8.0)

寡核苷酸

方法

通过具有连接制备的LAMPlate池(如实施例1所述，使用LP1_v1和LP2_v1衔接头和全部七个插入物SBL_T01-7的池)、LAMP引物LP1rc_INV_v1(230pmol)和LP2_INV_v1(230pmol)、以及超纯水稀释12.5uL的2X LAMP主混合物(包含缓冲液、Bst2.0热启动DNA聚合酶和dNTP)，从而制备示例性25uL溶液LAMP扩增反应物质。如图4所示测试一系列条件。通过加热至65℃并将反应物质孵育60分钟从而引发反应。通过添加3uL 500mM EDTA终止反应，或直接通过Qiagen PCR净化柱纯化。样品在3％TBE琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶红染色以可视化。

图17文字说明：通过连接制备单LAMPlate的溶液LAMP扩增

SEQUENCE LISTING

<110> DNAE诊断有限公司

<120> 多重等温扩增核酸序列的方法

<130> P31183WO1

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> LAMP_LP1_v1

<220>

<223> 处于位置1的T具有处于位置5的PO4

<400> 1

tccagttatc tcgtatgccg tcttctgctt gaactggatc tataag 46

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> LAMP_LP2_v1

<400> 2

gactcctcag ctagcgaatg atacggcgac caccgacgct agct 44

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> LAMP_LP1_v2

<220>

<223> 处于位置1的T具有处于位置5的PO4

<400> 3

tccagttttc agaggatcta gtcggcaact ggatctataa g 41

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> LAMP_LP2_v2

<400> 4

gactcctcag ctagcgcttg gcttcattgt ggtccgctag ct 42

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> SHRK_INS01

<220>

<223> 处于位置1的G具有处于位置5的PO4

<400> 5

gaggagtcgc tccatcggtg tgtacgcgat ggataccggc tcaggcgcaa cttataga 58

<210> 6

<211> 72

<212> DNA

<213> SBL_PHIX_01

<220>

<223> 处于位置1, 2, 3和4的G, A, C和T由硫代磷酸酯键连接。

<400> 6

gactcctcag ctagcgaatg atacggcgac caccgacgct agctgaggag tccaatccgt 60

acgtttccag ac 72

<210> 7

<211> 74

<212> DNA

<213> SBL_PHIX_02

<400> 7

cttatagatc cagttcaagc agaagacggc atacgagata actggatcta taagacggca 60

gcaataaact caac 74

<210> 8

<211> 72

<212> DNA

<213> SBL_PHIX_03

<220>

<223> 处于位置1, 2, 3和4的G, A, C和T由硫代磷酸酯键连接。

<400> 8

gactcctcag ctagcgaatg atacggcgac caccgacgct agctgaggag tcttaaagcc 60

gctgaattgt tc 72

<210> 9

<211> 74

<212> DNA

<213> SBL_PHIX_04

<400> 9

cttatagatc cagttcaagc agaagacggc atacgagata actggatcta taagtgcctt 60

tagtacctcg caac 74

<210> 10

<211> 72

<212> DNA

<213> SBL_PHIX_05

<220>

<223> 处于位置1, 2, 3和4的G, A, C和T由硫代磷酸酯键连接。

<400> 10

gactcctcag ctagcgaatg atacggcgac caccgacgct agctgaggag tccgcctact 60

gcgactaaag ag 72

<210> 11

<211> 78

<212> DNA

<213> SBL_PHIX_06

<400> 11

cttatagatc cagttcaagc agaagacggc atacgagata actggatcta taagaacgat 60

accactgact gaccctca 78

<210> 12

<211> 72

<212> DNA

<213> SBL_PHIX_07

<220>

<223> 处于位置1, 2, 3和4的G, A, C和T由硫代磷酸酯键连接。

<400> 12

gactcctcag ctagcgaatg atacggcgac caccgacgct agctgaggag tccttcttcg 60

gcacctgttt ta 72

<210> 13

<211> 74

<212> DNA

<213> SBL_PHIX_08

<400> 13

cttatagatc cagttcaagc agaagacggc atacgagata actggatcta taagaaaaat 60

ttagggtcgg catc 74

<210> 14

<211> 72

<212> DNA

<213> SBL_PHIX_09

<220>

<223> 处于位置1, 2, 3和4的G, A, C和T由硫代磷酸酯键连接。

<400> 14

gactcctcag ctagcgaatg atacggcgac caccgacgct agctgaggag tctcaaggtg 60

atgtgcttgc ta 72

<210> 15

<211> 74

<212> DNA

<213> SBL_PHIX_10

<400> 15

cttatagatc cagttcaagc agaagacggc atacgagata actggatcta taagccaagt 60

ccaaccaaat caag 74

<210> 16

<211> 148

<212> DNA

<213> LAMP_T01_v1

<400> 16

gactcctcag ctagcgaatg atacggcgac caccgacgct agctgaggag tcgctccatc 60

ggtgtgtacg cgatggatac cggctcaggc gcaacttata gatccagtta tctcgtatgc 120

cgtcttctgc ttgaactgga tctataag 148

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> LP1rc_INV_v1

<220>

<223> 处于位置34, 35, 36和37的C, G, A和G由硫代磷酸酯键连接。

<400> 17

cttatagatc cagttcaagc agaagacggc atacgag 37

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> LP2_INV_v1

<220>

<223> 处于位置30, 31, 32和33的C, C, A和C由硫代磷酸酯键连接。

<400> 18

gactcctcag ctagcgaatg atacggcgac cac 33

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> LP1rc_INV_v2

<220>

<223> 处于位置29, 30, 31和32的T, C, T和G由硫代磷酸酯键连接。

<400> 19

cttatagatc cagttgccga ctagatcctc tg 32

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> LP2_INV_v2

<220>

<223> 处于位置29, 30, 31和32的G, T, G和G由硫代磷酸酯键连接。

<400> 20

gactcctcag ctagcgcttg gcttcattgt gg 32

<210> 21

<211> 97

<212> DNA

<213> SBL_T01

<400> 21

gaggagtctc gccttcgtat agcctattac tcgcgtctaa tggctctgag agattcctcg 60

ccttaaggcg aagattcaga aactgcatac ttataga 97

<210> 22

<211> 97

<212> DNA

<213> SBL_T02

<400> 22

gaggagtcta tcctccgtaa tcttagaatt cgtgtagaga gatagaggca ttactcgtta 60

tgcgacagga cgtctgaagc tgtagagagc ttataga 97

<210> 23

<211> 97

<212> DNA

<213> SBL_T03

<400> 23

gaggagtcct agtaccggta ctgactaatg cgctcgacta gtatagcctc ggctatgttc 60

tgcctcctat cctcgctcat tcgtctaatc ttataga 97

<210> 24

<211> 97

<212> DNA

<213> SBL_T04

<400> 24

gaggagtcgt aaggacgtat agcctattac tcgcagcctc gatagaggca ttactcgtat 60

cctctataga ggctccgcga acagcctcgc ttataga 97

<210> 25

<211> 97

<212> DNA

<213> SBL_T05

<400> 25

gaggagtctt ctgcccgcct atccttctcg cgccctagag tatagaggca ttactcgtgg 60

agtcccctat cctcgctcat ttcgactagc ttataga 97

<210> 26

<211> 97

<212> DNA

<213> SBL_T06

<400> 26

gaggagtcac tgcatcgtat agcctattac tcgtgcctct tggctctgaa gcgatagtta 60

aggagcctat cctcgctcat ttgcctcttc ttataga 97

<210> 27

<211> 97

<212> DNA

<213> SBL_T07

<400> 27

gaggagtcag gagtccgtat agcctattac tcggcgtaag aatagaggca ttactcgtat 60

gcctacctat cctcgctcat tcctagagtc ttataga 97

Claims

1.一种用于多联体扩增多种核酸序列的方法，包括，

a)取长度为至少50个核苷酸的不同单链核酸分子ss1的群体，其中所述单链具有不同序列，并且所述单链各自具有在3'端的共用发夹区域LP1和在5'端的共用发夹区域LP2，其中各发夹具有长度在15个碱基对和30个碱基对之间的杂交茎臂，所述茎臂的Tm范围为45℃至55℃；以及

b)使用包含链置换聚合酶、核苷酸单体和扩增引物的反应混合物扩增所述不同单链核酸分子ss1的群体，其中所述扩增引物中的至少一者P1'与LP1的环L的至少一部分互补，并且所述扩增引物中的一者P2包括与LP2的环的拷贝LP2'的至少一部分相同的序列，

其中该方法用于非诊断目的。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述茎臂的3'端延伸以产生长度为至少50个核苷酸的所述单链核酸分子的完整拷贝ss1'和序列LP2的完整拷贝LP2'。

3.根据权利要求2所述的方法，其中P1'与所述LP1的环杂交并延伸以进行链置换，从而分离LP2和LP2'。

4.根据权利要求3所述的方法，其中LP2'的末端的茎臂能够自引发以延伸并形成全部ss1'、LP1、ss1和LP2的完整拷贝。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述扩增引物P2与LP2'的环杂交并延伸以置换全部ss1'、LP1、ss1和LP2。

6.根据权利要求5所述的方法，其中释放的末端LP2'重复自引发以拷贝多联体ss1'、LP1和ss1。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中扩增引物P1附接至固体支持物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述扩增引物P2处于溶液中。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中确定是否存在核酸扩增产物、或确定所述核酸扩增产物的序列。

10.一种用于扩增多种核酸序列的试剂盒，包括，

a.第一发夹衔接头，其具有长度在15个碱基对和30个碱基对之间的杂交茎臂，所述茎臂的Tm范围为45℃至55℃，并且单链环L处于所述茎臂之间，所述环的长度为15个至30个核苷酸，并且当与互补引物退火时Tm的范围为55℃至65℃；

b.第二发夹衔接头，其具有长度在15个碱基对和30个碱基对之间的杂交茎臂，所述茎臂的Tm范围为45℃至55℃，并且单链环L处于所述茎臂之间，所述环的长度为15个至30个核苷酸，并且当与互补引物退火时Tm的范围为55℃至65℃；

c.具有固定化扩增引物的固体支持物，其中所述引物与所述第一发夹衔接头的环L的至少一部分互补；以及

d.核酸聚合酶和核苷三磷酸。