WO2024106930A1 - 헤어핀 핵산을 이용한 등온 핵산 증폭 방법 - Google Patents

헤어핀 핵산을 이용한 등온 핵산 증폭 방법 Download PDF

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WO2024106930A1
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sequence
analyte
primer
binding
nucleic acid
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PCT/KR2023/018326
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최석정
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강릉원주대학교산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Definitions

  • the present invention relates to a method of amplifying nucleic acids without changing temperature. To describe this in more detail, it relates to a method of amplifying nucleic acids using nucleic acids having a hairpin structure.
  • NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
  • SDA Strand Displacement Amplification
  • LAMP Loop-mediated isothermal Amplification
  • HDA Helicase Dependent Amplification
  • RPA Recombinase Primed Amplification
  • RCA Rolling Circle Amplification
  • the purpose of the present invention is to provide a method for rapidly amplifying nucleic acids without temperature conversion using a simple composition and a method for detecting analytes using this isothermal nucleic acid amplification method.
  • the present invention relates to a method for amplifying nucleic acids using a template hairpin (TH), which is a single-stranded nucleic acid with a hairpin structure.
  • TH template hairpin
  • an initiator (I) a nucleic acid that can bind complementary to a template hairpin, can be produced at a high speed without temperature change.
  • This isothermal nucleic acid amplification method can be applied to a variety of fields, including analyte detection, cell imaging, cell function control, and therapeutic development.
  • Analytes refer to all substances that can be detected, including cells such as eukaryotic cells or bacteria, viral particles, nucleic acids such as DNA or RNA, proteins, carbohydrates, lipids, organic molecules, and substances such as metal ions. Detection of analytes is necessary in various fields such as life science research, disease diagnosis, environmental monitoring, and food inspection.
  • Isothermal nucleic acid amplification using a template hairpin can be achieved by combining two oligonucleotides, that is, a template hairpin and a primer (PR). This method is called bimolecular hairpin-assisted amplification (bHAA).
  • bHAA bimolecular hairpin-assisted amplification
  • the template hairpin of bimolecular hairpin-mediated amplification is, in order from the 5'-end, analyte binding sequence (ABSQ), amplification enzyme recognition sequence (AESQ), and primer binding sequence. It may be a single-stranded oligonucleotide containing a sequence (PBSQ) and an inhibitor sequence (INSQ) ( Figure 1).
  • Analyte binding sequence is a base sequence that can specifically bind to an analyte.
  • the analyte is a nucleic acid such as DNA or RNA
  • the analyte binding sequence is a base sequence complementary to the base sequence of the analyte DNA or RNA.
  • the analyte is one of eukaryotic cells, bacteria, virus particles, proteins, carbohydrates, lipids, organic molecules, or metal ions
  • the aptamer base sequence that can bind to the analyte is the analyte binding sequence (ABSQ). It can be used as
  • the inhibitory sequence is a base sequence that can bind complementary to the analyte binding sequence (ABSQ).
  • the template hairpin forms a hairpin structure through the bond between the inhibitory sequence (INSQ) and the analyte binding sequence (ABSQ).
  • the longer the inhibitory sequence (INSQ) the more stable the hairpin structure can be formed. However, if it is too long, it becomes difficult to bind the analyte and the template hairpin becomes longer, so it is best to optimize it in the range of 15 to 24 nucleotides.
  • the analyte binds to the analyte binding sequence (ABSQ).
  • the portion of the analyte binding sequence (ABSQ) that remains as a single strand is called the toehold. Since a long scaffold may increase non-specific binding at the expense of faster binding, it is recommended to optimize the scaffold length in the range of 6 to 15 nucleotides.
  • the scaffold (1 * ) is located at the 3'-end of the analyte binding sequence (ABSQ, 3 * -2 * -1 * ).
  • the scaffold (3 * ) may be located at the 5'-end of the analyte binding sequence (ABSQ, 3 * -2 * -1 * ).
  • the base sequence of the nucleic acid is shown in the direction from the 5'-end to the 3'-end.
  • the amplifying enzyme recognition sequence is a base sequence that allows an amplifying enzyme to bind and amplify a nucleic acid when an analyte binds to a template hairpin.
  • the amplification enzyme recognition sequence may include part (base sequence 5 in FIGS. 1 and 2) or all of the primer binding sequence (PBSQ).
  • the primer binding sequence is a base sequence to which a primer can bind complementary and may include a portion of the inhibitory sequence (INSQ) at the 3'-end.
  • base sequence 2 of the template hairpin corresponds to this
  • base sequence 1 of the template hairpin corresponds to this.
  • Primer (PR) is an oligonucleotide that can bind complementary to the primer binding sequence (PBSQ). Because part of the primer binding sequence (PBSQ) is included in the inhibitory sequence (INSQ), it is difficult for the primer to bind to the template hairpin to which the analyte is not bound.
  • the primer binding sequence (PBSQ) is at least 6 nucleotides in length. However, in order to suppress the leakage reaction that occurs when the primer binds to the template hairpin in the absence of the analyte (A), it is better that the length is 15 nucleotides or less.
  • base sequences other than those complementary to the primer binding sequence (PBSQ) can be added to the primer. This additional base sequence is intended to complement the function of the primer or to provide another function to the initiator.
  • the inhibitory sequence (INSQ) dissociates from the analyte binding sequence (ABSQ) (step 1 in FIGS. 1 and 2).
  • the primer binding sequence (PBSQ) within the suppression sequence (INSQ) is opened, allowing the primer (PR) to bind (step 2 in FIGS. 1 and 2).
  • the amplification enzyme acts on the amplification enzyme recognition sequence (AESQ) to repeatedly generate initiator (I), a nucleic acid molecule that can bind complementary to the analyte binding sequence (ABSQ) ( Figures 1 and 2 Step 3).
  • the initiator (I) binds again to the analyte binding sequence (ABSQ) of the template hairpin and repeats the above process, resulting in exponential amplification.
  • the initiator (I) is produced in proportion to the concentration of the analyte (A), so the concentration of the analyte contained in the sample can be measured by detecting the initiator (I).
  • the first method to detect the initiator (I) is to use a template hairpin containing a fluorophore (F) and a quencher (Q) at each end ( Figures 1 and 2).
  • F fluorophore
  • Q quencher
  • a second method of detecting the initiator (I) is with a lateral flow assay strip.
  • a template hairpin (TH) containing a fluorescein (F) group and a primer (PR) containing a biotin (B) group at the 5'-end can be used.
  • the primer (PR) binds.
  • the resulting template hairpin (TH)-initiator (I)-primer (PR) complex has a fluorescein group on one end and a biotin group on the other and can be detected with a lateral flow assay strip ( Figures 1 and 2). Because this method does not use a separate device, it can be applied to rapid point-of-care testing.
  • An example of a commercially available lateral flow assay strip is the HybriDetect Dipstick (Milenia Biotec GmbH, Germany).
  • the third method of detecting the initiator (I) is a lateral flow assay strip using two probes that can bind complementary to different regions of the initiator (I). ) can be detected ( Figure 3). At this time, fluorescein is attached to the 5'-end of one probe and biotin is attached to the 3'-end of the other probe.
  • the fourth method of detecting the initiator (I) is to use a molecular beacon that can bind complementary to the initiator (FIG. 4).
  • a fluorophore (F) and a quencher (Q) are attached to both ends of the molecular beacon.
  • F fluorophore
  • Q quencher
  • the distance between the fluorophore and the quencher is close, so fluorescence is suppressed.
  • the molecular beacon binds to the initiator and the hairpin structure opens, the distance between the fluorophore and the quencher increases, and fluorescence occurs.
  • CMOS complementary metal-oxide-semiconductor
  • CRISPR-Cas catalytic hairpin assembly
  • HCR hybridization chain reaction
  • EDCR entropy-driven catalytic reaction
  • Figure 5 presents an example of a detection method using catalytic hairpin assembly (CHA).
  • base sequence 4 which binds to the scaffold (base sequence 4 * ) of the first hairpin (H1), is a base sequence that is not in the analyte (A).
  • A analyte
  • RNA polymerase An example of an amplification enzyme is RNA polymerase (FIG. 6).
  • AESQ amplification enzyme recognition sequence
  • PMSQ promoter sequence
  • PMSQ Promoter sequence
  • RNA synthesized using a template hairpin as a template serves as the initiator (I).
  • the base sequence of any promoter can be used for the promoter sequence (PMSQ), it is better to use a promoter that has high stability and activity of RNA polymerase and has a short base sequence.
  • the T7 promoter which is the promoter of T7 RNA polymerase
  • the T3 promoter which is the promoter of T3 RNA polymerase
  • the SP6 promoter which is the promoter of SP6 RNA polymerase
  • the base sequence of the RNA polymerase promoter in that cell can be used as the promoter sequence (PMSQ).
  • RNA polymerase in the case of T7 RNA polymerase, transcription can occur even if the promoter base sequence is not complete.
  • RNA is synthesized when the enzyme concentration is high, even if there is only one strand of the template strand or coding strand, or only a part of the base sequence, so various modifications are possible (Example 1; Chem. Commun, 2021, 57 , 1619).
  • RNA polymerase is used as an amplification enzyme, RNA is not synthesized with the promoter sequence (PMSQ) on the template hairpin, but when the analyte binds to the template hairpin and then the primer binds to the template hairpin, an active form of the promoter is formed.
  • the promoter sequence (PMSQ) and primer sequences must be adjusted to ensure completion.
  • the inhibitory sequence (INSQ) dissociates from the analyte binding sequence (ABSQ) (step 1 in Figure 6).
  • the primer binds to the primer binding sequence (PBSQ)
  • a promoter on which RNA polymerase can act is completed (step 2 in Figure 6).
  • RNA polymerase binds to the promoter and synthesizes RNA initiator (I) complementary to the template hairpin (step 3 in Figure 6).
  • the amount of initiator (I) generated is proportional to the amount of analyte.
  • an amplification enzyme is that DNA polymerase and RNA polymerase can be used together.
  • the analyte (A) binds to the analyte binding sequence (ABSQ)
  • the inhibitory sequence (INSQ) dissociates from the analyte binding sequence (ABSQ) (step 1 in Figure 7).
  • the primer binds to the primer binding sequence (PBSQ) (step 2 in Figure 7)
  • DNA polymerase synthesizes DNA complementary to the template hairpin starting from the 3'-end of the primer, producing a double-stranded product. -stranded product) (step 3 in FIG. 7).
  • RNA polymerase binds to the promoter and synthesizes RNA initiator (I) (step 4 in Figure 7). As a result, the amount of initiator (I) generated is proportional to the amount of analyte.
  • Strand replacement DNA polymerases include, but are not limited to, phi29 DNA polymerase, Bsu DNA polymerase, Bst DNA polymerase, and Klenow enzyme.
  • the primer binding sequence (PBSQ) is completely contained within the inhibitory sequence (INSQ)
  • the primer will bind to the analyte (A).
  • double-stranded DNA using the analyte (A) as a template can be synthesized. Therefore, it is better for the 5'-end of the primer binding sequence (PBSQ) to be outside the inhibitory sequence (INSQ) (base sequence 5 of the template hairpin in Figure 7).
  • a cutting enzyme is an enzyme that recognizes a specific base sequence in DNA and cuts only one strand.
  • Cutting enzymes include, but are not limited to, Nt.BspQI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Nb.BssSI, and Nt.BsmAI.
  • AESQ amplification enzyme recognition sequence
  • NESQ nicking enzyme recognition sequence
  • the inhibitory sequence (INSQ) dissociates from the analyte binding sequence (ABSQ) (step 1 in Figure 8).
  • the primer binds to the primer binding sequence (PBSQ) (step 2 in Figure 8)
  • DNA polymerase synthesizes DNA complementary to the template hairpin starting from the 3'-end of the primer, producing a double-stranded product. -stranded product) (step 3 in FIG. 8).
  • the analyte (A) is dissociated from the analyte binding sequence (ABSQ) and binds to another template hairpin, thereby repeating DNA synthesis.
  • the cleavage enzyme binds to the cleavage enzyme recognition sequence (NESQ) to cleave one strand (step 4 in Figure 8).
  • the cutting enzyme recognition sequence (NESQ) must be set so that the newly synthesized strand by DNA polymerase, that is, the strand complementary to the template hairpin, is cut.
  • the DNA polymerase synthesizes DNA again starting from the 3'-end of the nick, pushing out the single-stranded DNA (step 5 in Figure 8). In this way, steps 4 and 5 are repeated to synthesize multiple single-stranded DNA initiators (I). Most strand replacement DNA polymerases can synthesize DNA from a nick, but it is more effective to use one of Bsu DNA polymerase, Bst DNA polymerase, and Klenow Fragment.
  • amplification can be achieved by adding a primer sequence (PRSQ) within the template hairpin (FIG. 9). This method is called monomolecular hairpin-assisted amplification (mHAA).
  • mHAA single-molecule hairpin-mediated amplification
  • the inhibitory sequence (INSQ) dissociates from the analyte binding sequence (ABSQ)
  • the inhibition sequence (INSQ) is The primer binding sequence (PBSQ) is opened so that the primer sequence (PRSQ) can bind (step 1 in Figure 9).
  • the amplification enzyme acts on the amplification enzyme recognition sequence (AESQ) to repeatedly generate initiator (I), a nucleic acid molecule that can bind complementary to the analyte binding sequence (ABSQ) (step 2 in Figure 9 ).
  • the initiator (I) binds again to the analyte binding sequence (ABSQ) of the template hairpin and repeats the above process, resulting in exponential amplification.
  • bimolecular hairpin-mediated amplification bHAA
  • mHAA unimolecular hairpin-mediated amplification
  • the amplification enzyme includes DNA polymerase, the 3'-terminal hydroxyl (-OH) group of the template hairpin should be left as is without attaching a fluorophore or quencher.
  • the template hairpin of single-molecule hairpin-mediated amplification consists of two hairpin structures: an inactive hairpin structure in which the analyte binding sequence (ABSQ) and an inhibitory sequence (INSQ) are combined so that amplification enzymes cannot act, and a primer.
  • ABSQ analyte binding sequence
  • INSQ inhibitory sequence
  • PRSQ the primer binding sequence
  • PBSQ may be combined to form an active hairpin structure on which an amplification enzyme can act (FIG. 10).
  • the inactive hairpin structure and the active hairpin structure are mutually exclusive, so the length of the primer binding sequence (PBSQ) is short and the length of the inhibitory sequence (INSQ) is long, so that the template hairpin cannot be extended. It is better to have it exist only in a hairpin structure.
  • the primer sequence (PRSQ) must be connected to the primer binding sequence (PBSQ). Must be able to combine effectively.
  • the length of the effective primer sequence (PRSQ) and primer binding sequence (PBSQ) varies depending on the temperature at which the analysis is performed, but at 37°C, the length should be at least 4 nucleotides and shorter than the length of the inhibitory sequence (INSQ).
  • Functional sequences can be added to the template hairpin used in both hairpin-mediated amplification (HAA) to confer different functions to the double-stranded product or the initiator (RNA transcript or single-stranded DNA product) ( Figure 11).
  • the functional sequence (FNSQ) can be added to the 3'-end of the analyte binding sequence (ABSQ) (base sequence 4 of the left hairpin in Figure 11), or it can be added to the 5'-end of the analyte binding sequence (ABSQ). (base sequence 4 of the right hairpin in Figure 11).
  • FNSQ a functional sequence that confers function to a double-stranded product
  • CRISPR-Cas target sequence FNSQ
  • Adding the CRISPR-Cas target sequence as a functional sequence allows the double-stranded product to activate the CRISPR-Cas enzyme. Since the activated CRISPR-Cas enzyme has a secondary cleavage activity that non-specifically cleaves the reporter nucleic acid, which is single-stranded DNA or RNA, fluorophores and quenchers are included at both ends of the reporter nucleic acid to produce fluorescence. Double-stranded products can be detected by measuring changes in .
  • FNSQ functional sequence
  • Figure 12 Another example of a functional sequence (FNSQ) that confers a function to a double-stranded product is a protein binding sequence to which a DNA binding protein can specifically bind ( Figure 12).
  • DNA binding proteins include repressor proteins, transcription factors, hormone receptors, proteins with zinc-finger domains, and basic leucine zipper domains. There are proteins with , proteins with a helix-turn-helix domain, etc.
  • FNSQs functional sequences
  • RNA transcript or single-stranded DNA produced by the initiator examples include CRISPR-Cas guide RNA function, antisense function, aptamer function, and ribozyme function. etc.
  • an aptamer function that can be assigned to an initiator is a light-up aptamer (Analysis & Sensing, 2002, e202200090) that generates fluorescence by combining with a dye molecule ( Figure 13).
  • a light-up aptamer (Analysis & Sensing, 2002, e202200090) that generates fluorescence by combining with a dye molecule ( Figure 13).
  • RNA polymerase acting as an amplification enzyme.
  • the luminescent aptamer sequence can be divided into two pieces that can be combined to create a completed aptamer, and only one piece among them can be included in the initiator. If the remaining fragments are added to the reactant at a constant concentration, the number of complete aptamers formed by combining the two fragments is proportional to the number of initiators. By doing this, the size of the mold hairpin can be reduced.
  • CRISPR-Cas guide RNA function ( Figure 14).
  • an example of using RNA polymerase and CRISPR-Cas12 is given.
  • the initiator acts as a guide RNA for CRISPR-Cas.
  • base sequence 1 of the guide RNA becomes the base sequence that recognizes the target DNA. Therefore, CRISPR-Cas12 is activated by adding double-stranded DNA (target for CRISPR, TCR) containing base sequences 1 and 1 * and PAM sequences (6 and 6*). Therefore, the initiator can be detected by using the secondary cleavage activity of the activated CRISPR-Cas12 enzyme to cleave the reporter nucleic acid containing a fluorophore and a quencher at both ends.
  • RNA transcripts or single-stranded DNA the ability to act as an initiator of non-enzymatic nucleic acid amplification, such as catalytic hairpin assembly (CHA), hybridization chain reaction (HCR), and entropy-driven catalytic reaction (EDCR). You may.
  • CHA catalytic hairpin assembly
  • HCR hybridization chain reaction
  • EDCR entropy-driven catalytic reaction
  • amplification reactions can be cascaded by adding an extension sequence (EXSQ) to the template hairpin.
  • EXSQ extension sequence
  • Figures 15 and 16 the principle of the method of sequentially causing bimolecular hairpin-mediated amplification and single-molecular hairpin-mediated amplification using RNA polymerase as an amplification enzyme is presented.
  • the analyte binds to template hairpin 1, in which extended sequence 6 is added to the 5'-end of the analyte binding sequence (3 * -2 * -1 * ), and the primer binds to the template hairpin again. If you do this, transcription occurs (Figure 15).
  • the generated initiator 1 (1-2-3-6 * ) binds to template hairpin 1, but can also bind to template hairpin 2 having the initiator 1 binding sequence (6-3 * -2 * ).
  • a primer binds here again, transcription occurs and initiator 2 (2-3-6 * -7 * ) is generated.
  • initiator 2 can again bind to template hairpin 3 having the initiator 2 binding sequence (7-6-3 * ) to generate initiator 3, chain amplification occurs. This method can be equally applied when using other amplification enzymes.
  • Using the isothermal nucleic acid amplification method according to the present invention has the effect of rapidly amplifying nucleic acids with high efficiency without changing temperature.
  • analyte detection kit that can be used in the field can be provided.
  • Figure 1 shows bimolecular hairpin-mediated amplification using a template hairpin (TH) in which the scaffold (1 * ) is located at the 3'-end of the analyte binding sequence (ABSQ, 3 * -2 * -1 * ) in the present invention. It shows the principle of (bimolecular hairpin-assisted amplification, bHAA).
  • FIG. 2 shows bimolecular hairpin-mediated amplification (bHAA) in which the scaffold (3 * ) uses a template hairpin (TH) at the 5'-end of the analyte binding sequence (ABSQ, 3 * -2 * -1 * ) in the present invention. It shows the principle of.
  • Figure 3 shows the method of detecting the initiator (I) with a lateral flow assay strip using two probes that can bind complementary to different regions of the initiator (I) in the present invention. It shows the principle.
  • Figure 4 shows the principle of the method of detecting the initiator (I) using a molecular beacon that can bind complementary to the initiator in the present invention.
  • Figure 5 shows the principle of the method of detecting the initiator (I) using the catalytic hairpin assembly (CHA) reaction in the present invention.
  • FIG. 6 shows the principle of bimolecular hairpin-mediated amplification (bHAA), which uses RNA polymerase as an amplification enzyme and a promoter sequence (PMSQ) as an amplification enzyme recognition sequence (AESQ) in the present invention. It represents.
  • Figure 7 shows bimolecular hairpin-mediated amplification in which, in the present invention, DNA polymerase and RNA polymerase are used as amplification enzymes, and a promoter sequence (PMSQ) is used as an amplification enzyme recognition sequence (AESQ).
  • PMSQ a promoter sequence
  • AESQ amplification enzyme recognition sequence
  • Figure 8 shows that in the present invention, DNA polymerase and a nicking enzyme are used as amplification enzymes, and a nicking enzyme recognition sequence (NESQ) is used as an amplification enzyme recognition sequence (AESQ).
  • NESQ nicking enzyme recognition sequence
  • AESQ amplification enzyme recognition sequence
  • Figure 9 shows the principle of monomolecular hairpin-assisted amplification (mHAA), which amplifies by adding a primer sequence (PRSQ) to a template hairpin instead of using a separate primer (PR) in the present invention. It is shown.
  • mHAA monomolecular hairpin-assisted amplification
  • Figure 10 shows two possible structures of the template hairpin used in single-molecule hairpin-mediated amplification (mHAA) in the present invention.
  • Figure 11 shows two templates used in single-molecule hairpin-mediated amplification (mHAA) in the present invention, in which a functional sequence (FNSQ) is added to the 3'-end or 5'-end of the analyte binding sequence (ABSQ). It represents a hairpin (template hairpin).
  • FNSQ functional sequence
  • ABSQ analyte binding sequence
  • Figure 12 shows an example of a functional sequence (FNSQ) that confers a function to a double-stranded product in the present invention, to which a CRISPR-Cas target sequence or protein binding sequence is added. .
  • FNSQ functional sequence
  • Figure 13 shows an example in which a luminescent aptamer template sequence is added as a functional sequence (FNSQ) that confers a function to the initiator in the present invention.
  • FNSQ functional sequence
  • Figure 14 shows an example in which a CRISPR-Cas guide RNA pseudoknot template sequence is added as a functional sequence (FNSQ) that confers a function to the initiator in the present invention.
  • FNSQ functional sequence
  • Figure 15 shows the principle of the method of sequentially causing bimolecular hairpin (bHAA)-mediated amplification using RNA polymerase as an amplification enzyme in the present invention.
  • bHAA bimolecular hairpin
  • Figure 16 shows the principle of the method of sequentially causing single-molecule hairpin-mediated amplification (mHAA) using RNA polymerase as an amplification enzyme in the present invention.
  • FIG 17 shows the results of an experiment showing that, in one embodiment of the present invention, the transcription process to synthesize RNA can occur if the concentration of T7 RNA polymerase (T7 RNAP) is high even if the base sequence of the T7 promoter is not complete.
  • T7 RNAP T7 RNA polymerase
  • Figure 18 shows the results of an experiment in which analyte (A), a single-stranded nucleic acid, was detected using the T7 promoter base sequence as an amplification enzyme recognition sequence (AESQ) and T7 RNAP as an amplification enzyme in one embodiment of the present invention. It's a graph.
  • A analyte
  • AESQ amplification enzyme recognition sequence
  • T7 RNAP T7 RNAP
  • FIG 19 shows that in one embodiment of the present invention, the T7 promoter base sequence is used as an amplification enzyme recognition sequence (AESQ), and T7 RNAP and Klenow Fragment, a strand alternative DNA polymerase, are used as amplification enzymes to produce a single-stranded nucleic acid analyte (AESQ), and T7 RNAP and Klenow Fragment, a strand alternative DNA polymerase, are used as amplification enzymes to produce a single-stranded nucleic acid analyte ( This is a graph showing the results of the experiment that detected A).
  • AESQ amplification enzyme recognition sequence
  • Figure 20 shows that in one embodiment of the present invention, a nicking enzyme recognition sequence (NESQ) is used as an amplifying enzyme recognition sequence (AESQ), and the nicking enzyme Nb.BbvCI and the strand displacement DNA polymerase Klenow Fragment are used.
  • NESQ nicking enzyme recognition sequence
  • AESQ amplifying enzyme recognition sequence
  • Nb.BbvCI and the strand displacement DNA polymerase Klenow Fragment are used.
  • FIG. 21 shows that in one embodiment of the present invention, the T7 promoter base sequence is used as an amplification enzyme recognition sequence (AESQ), T7 RNAP is used as an amplification enzyme, and the luminescent aptamer template sequence is attached to the template hairpin as a functional sequence (FNSQ).
  • AESQ amplification enzyme recognition sequence
  • FNSQ luminescent aptamer template sequence
  • T7 RNAP T7 RNA polymerase
  • the primer binding sequence (PBSQ) in the inhibitory sequence (INSQ) is indicated in italics, and the dark green color in the analyte binding sequence is the toehold.
  • FAM 3'-Fluorescein phosphoramidite
  • BHQ1 Black Hole Quencher 1
  • the initiator is the RNA sequence expected to be produced in this amplification reaction.
  • T7 RNAP As an amplifying enzyme recognition sequence (AESQ), different amounts of T7 RNAP were added to samples containing TH12 and molecular beacon at a concentration of 100 nM each, and the change in fluorescence over time was measured.
  • Klenow Buffer 500mM Tris-HCl, pH 7.2, 100mM MgSO 4 , 1mM DTT was used as the reaction buffer, and all four rNTPs were used at a concentration of 0.5mM.
  • T7 RNAP 25 units or more (FIG. 17). This shows that even if the T7 promoter has only one strand, that is, even if the T7 promoter is not in a complete double-stranded form, transcription can occur when the concentration of T7 RNAP is increased. Therefore, it was confirmed that the base sequence can be designed flexibly when using the T7 promoter as an amplification enzyme recognition sequence (AESQ).
  • AESQ amplification enzyme recognition sequence
  • the analyte (A) a single-stranded nucleic acid
  • AESQ amplification enzyme recognition sequence
  • T7 RNAP T7 RNAP
  • Table 2 summarizes the oligonucleotide base sequences used in this example. Starting from the 5'-end of template hairpin TH20, dark green and underlined green are the analyte binding sequence (ABSQ), light blue and red are the promoter sequence (PMSQ), which is the amplification enzyme recognition sequence (AESQ), and blue are the repressor sequences. (INSQ).
  • the primer (PR20) consists of 17 essential base sequences on the coding strand of the T7 promoter, of which 13 underlined bind to the promoter sequence (PMSQ) of the template hairpin.
  • the dark green part of the analyte binding sequence is the toehold.
  • a fluorescent group, FAM (5'-Fluorescein phosphoramidite)
  • BHQ1 Black Hole Quencher 1
  • the initiator is the RNA sequence expected to be produced in this amplification reaction.
  • analyte (A) Different amounts of analyte (A) were added to samples containing 100 nM of TH20, 100 nM of PR20, and 0.5 mM of each of the four rNTPs, and the change in fluorescence over time was measured.
  • Klenow Buffer (10mM Tris-HCl, pH 7.9, 50mN NaCl, 10mM MgCl 2 , 1mM DTT) was used as the reaction buffer, and 5 units of T7 RNAP were added.
  • the T7 promoter base sequence was used as an amplification enzyme recognition sequence (AESQ), and T7 RNAP and Klenow Fragment, a strand displacement DNA polymerase, were used as amplification enzymes to detect the analyte (A), a single-stranded nucleic acid.
  • A analyte
  • Table 3 summarizes the oligonucleotide base sequences used in this example. Starting from the 5'-end of template hairpin TH21, dark green and underlined green are the analyte binding sequence (ABSQ), red are the T7 promoter sequence (PMSQ), which is an amplification enzyme recognition sequence (AESQ), and blue are the suppressor sequences (INSQ).
  • the dark green part of the analyte binding sequence is the toehold.
  • a fluorescent group, FAM (5'-Fluorescein phosphoramidite) is attached to the 5'-end of the template hairpin, and a quenching group, BHQ1 (Black Hole Quencher 1), is attached to the 3'-end.
  • the initiator is the RNA sequence expected to be produced in this amplification reaction.
  • analyte (A) Different amounts of analyte (A) were added to samples containing 100 nM of TH21, 100 nM of PR21, all four dNTPs, and four rNTPs at a concentration of 0.5 mM, and the change in fluorescence over time was measured.
  • Klenow Buffer (10mM Tris-HCl, pH 7.9, 50mN NaCl, 10mM MgCl 2 , 1mM DTT) was used as the reaction buffer, and 1 unit of Klenow Fragments and 5 units of T7 RNAP were added.
  • RNA initiator (I) that can bind to TH21.
  • fluorescence barely increased in samples without the analyte (A), but it was observed that fluorescence increased in samples with the analyte (FIG. 19). This means that when the RNA initiator (I) was synthesized in the sample containing the analyte and bound to TH21, the distance between the fluorophore and the quencher increased and the fluorescence increased.
  • a nicking enzyme recognition sequence (NESQ) is used as an amplification enzyme recognition sequence (AESQ), and a nicking enzyme, Nb.BbvCI, and a strand replacement DNA polymerase, Klenow Fragment, are used as amplification enzymes to form a single strand.
  • A a nicking enzyme recognition sequence
  • Nb.BbvCI a nicking enzyme
  • Klenow Fragment a strand replacement DNA polymerase
  • analyte binding sequence (ABSQ)
  • red are the Nb.BbvCI recognition sequence, which is an amplifying enzyme recognition sequence (AESQ)
  • INSQ inhibitory sequence
  • PR3 primer (PR3) base sequences
  • eight bind to the inhibitory sequence (shown in blue) and two bind to the Nb.BbvCI recognition sequence (shown in red).
  • the dark green part of the analyte binding sequence is the toehold.
  • the initiator is the single-stranded DNA sequence expected to be generated in this amplification reaction.
  • analyte (A) Different amounts of analyte (A) were added to samples containing 100 nM of THN3, 100 nM of PR3, and 0.5 mM of each of the four dNTPs, and the change in fluorescence over time was measured.
  • Klenow Buffer (10mM Tris-HCl, pH 7.9, 50mN NaCl, 10mM MgCl 2 , 1mM DTT) was used as the reaction buffer, and 1 unit of Klenow Fragment and 5 units of Nb.BbvCI were added. .
  • the promoter sequence (PMSQ) is used as an amplification enzyme recognition sequence (AESQ)
  • AESQ amplification enzyme recognition sequence
  • Pepper aptamer sequence which is a luminescent aptamer (Nature Biotechnology, 2019, 37) , 1287-1293) as a functional sequence, the analyte (A), a single-stranded nucleic acid, was detected using a single-molecule hairpin-mediated amplification method.
  • Pepper aptamer is an aptamer that emits fluorescence when combined with HB530 dye. Table 5 below summarizes the oligonucleotide base sequences used in this example.
  • the blue part of PAL is the base sequence for transcription of the remaining part of the pepper aptamer, and the red part is the T7 promoter sequence.
  • the initiator RNA generated from THRP and the PAL RNA generated from PAL combine with each other to complete the pepper aptamer.
  • Oligonucleotides were added in different combinations to samples containing each of the four rNTPs at a concentration of 0.5 mM and HBC530 dye at a concentration of 1 ⁇ M, and the change in fluorescence over time was measured at 37°C.
  • Each oligonucleotide, including THRP, PAL, and analyte (A) was added at a concentration of 100 nM.
  • the reaction buffer solution used was T7 RNA Polymerase Buffer (40mM Tris-HCl, pH 8, 6mM MgCl 2 , 10mM spermidine), and 30 units of T7 RNA polymerase were added.
  • the promoter sequence contains only part of the T7 promoter (8 out of 17 nucleotides), so transcription does not occur, and the primer sequence does not contain template DNA, so transcription does not occur.
  • the promoter sequence opens and the primer sequence binds to it. Then, the promoter sequence and the primer sequence act together as a promoter, causing transcription to occur, and initiator RNA is synthesized (see Figure 13).

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Abstract

본 발명은 헤어핀(hairpin) 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 이용하여 온도의 변환 없이 핵산을 증폭함으로써 분석물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

헤어핀 핵산을 이용한 등온 핵산 증폭 방법
본 발명은 온도의 변환 없이 핵산을 증폭하는 방법에 관한 것이며, 이를 좀 더 상세하게 기술하면 헤어핀(hairpin) 구조를 갖는 핵산을 이용하여 핵산을 증폭하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 출원일자 2022년 11월 15일자, 출원번호 10-2022-0152591, 명칭 "헤어핀 핵산을 이용한 등온 핵산 증폭 방법"에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 발명의 일부로 포함시킨다.
특정 염기서열을 갖는 핵산을 검출하는 분자진단(molecular diagnostics)에는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)에 의해 핵산을 증폭하는 방법이 널리 사용되고 있다. 그러나 이 방법을 위해서는 온도 변환을 위한 기기가 필요한 단점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 Nucleic Acid Sequence Based Amplification(NASBA), Strand Displacement Amplification(SDA), Loop-mediated isothermal Amplification(LAMP), Helicase Dependent Amplification(HDA), Recombinase Primed Amplification(RPA) 및 Rolling Circle Amplification(RCA)와 같은 등온 핵산 증폭(isothermal nucleic acid amplification) 방법이 개발되었다(Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2021, VOL. 56, NO. 6, 543-586).
그러나 이러한 등온 증폭 방법들은 증폭 효율이 낮거나, 정확도가 낮거나, 구성 요소가 복잡하거나, 응용 범위가 제한적인 단점이 있다.
본 발명은 단순한 조성물을 이용하여 온도 변환 없이 신속하게 핵산을 증폭하는 방법과 이 등온 핵산 증폭 방법을 이용한 분석물질 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 헤어핀(hairpin) 구조를 갖는 단일 가닥 핵산(single-stranded nucleic acid)인 주형 헤어핀(template hairpin, TH)을 이용하여 핵산을 증폭하는 방법에 대한 것이다. 이 방법에 의하면 주형 헤어핀과 상보적으로 결합할 수 있는 핵산인 개시자(Initiator, I)를 온도의 변환 없이 빠른 속도로 생성할 수 있다. 이 등온 핵산 증폭 방법은 분석물질(analyte) 검출을 비롯하여, 세포 영상화(cell imaging), 세포 기능 조절, 치료제 개발 등 다양한 분야에 응용할 수 있다. 여기에서는 분석물질 검출 방법에 대해 중점적으로 기술하고자 한다.
분석물질은 진핵세포나 박테리아 같은 세포, 바이러스 입자, DNA나 RNA와 같은 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 금속이온과 같은 물질 등 검출 대상이 될 수 있는 모든 물질을 의미한다. 분석물질의 검출은 생명과학 연구, 질병 진단, 환경 모니터링, 식품 검사 등 다양한 분야에 필요하다.
주형 헤어핀을 이용하는 등온 핵산 증폭 방법은 두 가지 올리고뉴클레오타이드, 즉 주형 헤어핀과 프라이머(primer, PR)의 결합으로 일어날 수 있다. 이 방법을 이분자 헤어핀 매개 증폭(bimolecular hairpin-assisted amplification, bHAA)으로 부르기로 한다.
이분자 헤어핀 매개 증폭(bHAA)의 주형 헤어핀은, 5'-말단부터 순서대로 분석물질 결합서열(analyte binding sequence, ABSQ), 증폭효소 인식서열(amplification enzyme recognition sequence, AESQ), 프라이머 결합서열(primer binding sequence, PBSQ) 및 억제서열(inhibitor sequence, INSQ)을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)일 수 있다(도 1).
분석물질 결합서열(ABSQ)은 분석물질(analyte)과 특이적으로(specifically) 결합할 수 있는 염기서열이다. 분석물질이 DNA 또는 RNA와 같은 핵산일 경우 분석물질 결합서열(ABSQ)은 분석물질인 DNA 또는 RNA의 염기서열에 대해 상보적인 염기서열이다. 분석물질이 진핵세포, 박테리아, 바이러스 입자, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자, 금속이온 가운데 하나일 경우에는 그 분석물질과 결합할 수 있는 압타머(aptamer) 염기서열이 분석물질 결합서열(ABSQ)로 사용될 수 있다.
억제서열(INSQ)은 분석물질 결합서열(ABSQ)과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열이다. 주형 헤어핀은 억제서열(INSQ)과 분석물질 결합서열(ABSQ) 사이의 결합으로 헤어핀 구조를 형성하게 된다. 억제서열(INSQ)의 길이가 길수록 안정한 헤어핀 구조를 형성할 수 있지만, 너무 길면 분석물질의 결합이 어려워지고 주형 헤어핀이 길어지기 때문에 15∼24 뉴클레오타이드 범위에서 최적화하는 것이 좋다.
억제서열(INSQ)을 분석물질 결합서열(ABSQ)보다 짧게 하여, 분석물질 결합서열(ABSQ)의 일부를 단일 가닥(single strand)으로 남겨둠으로써 분석물질이 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합하는 것을 촉진할 수 있다. 이렇게 분석물질 결합서열(ABSQ) 가운데 단일 가닥으로 남겨진 부분을 발판(toehold)이라고 한다. 발판의 길이가 길면 결합 속도가 빨라지는 대신 비특이적인 결합이 증가할 수 있기 때문에, 발판의 길이를 6∼15 뉴클레오타이드 범위에서 최적화하는 것이 좋다. 도 1에서는 발판(1*)이 분석물질 결합서열(ABSQ, 3*-2*-1*)의 3'-말단 쪽에 있다. 그러나 도 2와 같이 발판(3*)이 분석물질 결합서열(ABSQ, 3*-2*-1*)의 5'-말단 쪽에 있을 수도 있다. 본 명세서에서는, 별도의 언급이 없으면 핵산의 염기서열은 5'-말단에서 3'-말단 방향으로 나타낸다.
증폭효소 인식서열(AESQ)은, 분석물질이 주형 헤어핀에 결합했을 때 증폭 효소(amplifying enzyme)가 결합하여 핵산을 증폭할 수 있는 염기서열이다. 증폭효소 인식서열(AESQ)은 프라이머 결합서열(PBSQ)의 일부(도 1 및 도 2의 염기서열 5) 또는 전부를 포함할 수 있다.
프라이머 결합서열(PBSQ)은 프라이머가 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열로 3'-말단 쪽에 억제서열(INSQ)의 일부를 포함할 수 있다. 도 1에서는 주형 헤어핀의 염기서열 2가, 도 2에서는 주형 헤어핀의 염기서열 1이 여기에 해당한다. 이와 같이 프라이머 결합서열(PBSQ)에 억제서열(INSQ)의 일부가 포함되어 있으면 분석물질이 결합하지 않은 주형 헤어핀에는 프라이머가 결합하기 어려워진다.
프라이머(PR)는 프라이머 결합서열(PBSQ)에 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드이다. 프라이머 결합서열(PBSQ)의 일부가 억제서열(INSQ)에 포함되어 있기 때문에, 분석물질이 결합하지 않은 주형 헤어핀에는 프라이머가 결합하기 어렵다. 프라이머(PR)의 결합을 위해서 프라이머 결합서열(PBSQ)의 길이가 최소한 6 뉴클레오타이드 이상인 것이 바람직하다. 그러나 분석물질(A)이 없는 상태에서 프라이머가 주형 헤어핀에 결합하여 일어나는 누출 반응(leakage reaction)을 억제하기 위해서는 그 길이가 15 뉴클레오타이드 이하인 것이 좋다. 또한 프라이머에는 프라이머 결합서열(PBSQ)에 상보적인 염기서열 외에 다른 염기서열을 추가할 수도 있다. 이 추가 염기서열은 프라이머의 기능을 보완하거나, 개시자에 다른 기능을 부여하기 위한 것이다.
분석물질(A)이 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합하면, 억제서열(INSQ)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리된다(도 1 및 도 2의 단계 1). 결과적으로 억제서열(INSQ) 내에 있던 프라이머 결합서열(PBSQ)이 열려 프라이머(PR)가 결합할 수 있게 된다(도 1 및 도 2의 단계 2). 다음으로 증폭 효소가 증폭효소 인식서열(AESQ)에 작용하여 분석물질 결합서열(ABSQ)에 상보적으로 결합할 수 있는 핵산 분자인 개시자(I)를 반복적으로 생성하게 된다(도 1 및 도 2의 단계 3). 개시자(I)는 다시 주형 헤어핀의 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합하여 위의 과정을 반복하기 때문에 지수적 증폭(exponential amplification)이 일어나게 된다.
이 증폭 반응에서 개시자(I)는 분석물질(A)의 농도에 비례하여 생성되기 때문에 개시자(I)를 검출함으로써 시료에 포함된 분석물질의 농도를 측정할 수 있다.
개시자(I)를 검출하는 첫 번째 방법은, 양 끝에 각각 형광체(fluorophore, F)와 소광체(quencher, Q)를 포함하는 주형 헤어핀을 사용하는 것이다(도 1 및 도 2). 주형 헤어핀이 헤어핀 구조로 존재할 때는 형광체와 소광체 사이의 거리가 가까워 형광이 약하지만, 개시자가 결합하며 헤어핀이 열리면 양 끝이 멀어지기 때문에 형광이 증가하게 된다. 따라서 형광이 증가하는 정도를 실시간으로 측정함으로써 분석물질의 농도를 측정할 수 있다.
개시자(I)를 검출하는 두 번째 방법은, 측면 흐름 분석(lateral flow assay) 스트립으로 검출하는 것이다. 이를 위해 플루오레신(fluorescein, F) 기를 포함하는 주형 헤어핀(TH)과 5'-말단에 바이오틴(biotin, B) 기를 포함하는 프라이머(PR)를 사용할 수 있다. 주형 헤어핀(TH)에 개시자(I)가 결합하여 헤어핀이 열리면 프라이머(PR)가 결합하게 된다. 그 결과 형성된 주형 헤어핀(TH)-개시자(I)-프라이머(PR) 복합체는 한쪽 끝에 플루오레신 기를 갖고 다른 쪽 끝에 바이오틴 기를 갖기 때문에 측면 흐름 분석(lateral flow assay) 스트립으로 검출할 수 있다(도 1 및 도 2). 이 방법은 별도의 기기를 사용하지 않기 때문에, 신속 현장 검사(rapid point-of-care testing)에 적용할 수 있다. 상용화된 측면 흐름 분석 스트립의 예로는 HybriDetect Dipstick(Milenia Biotec GmbH, Germany)을 들 수 있다.
개시자(I)를 검출하는 세 번째 방법은, 개시자(I)의 서로 다른 부위에 상보적으로 결합할 수 있는 두 개의 프로브를 이용하여 측면 흐름 분석(lateral flow assay) 스트립으로 개시자(I)를 검출할 수 있다(도 3). 이때 한 프로브의 5'-말단에는 플루오레신을, 다른 프로브의 3'-말단에는 바이오틴을 부착하여 사용한다.
개시자(I)를 검출하는 네 번째 방법은, 개시자와 상보적으로 결합할 수 있는 분자 비콘(molecular beacon)을 이용하는 것이다(도 4). 분자 비콘의 양 끝에는 형광체(fluorophore, F)와 소광체(quencher, Q)가 부착되어 있는데, 헤어핀 구조에서는 형광체와 소광체의 거리가 가까워 형광이 억제된다. 그러나 분자 비콘이 개시자에 결합하며 헤어핀 구조가 열리면 형광체와 소광체의 거리가 멀어지며 형광이 발생한다.
그 외에도 단일 가닥 핵산을 검출하는데 사용되는 방법들은 모두 개시자를 검출하는데 사용될 수 있다. 그 예로는 CRISPR-Cas 시스템, catalytic hairpin assembly(CHA), hybridization chain reaction(HCR), entropy-driven catalytic reaction(EDCR) 등이 있다.
도 5에 catalytic hairpin assembly(CHA)에 의한 검출 방법의 한 예를 제시하였다. 여기에서 첫 번째 헤어핀(H1)의 발판(염기서열 4*)과 결합하는 염기서열 4는 분석물질(A)에 없는 염기서열이 되도록 하는 것이 좋다. CHA에 사용되는 헤어핀들 가운데 한 개의 양 끝에 형광체와 소광체를 부착하면 형광 세기의 증가로 CHA 반응을 측정할 수 있다. 또한 헤어핀 한 개에 플루오레신을 부착하고 다른 헤어핀에 바이오틴을 부착하면 두 헤어핀이 결합한 생성물을 측면 흐름 분석(lateral flow assay) 스트립으로 검출할 수 있다.
증폭 효소의 한 예로 RNA 중합효소(RNA polymerase)를 들 수 있다(도 6). RNA 중합효소를 증폭 효소로 사용할 경우, 증폭 효소 인식 서열(AESQ)은 프로모터 서열(promoter sequence, PMSQ)이 된다. 프로모터 서열(PMSQ)은 RNA 중합효소가 결합하여 전사(transcription)를 시작할 수 있는 프로모터(promoter)의 염기서열을 의미한다. DNA의 두 가닥 가운데 전사의 주형(template)으로 사용되는 가닥을 주형 가닥(template strand), RNA로 전사되는 가닥을 암호화 가닥(coding strand)이라고 한다. 주형 헤어핀이 전사 과정의 주형으로 작용하기 위해서는, 프로모터의 주형 가닥 쪽 염기서열의 일부 또는 전부가 프로모터 서열(PMSQ)이 되고, 프라이머에 프로모터의 암호화 가닥 쪽 염기서열의 일부 또는 전부가 포함되도록 하는 것이 좋다. 이 방법에서는 주형 헤어핀을 주형으로 하여 합성된 RNA가 개시자(I)가 된다.
프로모터 서열(PMSQ)에는 모든 프로모터의 염기서열을 사용할 수 있지만, RNA 중합효소의 안정성과 활성이 높으면서, 염기서열의 길이가 짧은 프로모터를 사용하는 것이 좋다. 예를 들어 T7 RNA 중합효소의 프로모터인 T7 프로모터, T3 RNA 중합효소의 프로모터인 T3 프로모터, SP6 RNA 중합효소의 프로모터인 SP6 프로모터 가운데 하나를 사용할 수 있다. 살아있는 세포 내에서 헤어핀 매개 증폭 반응을 일으킬 경우, 그 세포에 있는 RNA 중합효소 프로모터의 염기서열을 프로모터 서열(PMSQ)로 사용할 수도 있다.
특히 T7 RNA 중합효소의 경우 프로모터 염기서열이 완전하지 않아도 전사가 일어날 수 있다. 예를 들어 주형 가닥이나 암호화 가닥 가운데 한쪽 가닥만 있거나, 염기서열의 일부만 있어도, 효소 농도가 높으면 RNA가 합성된다는 사실이 확인되었기 때문에 다양한 변형이 가능하다(실시예 1; Chem. Commun, 2021, 57, 1619). RNA 중합효소를 증폭 효소로 사용할 경우, 주형 헤어핀에 있는 프로모터 서열(PMSQ)로는 RNA가 합성되지 않지만, 분석물질이 주형 헤어핀에 결합하고, 이어서 프라이머가 주형 헤어핀에 결합하면, 활성이 있는 형태의 프로모터가 완성되도록 프로모터 서열(PMSQ)과 프라이머의 염기서열을 조절해야 한다.
분석물질(A)이 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합하면 억제서열(INSQ)이 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리된다(도 6의 단계 1). 프라이머 결합서열(PBSQ)에 프라이머가 결합하면 RNA 중합효소가 작용할 수 있는 프로모터가 완성된다(도 6의 단계 2). RNA 중합효소(RNA polymerase)가 프로모터에 결합하여 주형 헤어핀에 상보적인 RNA 개시자(I)를 합성한다(도 6의 단계 3). 그 결과 생성되는 개시자(I)의 양은 분석물질의 양에 비례하게 된다. 이 방법은 증폭효소로 RNA 중합효소 하나만 사용하기 때문에 다른 방법에 비해 단순하고, 경제적인 장점이 있다.
증폭 효소의 또 다른 예로 DNA 중합효소(DNA polymerase)와 RNA 중합효소(RNA polymerase)를 함께 사용할 수 있다. 분석물질(A)이 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합하면 억제서열(INSQ)이 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리된다(도 7의 단계 1). 프라이머 결합서열(PBSQ)에 프라이머가 결합하면(도 7의 단계 2), DNA 중합효소(DNA polymerase)가 프라이머의 3'-말단부터 시작하여 주형 헤어핀에 상보적인 DNA를 합성함으로써 이중가닥 생성물(double-stranded product)을 만든다(도 7의 단계 3). 이때 가닥 대체 DNA 중합효소(strand displacement DNA polymerase)를 사용하면, DNA 합성과 함께 분석물질(A)이 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리된 후 다른 주형 헤어핀에 결합하여, DNA 합성을 반복하게 된다. 다음으로 RNA 중합효소가 프로모터에 결합하여 RNA 개시자(I)를 합성한다(도 7의 단계 4). 그 결과 생성되는 개시자(I)의 양은 분석물질의 양에 비례하게 된다. 가닥 대체 DNA 중합효소로는 phi29 DNA 중합효소, Bsu DNA 중합효소, Bst DNA 중합효소 및 Klenow enzyme 등이 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
DNA 중합효소와 RNA 중합효소를 함께 사용하는 방법에서 분석물질(A)이 단일가닥 DNA일 경우, 프라이머 결합서열(PBSQ)이 억제서열(INSQ) 내에 완전히 포함되어 있으면 프라이머가 분석물질(A)에 결합했을 때, 분석물질(A)을 주형으로 하는 이중가닥 DNA가 합성될 수 있다. 따라서 프라이머 결합서열(PBSQ)의 5'-말단 쪽은 억제서열(INSQ) 외부에 있는 것이 좋다(도 7의 주형 헤어핀의 염기서열 5).
증폭 효소의 또 다른 예로 DNA 중합효소(DNA polymerase)와 절단 효소(nicking enzyme)를 함께 사용할 수 있다. 절단 효소는 DNA의 특정 염기서열을 인식하여 한 가닥만 절단하는 효소이다. 절단 효소로는 Nt.BspQI, Nb.BtsI, Nt.AlwI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Nb.BssSI 및 Nt.BsmAI 등이 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 절단 효소가 증폭 효소로 사용될 경우, 증폭효소 인식서열(AESQ)은 절단효소 인식서열(nicking enzyme recognition sequence, NESQ)이 된다(도 8).
분석물질(A)이 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합하면 억제서열(INSQ)이 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리된다(도 8의 단계 1). 프라이머 결합서열(PBSQ)에 프라이머가 결합하면(도 8의 단계 2), DNA 중합효소(DNA polymerase)가 프라이머의 3'-말단부터 시작하여 주형 헤어핀에 상보적인 DNA를 합성함으로써 이중가닥 생성물(double-stranded product)을 만든다(도 8의 단계 3). 이때 가닥 대체 DNA 중합효소(strand displacement DNA polymerase)를 사용하면, DNA 합성과 함께 분석물질(A)이 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리되어 다른 주형 헤어핀에 결합함으로써 DNA 합성을 반복하게 된다. 다음으로 절단 효소가 절단 효소 인식서열(NESQ)에 결합하여 한 가닥을 절단한다(도 8의 단계 4). 이때 DNA 중합효소에 의해 새로 합성된 가닥, 즉 주형 헤어핀에 상보적인 가닥이 절단되도록 절단효소 인식서열(NESQ)을 설정해야 한다. 그러면 DNA 중합효소가 절단 부분(nick)의 3'-말단으로부터 시작하여 다시 DNA를 합성하면서 단일 가닥 DNA를 밀어낸다(도 8의 단계 5). 이와 같이 단계 4와 5가 반복되면서 여러 개의 단일 가닥 DNA 개시자(I)를 합성하게 된다. 대부분의 가닥 대체 DNA 중합효소들은 절단된 부분(nick)으로부터 DNA를 합성할 수 있지만, 그 가운데 Bsu DNA 중합효소, Bst DNA 중합효소, Klenow Fragment 가운데 어느 하나를 사용하는 것이 더 효과적이다.
별도의 프라이머(PR)를 사용하는 대신 주형 헤어핀 내에 프라이머 서열(primer sequence, PRSQ)을 추가하여 증폭할 수도 있다(도 9). 이 방법을 단분자 헤어핀 매개 증폭(monomolecular hairpin-assisted amplification, mHAA)으로 부르기로 한다.
단분자 헤어핀 매개 증폭(mHAA)에서는 분석물질(A)이 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합하면, 억제서열(INSQ)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리되면서 억제서열(INSQ) 내에 있던 프라이머 결합서열(PBSQ)이 열려 프라이머 서열(PRSQ)이 결합할 수 있게 된다(도 9의 단계 1). 다음으로 증폭 효소가 증폭 효소 인식 서열(AESQ)에 작용하여 분석물질 결합서열(ABSQ)에 상보적으로 결합할 수 있는 핵산 분자인 개시자(I)를 반복적으로 생성하게 된다(도 9의 단계 2). 개시자(I)는 다시 주형 헤어핀의 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합하여 위의 과정을 반복하기 때문에 지수적 증폭(exponential amplification)이 일어나게 된다.
위에 기술된, 이분자 헤어핀 매개 증폭(bHAA)에서 사용된 모든 방법은 단분자 헤어핀 매개 증폭(mHAA)에도 적용될 수 있다. 그러나 증폭 효소에 DNA 중합효소가 포함될 경우, 주형 헤어핀의 3'-말단 수산화(-OH) 기에는 형광체나 소광체를 부착하지 말고 그대로 남겨두어야 한다.
단분자 헤어핀 매개 증폭(mHAA)의 주형 헤어핀은 두 가지 헤어핀 구조, 즉 분석물질 결합서열(ABSQ)과 억제서열(INSQ)이 결합하여 증폭 효소가 작용할 수 없는 비활성 헤어핀(inactive hairpin) 구조, 그리고 프라이머 서열(PRSQ)과 프라이머 결합서열(PBSQ)이 결합하여 증폭 효소가 작용할 수 있는 활성 헤어핀(active hairpin) 구조로 존재할 수 있다(도 10). 이와 같이 단분자 헤어핀 매개 증폭(mHAA)에서는 비활성 헤어핀 구조와 활성 헤어핀 구조가 서로 배타적이기 때문에, 프라이머 결합서열(PBSQ)의 길이는 짧게 하고 억제서열(INSQ)의 길이는 길게 하여 주형 헤어핀이 연장 불가 헤어핀 구조로만 존재하게 하는 것이 좋다. 그러나 분석물질이 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합하여 억제서열(INSQ)이 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리된 후 증폭 효소가 작용하기 위해서는, 프라이머 서열(PRSQ)이 프라이머 결합서열(PBSQ)에 효과적으로 결합할 수 있어야 한다. 효과적인 프라이머 서열(PRSQ) 및 프라이머 결합서열(PBSQ)의 길이는 분석이 이루어지는 온도에 따라 다르지만 37℃의 경우 그 길이가 4 뉴클레오타이드 이상이어야 하고 억제서열(INSQ)의 길이보다는 짧아야 한다.
두 가지 헤어핀 매개 증폭(HAA)에 사용되는 주형 헤어핀에 기능 서열(functional sequence, FNSQ)을 추가하여 이중가닥 생성물이나 개시자(RNA 전사물 또는 단일 가닥 DNA 생성물)에 다른 기능을 부여할 수도 있다(도 11). 기능서열(FNSQ)은 분석물질 결합서열(ABSQ)의 3'-말단에 추가할 수도 있고(도 11 왼쪽 헤어핀의 염기서열 4), 분석물질 결합서열(ABSQ)의 5'-말단에 추가할 수도 있다(도 11 오른쪽 헤어핀의 염기서열 4).
이중가닥 생성물에 기능을 부여하는 기능 서열(FNSQ)의 한 예로는 CRISPR-Cas 목표 서열(CRISPR-Cas target sequence)을 들 수 있다(도 12). CRISPR-Cas 목표 서열을 기능서열로 추가하면 이중가닥 생성물이 CRISPR-Cas 효소를 활성화시킬 수 있게 된다. 활성화된 CRISPR-Cas 효소는 단일가닥 DNA 또는 RNA인 보고자 핵산(reporter nucleic acid)을 비특이적으로 절단하는 이차 절단(collateral cleavage) 활성을 가지고 있기 때문에, 보고자 핵산의 양 끝에 형광체와 소광체를 포함시켜 형광의 변화를 측정하면 이중가닥 생성물을 검출할 수 있다.
이중가닥 생성물에 기능을 부여하는 기능 서열(FNSQ)의 또 다른 예로는 DNA 결합 단백질(DNA binding protein)이 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결합서열(protein binding sequence)을 들 수 있다(도 12). 이러한 DNA 결합 단백질로는 억제 단백질(repressor protein), 전사 인자(transcription factor), 호르몬 수용체(hormone receptor), 아연 손가락 영역(zinc-finger domain)을 갖는 단백질, 염기성 류신 지퍼 영역(basic leucine zipper domain)을 갖는 단백질, 나선-회전-나선 영역(helix-turn-helix domain)을 갖는 단백질 등이 있다.
개시자로 생성된 RNA 전사물 또는 단일 가닥 DNA에 기능을 부여할 수 있는 기능 서열(FNSQ)의 예로는 CRISPR-Cas 가이드 RNA 기능, 안티센스(antisense) 기능, 압타머 기능, 라이보자임(ribozyme) 기능 등이 있다.
개시자에 부여할 수 있는 압타머 기능의 한 예로 염료 분자와 결합하여 형광을 발생시키는 발광 압타머(light-up aptamer; Analysis & Sensing, 2002, e202200090)를 들 수 있다(도 13). 여기에서는 RNA 중합효소가 증폭효소로 작용하는 예를 들었다. 발광 압타머에 상보적인 염기서열(도 13 염기서열 3)을 주형 헤어핀에 포함시키면, 발광 압타머 서열(도 13 염기서열 3*)이 개시자에 포함된다. 발광 압타머 서열은 염료 분자와 결합하며 형광을 발생하기 때문에 간편하게 개시자를 검출할 수 있다.
또한 발광 압타머 서열을, 결합하여 완성된 압타머를 만들 수 있는 두 조각으로 분할하여, 그 가운데 한 조각만 개시자에 포함시킬 수도 있다. 나머지 조각을 일정한 농도로 반응물에 넣어주면 두 조각이 결합하여 형성되는 완전한 압타머의 수는 개시자의 수에 비례하게 된다. 이렇게 함으로써 주형 헤어핀의 크기를 줄일 수 있다.
개시자에 부여할 수 있는 기능의 또 다른 예로 CRISPR-Cas 가이드 RNA(guide RNA) 기능을 들 수 있다(도 14). 여기에서는 RNA 중합효소와 CRISPR-Cas12를 이용하는 예를 들었다. CRISPR-Cas 가이드 RNA의 pseudoknot에 대한 상보서열(도 14의 염기서열 3)을 주형 헤어핀에 포함시키면, 개시자가 CRISPR-Cas의 가이드 RNA로 작용하게 되는데. 이 때 가이드 RNA의 염기서열 1이 목표 DNA를 인식하는 염기서열이 된다. 따라서 염기서열 1과 1* 및 PAM 서열(6과 6*)을 포함하는 이중가닥 DNA(target for CRISPR, TCR)를 넣어주면 CRISPR-Cas12가 활성화된다. 따라서 활성화된 CRISPR-Cas12 효소의 이차 절단(collateral cleavage) 활성을 이용하여, 양 끝에 형광체와 소광체를 포함하는 보고자 핵산을 절단함으로써 개시자를 검출할 수 있다.
또한 RNA 전사물 또는 단일 가닥 DNA가 catalytic hairpin assembly(CHA), hybridization chain reaction(HCR), entropy-driven catalytic reaction(EDCR) 등 비효소적 핵산 증폭의 개시자(initiator)로 작용하도록 하는 기능을 부여할 수도 있다.
단분자 및 이분자 헤어핀 매개 증폭에서, 주형 헤어핀에 연장서열(extension sequence, EXSQ)을 추가하여 증폭 반응을 연쇄적으로 일으킬 수 있다. 도 15와 16에서는 RNA 중합효소를 증폭효소로 사용하여 이분자 헤어핀 매개 증폭과 단분자 헤어핀 매개 증폭을 연쇄적으로 일으키는 방법의 원리를 제시하였다. 이분자 헤어핀 매개 증폭의 경우 분석물질 결합서열(3*-2*-1*)의 5'-말단에 연장서열 6이 추가된 주형 헤어핀 1에 분석물질이 결합하고, 그 주형 헤어핀에 다시 프라이머가 결합하면 전사가 일어난다(도 15). 이 때 생성된 개시자 1(1-2-3-6*)은 주형 헤어핀 1에도 결합하지만, 개시자 1 결합서열(6-3*-2*)을 갖는 주형 헤어핀 2에도 결합할 수 있다. 개시자 1이 주형 헤어핀 2에 결합하고, 여기에 다시 프라이머가 결합하면 전사가 일어나 개시자 2(2-3-6*-7*)가 생성된다. 마찬가지로 개시자 2는 다시 개시자 2 결합서열(7-6-3*)을 갖는 주형 헤어핀 3에 결합하여 개시자 3을 생성할 수 있기 때문에, 연쇄적인 증폭이 일어난다. 이 방법은 다른 증폭효소를 사용할 때도 동일하게 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 등온 핵산 증폭 방법을 이용하면 온도의 변환 없이 높은 효율로 신속하게 핵산을 증폭할 수 있는 효과가 있다.
또한, 이 등온 핵산 증폭 방법을 이용하여 DNA, RNA, 세포, 바이러스, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자 및 금속이온 등 다양한 물질을 높은 감도로 검출할 수 있다.
또한, 현장에서 사용할 수 있는 간단하고 경제적인 분석물질 검출 키트를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에서, 발판(1*)이 분석물질 결합서열(ABSQ, 3*-2*-1*)의 3'-말단 쪽에 있는 주형 헤어핀(template hairpin, TH)을 이용하는 이분자 헤어핀 매개 증폭(bimolecular hairpin-assisted amplification, bHAA)의 원리를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서, 발판(3*)이 분석물질 결합서열(ABSQ, 3*-2*-1*)의 5'-말단 쪽에 있는 주형 헤어핀(TH)을 이용하는 이분자 헤어핀 매개 증폭(bHAA)의 원리를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서, 개시자(I)의 서로 다른 부위에 상보적으로 결합할 수 있는 두 개의 프로브를 이용하여 측면 흐름 분석(lateral flow assay) 스트립으로 개시자(I)를 검출하는 방법의 원리를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에서, 개시자와 상보적으로 결합할 수 있는 분자 비콘(molecular beacon)을 이용하여 개시자(I)를 검출하는 방법의 원리를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에서, catalytic hairpin assembly(CHA) 반응을 이용하여 개시자(I)를 검출하는 방법의 원리를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에서, RNA 중합효소(RNA polymerase)를 증폭 효소로 사용하고, 프로모터 서열(promoter sequence, PMSQ)을 증폭효소 인식서열(AESQ)로 사용하는, 이분자 헤어핀 매개 증폭(bHAA)의 원리를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에서, DNA 중합효소(DNA polymerase)와 RNA 중합효소(RNA polymerase)를 증폭 효소로 사용하고, 프로모터 서열(PMSQ)을 증폭효소 인식서열(AESQ)로 사용하는, 이분자 헤어핀 매개 증폭(bHAA)의 원리를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에서, DNA 중합효소(DNA polymerase)와 절단 효소(nicking enzyme)를 증폭 효소로 사용하고, 절단효소 인식서열(nicking enzyme recognition sequence, NESQ)을 증폭효소 인식서열(AESQ)로 사용하는, 이분자 헤어핀 매개 증폭(bHAA)의 원리를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에서, 별도의 프라이머(PR)를 사용하는 대신 주형 헤어핀에 프라이머 서열(primer sequence, PRSQ)을 추가하여 증폭하는 단분자 헤어핀 매개 증폭(monomolecular hairpin-assisted amplification, mHAA)의 원리를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에서, 단분자 헤어핀 매개 증폭(mHAA)에 사용되는 주형 헤어핀의 두 가지 가능한 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서, 단분자 헤어핀 매개 증폭(mHAA)에서 사용되며, 기능서열(functional sequence, FNSQ)이 분석물질 결합서열(ABSQ)의 3'말단 또는 5'-말단에 추가된 두 가지 주형 헤어핀(template hairpin)을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에서, 이중가닥 생성물에 기능을 부여하는 기능서열(FNSQ)로서, CRISPR-Cas 목표 서열(CRISPR-Cas target sequence) 또는 단백질 결합서열(protein binding sequence)이 추가된 예를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에서, 개시자에 기능을 부여하는 기능서열(FNSQ)로서, 발광 압타머 주형 서열이 추가된 예를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에서, 개시자에 기능을 부여하는 기능서열(FNSQ)로서, CRISPR-Cas 가이드 RNA pseudoknot 주형 서열이 추가된 예를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에서, RNA 중합효소를 증폭효소로 사용하여 이분자 헤어핀(bHAA) 매개 증폭을 연쇄적으로 일으키는 방법의 원리를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명에서, RNA 중합효소를 증폭효소로 사용하여 단분자 헤어핀 매개 증폭(mHAA)을 연쇄적으로 일으키는 방법의 원리를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 한 실시예에서, T7 프로모터의 염기서열이 완전하지 않아도 T7 RNA polymerase(T7 RNAP)의 농도가 높으면 RNA를 합성하는 전사 과정이 일어날 수 있다는 것을 보여주는 실험 결과이다.
도 18은 본 발명의 한 실시예에서, T7 프로모터 염기서열을 증폭 효소 인식 서열(AESQ)로 사용하고 T7 RNAP를 증폭 효소로 사용하여 단일 가닥 핵산인 분석물질(A)을 검출한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 19는 본 발명의 한 실시예에서, T7 프로모터 염기서열을 증폭 효소 인식 서열(AESQ)로 사용하고 T7 RNAP와 가닥 대체 DNA 중합효소인 Klenow Fragment를 증폭 효소로 사용하여 단일 가닥 핵산인 분석물질(A)을 검출한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20은 본 발명의 한 실시예에서, 절단효소 인식서열(nicking enzyme recognition sequence, NESQ)을 증폭효소 인식서열(AESQ)로 사용하고 절단 효소인 Nb.BbvCI과 가닥 대체 DNA 중합효소인 Klenow Fragment를 증폭 효소로 사용하여 단일 가닥 핵산인 분석물질(A)을 검출한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 21은 본 발명의 한 실시예에서, T7 프로모터 염기서열을 증폭 효소 인식 서열(AESQ)로 사용하고, T7 RNAP를 증폭 효소로 사용하고, 주형 헤어핀에 발광 압타머 주형 서열을 기능서열(FNSQ)로 추가하여, 개시자에 발광 압타머 기능을 부여함으로써 단일 가닥 핵산인 분석물질(A)을 검출한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1.
본 실시예에서는 T7 프로모터의 염기서열이 완전하지 않아도 T7 RNA polymerase(T7 RNAP)의 농도가 높으면 RNA를 합성하는 전사 과정이 일어날 수 있다는 것을 확인하였다. 하기 표 1에 본 실시예에서 사용한 올리고뉴클레오타이드 염기서열이 정리되어 있다. 주형 헤어핀(template hairpin) TH12의 5'-말단부터 밑줄 친 초록색과 짙은 초록색은 분석물질 결합서열(ABSQ), 하늘색과 빨간색은 증폭효소 인식서열(AESQ)인 프로모터 서열(PMSQ), 파란색은 억제서열(INSQ), 보라색은 프라이머 서열(PRSQ)이다. 억제서열(INSQ) 가운데 있는 프라이머 결합서열(PBSQ)은 이탤릭체로 표시하였고, 분석물질 결합서열 가운데 짙은 초록색은 발판(toehold)이다. 분자비콘의 3'-말단에는 형광 원자단인 FAM(3'-Fluorescein phosphoramidite)이, 5'-말단에 소광 원자단인 BHQ1(Black Hole Quencher 1)이 부착되어 있다. 개시자는 이 증폭 반응에서 생성될 것으로 예상되는 RNA 서열이다.
Figure PCTKR2023018326-appb-img-000001
증폭효소 인식서열(AESQ)로서 T7 프로모터의 기능을 확인하기 위해 TH12와 분자비콘이 각각 100 nM 농도로 들어있는 시료에 서로 다른 양의 T7 RNAP를 넣고 시간에 따른 형광의 변화를 측정하였다. 이 실험에서 반응 완충용액은 Klenow Buffer(500 mM Tris-HCl, pH 7.2, 100 mM MgSO4, 1 mM DTT)를 사용하였고, 네 가지 rNTP는 모두 0.5 mM 농도로 사용하였다.
그 결과 25 unit 이상의 T7 RNAP에서는 형광이 현저하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 17). 이는 T7 프로모터가 한 가닥만 있어도, 즉 T7 프로모터가 이중가닥의 완전한 형태가 아니어도 T7 RNAP의 농도가 높아지면 전사가 일어날 수 있다는 것을 보여준다. 따라서 T7 프로모터를 증폭효소 인식서열(AESQ)로 사용할 때 유연하게 염기서열을 설계할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 2.
본 실시예에서는 T7 프로모터 염기서열을 증폭효소 인식서열(AESQ)로 사용하고 T7 RNAP를 증폭 효소로 사용하여 단일 가닥 핵산인 분석물질(A)을 검출하였다. 하기 표 2에 본 실시예에서 사용한 올리고뉴클레오타이드 염기서열이 정리되어 있다. 주형 헤어핀(template hairpin) TH20의 5'-말단부터 짙은 초록색과 밑줄 친 초록색은 분석물질 결합서열(ABSQ), 하늘색과 빨간색은 증폭효소 인식서열(AESQ)인 프로모터 서열(PMSQ), 파란색은 억제 서열(INSQ)이다. 프라이머(PR20)는 T7 프로모터의 암호화 가닥 쪽 필수 염기서열 17개로 되어 있고, 그 가운데 밑줄로 표시한 13개가 주형 헤어핀의 프로모터 서열(PMSQ)과 결합한다. 분석물질 결합서열 가운데 짙은 초록색은 발판(toehold)이다. 주형 헤어핀의 5'-말단에는 형광 원자단인 FAM(5'-Fluorescein phosphoramidite)이, 3'-말단에 소광 원자단인 BHQ1(Black Hole Quencher 1)이 부착되어 있다. 개시자는 이 증폭 반응에서 생성될 것으로 예상되는 RNA 서열이다.
Figure PCTKR2023018326-appb-img-000002
TH20 100 nM, PR20 100 nM, 네 가지 rNTP 각각 0.5 mM 농도로 들어있는 시료에 서로 다른 양의 분석물질(A)을 넣고 시간에 따른 형광의 변화를 측정하였다. 이 실험에서 반응 완충용액은 Klenow Buffer(10 mM Tris-HCl, pH 7.9, 50 mN NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT)를 사용하였고 T7 RNAP는 5 unit을 넣어주었다.
TH20에 분석물질(A)이 결합한 후 프라이머(PR20)가 결합하면 암호화 가닥 쪽은 필수 염기서열 17개가 모두 있지만, 주형 가닥 쪽은 13개만 있어 불완전한 프로모터가 된다. 그러나 도 18에서 보는 것처럼 분석물질(A)이 없는 시료에서는 형광이 거의 증가하지 않지만, 분석물질이 있는 시료에서는 형광이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 분석물질이 들어간 시료에서 RNA 개시자(I)가 합성되어 TH20에 결합할 때 형광체와 소광체의 거리가 멀어져 형광이 증가한 것이다. 따라서 불완전한 T7 프로모터를 증폭효소 인식서열(AESQ)로 사용해도 분석물질(A)이 있을 때 증폭이 일어날 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 3.
본 실시예에서는 T7 프로모터 염기서열을 증폭효소 인식서열(AESQ)로 사용하고 T7 RNAP와 가닥 대체 DNA 중합효소인 Klenow Fragment를 증폭 효소로 사용하여 단일 가닥 핵산인 분석물질(A)을 검출하였다. 하기 표 3에 본 실시예에서 사용한 올리고뉴클레오타이드 염기서열이 정리되어 있다. 주형 헤어핀(template hairpin) TH21의 5'-말단부터 짙은 초록색과 밑줄 친 초록색은 분석물질 결합서열(ABSQ), 빨간색은 증폭효소 인식서열(AESQ)인 T7 프로모터 서열(PMSQ), 파란색은 억제서열(INSQ)이다. 프라이머(PR21) 염기서열 가운데 7개는 억제서열과 결합하고(파란색으로 표시) 4개는 T7 프로모터 서열과 결합한다(빨간색으로 표시). 분석물질 결합서열 가운데 짙은 초록색은 발판(toehold)이다. 주형 헤어핀의 5'-말단에는 형광 원자단인 FAM(5'-Fluorescein phosphoramidite)이, 3'-말단에 소광 원자단인 BHQ1(Black Hole Quencher 1)이 부착되어 있다. 개시자는 이 증폭 반응에서 생성될 것으로 예상되는 RNA 염기서열이다.
Figure PCTKR2023018326-appb-img-000003
TH21 100 nM, PR21 100 nM, 네 가지 dNTP와 네 가지 rNTP 모두 각각 0.5 mM 농도로 들어있는 시료에 서로 다른 양의 분석물질(A)을 넣고 시간에 따른 형광의 변화를 측정하였다. 이 실험에서 반응 완충용액은 Klenow Buffer(10 mM Tris-HCl, pH 7.9, 50 mN NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT)를 사용하였고 Klenow Fragmentsms 1 unit, T7 RNAP는 5 unit을 넣어주었다.
TH21에 분석물질(A)이 결합한 후 프라이머(PR21)가 결합하면, Klenow Fragment에 의해 프라이머로부터 시작하여 TH21에 상보적인 DNA가 합성된다. 그 결과 만들어진 이중가닥 DNA에는 완전한 T7 프로모터가 생성되며, 이 프로모터를 이용하여 T7 RNAP가 TH21과 결합할 수 있는 RNA 개시자(I)를 반복적으로 합성한다. 이 실험의 결과 분석물질(A)이 없는 시료에서는 형광이 거의 증가하지 않지만, 분석물질이 있는 시료에서는 형광이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 19). 이는 분석물질이 들어간 시료에서 RNA 개시자(I)가 합성되어 TH21에 결합할 때 형광체와 소광체의 거리가 멀어져 형광이 증가했다는 것을 의미한다.
실시예 4.
본 실시예에서는 절단효소 인식서열(nicking enzyme recognition sequence, NESQ)을 증폭효소 인식서열(AESQ)로 사용하고 절단 효소인 Nb.BbvCI과 가닥 대체 DNA 중합효소인 Klenow Fragment를 증폭 효소로 사용하여 단일 가닥 핵산인 분석물질(A)을 검출하였다. 하기 표 4에 본 실시예에서 사용한 올리고뉴클레오타이드 염기서열이 정리되어 있다. 주형 헤어핀(template hairpin) THN3의 5'-말단부터 짙은 초록색과 밑줄 친 초록색은 분석물질 결합서열(ABSQ), 빨간색은 증폭효소 인식서열(AESQ)인 Nb.BbvCI 인식서열, 파란색은 억제서열(INSQ)이다. 프라이머(PR3) 염기서열 가운데 8개는 억제서열과 결합하고(파란색으로 표시) 2개는 Nb.BbvCI 인식서열과 결합한다(빨간색으로 표시). 분석물질 결합서열 가운데 짙은 초록색은 발판(toehold)이다. 주형 헤어핀의 5'-말단에는 형광 원자단인 FAM(5'-Fluorescein phosphoramidite)이, 3'-말단에 소광 원자단인 BHQ1(Black Hole Quencher 1)이 부착되어 있다. 개시자는 이 증폭 반응에서 생성될 것으로 예상되는 단일가닥 DNA 염기서열이다.
Figure PCTKR2023018326-appb-img-000004
THN3 100 nM, PR3 100 nM, 네 가지 dNTP 각각 0.5 mM 농도로 들어있는 시료에 서로 다른 양의 분석물질(A)을 넣고 시간에 따른 형광의 변화를 측정하였다. 이 실험에서 반응 완충용액은 Klenow Buffer(10 mM Tris-HCl, pH 7.9, 50 mN NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT)를 사용하였고 Klenow Fragment는 1 unit, Nb.BbvCI는 5 unit을 넣어주었다.
THN3에 분석물질(A)이 결합한 후 프라이머(PR3)가 결합하면, Klenow Fragment에 의해 프라이머로부터 시작하여 THN3에 상보적인 DNA가 합성된다. 그 결과 만들어진 이중가닥 DNA에는 완전한 Nb.BbvCI 인식서열이 생성되며, Nb.BbvCI가 이 인식서열의 한 가닥을 절단한다. 그 결과 만들어진 틈(nick)으로부터 시작하여 Klenow Fragment가 DNA를 합성하면서 절단된 가닥을 밀어낸다. 이 과정이 반복되며 개시자(I)가 반복적으로 만들어지는 것이다. 이 실험의 결과 분석물질(A)이 없는 시료에서는 형광이 거의 증가하지 않지만, 분석물질이 있는 시료에서는 형광이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 20). 이는 분석물질이 들어간 시료에서 단일가닥 DNA 개시자(I)가 합성되어 THN3에 결합할 때 형광체와 소광체의 거리가 멀어져 형광이 증가했다는 것을 의미한다.
실시예 5.
본 실시예에서는 프로모터 서열(promoter sequence, PMSQ)을 증폭효소 인식서열(AESQ)로 사용하고, T7 RNA 중합효소를 증폭효소로 사용하고, 발광 압타머인 Pepper 압타머 서열(Nature Biotechnology, 2019, 37, 1287-1293)을 기능서열로 사용하여, 단분자 헤어핀 매개 증폭 방법으로 단일 가닥 핵산인 분석물질(A)을 검출하였다. Pepper 압타머는 HB530 염료와 결합하여 형광을 내는 압타머이다. 하기 표 5는 본 실시예에서 사용한 올리고뉴클레오타이드 염기서열이 정리되어 있다. 주형 헤어핀(template hairpin) THRP의 5'-말단부터 파란색은 pepper 압타머 일부분에 대한 상보서열, 짙은 초록색과 밑줄 친 초록색은 분석물질 결합서열(ABSQ), 빨간색은 증폭효소 인식서열(AESQ)인 T7 프로모터 서열의 일부, 밑줄 친 청록색은 억제 서열(INSQ), 주황색은 프라이머 서열(PMSQ)이다. 프라이머 서열(PMSQ)은 T7 프로모터의 암호화 가닥 서열이다. 개시자 RNA는 THRP로부터 생성될 것으로 예상되는 RNA이며, 파란색이 pepper 압타머의 일부이다. pepper 압타머의 나머지 부분은 PAL로 명명한 별도의 DNA로부터 전사되어 생성되게 하였다. PAL의 파란색은 pepper 압타머 나머지 부분의 전사를 위한 염기서열이고 빨간색은 T7 프로모터 서열이다. THRP로부터 생성된 개시자 RNA와 PAL로부터 생성된 PAL RNA는 서로 결합하여 pepper 압타머를 완성시킨다.
Figure PCTKR2023018326-appb-img-000005
네 가지 rNTP 각각 0.5 mM, HBC530 염료 1 μM 농도로 들어있는 시료에 올리고뉴클레오타이드를 서로 다른 조합으로 넣고 37℃에서 시간에 따른 형광의 변화를 측정하였다. THRP, PAL, 분석물질(A) 등 각 올리고뉴클레오타이드는 모두 100 nM 농도로 넣어주었다. 반응 완충용액은 T7 RNA 중합효소 Buffer(40 mM Tris-HCl, pH 8, 6 mM MgCl2, 10 mM spermidine)를 사용하였고, T7 RNA 중합효소는 30 unit을 넣어주었다.
THRP에서 프로모터 서열에는 T7 프로모터의 일부(17개 뉴클레오타이드 가운데 8개)만 포함되어 있어 전사가 일어나지 않고, 프라이머 서열에는 주형 DNA가 없어 전사가 일어나지 않는다. 그러나 THRP에 분석물질이 결합하면 프로모터 서열이 열리고 여기에 프라이머 서열이 결합한다. 그러면 프로모터 서열과 프라이머 서열이 함께 프로모터로 작용하여 전사가 일어나게 되어 개시자 RNA가 합성된다(도 13 참조).
도 21에 정리한 실험 결과를 보면 PAL만 있는 시료, THRP만 있는 시료, THRP에 분석물질(A)을 더한 시료에서는 T7 RNA 중합효소를 넣어도 형광이 발생하지 않는다. 그 이유는 RNA가 합성되지 않거나 pepper 압타머의 일부만 생성되기 때문이다. 또한 PAL과 THRP가 모두 있는 시료에서도 분석물질이 없으면 형광이 거의 발생하지 않는다. PAL에서는 RNA가 합성되어도 THRP의 프로모터가 비활성 상태여서 RNA가 거의 합성되지 않기 때문이다. 여기에 분석물질을 넣어주면 뚜렷하게 형광이 증가하는 것을 볼 수 있다(도 21의 A+PAL+THRP). 이는 PAL과 THRP에서 합성된 RNA가 서로 결합하여 pepper 압타머가 형성되었다는 것을 보여준다. 그러나 여기에 RNA를 가수분해하는 RNase를 더하면 형광이 사라지는 것을 볼 수 있는데, 이는 형광 증가의 원인이 pepper 압타머라는 것을 더욱 확실하게 증명해준다.

Claims (19)

  1. 주형 헤어핀(template hairpin, TH)과 프라이머(primer, PR)를 포함하고,
    상기 주형 헤어핀은 5'-말단부터 분석물질(analyte, A)과 상보적으로 결합할 수 있는 분석물질 결합서열(analyte binding sequence, ABSQ); 증폭 효소(amplification enzyme, AE)와 상보적으로 결합할 수 있는 증폭효소 인식서열(amplification enzyme recognition sequence, AESQ); 프라이머와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 결합서열(primer binding sequence, PBSQ) 및 분석물질 결합서열의 전부 또는 일부와 상보적으로 결합할 수 있는 억제서열(inhibitor sequence, INSQ)을 순차적으로 포함하며,
    (a) 상기 분석물질(A)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합할 때, 상기 억제서열(INSQ)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리되는 단계;
    (b) 상기 프라이머 결합서열(PBSQ)에 상기 프라이머(PR)가 결합하는 단계; 및
    (c) 증폭효소가 증폭효소 인식서열(AESQ)에 작용하여 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)에 상보적으로 결합할 수 있는 핵산 분자인 개시자(initiator, I)를 반복적으로 생성하는 단계를 포함하는, 등온 핵산 증폭 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 증폭 효소는 RNA 중합효소(RNA polymerase)이고,
    상기 증폭효소 인식서열(AESQ)은 프로모터 서열(promoter sequence, PMSQ)이며,
    (a) 상기 분석물질(A)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합할 때, 상기 억제서열(INSQ)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리되는 단계;
    (b) 상기 프라이머 결합서열(PBSQ)에 상기 프라이머(PR)가 결합하여 RNA중합효소가 작용할 수 있는 프로모터가 완성되는 단계; 및
    (c) RNA 중합효소(RNA polymerase)가 상기 프로모터에 결합하여 상기 주형 헤어핀에 상보적인 RNA 개시자(I)를 반복적으로 생성하는 단계를 포함하는, 등온 핵산 증폭 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 증폭효소는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 RNA 중합효소이고,
    상기 증폭효소 인식서열(AESQ)은 프로모터 서열(PMSQ)이며,
    (a) 상기 분석물질(A)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합할 때, 상기 억제서열(INSQ)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리되는 단계;
    (b) 상기 프라이머 결합서열(PBSQ)에 상기 프라이머(PR)가 결합하는 단계;
    (c) DNA 중합효소(DNA polymerase)가 상기 프라이머(PR)로부터 시작하여 상기 주형 헤어핀에 상보적인 DNA를 합성하면서 상기 분석물질을 해리시키는 단계; 및
    (d) 그 결과 생성된 이중가닥 생성물(double-stranded product, DSP)의 프로모터 서열(PMSQ)에 RNA 중합효소가 결합하여 RNA 개시자(I)를 반복적으로 생성하는 단계를 포함하는, 등온 핵산 증폭 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 증폭효소는 DNA 중합효소 및 절단 효소(nicking enzyme)이고,
    상기 증폭효소 인식서열(AESQ)은 절단효소 인식서열(nicking enzyme recognition sequence, NESQ)이며,
    (a) 상기 분석물질(A)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합할 때, 상기 억제서열(INSQ)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리되는 단계;
    (b) 상기 프라이머 결합서열(PBSQ)에 상기 프라이머(PR)가 결합하는 단계;
    (c) DNA 중합효소(DNA polymerase)가 상기 프라이머(PR)로부터 시작하여 상기 주형 헤어핀에 상보적인 DNA를 합성하면서 상기 분석물질을 해리시키는 단계;
    (d) 그 결과 생성된 이중가닥 생성물(DSP)의 절단효소 인식서열(NESQ)에 절단 효소가 결합하여 상기 주형 헤어핀에 상보적인 가닥을 절단하는 단계; 및
    (e) DNA 중합효소가 상기 절단된 부분의 3'-말단으로부터 시작하여 DNA를 합성하면서 상기 주형 헤어핀에 상보적인 DNA를 밀어내어 단일 가닥 DNA 개시자(I)를 반복적으로 생성하는 단계를 포함하는, 등온 핵산 증폭 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 결합서열(PBSQ)의 일부가 상기 억제서열(INSQ)에 포함되는, 등온 핵산 증폭 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 분석물질은 핵산이고,
    상기 분석물질 결합서열(ABSQ)은 분석물질의 염기서열에 대해 상보적인 염기서열인, 등온 핵산 증폭 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 분석물질은 진핵세포, 박테리아, 바이러스 입자, 단백질, 탄수화물, 지질, 유기 분자 및 금속이온 가운데 어느 하나이고,
    상기 분석물질 결합서열(ABSQ)은 상기 분석물질과 결합할 수 있는 압타머(aptamer) 서열인, 등온 핵산 증폭 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 주형 헤어핀의 양 끝에 각각 형광체(fluorophore)와 소광체(quencher)가 부착되어 상기 분석물질(A) 또는 개시자(I)의 결합에 의해 형광이 증가하는, 등온 핵산 증폭 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머(PR)에 상기 증폭효소 인식서열(AESQ)의 상보적인 염기서열 일부가 포함되는, 등온 핵산 증폭 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 주형 헤어핀은 분석물질 결합서열(ABSQ)과 억제서열(INSQ) 사이에 기능 서열(functional sequence, FNSQ)을 추가로 포함하는, 등온 핵산 증폭 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 기능 서열(FNSQ)은 CRISPR-Cas 효소를 활성화시킬 수 있는 CRISPR-Cas 목표 서열(target sequence)인, 등온 핵산 증폭 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 기능 서열(FNSQ)은 CRISPR-Cas 효소의 가이드 RNA를 합성할 수 있는 주형 염기서열인, 등온 핵산 증폭 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 기능 서열(FNSQ)은 압타머(aptamer)의 상보적인 염기서열인, 등온 핵산 증폭 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 압타머(aptamer)는 염료 분자와 결합하여 형광을 발생하는 발광 압타머(light-up aptamer)인, 등온 핵산 증폭 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 기능 서열(FNSQ)은 DNA 결합 단백질이 특이적으로 인식하여 결합할 수 있는 염기서열이고,
    상기 DNA 결합 단백질은 억제 단백질(repressor protein), 전사 인자(transcription factor), 호르몬 수용체(hormone receptor), 아연 손가락 영역(zinc-finger domain)을 갖는 단백질, 염기성 류신 지퍼 영역(basic leucine zipper domain)을 갖는 단백질, 나선-회전-나선 영역(helix-turn-helix domain)을 갖는 단백질 가운데 어느 하나인, 등온 핵산 증폭 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머를 포함하는 대신 상기 주형 헤어핀의 3'-말단에 프라이머 서열(primer sequence, PRSQ)을 포함하고,
    상기 프라이머 서열(PRSQ)은 상기 프라이머 결합서열(PBSQ)에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열이며,
    (a) 상기 분석물질(A)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합할 때, 상기 억제서열(INSQ)이 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)로부터 해리되는 단계; 및
    (b) 상기 상기 프라이머 서열(PRSQ)이 프라이머 결합서열(PBSQ)에 결합하면, 증폭효소(amplification enzyme)가 증폭효소 인식서열(AESQ)에 작용하여 상기 분석물질 결합서열(ABSQ)에 상보적으로 결합할 수 있는 핵산 분자인 개시자(I)를 반복적으로 생성하는 단계를 포함하는, 등온 핵산 증폭 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 주형 헤어핀은 5'-말단에 연장서열(extension sequence, EXSQ)이 추가된 복수의 주형 헤어핀이고,
    분석물질(A)이 첫 번째 주형 헤어핀(TH1)의 분석물질 결합서열(ABSQ)에 결합하여 증폭 반응을 일으키며,
    첫 번째 주형 헤어핀에서 생성된 개시자 1이 두 번째 주형 헤어핀(TH2)의 개시자 1 결합서열에 결합하여 증폭 반응을 일으키고,
    두 번째 주형 헤어핀에서 생성된 개시자 2가 세 번째 주형 헤어핀(TH3)의 개시자 2 결합서열에 결합하여 증폭 반응을 일으킴으로써,
    연쇄적인 반응이 일어나는, 등온 핵산 증폭 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 주형 헤어핀의 5'-말단과 상기 프라이머의 5'-말단에 각각 플루오레신(fluorescein) 기 및 바이오틴(biotin) 기를 부착하여, 상기 주형 헤어핀-프라이머 복합체를 측면 흐름 분석법으로 검출하는, 분석물질 검출 방법.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 생성된 개시자(I)의 5'-말단 쪽 절반 및 3'-말단 쪽 절반에 각각 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드인 프로브 1 및 프로브 2를 포함하고,
    상기 프로브 1의 5'-말단 및 프로브 2의 3'-말단에는 각각 플루오레신 및 바이오틴이 고정되어 있어,
    상기 프로브 1-개시자(I)-프로브 2 복합체를 측면 흐름 분석법으로 검출하는, 분석물질 검출 방법.
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