CN111909990A - 单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法，包括如下步骤：筛选出可用的引物和探针，所述引物的Tm值高于探针的Tm值；使用所得引物和探针在单管同一个反应体系之中进行PCR反应；使用仪器检测PCR反应荧光值的变化，分析并采集与设计探针相应的通道荧光信号，根据各荧光通道有无解链峰，以判断受检样本是否存在某种缺失突变；根据各荧光通道解链峰的温度，以判断受检样本是否存在某种点突变。本发明有益效果：只需将受检样本基因组DNA加入到检测试剂中，实现同时对多个缺失突变和点突变的检测，一次性闭管操作，消除PCR产物对实验环境的污染。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法。
背景技术
单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，其种类繁多，目前已发现8000多种，综合发病率高达1/100，常见的单基因遗传病包括遗传性耳聋、脊髓性肌肉萎缩症、地中海贫血等。大多数单基因遗传病会出现致死致残，且极少有有效的治疗药物，因此应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断，及时发现生育患儿的风险，阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。所以，简单实用、准确灵敏的基因突变检测方法，是实现此类遗传病有效防控的前提与基础。
常见的单基因缺陷包括基因片段缺失突变和点突变。在目前的实践之中，常规使用的跨越裂点PCR技术(也称裂口PCR，gap-PCR)检测大片段缺失，PCR扩增结合反向点杂交法(PCR-RDB)检测点突变。gap-PCR技术是针对各种缺失突变进行扩增，然后再采用凝胶电泳进行产物分析；PCR-RDB是对目标序列进行PCR扩增，再通过变性、杂交、显色等操作进行突变分析。总的来说，目前常规使用的gap-PCR和PCR-RDB，必须分别单独检测，成本高、工作量大、操作繁琐、检测通量小，难以实现自动化和标准化，且存在PCR扩增后的开管操作而造成实验室携带污染的难题，不能满足大规模人群筛查和临床常规分子诊断需要。
针对上述基因突变检测分析的技术局限，研发相应的技术方法，一次性闭管操作以防止PCR产物携带污染，单反应管检测多种突变类型以提高检测通量且简化操作强度，仪器自动检测分析以实现自动和标准化，是目前方法学研究的主要方向。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种可以单反应管、一次性闭管同步检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
步骤1：设计特异性扩增缺失突变截短的跨越断裂点的序列的引物和特异性扩增包含点突变的序列的引物；
设计特异性识别缺失突变和点突变PCR产物的荧光探针以及相对应的荧光淬灭探针；
步骤2：从步骤1所得候选的引物和探针中筛选出可用的引物和探针；所述筛选的条件为：所述引物的Tm值高于探针的Tm值；
步骤3：使用步骤2所得引物和探针在单管同一个反应体系之中进行PCR反应；
步骤4：使用仪器检测步骤3的PCR反应荧光值的变化，分析并采集与设计探针相应的通道荧光信号，根据各荧光通道有无解链峰，以判断受检样本是否存在某种缺失突变；根据各荧光通道解链峰的温度，以判断受检样本是否存在某种点突变。
进一步的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述引物的Tm值为70-72℃，所述探针的Tm值为45-65℃。
进一步的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述荧光探针的Tm值小于荧光淬灭探针的Tm值。
进一步的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述检测同一突变位点的荧光探针与淬灭探针在与完成扩增目的片段杂交后，所述探针包含的荧光基团和淬灭基团距离为2-8bp。
进一步的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述反应体系还包括模板DNA、PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、甜菜碱和灭菌双蒸水。
进一步的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述步骤3的单管反应体系加入待测样本后，一次性闭管同步检测基因缺失突变和点突变。
进一步的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述探针的非3’端标记相应荧光或淬灭基团，则添加2-5bp与目的序列不匹配的碱基。
本发明有益效果在于：本发明的单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，在检测反应的起始阶段，以较高的退火温度完成目标靶序列的PCR扩增。在此步骤，由于探针的Tm值低于扩增引物，不会与模板杂交而不影响PCR扩增。扩增后的PCR产物，即可作为探针检测的模板，经变性、复性，各特异性荧光探针和淬灭探针与相对应的目标序列互补模板进行分子杂交，荧光探针的荧光基团与淬灭探针的淬灭基团距离靠近而无荧光。随着程序性的温度逐渐上升，各荧光探针在相应的温度时首先发生解链，荧光探针游离于模板、远离淬灭基团而发出荧光，仪器可检测到某一温度、某一荧光通道荧光值的变化。根据各荧光通道有无解链峰，以判断受检样本是否存在某种缺失突变；根据各荧光通道解链峰的温度，以判断受检样本是否存在某种点突变。
本发明检测方法与现有技术相比具有如下优点：1)本发明能够实现同时对多个缺失突变和点突变的检测；2)本发明设计的引物探针具有很好的特异性和重复性；3)本发明所述的方法对基因缺失突变和点突变检测具有良好的灵敏度、稳定性与准确性；4)本发明所述的方法，只需将受检样本基因组DNA加入到检测试剂中，一次性闭管操作，无中间环节，操作简单且可消除PCR产物对实验环境的污染；5)本发明是以当前的常规荧光定量PCR仪为仪器平台，可实现自动化和规模化检测。
附图说明
图1为本发明具体实施方式的实施例1的基本原理及探针位置示意图；
图2为本发明具体实施方式的实施例1的解链分析代表性峰图；
图3为本发明具体实施方式的实施例1的α-珠蛋白基因NG_000006.1:g.10664-44164del缺失突变解链分析峰图；
图4为本发明具体实施方式的实施例1的α-珠蛋白基因HBA2:c.427T>C点突变解链分析峰图；
图5为本发明具体实施方式的实施例1的α-珠蛋白基因NG_000006.1:g.34164-37967del缺失突变解链分析峰图；
图6为本发明具体实施方式的实施例1的α-珠蛋白基因NG_000006.1:g.30908-35164del缺失突变解链分析峰图；
图7为本发明具体实施方式的实施例1的同时含有α-珠蛋白基因缺失突变NG_000006.1:g.26264-45564del和HBA2:c.427T>C点突变的解链分析峰图；
图8为本发明具体实施方式的实施例1的含有α-珠蛋白基因HBA2:c.427T>C点突变杂合子的解链分析峰图；
图9为本发明具体实施方式的实施例1的含有α-珠蛋白基因HBA2:c.377T>C点突变杂合子的解链分析峰图；
图10为本发明具体实施方式的实施例1的含有α-珠蛋白基因HBA2:c.369C>G点突变杂合子的解链分析峰图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
本发明所采取的技术方案是：提供一种单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
步骤1：设计特异性扩增缺失突变截短的跨越断裂点的序列的引物和特异性扩增包含点突变的序列的引物；
设计特异性识别缺失突变和点突变PCR产物的荧光探针以及相对应的荧光淬灭探针；
步骤2：从步骤1所得候选的引物和探针中筛选出可用的引物和探针；所述筛选的条件为：所述引物的Tm值高于探针的Tm值；
步骤3：使用步骤2所得引物和探针在单管同一个反应体系之中进行PCR反应；
步骤4：使用仪器检测步骤3的PCR反应荧光值的变化，分析并采集与设计探针相应的通道荧光信号，根据各荧光通道有无解链峰，以判断受检样本是否存在某种缺失突变；根据各荧光通道解链峰的温度，以判断受检样本是否存在某种点突变。
作为优选的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述用于扩增目的片段的引物和检测突变类型的荧光和淬灭探针均包含在单管同一个反应体系之中。
作为优选的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述单管反应体系为加入待测样本后，一次性闭管同步检测基因缺失突变和点突变。
作为优选的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述特异性检测的基因缺失突变和点突变的荧光探针和淬灭探针为分别单独标记，解链分析Tm值介于45℃-65℃。
作为优选的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述用于特异性扩增的引物对的Tm值比荧光探针、淬灭探针的Tm值高。
作为优选的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述用于特异性检测基因缺失突变和点突变的淬灭探针Tm值比对应的荧光探针Tm值高。
作为优选的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述检测同一突变位点的荧光探针所包含的荧光基团能够被其对应的淬灭探针所包含的淬灭基团淬灭而不能发出荧光。
作为优选的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述检测同一突变位点的荧光探针与淬灭探针在与完成扩增目的片段杂交后，所述探针包含的荧光基团和淬灭基团距离为2-8bp。
作为优选的，上述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法中，所述荧光探针及淬灭探针，如非3’端标记相应荧光或淬灭基团，则添加2-5bp与目的序列不匹配的碱基，以防止未标记3’端在PCR扩增反应中的延伸性。
上述荧光PCR检测方法主要流程包括：
(1)设计特异性扩增缺失突变截短的跨越断裂点(gap-PCR)引物对和特异性扩增包含点突变的正常范围序列引物对。
(2)设计特异性识别缺失突变和点突变PCR产物的单荧光标记探针以及相对应的荧光淬灭探针。
(3)配置荧光PCR反应体系。所述反应体系包含上述特异扩增引物对、特异识别荧光探针及淬灭探针、模板DNA、PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、甜菜碱和灭菌双蒸水。
(4)运行荧光PCR反应及收集实验数据。所述反应过程包括目标靶序列的PCR扩增，变性和复性，45℃-70℃逐渐升温进行解链分析并采集与设计探针相应的通道荧光信号。
(5)数据分析与结果判断。仪器配套软件会根据解链分析荧光信号的变化而自动显示解链分析峰图，峰图峰尖处(倒置峰的最低点)对应的温度即为解链温度，根据各荧光通道有无解链峰，以判断受检样本是否存在某种缺失突变；根据各荧光通道解链峰的温度，以判断受检样本是否存在某种点突变。
上述单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法的原理：设计特异性扩增跨越缺失突变的跨越断裂点(gap-PCR)引物对和特异性扩增包含点突变的正常范围序列引物对，且这些引物的Tm值较高(70-72℃)。设计针对缺失突变及点突变位点的荧光探针和淬灭探针，这些探针的Tm值较低(45-65℃)且荧光探针较其所对应的淬灭探针Tm值更低。在检测反应的起始阶段，以较高的退火温度完成目标靶序列的PCR扩增。在此步骤，由于探针的Tm值低于扩增引物，不会与模板杂交而不影响PCR扩增。扩增后的PCR产物，即可作为探针检测的模板，经变性、复性，各特异性荧光探针和淬灭探针与相对应的目标序列互补模板进行分子杂交，荧光探针的荧光基团与淬灭探针的淬灭基团距离靠近而无荧光。随着程序性的温度逐渐上升，各荧光探针在相应的温度时首先发生解链，荧光探针游离于模板、远离淬灭基团而发出荧光，仪器可检测到某一温度、某一荧光通道荧光值的变化。根据各荧光通道有无解链峰，以判断受检样本是否存在某种缺失突变；根据各荧光通道解链峰的温度，以判断受检样本是否存在某种点突变。
实施例1
请参阅图1至图10，一种单管同时检测α珠蛋白基因(HBA)缺失突变和点突变的荧光PCR方法，包括：
1、设计特异性扩增目的序列的引物对
(1)一对特异性扩增α珠蛋白基因NG_000006.1:g.26264-45564del截短序列的引物对如下所示：
F：5’-agcgatctgggctctgtgttctc-3’(SEQ ID NO.1)，
R：5’-agcccacgttgtgttcatggc-3’(SEQ ID NO.2)。
(2)一对特异性扩增α珠蛋白基因NG_000006.1:g.10664-44164del截短序列的引物对如下所示：
F：5’-cctcagcctcctccatcactcac-3’(SEQ ID NO.3)，
R：5’-gatctgcacctctgggtaggttctgtac-3’(SEQ ID NO.4)。
(3)一对特异性扩增α珠蛋白基因NG_000006.1:g.30908-35164del截短序列的引物对如下所示：
F：5’-ccagtttacccatgtggtgcctc-3’(SEQ ID NO.5)，
R：5’-cccgttggatcttctcatttccc-3’(SEQ ID NO.6)。
(4)一对特异性扩增α珠蛋白基因NG_000006.1:g.34164-37967del截短序列的引物对如下所示：
F：5’-cccctcgccaagtccaccc-3’(SEQ ID NO.7)，
R：5’-gcaaacctgcattgaatctgaaaagtc-3’(SEQ ID NO.8)。
(5)一对特异性扩增α2珠蛋白基因(HBA2)第三外显子正常序列的引物对如下所示：
F：5’-cccctcgccaagtccaccc-3’(SEQ ID NO.7)，该引物为共用引物，此处与前面(4)中所用均为SEQ ID NO.7引物，引物序列一致；
R：5’-agaccaggaagggccggtg-3’(SEQ ID NO.9)。
2、设计特异性识别缺失突变和点突变PCR产物的单荧光标记探针和淬灭探针
(1)特异性检测α珠蛋白基因NG_000006.1:g.26264-45564del缺失突变的荧光和淬灭探针：
5’-ctctgagggtgacgctgtctgctt-ROX-3’(SEQ NO.10)，
5’-BHQ2-ggcccagggaaacccaggtg-3’(SEQ NO.11)；
(2)特异性检测α珠蛋白基因NG_000006.1:g.10664-44164del的荧光和淬灭探针：
5’-Cy5-cactcctggttcatctcagcctgg-3’(SEQ NO.12)，
5’-ccttcgctgttgctgggttcaga-BHQ2-3’(SEQ NO.13)；
(3)特异性检测α珠蛋白基因NG_000006.1:g.30908-35164del的荧光和淬灭探针：
5’-Cy5-caaagatcaggaagtgctggg-3’(SEQ NO.14)，
5’-caggctgctgcctactcggacttc-BHQ2-3’(SEQ NO.15)；
(4)特异性检测α珠蛋白基因NG_000006.1:g.34164-37967del的荧光和淬灭探针：
5’-Cy5-tgcagctggatagggta-3’(SEQ NO.16)，
5’-cagctgggacacacatggctagaac-BHQ2-3’(SEQ NO.17)；
(5)特异性检测α珠蛋白基因点突变位点HBA2:c.369C>G,HBA2:c.377T>C和HBA2:c.427T>C的荧光和淬灭探针：
5’-cacgcctccctggacaagttc-FAM-3’(SEQ NO.18)；
5’-ROX-ctccaaataccgttaagctggagc-3’(SEQ NO.19)；
5’-BHQ1-cttctgtgagcaccgtgctgacct-BHQ2-3’(SEQ NO.20)。
FAM指6-羧基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，Cy5是指花青染料分子5，BHQ1和BHQ2是指荧光淬灭基团。各引物扩增范围及探针杂交位点的位置见图1。
上述用于特异性扩增目的序列的引物(包含SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9)的Tm值均在70-72℃之间。
其中检测α珠蛋白基因NG_000006.1:g.26264-45564del缺失突变的荧光和淬灭探针(SEQ NO.10和SEQ NO.11)的Tm值分别为64.0℃和65.0℃；
检测α珠蛋白基因NG_000006.1:g.10664-44164del的荧光和淬灭探针(SEQ NO.12和SEQ NO.13)的Tm值分别为62.5℃和65.0℃；
检测α珠蛋白基因NG_000006.1:g.30908-35164del的荧光和淬灭探针(SEQ NO.14和SEQ NO.15)的Tm值分别为58.5℃和64.5℃；
检测α珠蛋白基因NG_000006.1:g.34164-37967del的荧光和淬灭探针(SEQ NO.16和SEQ NO.17)的Tm值分别为55.0℃和63.5℃；
检测α珠蛋白基因点突变位点HBA2:c.369C>G,HBA2:c.377T>C和HBA2:c.427T>C的荧光和淬灭探针(SEQ NO.18、SEQ NO.19和SEQ NO.20)的Tm值分别为63.5℃、59.5℃和65.0℃。
所述引物的Tm值均高于所述荧光及淬灭探针的Tm值，且所述淬灭探针的Tm值均高于所述荧光探针的Tm值。
3、处理制备gDNA样本
用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至50-100ng/μl备用。其中gDNA标本可以通过以下方法获得：抽取外周全血标本，EDTA抗凝，采用天根柱式外周血基因组DNA柱式提取试剂(北京天根生物技术公司)抽提得到gDNA样本。
4、配置荧光PCR反应体系，如下表1所示。
表1
所述反应体系中，TaKaRa LA Taq酶及配套LA Taq Buffer、dNTPS购自Takara公司，甜菜碱购自美国Sigma公司。
4、运行荧光PCR反应及收集实验数据
本实施例反应程序为：95℃预变性7min；95℃45sec+64℃1min+72℃2min，50个循环；72℃再延伸5min；95℃变性5min；40℃复性30min；45℃-70℃解链分析并采集FAM、ROX、Cy5通道荧光信号，记录解链分析图谱及对应解链温度值。
所用仪器为宏石SLAN 96P荧光定量PCR仪，购于上海宏石医疗科技有限公司。
5、数据分析和结果判断：
仪器配套软件会根据解链分析荧光信号的变化而自动显示解链分析峰图，峰图峰尖处(倒置峰的最低点)对应的温度即为解链温度。
对于基因缺失突变，如图3所示：Cy5通道于62.5±1.0℃有一个解链峰，可判定此样本含有NG_000006.1:g.10664-44164del缺失突变。
对于基因点突变，如图4所示：ROX通道于50.5±1.0℃有一个解链峰，可判定此样本有HBA2:c.427T>C点突变。
如图5所示：Cy5通道于55.0±1.0℃有一个解链峰，可判定此样本有NG_000006.1:g.34164-37967del缺失突变。
如图6所示：Cy5通道于58.5±1.0℃有一个解链峰，可判定此样本有NG_000006.1:g.30908-35164del缺失突变。
如图7所示：ROX通道有64.0±1.0℃和50.5±1.0℃两个解链峰，可判定此样本同时含有NG_000006.1:g.26264-45564del缺失突变和HBA2:c.427T>C点突变。
如图8所示：ROX通道有50.5±1.0℃和59.5±1.0℃两个解链峰，可判定此样本有野生型和HBA2:c.427T>C点突变，据此可确定此样本为含有α-珠蛋白基因HBA2:c.427T>C点突变的杂合子。
如图9所示：FAM通道有60.0±1.0℃和63.5±1.0℃两个解链峰，可判定此样本有野生型和HBA2:c.377T>C点突变，据此可确定此样本为含有α-珠蛋白基因HBA2:c.377T>C点突变的杂合子。
如图10所示：FAM通道有53.0±1.0℃和63.5±1.0℃两个解链峰，可判定此样本有野生型和HBA2:c.369C>G点突变，据此可确定此样本为含有α-珠蛋白基因HBA2:c.369C>G点突变的杂合子。
本实施例中检测的7种突变类型，其解链温度均设计在45℃-68℃之间,此7个突变型对应的荧光通道及解链温度见表2。检测结果可按上述操作说明获得受检样本的解链温度，然后再结合表2分析其突变基因型，表2为α珠蛋白基因缺失突变和点突变对应荧光通道及解链温度表。
表2
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 亚能生物技术(深圳)有限公司
<120> 单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agcgatctgg gctctgtgtt ctc 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcccacgtt gtgttcatgg c 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctcagcctc ctccatcact cac 23
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatctgcacc tctgggtagg ttctgtac 28
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccagtttacc catgtggtgc ctc 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccgttggat cttctcattt ccc 23
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cccctcgcca agtccaccc 19
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcaaacctgc attgaatctg aaaagtc 27
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agaccaggaa gggccggtg 19
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctctgagggt gacgctgtct gctt 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggcccaggga aacccaggtg 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cactcctggt tcatctcagc ctgg 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccttcgctgt tgctgggttc aga 23
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caaagatcag gaagtgctgg g 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
caggctgctg cctactcgga cttc 24
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgcagctgga tagggta 17
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cagctgggac acacatggct agaac 25
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cacgcctccc tggacaagtt c 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ctccaaatac cgttaagctg gagc 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cttctgtgag caccgtgctg acct 24
Claims (7)
1.一种单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：设计特异性扩增缺失突变截短的跨越断裂点的序列的引物和特异性扩增包含点突变的序列的引物；
设计特异性识别缺失突变和点突变PCR产物的荧光探针以及相对应的荧光淬灭探针；
步骤2：从步骤1所得候选的引物和探针中筛选出可用的引物和探针；所述筛选的条件为：所述引物的Tm值高于探针的Tm值；
步骤3：使用步骤2所得引物和探针在单管同一个反应体系之中进行PCR反应；
步骤4：使用仪器检测步骤3的PCR反应荧光值的变化，分析并采集与设计探针相应的通道荧光信号，根据各荧光通道有无解链峰，以判断受检样本是否存在某种缺失突变；根据各荧光通道解链峰的温度，以判断受检样本是否存在某种点突变。
2.根据权利要求1所述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述引物的Tm值为70-72℃，所述探针的Tm值为45-65℃。
3.根据权利要求1至2任一项所述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述荧光探针的Tm值小于荧光淬灭探针的Tm值。
4.根据权利要求1所述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述检测同一突变位点的荧光探针与淬灭探针在与完成扩增目的片段杂交后，所述探针包含的荧光基团和淬灭基团距离为2-8bp。
5.根据权利要求1所述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述反应体系还包括模板DNA、PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、甜菜碱和灭菌双蒸水。
6.根据权利要求1所述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤3的单管反应体系加入待测样本后，一次性闭管同步检测基因缺失突变和点突变。
7.根据权利要求1所述的单管同时检测基因缺失突变和点突变的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述探针的非3’端标记相应荧光或淬灭基团，则添加2-5bp与目的序列不匹配的碱基。
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