CN112695097B - 一种区分cyp2d7p和cyp2d8p的cyp2d6*10遗传多态性检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种区分CYP2D7P和CYP2D8P的CYP2D6*10遗传多态性检测试剂盒，属于分子医学技术领域。本发明的试剂盒利用高度特异的引物对CYP2D6（rs1065852）进行精准的靶向扩增，结合Taqman探针高特异性、快速简便的优点实现CYP2D6（rs1065852）的基因分型。

Description

一种区分CYP2D7P和CYP2D8P的CYP2D6*10遗传多态性检测试 剂盒

技术领域

本发明属于分子医学技术领域，具体涉及一种用以区分假基因CYP2D7P和CYP2D8P从而精准扩增和分型CYP2D6*10遗传多态性的检测试剂盒。

背景技术

细胞色素P450 2D6又称异喹胍4’-羟化酶，为CYP第二亚家族中的重要成员，是一种由人CYP2D6基因所编码的酶，主要在肝脏和中枢神经系统中表达。CYP2D6通过羟基化、去甲基化和脱烷基化等代谢和消除约25%的临床使用的药物，是人体中最重要的药物代谢酶之一。

由于不同个体间CYP2D6的基因型不同导致其酶的活性和数量存在很大差异,人群中CYP2D6的活性呈现强代谢者（EM）、中间代谢者（IM）、弱代谢者（PM）和超强代谢者（UM）四态分布的现象。对于由CYP2D6代谢的药物即CYP2D6底物，某些个体会快速地清除这些药物（超速代谢者），而某些个体会缓慢清除这些药物（弱代谢者）。如果药物代谢过快，可能会降低药物的功效，而如果药物代谢过慢，可能会产生毒性。因此，根据不同个体对CYP2D6代谢药物的速度，需要对药物的剂量进行相应的调整。

目前已发现了CYP2D6基因的70多种遗传变异。不同突变类型对酶活性和药物代谢的影响不一。中国人群中CYP2D6常见的导致酶活性降低的等位基因包括CYP2D6*3（A2637deletion）、CYP2D6*4（G1934A）、CYP2D6*5（CYP2D6 deletion）和CYP2D6*10（C188T 即rs1065852 或C100T），等位基因频率分别为1％、1％、6％和53％。其中，CYP2D6*5为基因缺失多态，导致PM表型；CYP2D6*10为该酶第34位脯氨酸被丝氨酸所替代所致，导致IM表型。

目前常用的基因分型方法大致可分为三类：一是基于凝胶电泳的技术，如PCR 反应结合限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）、多重 PCR、等位基因特异性扩增等；二是基于荧光标记杂交反应的基因分型技术，包括寡核苷酸连接分析、焦磷酸法DNA 测序、直接杂合子测序以及等位基因特异性引物延伸等。以上二种方法都是在 PCR 扩增反应之后，再采取不同的方法检测多态性位点。三是基因芯片技术，基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。基因芯片技术由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，但也存在检测时条件难以控制、重复性差，准确性低，易出现假阳性、假阴性结果、灵敏度较低等缺点。此外，还有磁珠/PCR荧光探针法、怛温扩增法、PCR溶解曲线法、PCR+导流杂交法等方法。上述各种方法都具有各自的优缺点及适用性。

由于CYP2D6存在两个序列高度相似的假基因CYP2D7P和CYP2D8P。通常PCR扩增的产物片段都在400bp以内，而CYP2D6（rs1065852）位点附近约400bp的片段与CYP2D7P的相似度高达95%以上，与CYP2D8P的相似度也高达88%以上。由于假基因的存在使得CYP2D6很难像其他不存在假基因的基因一样通过普通的引物进行扩增，往往扩增产物除了CYP2D6外，其假基因也被一并地扩展出来，使基因分型结果受到严重的干扰，这也是目前很多研究没有注重的干扰因素。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种用以区分假基因CYP2D7P和CYP2D8P从而精准扩增和分型CYP2D6*10遗传多态性的检测试剂盒，利用高度特异的引物对CYP2D6（rs1065852）进行精准的靶向扩增，结合Taqman探针高特异性、快速简便的优点实现CYP2D6（rs1065852）的基因分型。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：

一种用于检测CYP2D6遗传多态性的引物探针组合，所述引物探针组合包括以下引物和探针：

引物：CYP2D6-F:5’-GCGCTCGGTGTGCT-3’

CYP2D6-R:5’-CTGTGGTTTCACCCACCAT-3’

探针：CYP2D6-Pw:FAM-5’-CTGCACGCTACCCACC-3’- BHQ1

CYP2D6-Pm:HEX-5’-CTGCACGCTACTCACC-3’-BHQ1。

上述引物探针组合在区分假基因CYP2D7P和CYP2D8P从而扩增和分型CYP2D6*10遗传多态性中的应用。

一种用于检测CYP2D6遗传多态性的试剂盒，包括上述引物探针组合。

进一步地，所述试剂盒还包括：

反应体系（PCR Mix）：10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，2.5mmol/L MgCl₂，2.0mmol/LdNTP 溶液，1U Champagne Taq，0.1U UNG酶，0.4 μ mol/L CYP2D6-F，0.4 μ mol/LCYP2D6-R，0.4 μmol/L CYP2D6-Pw，0.4 μmol/L CYP2D6-Pm；

阴性对照：灭菌超纯水；

阳性对照：rs1065852野生型及突变型质粒混合液。

本发明采用荧光定量PCR（FQ-PCR）技术检测 CYP2D6 基因多态性，FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团，靠近3’端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来。不同的等位基因探针由于标记的荧光染料不同，因此所发荧光信号不同，可通过对荧光信号的检测判断样本的基因型。

高度特异的引物可以避开CYP2D6假基因序列的影响，实现CYP2D6单一扩增，扩增产物纯净无干扰。不同的荧光基团标记的探针可同时检测样品中CYP2D6（rs1065852）多态性，实现单管封闭可同时检测SNP，克服传统荧光法检测通量不高的缺陷，减少了交叉污染的几率；操作简便，检测快速；检测结果直观，根据不同的荧光信号产生的扩增曲线即可定性判断待测样本中各种基因型，无需繁琐的分析过程。本发明的试剂盒具有灵敏度高，分型准确，操作简便快捷等优点，可对患者进行有效的用药指导，提高药物的疗效、降低药物不良反应，为实现个体化治疗提供依据。可指导临床选择合适的药物和给药剂量，减少不良反应的发生。

附图说明

图1为采用纯水为阴性对照时，FAM(465-510 nm)和HEX(533-580nm)检测通道均无扩增曲线产生。

图2为对已知rs1065852 为C型的临床样本进行扩增反应，FAM检测通道有一条扩增曲线产生，HEX检测通道无扩增曲线，结果说明在该反应条件下含荧光基团FAM的探针只对rs1065852的C型基因的目标片段有特异结合，荧光基团HEX的探针不结合SNP位点为C的目标片段，两种探针不存在交叉反应。

图3为对已知rs1065852 为T型的临床样本进行扩增反应，HEX检测频道有一条扩增曲线产生，FAM检测通道无扩增曲线，结果说明在该反应条件下含荧光基团HEX的探针只对rs1065852的T型基因的目标片段有特异结合，荧光基团FAM的探针不结合SNP位点为T的目标片段，两种探针不存在交叉反应。

图4为对已知rs1065852 为C/T型的临床样本为模板进行扩增反应，FAM和HEX检测通道均有扩增曲线产生，实验结果说明同一反应管同时存在二种基因型，反应体系不影响试剂盒的灵敏性、特异性。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

实施例1

一、材料

1、仪器

实时荧光PCR仪、移液器、离心机、小型涡旋仪、紫外分光光度计。

2、引物、探针

本实施例设计了一对高效特异引物用于目标基因的检测，一对标记的荧光染料的探针检测相应的CYP2D6多态性位点。

引物、探针序列如下：

引物：

CYP2D6-F:5’-GCGCTCGGTGTGCT-3’（SEQ ID NO.1）

CYP2D6-R:5’-CTGTGGTTTCACCCACCAT-3’ （SEQ ID NO.2）；

探针：

CYP2D6-Pw:FAM-5’-CTGCACGCTACCCACC-3’- BHQ1（SEQ ID NO.3）

CYP2D6-Pm:HEX-5’-CTGCACGCTACTCACC-3’-BHQ1（SEQ ID NO.4）。

3、试剂

10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，2.5mmol/L MgCl₂，2.0mmol/L dNTP 溶液，1UChampagne Taq，0.1U UNG酶。

二、方法

1、样本选择

厦门大学附属第一医院体检人群的全血样本。

2、基因组DNA提取

采用市售人全血基因组DNA提取试剂盒提取人基因组。

3、实时荧光PCR扩增与检测

实时荧光PCR反应体系：10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，2.5mmol/L MgCl₂，2.0mmol/L dNTP 溶液，1U Champagne Taq，0.1U UNG酶，各0.4 μmol/L引物及荧光探针，25ng人基因组DNA。

实时荧光PCR反应在SLAN 96S仪器上按以下条件进行扩增检测：

第一阶段：95℃ 3min。

第二阶段：95℃ 20sec，62℃ 20sec（荧光采集），72℃ 20sec (40 Cycles)

二个荧光检测频道分别为FAM、HEX。

4、结果分析

阴性对照：以纯水作模板的反应管内应无任何扩增曲线产生。如图1所示。

阳性对照：分别对已知rs1065852-C型、rs1065852-T型和rs1065852-C/T型临床样本进行扩增。结果为rs1065852-C型的FAM通道为S型扩增曲线，HEX通道无扩增曲线；rs1065852-T型的FAM通道无扩增曲线，HEX通道为S型扩增曲线；rs1065852-C/T型两个通道均为S型扩增曲线。如图2-图4所示。

结果判定：样本反应管中FAM检测频道有扩增曲线产生则判定存在SNP位点上rs1065852 C型基因，HEX检测频道有扩增曲线产生则存在SNP位点上rs1065852 T型基因，若FAM、HEX检测频道同时有扩增曲线产生则SNP位点上rs1065852存在C、T两种基因型。

为验证本方法的准确性，将200个临床样本的用该方法进行扩增分型并将扩增产物进行Sanger测序，将扩增分型结果与测序结果进行对比，符合率达100%且扩增产物中不存在高度相似的假基因CYP2D7P和CYP2D8P目标序列。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种区分CYP2D7P和CYP2D8P的CYP2D6*10遗传多态性检测试剂盒

<130> 20201125

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgctcggtg tgct 14

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgtggtttc acccaccat 19

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgcacgcta cccacc 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgcacgcta ctcacc 16

Claims (3)

1.一种用于区分假基因CYP2D7P和CYP2D8P从而扩增和分型CYP2D6*10遗传多态性的引物探针组合，其特征在于：所述引物探针组合包括以下引物和探针：引物：CYP2D6-F:5’-GCGCTCGGTGTGCT-3’CYP2D6-R:5’-CTGTGGTTTCACCCACCAT-3’探针：CYP2D6-Pw:FAM-5’-CTGCACGCTACCCACC-3’-BHQ1CYP2D6-Pm:HEX-5’-CTGCACGCTACTCACC-3’-BHQ1。

2.一种用于区分假基因CYP2D7P和CYP2D8P从而扩增和分型CYP2D6*10遗传多态性的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组合。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：反应体系：10mmol/LTris-HCl pH 8.0，2.5mmol/L MgCl2，2.0mmol/L dNTP溶液，1U Champagne Taq，0.1U UNG酶，0.4μmol/L CYP2D6-F，0.4μmol/L CYP2D6-R，0.4μmol/L CYP2D6-Pw，0.4μmol/LCYP2D6-Pm；

阴性对照：灭菌超纯水；

阳性对照：rs1065852野生型及突变型质粒混合液。

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