CN112442525B - 用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir基因分型的试剂盒 - Google Patents
用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir基因分型的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR常见的16种基因，其中包括14个KIR功能性基因（2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5A/B、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DL1、3DL2、3DL3和3DS1）和2个假基因（2DP1和3DP1），以及2DS4的常见变异体的PCR扩增引物组和Taqman探针，所述的组合包含6个引物组。本发明还提供了含有所述的PCR扩增引物组和Taqman探针组合的试剂盒。本发明具有如下技术效果：本发明采用ARMS分析法结合Taqman多重荧光PCR技术对KIR基因进行定性分型检测，并在传统ARMS基础上进行了改良，克服了现有检测方法的种种缺陷，具有广泛的应用前景与临床参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR基因分型的方法和试剂盒，属于生物医学临床分子检测领域。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)来源于骨髓淋巴样干细胞，其发育成熟依赖于骨髓和胸腺微环境。NK细胞主要分布于外周血和脾，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。NK细胞不表达特异性抗原识别受体，是不同于T、B淋巴细胞的一类淋巴样细胞。NK细胞可表达多种表面标志，其中多数也可表达于其他免疫细胞表面。NK细胞属于非特异性免疫细胞，它们无需抗原预先致敏，就可直接杀伤某些肿瘤和病毒感染的靶细胞，因此在机体抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫过程中起重要作用。NK细胞能够杀伤某些病毒感染的细胞和突变的肿瘤细胞，而对宿主正常组织细胞下不具细胞毒作用，表明NK细胞具有识别宿主自身正常组织细胞和体内异常组织细胞的能力。近年来研究证实，NK细胞表面具有两类功能截然不同的受体，其中一类受体与靶细胞表面相应配体结合后，可激发NK细胞产生杀伤作用，称为杀伤细胞活化受体；另一类受体与靶细胞表面相应配体结合后，可抑制NK细胞产生杀伤作用，称为杀伤细胞抑制受体。NK细胞识别HLA I类分子的受体由两种结构不同的家族分子构成。一种称之为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killerimmunoglobulin-like receptor,KIR)；另一种称之为杀伤细胞凝集素样受体(killerlectin-like receptor,KLR)。
KIR(killer immunoglobulin-like receptor,KIR)是位于NK细胞和某些T细胞表面表达的一组特异性识别人类主要组织相容性抗原MHCⅠ类分子的受体，对NK细胞效应功能的发挥起重要免疫调节作用。KIR位于人类19q13.4，白细胞受体复合物(LRC)上，跨距约150kb、头尾排列，聚集成簇和多态性丰富的多基因家族所编码，基因呈不规律排列，其结构和功能具有多样性。Uhrberg等首次采用PCR-SSP方法对KIR进行基因分型，显示了在不同NK细胞克隆含有不同数目和种类的KIR基因。由于KIR基因分型方法的不断改进和完善，KIR基因家族成员的不断扩增，先前忽略的基因，假基因和变体不断浮出水面，Katharine等证实通过家系分离和基因组测序和基因序列的确定，单凭基因含量就超过20多种KIR单倍型和至少40-50种KIR基因型，目前在低分辨水平上可检测的有18个KIR基因型，即KIR1D、KIR2D1-5、KIR2DS1-5、KIR3DL1-3、KIR3DS1、假基因Xv、X和KIR2DP1，这些基因表现出不同程度的多态性。在Uhrberg、Norman和Gomez-Lozano等人的工作基础上，其他研究工作者通过重新调整合成多对引物优化KIR分型的正确性。
目前主要的KIR基因分型方法有PCR-RFLP法、PCR-SSOP法、PCR-SSP法、PCR-SBT法、SYBR Green I及Taqman荧光定量PCR法等。PCR-RFLP即PCR-限制性片段长度多态性检测技术，基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。此方法需构建等位基因特异性酶切位点，操作复杂，结果不能自动获得且带有主观性。PCR—SSOP即PCR-特异性序列寡核苷酸探针，基本方法是用人工合成的KIR型别特异的寡核苷酸序列作为探针，与待检样品经PCR扩增的KIR基因片段杂交，从而确定KIR型别。此法存在大量探针设计困难，以及在实验程序的最佳条件摸索中需要投入巨大的人力物力，并需配备杂交仪，而且实验室间可重复性差、准确度有待提高。PCR-SSP即序列特异性引物技术，基本方法是设计出一整套等位基因特异性引物，借助PCR技术获得KIR型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定KIR型别。此法操作相对简单，省去酶切、杂交等步骤，PCR扩增后直接电泳观察结果，如今广泛应用于临床。但其结果无法自动获得，带有主观性，准确度有待提高。PCR-SBT(PCR-直接测序法)也可用于KIR基因分型，但由于价格昂贵、操作复杂、时间冗长等原因，未在临床得到广泛应用。SYBR GreenⅠ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其与DNA的结合是非特异性的，此方法虽然操作简便、快速，但缺乏特异性，准确性差。
Taqman荧光定量PCR法，即在PCR反应体系中加入一条与靶片段两引物内的序列互补的荧光标记探针，探针为5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸，在PCR扩增过程中，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后对未知模板进行定性分析或通过标准曲线进行定量分析的方法。Taqman荧光PCR通常应用一对引物和一条探针，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定；多重Taqman荧光PCR是在同一PCR反应体系里加上二对或以上引物和相应的两条或多条探针，同时扩增出两个或者两个以上核酸片段，鉴定两种或两种以上的靶片段存在与否。因此，多重Taqman荧光定量PCR检测，一管多检，准确、高效满足检测需求。
中国专利CN201610668515.8，名称为“用于KIR基因PCR-SSP分型检测的引物组合及试剂盒及方法”，提供了一种KIR等位基因分型检测试剂盒。试剂盒中利用的方法学为PCR-SSP技术，需通过电泳扩增条带决定KIR型别，从而完成KIR等位基因分型检测。其应用的PCR-SSP方法学虽然操作简单方便，但是电泳制胶，实验过程时间较长，而且结果无法自动获得，带有主观性，准确度有待提高，同时也不利于大批量样本检测。
中国专利CN109486963A，名称为“一种人类KIR基因分型检测引物组及应用”，提供了一种检测人类KIR基因分型检测的试剂盒。在方法学角度，试剂盒利用PCR掺入染料法，通过DNA的扩增产物来表示DNA扩增的效果，即SYBRGeen I法，其作用原理为：SYBR Green I是一种与双链DNA小沟槽结合的染料，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可以发光。所以其缺点在于其非特异性，当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定性及定量。在通量角度，该试剂盒包含16对引物，每人份的检测包括16个检测孔，不利于大批量样本检测。同时无法对人类KIR基因分型进行全面性的检测，因为试剂盒无法检测出2DL5A,2DL5B及2DS4的常见变体等。该试剂盒对样本的要求较高，肝素抗凝的全血样本，该试剂盒无法检测；EDTA抗凝全血样本，要求提取的DNA样本浓度在40-70ng/ul之间，所以样本DNA最低检测限较高，相对灵敏度较差。检测结果分析复杂化，结果的分析需利用多个参数综合分析，其中包括波峰荧光导数值，阳性，阴性和多个Tm判断值范围，从而找出阳性孔，整个实验过程和分析时间较长远超一个小时。
中国专利CN106222288A，名称为“用于KIR基因PCR-SSP分型检测的引物组合及方法”，提供了一种用于KIR基因多重PCR-SSP分型检测的引物组合，试剂盒中利用的方法学为PCR-SSP技术，需通过电泳扩增条带决定KIR型别，从而完成KIR等位基因分型检测。其应用的PCR-SSP方法学虽然操作简单方便，但是电泳制胶，实验过程时间较长，而且结果无法自动获得，带有主观性，准确度也有待提高，同时也不利于大批量样本检测。总的来说PCR-SSP是一种相对简单方便、特异性高的方法，且目前已有基于PCR-SSP方法进行单特异性引物检测KIR的试剂盒，但还是由于KIR基因本身的复杂性，当标本为某些基因型时，检测中存在着结果判读、漏判或不易判断结果，监测不稳定等的技术问题。虽然该试剂盒同时用两套引物检测KIR基因，结果可以互相核对，一定程度提高了准确性和可靠性，但是无法排除实验过程中仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果。在检测通量角度，该试剂盒每人份需进行12个孔位的检测，通量较小，不利于大批量样本检测。
中国专利CN104032025A，名称为“用于KIR基因快速分型的引物、试剂盒及方法”，该试剂盒提供了一种KIR基因的PCR-SSP分型方法学的快速分型试剂盒。在方法学角度，试剂盒中利用的方法学为PCR-SSP技术，需通过电泳扩增条带决定KIR型别，从而完成KIR等位基因分型检测。其应用的PCR-SSP方法学虽然操作简单方便，但是电泳制胶，实验过程时间较长，需要3个小时，而且结果无法自动获得，带有主观性，准确度有待提高。在通量角度，该试剂盒包含23组引物，每人份的检测包括23个检测孔，不利于大批量样本检测。同时该试剂盒只能检测16个KIR基因，存在对人类KIR基因分型检测全面性的缺陷，无法准确检测出2DL5A,2DL5B及2DS4的常见变体等。
扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)分析法一种在PCR基础上发展起来用于检测DNA中各种点突变的新方法，其依据的基本原理是：TaqDNA聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，因此对于3’末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3’末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸，反应终止，也就得不到特异性扩增片段，从而表明模板DNA没有与引物3’末端相应的突变；如果PCR结果能得到特异性扩增片段，表明模板DNA上具有与引物3’末端相应的突变。特异性引物设计和筛选是ARMS技术中的关键，在引物中引入第二个错配碱基可以提高检测的准确性和灵敏度。所以该方法在实际应用中具有简便、快速、费用低、准确性和灵敏度高等特点，一旦方法建立后比其他SNP分型技术具有更适合大规模检测的特点，具有广阔的应用前景。
由此可见，本领域亟需一种操作简便快捷，价格适中，且准确度高的检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，如样本检测通量小，扩增产物非特异性及假阴性结果，实验过程较长，结果准确度低，分析复杂化，样本DNA浓度最低检测限较高，相对灵敏度较差，KIR基因检测不全面等问题，本发明提供一种用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR基因分型的方法和试剂盒。
本发明的原理是：采用扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutationsystem，ARMS)分析法结合Taqman荧光PCR技术对KIR常见16种基因型，其中包括14个KIR功能性基因(2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5A/B、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DL1、3DL2、3DL3和3DS1)和2个假基因(2DP1和3DP1)，以及2DS4的常见变异体进行定性分型检测。根据数据库中公布的KIR基因序列，应用ARMS分析法设计各亚型特异性引物，并设计各位点特异性探针，以FAM/HEX/ROX标记，同时每孔均添加一对内标引物和探针，以CY5标记，可监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果。探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸，在PCR扩增过程中，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，荧光定量PCR仪根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，从而实现对KIR基因的定性分型检测。
由于KIR基因多态性高，各亚型的序列高度相似，只存在少数碱基的差别，普通的引物设计方法对于区分KIR基因亚型存在一定局限性，准确性不高。在实际检测中，很容易出现假阳性，为了更准确地进行检测，避免假阳性的发生，发明人使用了ARMS引物设计方法，并在传统ARMS基础上进行了改良，增强了扩增引物的特异性，提高了检测的准确性，提高了荧光PCR的灵敏度，从而有效的避免了扩增产物非特异性的发生。
发明人的主要技术思路如下：发明人根据检测结果，设计了四类引物——正常无错配引物、弱错配引物、强错配引物和联合错配引物。我们首先检测正常无错配引物，若检测结果完全正确，则引物可用；若检测结果出现弱假阳，则使用弱错配引物，即在正常引物5’端5个碱基以内引入一个错配碱基，若检测结果完全正确，则引物可用；若仍存在假阳，则使用强错配引物，在距离3’突变碱基1～4个碱基位置，引入一个错配碱基，若检测结果完全正确，则引物可用；若仍存在假阳，则使用联合错配引物，即在引物5’端5个碱基以内和距离3’突变碱基1～4个碱基位置同时引入错配碱基，从而提高引物检测的特异性，具有广阔的应用前景。
本发明使用多重Taqman荧光PCR方法，是在同一PCR反应体系里加上二对或以上引物和相应的两条或多条探针，同时扩增出两个或者两个以上核酸片段，鉴定两种或两种以上的靶片段存在与否。KIR基因亚型众多，运用多重Taqman荧光定量PCR检测，一管多检，准确、高效满足检测需求。该发明整个实验过程仅需1个小时即可完成，有效的缩短了实验时间。本试剂盒中PCR扩增引物组和Taqman探针分布于6孔中，每个样本包括6个检测孔，一个冻干96孔板可进行16个样本的检测，增大了样本检测通量。本发明使用的96孔板，是将引物探针混合液采用冻干技术冷冻干燥于96孔板底部，大大提高了引物探针的稳定性，具有较好的实际应用价值。
本发明实验结果人工判读仅通过Ct值和扩增曲线即可判读，结果分析相对简单。智能软件判读只需将ABI 7500原始结果文件输出为Excel文件，并将其导入判读软件中，软件可直接分析出待检样本KIR基因型别。
本发明的技术方案如下：
用于检测KIR基因分型的PCR扩增引物组和Taqman探针组合，所述的组合包含如下表所示的6个引物组，每个引物组含有的引物对和探针的核苷酸序列如下表所示：
所述的Taqman探针5’端的报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5荧光标记，3’端的淬灭基团为BHQ-1或BHQ-2。
引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成，具体核苷酸序列SEQ ID No.01～48如下表所示：
引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成，具体核苷酸序列SEQ ID No.49～51如下：
| SEQ ID No | 序列5'→3' |
| 49 | GCATCTGGACATGCTTGCT |
| 50 | ACACACATGGAAGACCACAGA |
| 51 | CY5 5’-CTGTGTTAAAGCTCTGAATAATGGTA-3’BHQ2 |
使用多重荧光PCR技术在同一PCR反应体系里加上二对或以上引物和相应的两条或多条探针，同时扩增出两个或者两个以上核酸片段，鉴定两种或两种以上的基因型存在与否。
本发明提供了含有上述PCR扩增引物组和Taqman探针组合的试剂盒，所述的试剂盒包含的PCR扩增引物组和Taqman探针均冻干于96孔板底部。
所述的试剂盒中PCR扩增引物组和Taqman探针分布于6孔中，每个样本包括6个检测孔，一个96孔板可进行16个样本的检测。
所述的试剂盒中还包括PCR反应混合液、Taq酶和光学封膜。
所述的PCR主反应液包括：0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、甘油(glycerol)0.6％(v/v)，二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)和甲酰胺2.5％(v/v)，其中DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。
本发明具有如下技术效果：本发明采用ARMS分析法结合Taqman多重荧光PCR技术对KIR基因进行定性分型检测，并在传统ARMS基础上进行了改良，克服了现有检测方法的种种缺陷，具有广泛的应用前景与临床参考价值。
附图说明
图1-1～图1-6分别为Sample 1的1号孔至6号孔的扩增曲线。
图2为Sample1测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
图3为Sample2测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
图4为Sample3测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
图5为Sample4测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
图6为Sample5测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
图7为Sample6测序图，分型结果与本方法检测结果一致。
具体实施方式
实施例1
1.原料与设备
1.1PCR主反应液的配制：0.18mM脱氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化镁(MgCl2)、60.3mM氯化钾(KCl)，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、甘油(glycerol)0.6％(v/v)，二甲基亚砜(DMSO)5％(v/v)和甲酰胺2.5％(v/v)，按上述比例配制6*PCR反应混合液50mL，-20℃长期保存，4℃暂存备用。
1.2反应板的配制：
1.2.1引物探针混合液配制：引物0.54OD/mL，探针1.05μM，配成6*引物探针混合液。
1.2.2按下表点板：引物和探针如下表中SEQ ID No.01～48、SEQ ID No.52～53及SEQ ID No.54～55所示。每孔均添加内标引物和探针，核苷酸如SEQ IDNo.49～51所示。引物和探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
SEQ ID No.01～48、SEQ ID No.52～53及SEQ ID No.54～55的核苷酸序列如下表所示：
SEQ ID No.49～51的核苷酸序列如下：
| SEQ ID No | 序列5'→3' |
| 49 | GCATCTGGACATGCTTGCT |
| 50 | ACACACATGGAAGACCACAGA |
| 51 | CY5 5’-CTGTGTTAAAGCTCTGAATAATGGTA-3’BHQ2 |
1.2.3反应板冻干：按下表程序将反应板冷冻干燥。包装于避光锡箔袋，-20℃保存。
1.3样本的来源
1)血液样本采集
血液样本用含抗凝血剂柠檬酸钠(Sodium citrate)、乙二胺四乙酸(EDTA)或肝素(Heparin)的采血管进行采集，以新鲜或冷冻保存未经反复冻融的全血样本作为实验样本。
2)核酸样本萃取
可由全血或白血球层等含有核细胞的样本，以沉淀法、管柱法或磁珠法进行核酸萃取，取得足量且质量合格的核酸以进行聚合酶链式反应。
3)核酸样本定量
萃取的核酸样本必须溶解于灭菌水或其它适当的溶液(如TE Buffer)之中，且浓度应介于10-40ng/μl即可。
4)核酸样本质量规范
核酸样本的A260/A280比值应介于1.6到2.0之间。
1.4所需实验设备
荧光定量PCR仪、不同量程的移液器、小型台式离心机、96孔板离心机。
2.基因分型过程
2.1反应体系的配置：每一个样本需同时进行6管独立的实时荧光PCR反应，即每人份的检测包括6个检测孔即可，一个反应板可进行16个样本检测。按下表配制混合母液：
表1：PCR反应体系
因引物探针已提前冻干到反应板中，所以我们只需取18μL配制好的混合液分装至反应板各孔中，贴上光学封膜，短暂离心后，放入荧光PCR仪中。
2.2 PCR反应程序：如表2所示：
表2：PCR反应程序
请依各型号的自动循环控温仪操作手册进行程序设定，荧光信号采集点设定在65℃；荧光信号采集波长设定FAM、HEX、ROX、CY5。
2.3实验结果分析：
实验结果分析可采用人工判读或者智能软件判读。
2.3.1智能软件判读：
检测样本所有孔中内标基因CY5Ct值均小于35且扩增曲线正常的情况下，可继续进行结果判读。将ABI 7500原始结果文件输出为Excel文件，并将其导入判读软件中，软件可直接分析出待检样本KIR基因型别。结果举例如下：
2.3.2人工判读
内标基因CY5扩增曲线正常且Ct＜35。标记探针扩增曲线正常且Ct＜32，判断该标记探针为阳性反应；无扩增曲线升起或Ct≥32，判断该标记探针为阴性反应。
结论：整个实验流程仅需1个小时，实验结果准确，通过本发明的试剂盒可以准确判断实验样本的KIR基因型。
图1-1～图1-6分别为Sample 1的1号孔至6号孔的扩增曲线。内标基因CY5扩增曲线正常且Ct＜35。标记探针扩增曲线正常且Ct＜32，判断该标记探针为阳性反应；无扩增曲线升起或Ct≥32，判断该标记探针为阴性反应。
图2为Sample1测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
图3为Sample2测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
图4为Sample3测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
图5为Sample4测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
图6为Sample5测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
图7为Sample6测序图，测序结果与本方法检测结果一致。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神所做的等效修饰或变化，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏伟禾生物科技有限公司
<120> 用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR基因分型的试剂盒
<160> 55
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cctgaccact aatagggt 18
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcatgtagga tgtatccagg ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agctggagct ggcacctgat a 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcagagaccg gaagta 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgcaaggt cttgca 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atctttgcac tcatggagag c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggctcattcg agagcaca 18
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<212> DNA
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gcgatagggg gagtgg 16
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atagcatctg taggtccctg c 21
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<212> DNA
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tagcagtgcc cagca 15
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<212> DNA
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tcactactgg tagggagc 18
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cgcgaagagc gaagcatctg t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacgatggag agttgc 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgcgcctcg ttggagagc 19
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgagacagca tgatg 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agatgccagg tcttcca 17
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<211> 21
<212> DNA
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gctgggaccg atggagaagt t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatgcaatgt tggtcagata 20
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tcgctgcaag ggcaa 15
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gttgggaccg atggagaaat 20
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<212> DNA
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ggaggaggac acgtgg 16
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cacccatgaa gaagctc 17
<210> 39
<211> 21
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tgagtgtcac tatctcgtgg t 21
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cctgagggac catgtga 17
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cagtgtgggt gtaaactg 18
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tgtgtcgctg gtcttggt 18
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atacctgact cttacgtgtc act 23
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gcatctggac atgcttgct 19
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<212> DNA
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ctgtgttaaa gctctgaata atggta 26
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<400> 52
tcgacgattc ggc 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ctatgcttgg accgat 16
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<212> DNA
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<400> 54
agctccagga gatcc 15
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ttgaccccta ataaggcctt 20
Claims (5)
1.用于检测KIR基因分型的PCR扩增引物组和Taqman探针组合，其特征在于，所述的组合包含如下表所示的6个引物组，每个引物组含有的引物对和探针的核苷酸序列如下表所示：
所述的6个引物组中，每个引物组内还分别包含一对内对照引物及相应一条探针，核苷酸序列如SEQ ID No.49～51所示；用于监控仪器故障、试剂因素、聚合酶活性或样本中的抑制物等因素造成的假阴性结果；
所述的Taqman探针5’端的报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5荧光标记，3’端的淬灭基团为BHQ-1或BHQ-2。
2.含有如权利要求1所述的PCR扩增引物组和Taqman探针组合的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括PCR反应混合液、Taq酶和光学封膜。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应混合液包括：0.18mM脱氧核苷酸dNTP、1.8mM氯化镁、60.3mM氯化钾，18.9mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl、甘油0.6％v/v，二甲基亚砜5％v/v和甲酰胺2.5％v/v，其中DMSO和甲酰胺同时作为PCR反应增强剂及稳定剂。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增引物组和Taqman探针均冻干于96孔板底部。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080213787A1 (en) * | 2005-09-29 | 2008-09-04 | Trachtenberg Elizabeth A | Methods and Compositions for Kir Genotyping |
| WO2009051672A2 (en) * | 2007-10-12 | 2009-04-23 | St. Jude Children's Research Hospital | Natural killer immunoglobulin-like receptor (kir) assay |
| CN103209988A (zh) * | 2010-10-06 | 2013-07-17 | 圣朱德儿童研究医院 | Kir等位基因及kir-配体的基于分子决定簇的分型 |
| CN104032025A (zh) * | 2014-06-25 | 2014-09-10 | 上海荻硕贝肯生物科技有限公司 | 用于kir基因快速分型的引物、试剂盒及方法 |
| CN106222288A (zh) * | 2016-08-15 | 2016-12-14 | 中国医学科学院输血研究所 | 用于kir基因pcr‑ssp分型检测的引物组合及试剂盒及方法 |
| CN108624665A (zh) * | 2018-05-18 | 2018-10-09 | 韩瑜 | 一种kir及配体基因分型实验方法 |
| US20180305744A1 (en) * | 2017-04-25 | 2018-10-25 | Shenzhen Blood Center | Method for simultaneous sequence-based typing of 14 functional killer cell immunoglobulin-like receptor (kir) genes |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080213787A1 (en) * | 2005-09-29 | 2008-09-04 | Trachtenberg Elizabeth A | Methods and Compositions for Kir Genotyping |
| WO2009051672A2 (en) * | 2007-10-12 | 2009-04-23 | St. Jude Children's Research Hospital | Natural killer immunoglobulin-like receptor (kir) assay |
| CN103209988A (zh) * | 2010-10-06 | 2013-07-17 | 圣朱德儿童研究医院 | Kir等位基因及kir-配体的基于分子决定簇的分型 |
| CN104032025A (zh) * | 2014-06-25 | 2014-09-10 | 上海荻硕贝肯生物科技有限公司 | 用于kir基因快速分型的引物、试剂盒及方法 |
| CN106222288A (zh) * | 2016-08-15 | 2016-12-14 | 中国医学科学院输血研究所 | 用于kir基因pcr‑ssp分型检测的引物组合及试剂盒及方法 |
| US20180305744A1 (en) * | 2017-04-25 | 2018-10-25 | Shenzhen Blood Center | Method for simultaneous sequence-based typing of 14 functional killer cell immunoglobulin-like receptor (kir) genes |
| CN108624665A (zh) * | 2018-05-18 | 2018-10-09 | 韩瑜 | 一种kir及配体基因分型实验方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Extensive Variation in Gene Copy Number at the Killer Immunoglobulin-Like Receptor Locus in Humans;Sanne Vendelbosch et al.;《PLOS ONE》;20130630;第1-10页 * |
| Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor gene linkage and copy number variation analysis by droplet digital PCR;Roberts et al.;《Genome Medicine》;20141231;第1-9页 * |
| NK 细胞表面受体KIＲ2DS1 mＲNA 表达水平检测方法的建立;王甜等;《临床检验杂志》;20191231;第37卷(第11期);第825-830页 * |
| PCR-SSP/PCR-SSO 两种KIR 基因分型方法的比较;李娟等;《生物医学工程与临床》;20210226;第25卷(第2期);第225-231页 * |
| Quantitative Multiplex Real-Time Reverse Transcriptase–Polymerase Chain Reaction with Fluorescent Probe Detection of Killer Immunoglobulin-Like Receptors, KIR2DL4/3DL3;Wipaporn Wongfieng et al.;《MDPI》;20200813;第1-13页 * |
| QUANTITATIVE PCR FOR KILLER-CELL IMMUNOGLOBULIN-LIKE RECEPTORS (KIRS) RESEARCH GENOTYPING;Persis P. Wadia et al.;《Human Immunology》;20121231;第15页 * |
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