WO2013122319A1 - 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법 - Google Patents

리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법 Download PDF

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target gene
reaction
ligase
amplification
probe
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박현규
박정훈
정예림
정철희
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한국과학기술원
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
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    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/137—Ligase Chain Reaction [LCR]

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target gene or a mutation thereof, and more particularly, to a product of a polymerase chain reaction, when a target gene is present or a mutation in the target gene is present, a ligase reaction product is formed. Then, the present invention relates to a method for detecting a target gene or a mutation thereof by performing a cleavage enzyme amplification reaction.
  • Mutation analysis of genes that cause genetic disorders in humans is basically confirmed through DNA sequencing. However, this method has many limitations because it must analyze the entire sequence of genes. Since a large amount of data is required for analysis of one sample, time, cost, and manpower are consumed. Different analysis conditions are required for genetic mutation analysis of multiple samples, so only one sample can be tested with one test. Not suitable for analyzing multiple samples simultaneously.
  • MALDI-TOF MS Mass-Assisted Laser Desorption / Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry
  • MALDI-TOF MS is a device that analyzes the mass of a sample by measuring the time when the sample is ionized by the laser and the matrix, and the ionized sample is separated from the matrix by the laser and reaches the detector. Due to its small damage to the sample during the ionization process, it is mainly used for mass spectrometry of relatively high molecular weight biological samples such as proteins and DNA (Karas et al. , Anal .
  • the monobase extension reaction is a method in which a primer is extended by only one didioxynucleotide (ddNTP) base by a DNA polymerase. Prolongation with an enzyme produces an extended product of one base that is complementary to the base corresponding to the mutation site. Since the four bases (adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and thymine (T)) that make up the DNA have different masses, the products obtained by the single base extension reaction can be identified by mass spectrometry.
  • SBE Single Base Extension
  • LCR Ligase reaction
  • Ligase chain reaction is a technology that uses ligase to connect two adjacent strands of the left and right probes only when they are completely complementary to the gene sequence to be analyzed. Only products that are joined together by ligase are produced only when they are complementary, and products that are connected together are not produced when the two probes are not complementary in adjacent portions of each other. This can be easily identified through MALDI-TOF MS analysis (Jurinke et al. , Anal. Chem., 237: 174, 1996).
  • the present inventors have tried to develop a method for simultaneously analyzing multiple mutations of a target gene, and as a result, a ligase probe product specific to a mutant sequence is obtained by a ligase reaction, and then mass spectrometry using a cleavage amplification reaction. This easy small DNA fragment was amplified and mass analyzed. Through this method, it was confirmed that it is possible to quickly and accurately analyze multiple mutations in a target gene simultaneously in various samples, and thus, the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a new detection method that can quickly and accurately analyze the target gene or multiple mutations in the target gene at the same time.
  • the present invention comprises the steps of (a) performing a polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction) to produce an amplification product of a target gene comprising a mutation site; (b) a ligase using a first probe and a second probe complementarily binding to the 5 'region and the 3' region, respectively, with respect to the target gene amplification product of step (a) Performing a reaction (Ligase Reaction); (c) adding a mixed solution of a cleavage amplification primer, a cleavage enzyme and a polymerase to the reaction product of step (b) and performing a nicking amplification; And (d) by checking the presence or absence of the DNA fragments amplified in the reaction product of step (c) provides a target gene mutation detection method comprising the step of identifying whether the target gene mutation.
  • a polymerase chain reaction Polymerase Chain Reaction
  • a ligase using a first probe and a second probe complementarily binding to the 5 '
  • the present invention also comprises the steps of (a) performing a polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction) to produce an amplification product of the target gene; (b) performing a ligase reaction on the target gene amplification product of step (a) using a first probe and a second probe that complementarily bind to the target gene, respectively; (c) adding a mixed solution of a cleavage amplification primer, a cleavage enzyme and a polymerase to the reaction product of step (b) and performing a nicking amplification; And (d) by checking the presence or absence of the DNA fragment amplified in the reaction product of step (c) provides a method for detecting a target gene comprising the step of confirming the presence of the target gene.
  • a polymerase chain reaction Polymerase Chain Reaction
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the principle of mass spectrometry for diagnosis of mutation of a target gene using a ligase reaction and cleavage amplification reaction (wild: no mutation; mutant: if there is a mutation).
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the principle of the mass spectrometry method for detecting target genes using a ligase reaction and cleavage enzyme amplification reaction.
  • Figure 3 shows agarose gel electrophoresis results of amplification of exon 11 position of BRCA 1 gene using PCR (first line (1): DNA marker; second line (2): normal DNA without mutation) Other lines (3-7): DNA of patients with different mutations each; amplified gene size of about 3.3 kbp).
  • FIG. 5 is an amplification reaction of a cleavage enzyme using a DNA beacon detection probe in the form of a molecular beacon having a nucleotide sequence complementary to a cleavage amplification reaction product, a fluorescent dye at the 5 end, and a quencher at the 3 'end. The result was confirmed by fluorescence of the product.
  • Figure 6 is a singleplex mass spectrometry to confirm the final result after the cleavage amplification reaction. Only in the presence of mutations does the mass spectrometry peak of the DNA fragment, the product of cleavage amplification reactions (wild: no mutation, mutant: present).
  • a method for preparing amplified product of a target gene including a mutation site comprising: performing a polymerase chain reaction; (b) a ligase using a first probe and a second probe complementarily binding to the 5 'region and the 3' region, respectively, with respect to the target gene amplification product of step (a) Performing a Ligase reaction; (c) adding a mixed solution of a cleavage amplification primer, a cleavage enzyme and a polymerase to the reaction product of step (b) and performing a nicking amplification; And (d) relates to a target gene mutation detection method comprising the step of confirming the presence or absence of amplification of the DNA fragment amplified in the reaction product of step (c).
  • a method for preparing amplification products comprising: (a) performing a polymerase chain reaction to prepare an amplification product of a target gene; (b) performing a ligase reaction with respect to the target gene amplification product of step (a) using a first probe and a second probe complementarily binding to the target gene, respectively; (c) adding a mixed solution of a cleavage amplification primer, a cleavage enzyme and a polymerase to the reaction product of step (b) and performing a nicking amplification; And (d) relates to a method for detecting a target gene comprising the step of confirming the presence of the target gene by the presence or absence of the DNA fragment amplified in the reaction product of step (c).
  • amplification of the mutation region of the target gene by the polymerase chain reaction for the five mutant sites present in BRCA 1 exon 11, and obtained from the ligase reaction and cleavage enzyme amplification reaction As for the amplification product, the detection ability of the target gene having a mutant base was confirmed using various known methods including fluorescence detection method and MALDI-TOF MS, and it was confirmed that the detection performance was excellent (FIGS. 5, 6, and 7). ).
  • a ligase reaction may occur only when a mutation is present in the sequence of the target gene amplified by polymerase chain reaction (PCR). If there is no mutation in the sequence, the principle that no ligase reaction product is generated is used. Since the ligase reaction product is a template for cleavage amplification reaction, the cleavage amplification reaction occurs only when the ligase reaction product is present. In principle, the presence or absence of a mutation or target gene can be read.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the term 'polymerase chain reaction' in the present invention is a molecular biological technique for amplifying DNA, and includes multiplex PCR, nested PCR, quantitative PCR, and real time.
  • Real-time PCR (PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), and touchdown PCR (touchdown PCR) may be used, but is not limited thereto.
  • the purpose of the polymerase chain reaction is to obtain a high yield after the reaction rather than to quantitatively measure the amplification products according to the number of times of amplification, and thus a general method may be used.
  • the term 'ligase reaction' in the present invention is one of gene synthesis methods, and allows the two probes of a specific length to hybridize to the target sequence side by side, and then the nick region of the double helix formed at this time. Is a reaction in which two probes are connected in a single strand state through a conventional ligation based on the principle of linking a nucleic acid by a DNA ligase. Therefore, enzymes commonly used in the art as ligase to induce ligation of nucleic acids can be used without limitation.
  • nick' in the present invention means between two adjacent strands of nucleic acid which are not linked, and are generated when artificially disposing two strands of nucleic acid adjacently or cutting one strand of nucleic acid by a cleavage enzyme.
  • a reaction that exhibits cleavage activity of only one chain of the double-stranded nucleic acid molecule of the enzyme is referred to as nicking or cleavage.
  • the probe used in the ligase reaction of the present invention is used for hybridization with a target gene, and requires two probes per site of the target gene or mutation of the target gene.
  • the probes are characterized by binding complementarily to the left (first probe) and the right (second probe) based on the central position of the target gene or based on the mutation position. If the two probes are complementarily hybridized to the target gene, due to the characteristics of the ligase that connects the 5'-P end of the first probe and the 3'-OH end of the second probe, FIGS. 1 and 2 Likewise, probes will be conjugated to form a complete double helix, and no ligase reaction will occur if there is no target gene or no mutation.
  • the ligase probe used in the mutation detection of the present invention may have a base complementary to the mutation position at the 5 'end of the first probe or the 3' end of the second probe.
  • the first and second probes for ligase reaction which are used for detecting the target gene of the present invention, are characterized in that some sequences are complementary to the left and right sides of the target gene, respectively.
  • the 3 'end of the first probe of the present invention there is an additional base sequence capable of hybridizing a primer for the cleavage amplification reaction, and the cleavage enzyme recognition for the cleavage amplification reaction at the 5' end of the second probe.
  • the primer hybridization sequences are identical to those of the first probe of the ligase reaction, and the product sequence of the cleavage amplification reaction is characterized by being less than about 10,000 Da less than the mass that can be experimentally accepted in the MALDI-TOF MS analysis. .
  • a nucleotide sequence capable of hybridizing a primer for cleavage amplification reaction present on the sequence of the first probe may be used in any sequence within a range where no cross-reaction with the ligase reaction probe occurs.
  • 'clease' refers to an endonuclease that recognizes the nucleotide sequence of a complete or partial double-stranded nucleic acid molecule and cleaves only one chain of the nucleic acid molecule at a specific position relative to the recognition sequence.
  • the recognition sequence depends on the cleavage enzyme, for example N.
  • BstNB I is known to recognize the 5'-GAGTCNNNNN-3 '(N is any base) sequence.
  • the cleavage recognition site included in the second probe of the present invention can be prepared by inserting a known cleavage recognition sequence, and the recognition site of the known cleavage enzyme is apparent to those skilled in the art.
  • the enzyme used in the ligase reaction is selected from the group consisting of 9 0 N ligase, E. coli DNA ligase, Taq DNA ligase, T4 DNA ligase and Ampligase ligase It can be characterized by the above, It is not limited to this, Any ligase which has DNA binding activity can be used.
  • the ligase reaction may not only detect a single target gene or mutation, but also may be performed in one reaction using a plurality of probes that recognize a plurality of targets.
  • the ligase probe may be selected according to each mutation position so that the error of the melting temperature (Tm) value of the portion hybridized with the target gene in each ligase probe sequence is within 5 ° C.
  • the nicking amplification of the present invention is carried out using the ligase reaction product as a template. If a ligase reaction product is present, a cleavage amplification reaction occurs to yield a product of the cleavage amplification reaction, but if a ligase reaction product is not present, a cleavage amplification reaction does not occur so that no product of the cleavage amplification reaction occurs.
  • the principle is used (FIGS. 1 and 2).
  • the cleavage enzyme used in the cleavage amplification reaction is Nb. Bst INt. BstNB I, Nb. BvcC I, Nt. BvcC I and Nt. It may be characterized in that it is selected from the group consisting of the group consisting of Alw I, without being limited thereto, any DNA cleavage enzyme having an activity at 65 °C or less can be used.
  • the polymerase used for the cleavage amplification reaction may be selected from the group consisting of Klenow DNA polymerase, Bsu DNA polymerase, Vent DNA polymerase and Bst DNA polymerase. It is not limited to this, Any DNA polymerase which has a polymerization activity and substitution activity at 65 degrees C or less can be used.
  • the product amplified by the polymerase is characterized by having a sequence complementary to the nucleotide sequence present at the 5 'end of the second probe of the ligase reaction.
  • Identifying the presence or absence of DNA fragments amplified as a result of the nicking amplification of the present invention also allows qualitative detection to determine the presence or absence of specific nucleic acid sequences in the sample to be analyzed.
  • Qualitative detection can include the determination of a labeling group according to methods known in the art.
  • the present invention after purification of the cleavage amplification reaction product, it is possible to determine whether the peak of the cleavage amplification reaction product is detected through mass spectrometry using a MALDI-TOF MS instrument.
  • the generation of the DNA fragment of step (d) is characterized by using MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry).
  • Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry measures the time that a sample is ionized by a laser and a matrix, and the ionized sample is separated from the matrix by a laser and reaches the detector.
  • MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry
  • the presence or absence of the generation of the DNA fragment of step (d) has a base sequence complementary to the cleavage amplification reaction product, molecular beacon containing a fluorophore and quencher (Quencher) A probe in the form of a (molecular beacon) may be used.
  • the term 'molecular beacon' of the present invention has phosphors and quenchers located at the 5 'and 3' ends, and has a stem-and-loop structure, which is used for energy transfer between adjacent phosphors and quenchers.
  • the hairpin structure is released and fluorescence is restored by forming the target DNA and the DNA dimer, while the hairpin structure is encountered when one or more bases meet the mismatched target DNA. It is a DNA probe that retains the fluorescence and continues to disappear. Therefore, molecular beacons can be applied to single base diversity analysis, real-time nucleic acid analysis, real-time quantitative polymerase chain reaction, medical analysis diagnostic equipment, and the like.
  • RNA or DNA labeled with a fluorophore at the 5'-end and a quencher at the 3'-end.
  • known fluorescent materials such as fluorescein, tetramethylrhodamine, Cy5, Cy3, Texas Red, etc. may be used.
  • Those known as conventional quenchers such as dabsyl, dabcyl and blackhole quencher can be used.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the present invention is suitable for the detection of target genes present in medical, diagnostic and forensic uses, for example in human or veterinary medicine, for example in nucleic acids from pathogens such as human pathogens or pathogens of livestock or pets. .
  • pathogens such as human pathogens or pathogens of livestock or pets.
  • viruses or bacteria can be detected.
  • Further preferred uses include genetic variation, for example detection of SNPs in humans or detection of drug resistance, resistance or intolerance or allergies.
  • the present invention is suitable for genotyping, in particular human genotyping, for determining mutations associated with predisposition or increased risk of disorders, allergies and intolerances.
  • the invention can also be used for the detection of genetically modified organisms or strains, organisms or strains of bacteria or viruses, as well as genetically modified livestock animals and the like.
  • the present invention is particularly suitable for the rapid diagnosis of diseases such as genetic diseases, allergic diseases, autoimmune diseases or infectious diseases.
  • the invention is also suitable for detecting the function and / or expression of genes, for example for research purposes.
  • the nucleic acid is or is derived from a natural nucleic acid.
  • Natural target nucleic acids are obtained from biological samples.
  • Preferred biological samples include one or more mammalian tissues, preferably human tissues (eg, blood, plasma / serum, hair, skin, lymph nodes, spleen, liver, etc.) and / or cells or cell lines.
  • the biological sample may comprise one or more human tissues and / or cells. Mammalian and / or human tissue and / or cells may further comprise one or more tumor tissues and / or cells.
  • the target gene is the exon 11 position of the BRCA 1 gene, which is the genetic cause of breast cancer in the event of mutation, and the mutations included are 1041 (AGC deletion, T insertion), 1835 (A deletion), 2552 (C deletion), 3932 (T overlap), 4184 (TCAA deficit).
  • Primers for amplifying this is 3,323 bp in length and is characterized by complementary binding to exon 11 of BRCA 1 (Table 1).
  • PCR was performed on the genes extracted from actual patients using the primers of Table 1 to obtain a final amplification product of 3.3 kb including the five mutation positions.
  • Gene extracted from actual patient sample 0.25 ⁇ M primer set, 1X PCR reaction buffer (60 mM Tris-SO 4 , 20 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 2mMMgSO 4 , 3% glycerol, 0.06% NP-40, 0.05% Tween-20), 0.2 mM dNTPs and 2.5 U LongAmp.
  • Taq polymerase (New England Biolabs, USA) was mixed to prepare a reaction mixture, and DNA was amplified using a C1000 thermo-cycler (Bio-Rad, USA). PCR conditions were 5 minutes at 95 °C for denaturation of double-stranded DNA, and then repeated 40 cycles of 50 seconds at 95 °C, 30 seconds at 58 ° C, 180 seconds at 65 °C, 7 at 65 °C After the final extension process for a minute, the PCR product was confirmed by PCR agarose gel electrophoresis (agarose gel electrophoresis) and the size (Fig. 3).
  • ligase reactions were performed using PCR amplification products of the BRCA gene. Ligase reactions occur at each of the five mutation sites in total, and for mutants only the ligase reaction product is obtained.
  • Target gene amplified by PCR 1 ⁇ M probe set (Integrated DNA Technologies, USA), 1X ligase reaction buffer (10 mM Tris-HCl, 600 ⁇ M ATP, 2.5 mM MgCl 2 , 2.5 mM Dithiothreitol, 0.1% TritonX-100 ) And 1 U 9 ° N DNA Ligase (New England Biolabs, USA) were mixed to prepare a reaction mixture, and the ligase reaction was performed using a C1000 thermo-cycler (Bio-Rad, USA).
  • the ligase reaction was heated for 5 minutes at 95 ° C and then ligation for 15 minutes at 55 ° C to denaturate the double-stranded DNA, the ligase reaction product was polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was used to confirm the result of the ligase reaction (FIG. 4).
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • Cleavage amplification was performed to amplify and generate DNA fragments required for mass spectrometry using the ligase reaction product. Only when there is a mutation in the target gene is the ligase reaction product present, resulting in a cleavage amplification reaction. Result of ligase reaction, 1 ⁇ M primer (Integrated DNA Technologies, USA), 1 ⁇ NEBuffer 2 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM Dithiothreitol), 1 ⁇ M dNTPs, 2.5 U Klenow fragment polymerase ( 3 ′ ⁇ 5′exo-) and 1 U Nb.
  • Bts I nicking enzyme (New England Biolabs, USA) was mixed to prepare a reaction mixture, and cleavage enzyme amplification was performed in an incubator.
  • the cleavage amplification reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours, and the cleavage amplification reaction product was confirmed using a detection probe having a completely complementary molecular beacon.
  • the detection probe has a fluorescent substance inserted at the 5 'end and a quencher at the 3' end, so that no fluorescent signal is generated when there is no cleavage amplification reaction product, but a fluorescent signal is generated when cleavage amplification reaction product is present.
  • the result of the amplification reaction was confirmed (FIG. 5).
  • the reaction solution was purified using Ziptip (Millipore Corporation, USA) to remove other impurities in addition to the cleavage amplification reaction product.
  • the reaction solution was mixed 1: 1 with 0.2 M TEAA (triethylammonium acetate buffer) solution, and then pipetting several times with Ziptip washed with 50% acetonitrile solution and 0.1 M TEAA solution. After washing with 0.1 M TEAA solution to wash Ziptip again, the purified product is extracted with 50% acetonitrile solution.
  • TEAA triethylammonium acetate buffer
  • the purified product was mixed with 3-HPA (3-Hydroxypicolinic acid) in 50% acetonitrile solution at 50 mg / ml, and then mixed with 100 mg / ml Diammonium hydrogen citrate (AHC) solution at 10: 1.
  • AHC Diammonium hydrogen citrate
  • the MALDI substrate containing the dried sample is placed in an Autoflex III (Bruker Daltonics, Germany) MALDI-TOF MS apparatus and the mass of DNA fragments contained in the sample is measured. When the mass of the cleavage amplification reaction product was measured, it was confirmed that there was a mutation in the first extracted BRCA gene (FIGS. 6 and 7).
  • the target gene or a method for detecting a mutation thereof according to the present invention is excellent in sensitivity, specificity and reproducibility as well as having a large number of DNA fragments of any short length. Simultaneous and accurate analysis can be used as a platform for biosensors for on-site diagnosis, as well as for the prevention of genetic diseases, early diagnosis and the development and prescription of personalized medicines.

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Abstract

본 발명은 표적 유전자 또는 이의 돌연변이의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 표적 유전자 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제1 프로브 및 제2 프로브를 이용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 반응산물에 절단효소 증폭 프라이머, 절단 효소 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 반응산물에 증폭된 DNA 절편의 생성유무를 확인하는 단계를 포함하는 표적 유전자 또는 이의 돌연변이의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법은 임의의 짧은 길이의 DNA 조각을 대량 합성하여 질량분석하기 때문에 민감도, 특이도 및 재현성이 우수할 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 표적 유전자의 여러 개의 돌연변이 여부를 동시에 신속 정확하게 분석할 수 있어 유전적 요인에 의한 질병의 예방, 조기 진단 및 개인 맞춤 의약품 개발과 처방뿐만 아니라, 현장진단을 위한 바이오센서의 플랫폼으로 유용하다.

Description

리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법
본 발명은 표적 유전자 또는 이의 돌연변이의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 중합효소연쇄반응의 산물에 대하여, 표적 유전자가 존재하거나 표적 유전자 내 돌연변이가 존재하는 경우, 리가제 반응 산물이 형성되도록 한 후, 절단효소증폭반응을 수행하여, 표적 유전자 또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법에 관한 것이다.
사람의 유전적 질환을 일으키는 유전자의 돌연변이 분석은 기본적으로 유전자의 염기서열분석 방법(DNA Sequencing) 을 통해 확인한다. 그러나 이 분석법은 유전자의 염기서열 전체를 분석해야 하기 때문에 많은 한계가 있다. 한 시료의 분석에 많은 양의 데이터가 필요하므로 시간과 비용 및 인력이 많이 소모되며, 다수 시료의 유전자 돌연변이 분석을 위해서는 각각 다른 분석 조건이 필요하므로 한 번의 검사로 하나의 시료 밖에 검사를 할 수 없어 다수의 시료를 동시에 분석하기에 적합하지 못하다.
이에 따라 최근에는 다수의 샘플에 대하여 동시에 정확하게 분석할 수 있는 기술들이 개발되고 있으며, 이 기술들은 기존의 유전자 염기서열분석 방법을 빠르게 대체해 나가고 있다. 특히 다수 시료의 자동 분석이 가능한 질량분석 방법이 각광받고 있으며, 생체 시료의 질량분석을 위해서는 MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry)를 주로 이용한다. MALDI-TOF MS는 시료가 레이저와 매트릭스에 의해 이온화되고, 이온화된 시료가 레이저에 의해 매트릭스에서 떨어져나가 검출기까지 도달하는 시간을 측정하여 시료의 질량을 분석하는 장비로서, 이온화 과정에서 매트릭스를 이용하기 때문에 이온화 과정 중에 시료의 자체적 손상이 적어 단백질이나 DNA 등 비교적 분자량이 큰 생체 시료의 질량분석에 주로 이용된다 (Karas et al., Anal. Chem., 60:2299, 1988).
MALDI-TOF MS를 이용한 표적 유전자의 돌연변이 검출에는 주로 단일염기연장반응(Single Base Extension, SBE)과 리가제 연쇄반응(Ligase reaction, LCR)이 이용된다. 단일염기연장반응은 DNA 중합효소에 의해 프라이머를 한 개의 다이디옥시뉴클레오티드(ddNTP) 염기만 연장시키는 방법으로, 표적 유전자의 돌연변이 위치 직전까지의 서열과 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 결합시킨 후, 중합효소를 이용해 연장시킴으로써 돌연변이 위치에 해당하는 염기에 상보적인 하나의 염기가 연장된 산물을 생산한다. DNA를 구성하는 네 개의 염기(아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T)) 는 각각의 질량이 다르므로, 단일염기연장반응으로 얻어진 산물은 질량분석을 통해 해당 위치에 어떤 염기서열을 가지고 있는지 파악할 수 있다(Ross et al., Nat. Biotechnol., 16:1347, 1998). 리가제 연쇄반응은 서로 인접한 두 가닥의 왼쪽 프로브와 오른쪽 프로브가 분석하고자 하는 유전자 서열과 완전히 상보적으로 결합한 경우에만 리가제에 의해서 연결되는 특징을 이용한 기술로, 두 개의 프로브가 서로 인접한 부분에서 완전히 상보적인 경우에만 리가제에 의해 하나로 연결된 산물이 생성되고, 두 개의 프로브가 서로 인접한 부분에서 상보적이지 않을 경우에는 하나로 연결된 산물이 생성되지 않는다. 이를 MALDI-TOF MS 분석을 통해 확인하면, 해당 위치에 어떤 염기 서열을 가지고 있는지 쉽게 파악할 수 있다 (Jurinke et al., Anal. Chem., 237:174, 1996).
그러나 단일염기연장반응을 이용한 질량분석의 경우, DNA를 구성하는 네 종류 염기의 질량차이가 크지 않아 질량분석 신호간에 중첩이 빈번히 일어나기 때문에, 모든 표적 유전자 돌연변이 위치의 염기서열이 무엇인지 정확하게 파악하기 어려운 단점이 있다. 또한 리가제 연쇄반응은 두 가닥의 프로브가 연결되는 반응이므로, 리가제 연쇄반응 산물이 MALDI-TOF MS 분석에서 실험적으로 허용될 수 있는 질량보다 큰 경우가 많아 대량의 돌연변이 분석에는 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 표적 유전자의 돌연변이를 동시에 다중 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 리가제 반응으로 돌연변이 염기서열에 특이적인 리가제 프로브 산물을 얻은 후, 이를 절단효소 증폭반응을 이용하여 질량분석이 용이한 작은 DNA 조각으로 증폭 생성하여 이를 질량분석 하였다. 본 방법을 통해 다양한 검체를 대상으로 표적 유전자 내의 여러 개의 돌연변이 여부를 동시에 신속 정확하게 분석할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 표적 유전자 또는 표적 유전자 내의 여러 개의 돌연변이 여부를 동시에 신속 정확하게 분석할 수 있는 새로운 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 돌연변이 위치를 포함하는 표적 유전자의 증폭산물이 제조되도록 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 표적 유전자 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 돌연변이 위치를 중심으로 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제1 프로브 및 제2 프로브를 이용하여 리가제 반응(Ligase Reaction)을 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 반응산물에 절단효소 증폭 프라이머, 절단 효소 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 반응산물에 증폭된 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 돌연변이 여부를 확인하는 단계를 포함하는 표적 유전자 돌연변이 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 표적 유전자의 증폭산물이 제조되도록 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 표적 유전자 증폭산물에 대하여, 표적 유전자에 각각 상보적으로 결합하는 제1 프로브 및 제2 프로브를 이용하여 리가제 반응(Ligase Reaction)을 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 반응산물에 절단효소 증폭 프라이머, 절단 효소 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 반응산물에 증폭된 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 표적 유전자의 검출방법을 제공한다.
도 1은 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자의 돌연변이 진단용 질량분석 방법 원리를 나타낸 개략도이다(wild: 돌연변이가 없는 경우; mutant: 돌연변이가 있는 경우).
도 2는 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 검출용 질량분석 방법 원리를 나타낸 개략도이다.
도 3은 PCR을 이용하여 BRCA 1 유전자의 exon 11 위치를 증폭한 결과를 나타낸 아가로즈젤 전기영동 결과이다(첫 번째 줄(1): DNA 마커; 두 번째 줄(2): 돌연변이가 없는 정상 DNA; 그 외에 다른 줄(3~7): 각각 서로 다른 돌연변이를 가지는 환자의 DNA; 증폭된 유전자의 크기는 약 3.3 kbp).
도 4는 리가제 반응 산물을 확인하기 위한 폴리아크릴아마이드젤 전기영동 결과이다(첫 번째 줄: DNA 마커; 2 ~ 5 번째 줄: 돌연변이가 없는 경우; 6 ~ 9 번째 줄: 돌연변이가 있는 경우; 10 번째 줄: 리가제 연쇄반응을 수행하지 않았을 경우).
도 5는 절단효소 증폭반응 산물과 상보적인 염기서열을 가지고, 5 말단에 형광염료를, 3’ 말단에 소광제(quencher)를 포함하는 분자비콘 형태의 DNA 절편 검출 프로브를 이용하여 절단효소 증폭반응 산물을 형광으로 확인한 결과이다.
도 6은 절단효소 증폭반응 이후 최종 결과를 확인하는 Singleplex 질량분석 결과이다. 돌연변이가 있는 경우에만 절단효소 증폭반응의 산물인 DNA 절편의 질량 분석 피크가 나타난다(wild: 돌연변이가 없는 경우, mutant: 돌연변이가 있는 경우).
도 7은 절단효소 증폭반응 이후 반응산물을 한 튜브에 혼합하여 검출한 Multiplex질량분석 결과이다(wild: 돌연변이가 없는 경우, mutant: 돌연변이가 있는 경우).
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서 (a) 돌연변이 위치를 포함하는 표적 유전자의 증폭산물이 제조되도록 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 표적 유전자 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 돌연변이 위치를 중심으로 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제1 프로브 및 제2 프로브를 이용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 반응산물에 절단효소 증폭 프라이머, 절단 효소 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 반응산물에 증폭된 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 돌연변이 여부를 확인하는 단계를 포함하는 표적 유전자 돌연변이 검출방법에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 (a) 표적 유전자의 증폭산물이 제조되도록 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 표적 유전자 증폭산물에 대하여, 표적 유전자에 각각 상보적으로 결합하는 제1 프로브 및 제2 프로브를 이용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 반응산물에 절단효소 증폭 프라이머, 절단 효소 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계의 반응산물에 증폭된 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 표적 유전자의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 BRCA 1 exon 11에 존재하는 5 종의 변이부위에 대하여, 중합효소연쇄반응으로 상기 표적 유전자의 돌연변이 부위를 증폭하고, 이로부터 리가제 반응 및 절단효소 증폭반응을 통하여 얻어진 증폭산물에 대하여, 형광검출법 및 MALDI-TOF MS를 포함하는 공지된 다양한 방법을 사용하여 변이염기를 가진 표적 유전자 검출능을 확인한 결과, 검출능이 우수함을 확인하였다(도 5, 도 6, 및 도 7).
본 발명의 표적 유전자의 돌연변이 검출방법은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 증폭된 표적 유전자의 서열에 돌연변이가 존재할 경우에만 리가제 반응(Ligase reaction)이 일어날 수 있으며, 표적 유전자의 서열에 돌연변이가 존재하지 않을 경우에는 리가제 반응 산물이 생성되지 않는 원리를 이용하며, 상기 리가제 반응 산물은 절단효소 증폭반응의 주형이 되므로, 리가제 반응 산물이 존재해야 절단효소 증폭반응이 일어나는 원리로 돌연변이 또는 표적 유전자 존재유무를 판독할 수 있다.
본 발명에서의 용어 '중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)'은 DNA를 증폭시키는 분자생물학적 기술로서, 다중 PCR(multiplex-PCR), 네스티드 PCR(nested PCR), 정량적 PCR(quantitative PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(RT-PCR) 및 터치다운 PCR(touchdown PCR) 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서 중합효소연쇄반응의 목적은 증폭 횟수에 따른 증폭산물의 정량적 측정을 목적으로 하기 보다는 반응 후의 높은 수득률을 얻는 것인 바, 일반적인 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서의 용어 '리가제 반응(Ligase reaction)'은 유전자 합성법의 하나로서, 특정 길이의 2종의 프로브를 타겟 서열에 나란히 혼성화되도록 한 후, 이 때 형성되는 이중 나선의 닉(nick) 부위를 DNA ligase에 의하여 통상의 핵산의 연결 원리에 입각한 통상적인 접합(ligation)을 통해 2종의 프로브를 단일 가닥상태로 연결하는 반응이다. 따라서 핵산의 연결을 유도하는 리가제(ligase)로서 당업계에서 통상적으로 사용되는 효소를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에서의 용어 '닉(nick)'은 연결되어있지 않은 인접한 두 가닥의 핵산 사이를 의미하며, 인위적으로 두 가닥의 핵산을 인접하게 배치하거나 한 가닥의 핵산을 절단효소에 의해 절단됐을 때 생성되며, 상기 효소의 이중쇄 핵산 분자의 단지 하나의 쇄의 절단 활성을 나타내는 반응을 '니킹(nicking) 또는 절단'이라고 한다.
본 발명의 리가제 반응(Ligase reaction)에 사용되는 프로브는 표적 유전자와의 혼성화에 사용되며, 표적 유전자 또는 표적 유전자의 돌연변이 위치 한 부위당 두 개의 프로브가 필요하다.
상기 프로브는 표적 유전자의 중앙 위치를 기준으로, 또는 돌연변이 위치를 기준으로 왼쪽(제1 프로브)과 오른쪽(제2 프로브)에 각각 상보적으로 결합하는 특징이 있다. 만일 상기 두 프로브가 상보적으로 표적 유전자에 혼성화되었을 경우에는 제1 프로브의 5'-P 말단과 제2 프로브의 3'- OH 말단을 연결하는 리가제의 특성에 의하여, 도 1 및 도 2과 같이, 프로브가 접합하게 되고 완전한 이중나선을 형성하게 되며, 표적 유전자가 존재하지 않거나, 돌연변이가 없는 경우에는 리가제 반응이 일어나지 않는다.
본 발명의 돌연변이 검출에 사용되는 리가제 반응용 프로브는 제1 프로브의 5' 말단 또는 제2 프로브의 3' 말단에 돌연변이 위치와 상보적인 염기를 가질 수 있다.
본 발명의 표적 유전자 검출에 사용되는 리가제 반응용 제1 프로브 및 제2 프로브는 일부 서열이 표적 유전자의 왼쪽 및 오른쪽에 각각 상보적인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 제1 프로브의 3' 말단에는 절단효소 증폭 반응을 위한 프라이머가 혼성화할 수 있는 추가의 염기 서열이 존재하며, 제2 프로브의 5' 말단에는 절단효소 증폭 반응을 위한 절단효소 인식 부위와 절단효소 증폭 반응에 의해 DNA 절편을 생성하는데 주형으로 사용되는 염기서열이 존재한다. 상기 프라이머 혼성화 염기서열은 리가제 반응의 제1 프로브와 모두 동일하며, 절단효소 증폭 반응의 산물 염기서열은 MALDI-TOF MS 분석에서 실험적으로 허용될 수 있는 질량보다 약 ≤ 10,000 Da로 작은 특징이 있다.
본 발명에서 제1 프로브의 서열 상에 존재하는 절단효소 증폭반응을 위한 프라이머가 혼성화 할 수 있는 염기서열은 리가제 반응 프로브와 교차반응이 일어나지 않는 범위 내에서 어느 서열이든 사용할 수 있다.
본 발명의 용어, '절단효소'는 완전한 또는 부분적 이중쇄 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 인식하고, 인식 서열에 대해 특이적 위치에서 핵산 분자의 단지 하나의 쇄 만을 절단시키는 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 상기 인식서열은 절단효소에 따라 다르며, 예를 들어 N. BstNB I은 5'-GAGTCNNNNN-3' (N 은 임의의 염기)서열을 인식하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 제2 프로브에 포함된 절단효소 인식부위는 공지된 절단효소 인식서열을 삽입함으로써, 제조될 수 있으며, 공지된 절단효소의 인식부위는 당업자에게 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 리가제 반응(Ligase reaction)에 사용하는 효소는 90N리가제, E.coli DNA 리가제, Taq DNA 리가제, T4 DNA 리가제 및 Ampligase 리가제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, DNA 결합 활성을 가지는 리가제라면 어떤 것이든 사용할 수 있다.
또한 상기 리가제 반응은 단일의 표적 유전자 또는 돌연변이 검출이 가능할 뿐만 아니라, 복수의 타겟을 인지하는 복수의 프로브를 사용하여, 한 번의 반응으로 수행할 수 있다. 이 경우에는 각각의 리가제 프로브 염기서열 중 표적 유전자와 혼성화되는 부분의 melting temperature(Tm) 값의 오차를 5 ℃ 이내로 되도록 각각의 돌연변이 위치에 맞는 리가제 프로브를 선정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)은 리가제 반응 산물을 주형으로 이용하여 수행한다. 리가제 반응 산물이 존재할 경우, 절단효소 증폭반응이 일어나 절단효소 증폭반응의 산물이 산출되지만, 리가제 반응 산물이 존재하지 않을 경우, 절단효소 증폭 반응이 일어나지 못하여 절단효소 증폭 반응의 산물이 생기지 않는 원리를 이용한다(도 1 및 도 2).
본 발명에 있어서, 상기 절단효소 증폭반응에 사용되는 절단효소는 Nb. Bst ⅠNt. BstNBⅠ, Nb.BvcCI, Nt.BvcCI 및 Nt.AlwⅠ으로 구성된 군으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 65 ℃ 이하에서 활성을 가지는 DNA 절단효소라면 어떤 것이든 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 절단효소 증폭반응에 사용되는 중합효소는 Klenow DNA 중합효소, Bsu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소 및 Bst DNA 중합효소로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 65 ℃ 이하에서 중합 활성 및 치환 활성을 가지는 DNA 중합효소라면 어떤 것이든 사용할 수 있다.
상기 중합효소로 증폭된 산물은 리가제 반응의 제2 프로브의 5' 말단에 존재하는 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 특징이 있다.
본 발명의 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)의 결과로 증폭된 DNA 절편의 생성유무를 확인하는 단계에서는 분석될 샘플 내의 특정 핵산 서열의 존재 또는 부재를 결정하는 정성적 검출을 또한 허용한다. 정성적 검출은 당업계에 공지된 방법에 따른 표지 기의 결정을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 절단효소 증폭반응 산물을 정제한 후, MALDI-TOF MS 기기를 사용한 질량분석을 통하여 절단효소 증폭반응 산물의 피크가 검출되는지 여부를 판단할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에서 상기 (d) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry)를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 한다.
MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry)는 시료가 레이저와 매트릭스에 의해 이온화되고, 이온화된 시료가 레이저에 의해 매트릭스에서 떨어져나가 검출기까지 도달하는 시간을 측정하여 시료의 질량을 분석하는 장비로서, DNA를 구성하는 네 개의 염기, 즉 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T)의 질량이 서로 다르기 때문에, 이로 구성된 산물은 질량분석을 통해 해당 위치에 어떤 염기서열을 가지고 있는지 파악할 수 있으므로, 형광 물질 등의 라벨을 달지 않아도 리가제 반응 산물을 검출할 수 있으며, 절단효소 증폭반응 산물의 길이를 조절함으로써 다량의 표적 유전자 돌연변이를 한 번에 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서, 상기 (d) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 절단효소 증폭반응 산물에 대해 상보적인 염기서열을 가지며, 형광물질(fluorophore)와 소광제(Quencher)를 포함하는 분자 비콘(molecular beacon) 형태의 프로브를 이용할 수 있다.
본 발명의 용어 '분자 비콘(molecular beacon)'은 5’과 3’ 말단에 형광체와 소광체가 자리 잡고 있으며, 머리핀(stem-and-loop) 구조를 가지고 있기 때문에 인접한 형광체와 소광체간의 에너지 이동에 의해 형광이 소멸되어 있다가 상보적인 서열을 지닌 목표 DNA를 만나면 머리핀 구조가 풀리면서 목표 DNA와 DNA 이중합체를 형성하여 형광이 복원되는 반면, 하나 이상의 염기가 불일치하는 목표 DNA를 만나는 경우에는 머리핀 구조를 계속 유지하면서 형광이 계속 소멸되는 성질을 지니는 DNA 탐침이다. 따라서 분자 비콘은 단일염기 다양성 분석, 실시간 핵산 분석, 실시간 정량적 중합효소연쇄반응, 의료분석진단기 등에 응용될 수 있다.
본 발명의 분자 비콘(molecular beacon) 상태의 프로브는 5'-말단에는 형광물질(fluorophore)이, 3'-말단에는 소광제(quencher)이 표지된 단일가닥 의 RNA 또는 DNA를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 프로브에 표지될 수 있는 형광물질로는 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민 (tetramethylrhodamine), Cy5, Cy3, 텍사스 레드(Texas Red) 등의 공지된 형광물질들을 이용할 수 있고, 소광제로는 댑실(dabsyl), 댑실(dabcyl), 블랙홀소광제(blackhole quencher) 등의 기존의 소광제로 널리 알려진 것들을 이용할 수 있다. 또한, 소광제 대신 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 작용을 할 수 있는 또 다른 형광물질을 표지하여 이용할 수도 있으며, 형광물질과 소광제 선택에 있어서는 당업자에게는 자명한 일이다.
본 발명은 의학적, 진단용 및 법의학적 용도에, 예를 들어 인간 또는 수의학 의약에서, 예를 들어 병원체, 예를 들어 인간 병원체 또는 가축 또는 애완 동물의 병원체로부터의 핵산에 존재하는 표적 유전자 검출에 적절하다. 특히, 예를 들어 바이러스 또는 박테리아를 검출할 수 있다.
추가로 바람직한 용도에는 유전학적 변이성, 예를 들어 인간에서의 SNP의 검출 또는 의약 저항성, 내성 또는 불내성 또는 알러지의 검출이 포함된다. 또한, 본 발명은 장애, 알러지 및 불내성의 소인 또는 위험 증가와 관련이 있는 돌연변이를 결정하기 위한 유전자형 결정, 특히 인간의 유전자형 결정에 적절하다. 본 발명은 유전자 변형 유기체 또는 계통, 박테리아 또는 바이러스의 유기체 또는 계통, 뿐만 아니라 유전자 변형된 가축 동물 등의 검출에 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 질환, 예를 들어 유전자 질환, 알러지 질환, 자가면역 질환 또는 감염성 질환의 신속한 진단에 특히 적절하다.
또한, 본 발명은, 예를 들어 연구 목적으로, 유전자의 기능 및/또는 발현을 검출하는데 적절하다.
상기 핵산은 천연의 핵산이거나 천연의 핵산으로부터 유도된다. 천연의 표적 핵산은 생물학적 샘플로부터 수득된다. 바람직한 생물학적 샘플에는 하나 이상의 포유류 조직, 바람직하게는 사람 조직(예를 들면, 혈액, 혈장/혈청, 모발, 피부, 림프절, 비장, 간 등) 및/또는 세포 또는 세포주가 포함된다. 생물학적 샘플은 하나 이상의 사람 조직 및/또는 세포를 포함할 수 있다. 포유류 및/또는 사람 조직 및/또는 세포는 하나 이상의 종양 조직 및/또는 세포를 추가로 포함할 수 있다.
생물학적 샘플로부터 핵산 집단을 분리시키는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고 용이하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 BRCA1 유전자 돌연변이 진단용 질량 분석
(1) 표적 유전자의 증폭
표적 유전자는 돌연변이가 일어날 경우 유방암의 유전적 원인이 되는 BRCA 1 유전자 중 exon 11 위치이며, 이에 포함된 돌연변이는 1041(AGC 결손, T 삽입), 1835(A 결손), 2552(C 결손), 3932(T 중복), 4184(TCAA 결손) 이다. 이를 증폭하기 위한 프라이머(Integrated DNA Technologies, USA)는 3,323 bp의 길이를 가지며 BRCA 1의 exon 11에 상보적으로 결합하는 특징이 있다(표 1).
표 1
Figure PCTKR2012011425-appb-T000001
돌연변이 진단을 하고자 하는 BRCA 1 유전자를 증폭하기 위하여, 실제 환자에서 추출한 유전자를 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 상기 5 개의 돌연변이 위치를 포함하는 3.3 kb의 최종 증폭 산물을 얻었다. 실제 환자의 샘플에서 추출한 유전자, 0.25 μM의 프라이머 세트, 1X PCR reaction buffer (60 mM Tris-SO4, 20mM(NH4)2SO4, 2mMMgSO4, 3% glycerol, 0.06% NP-40, 0.05% Tween-20), 0.2mM dNTPs 및 2.5 U LongAmp. Taq polymerase (New England Biolabs, USA) 을 혼합하여 반응 혼합물을 제조하였으며, C1000 thermo-cycler (Bio-Rad, USA) 를 이용하여 DNA를 증폭시켰다. PCR의 조건은 이중가닥 DNA를 denaturation 시키기 위하여 95 ℃에서 5 분간 가열한 다음, 95 ℃에서 50 초, 58 °C에서 30 초, 65 ℃에서 180 초의 사이클을 40 번 반복한 뒤, 65 ℃에서 7 분간의 마지막 extension 과정을 거쳤으며, 상기 PCR 산물은 아가로오스 전기영동 (agarose gel electrophoresis) 을 이용하여 PCR 여부와 크기를 확인하였다(도 3).
(2) 리가제 반응
돌연변이 위치의 유전자 염기서열 분석을 위하여, BRCA 유전자의 PCR 증폭산물을 이용해 리가제 반응을 수행하였다. 총 5 개의 돌연변이 위치에서 각각 리가제 반응이 일어나며, 돌연변이의 경우에만 리가제 반응 결과물을 얻는다.
PCR을 이용해 증폭한 표적 유전자, 1 μM의 프로브 세트(Integrated DNA Technologies, USA), 1X ligase reaction buffer (10 mM Tris-HCl, 600 μM ATP, 2.5 mM MgCl2, 2.5mM Dithiothreitol, 0.1% TritonX-100) 및 1 U 9°N DNA Ligase (New England Biolabs, USA) 를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하였으며, C1000 thermo-cycler (Bio-Rad, USA) 를 이용하여 리가제 반응을 수행하였다. 리가제 반응의 조건은 이중가닥 DNA를 denaturation 시키기 위하여 95 ℃에서 5 분간 가열한 다음, 55 °C에서 15 분간의 ligation 과정을 거쳤으며, 상기 리가제 반응 산물은 폴리아크릴아마이드젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 을 이용하여 리가제 반응의 결과물을 확인하였다(도 4). 각각의 리가제 프로브는 표 2와 같다.
표 2
Figure PCTKR2012011425-appb-T000002
(3) 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)
리가제 반응 결과물을 이용하여 질량분석에 필요한 DNA 절편을 증폭 생성하기 위해 절단효소 증폭반응을 수행하였다. 표적 유전자에 돌연변이가 있을 경우에만 리가제 반응 산물이 존재하므로 절단효소 증폭 반응 결과물이 산출된다. 리가제 반응의 결과물, 1 μM의 프라이머(Integrated DNA Technologies, USA), 1X NEBuffer 2 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1mM Dithiothreitol), 1μM dNTPs, 2.5U Klenow fragment polymerase (3´→5´exo-) 및 1 U Nb. BtsI nicking enzyme (New England Biolabs, USA)을 혼합하여 반응 혼합물을 제조하였으며, 항온 반응기에서 절단효소 증폭반응을 수행하였다. 절단효소 증폭반응의 조건은 37 ℃에서 2 시간 반응 하였으며, 상기 절단효소 증폭반응 산물은 이와 완벽히 상보적인 분자 비콘 형태의 검출 프로브를 이용하여 생성 유무를 확인하였다. 이 검출 프로브는 5’ 말단에 형광 물질, 3’ 말단에 소광제가 삽입되어, 절단효소 증폭반응 산물이 없을 때는 형광 신호가 발생되지 않으나, 절단효소 증폭반응 산물이 존재할 경우 형광신호가 발생되어 절단효소 증폭반응의 결과물을 확인하였다(도 5).
표 3
Figure PCTKR2012011425-appb-T000003
(4) 질량분석
MALDI-TOF MS를 이용하여 절단효소 증폭반응의 산물을 질량분석 하는데 있어서, BRCA 1 유전자 중 exon 11 의 1041(AGC 결손, T 삽입), 1835(A 결손), 2552(C 결손), 3932(T 중복), 4184(TCAA 결손)에 대한 절단효소 증폭반응 산물은 각각의 개별튜브에(Singleplex), 또는 한 튜브에 4종을 모두 혼합(Multiplex)하여 돌연변이 검출능을 확인하였다.
우선, 절단효소 증폭반응 산물 외에 다른 불순물을 제거하기 위해 Ziptip(Millipore Corporation, USA) 을 이용하여 반응용액을 정제하였다. 반응이 완료된 용액은 0.2 M TEAA (triethylammonium acetate buffer) 용액과 1:1로 섞은 후, 50 % 아세토나이트릴 용액과 0.1 M TEAA 용액으로 세척된 Ziptip으로 수 차례 파이펫팅을 한다. 다시 Ziptip을 세척하기 위해 0.1 M TEAA 용액으로 세척한 후, 50 % 아세토나이트릴 용액으로 정제된 산물을 추출한다. 정제가 완료된 산물은 3-HPA(3-Hydroxypicolinic acid)를 50 % 아세토나이트릴 용액에 50 mg/ml로 섞은 후, 이 용액을 100 mg/ml AHC(Diammonium hydrogen citrate) 용액과 10:1로 혼합하여 제조된 매트릭스와 1:1로 섞어 MTP 384 groung steel MALDI-TOF MS 기판 위에 2 μl 를 올린 후 완전 건조시킨다. 건조된 시료를 포함하는 MALDI 기판을 Autoflex Ⅲ (Bruker Daltonics, Germany) MALDI-TOF MS 장치에 넣고 시료에 포함된 DNA 절편의 질량을 측정한다. 절단효소 증폭반응 산물의 질량이 측정되는 경우, 처음에 추출한 BRCA 유전자에 돌연변이가 있음을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 검은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법은 임의의 짧은 길이의 DNA 조각을 대량 합성하여 질량분석하기 때문에 민감도, 특이도 및 재현성이 우수할 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 표적 유전자의 여러 개의 돌연변이 여부를 동시에 신속 정확하게 분석할 수 있어 유전적 요인에 의한 질병의 예방, 조기 진단 및 개인 맞춤 의약품 개발과 처방뿐만 아니라, 현장진단을 위한 바이오센서의 플랫폼으로 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (18)

  1. 다음의 단계를 포함하는 표적 유전자의 돌연변이 검출방법:
    (a) 돌연변이 위치를 포함하는 표적 유전자의 증폭산물이 제조되도록 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 표적 유전자 증폭산물에 대하여, 표적 유전자의 돌연변이 위치를 중심으로 5' 영역 및 3' 영역에 각각 상보적으로 결합하는 제1 프로브 및 제2 프로브를 이용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 반응산물에 절단효소 증폭 프라이머, 절단 효소 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 반응산물에 증폭된 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 돌연변이 여부를 확인하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제1 프로브는 5' 말단에 돌연변이 위치와 상보적인 염기를 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제2 프로브는 3' 말단에 돌연변이 위치와 상보적인 염기를 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 리가제 반응에 사용하는 효소는 9°N 리가제, E.coli DNA 리가제, Taq DNA 리가제, T4 DNA 리가제 및 앰플리가제(Ampligase) 리가제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제 1 프로브는 그 3' 말단에 절단효소 증폭반응을 위한 프라이머 혼성화 염기서열을 추가로 가지고 있는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제 2 프로브는 그 5' 말단에 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 절단효소는 Nb. BstⅠ, Nt. BstNB Ⅰ, Nb. BvcC I, Nt. BvcC I 및 Nt. Alw Ⅰ으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 중합효소는 Klenow DNA 중합효소, Bsu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소 및 Bst DNA 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 MALDI-TOF MS((Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry))를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)의 결과로 증폭된 DNA 절편과 상보적인 염기서열을 가지며, 형광물질(Fluorophore)와 소광제(Quencher)를 포함하는 분자 비콘(molecular beacon) 형태의 프로브를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 돌연변이 검출방법.
  11. 다음의 단계를 포함하는 표적 유전자의 검출방법:
    (a) 표적 유전자의 증폭산물이 제조되도록 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 표적 유전자 증폭산물에 대하여, 표적 유전자에 각각 상보적으로 결합하는 제1 프로브 및 제2 프로브를 이용하여 리가제 반응(Ligase reaction)을 수행하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 반응산물에 절단효소 증폭 프라이머, 절단 효소 및 중합효소의 혼합용액을 첨가하고 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)을 수행하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 반응산물에 증폭된 DNA 절편의 생성유무를 확인하여, 표적 유전자의 존재를 확인하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제 1 프로브는 그 3' 말단에 절단효소 증폭반응을 위한 프라이머 혼성화 염기서열을 추가로 가지고 있는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 (b) 단계의 제2 프로브는 그 5' 말단에 절단효소 인식 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계의 리가제 반응에 사용하는 효소는 90N 리가제, E.coli DNA 리가제, Taq DNA 리가제, T4 DNA 리가제 및 앰플리가제(Ampligase) 리가제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계의 절단효소는 Nb. BstⅠ, Nt. BstNBⅠ, Nb. BvcCI, Nt. BvcCI 및 Nt. AlwⅠ으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계의 중합효소는 Klenow DNA 중합효소, BsuDNA 중합효소, Vent DNA 중합효소 및 Bst DNA 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 MALDI-TOF MS((Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry)를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계의 DNA 절편의 생성유무는 상기 (c)의 DNA 절편의 생성유무는 절단효소 증폭반응(Nicking Amplification)의 결과로 증폭된 DNA 절편과 상보적인 염기서열을 가지며, 형광물질(Fluorophore)와 소광제(Quencher)를 포함하는 분자 비콘(molecular beacon) 형태의 프로브를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 검출방법.
PCT/KR2012/011425 2012-02-16 2012-12-26 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법 WO2013122319A1 (ko)

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