CN108624665A - 一种kir及配体基因分型实验方法 - Google Patents

一种kir及配体基因分型实验方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108624665A
CN108624665A CN201810478080.XA CN201810478080A CN108624665A CN 108624665 A CN108624665 A CN 108624665A CN 201810478080 A CN201810478080 A CN 201810478080A CN 108624665 A CN108624665 A CN 108624665A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
kir
added
dna
electrophoresis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810478080.XA
Other languages
English (en)
Inventor
韩瑜
张晶莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810478080.XA priority Critical patent/CN108624665A/zh
Publication of CN108624665A publication Critical patent/CN108624665A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明公开了一种KIR及配体基因分型实验方法，本发明技术省时省力，同时还节省DNA样本量。采用多重PCR技术，同时还根据PCR产物的大小，对36对引物进行组合，最终在12个反应孔中完成扩增反应。方便应用于96孔板的扩增，使用常规的Taq酶，可在相同的反应条件下一次完成所有KIR基因及其配体的分型，大大增加了其实用性。对于KIR基因采用两对引物，提高了准确率，避免了假阴性结果。KIR基因可与靶细胞表面的MHC‑I类配体分子结合，传导抑制或激活信号来调节NK细胞和T细胞活性，在造血干细胞移植、母胎耐受、抗感染免疫、肿瘤免疫及自身免疫性疾病中发挥重要调节作用。因此，KIR基因分型有助于了解KIR对肿瘤免疫、造血干细胞移植以及自身免疫性疾病的影响。

Description

一种KIR及配体基因分型实验方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种KIR及配体基因分型实验方法。
背景技术
自然杀伤细胞(NK)是一种连接天然免疫和获得性免疫的“桥梁”细胞。NK 细胞的功能由不同的受体调节，其中有一类重要的受体被称为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer immunoglobulin-like receptors，KIR)。KIR是属于免疫球蛋白样超家族的一系列分子，表达于NK细胞和部分T细胞表面。
随着KIR新的基因和等位基因的不断发现和新技术的不断应用，至今共建立了聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)，聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)，聚合酶链反应-直接测序分型(PCR-SBT)等方法。
1、PCR-SSP
Uhrberg M等首次建立了PCR-SSP的方法检测KIR基因，随着新的KIR基因和等位基因的不断发现，Hsu Kc和Uhrberg M对PCR-SSP的检测方法引物不断改进。但由于大多数反应引物选择扩增编码免疫球蛋白样结构域的外显子，而这些外显子被大约1.5kbp的内含子分隔，所以上述PCR反应扩增的产物多为长片段，大小为0.5-2.0kbp，扩增需要高质量的DNA样本。姜侃和Vilches C，建立了短片段扩增KIR的PCR-SSP方法。姜侃的方法避免了前期HsuKc设计引物存在2DS3*003和3DS1*004漏检的缺陷。Vilches C，设计的引物一般情况下选择扩增外显子3、4和5的序列，并使其中内含子的扩增达到最小，除3DP1 反应外，其余PCR反应扩增的产物均小于200bp。对于KIR2DL3，引物选择扩增其具有独特多态性的外显子9，使扩增产物为156bp。Vilches C等还将KIR2DS4 和KIR3DP1的亚型均在一个反应孔中检测完成。Vilches C设定的引物包括了更多的明确的KIR的等位基因，设定16对引物在16个PCR反应孔，方便应用于96 孔板的扩增，使用常规的Taq酶，可在相同的反应条件下一次完成所有KIR基因分型，大大增加了其实用性。此外，Sun JY[9]等还建立了多重PCR-SSP的分型技术，14对引物扩增4组多重PCR反应，每组同时扩增3-4个KIR基因，扩增产物为108-565bp，部分降解的DNA模板仍可获得其分型结果，可用于KIR基因分型的快速筛查。
2、PCR-SSOP
Williams F等先后建立了KIR2DL4，KIR2DS4,KIR2DL3,KIR3DL1/S1和 KIR3DL2等PCR-SSOP分析KIR等位基因的方法，并对北爱尔兰人群的进行了调查。
由于正向SSO操作繁琐、程序耗时等缺点，Nong等基于Luminex公司液相芯片分析技术平台，建立了PCR反向序列特异性寡核普酸(polymerase chainreaction-reversesequence specific oligonucleotide,PGR-RSSO)杂交技术应用于KIR基因的分型。Nong等使用外显子特异性引物扩增3个PCR反应，分别扩增外显子3和4，外显子5和外显子7-9，扩增产物再与62个探针珠进行杂交，用Luminex软件分析KIR基因型。他们设计了一种独特的探针，包含2 个相连锁的多态性序列，应用到KIR2DS4的分型中。KIR2DS4的探针包含2个顺式的多态性的序列，一个多态性序列针对ZDS4基因，另外一个多态性序列针对 2DS4基因和其他KIR基因，用于区分2DS4基因有功能的2DS4*001和无效的 2DS4*003/004/006,无需额外增加一个PCR反应。Nong等设计的探针为解决常规 PCR-SSOP中，由于不能确定顺反式连锁而产生模棱两可结果，提供了一种新的思路。
3、PCR-SBT
最近PCR-SBT技术应用于分析KIR的等位基因。浙江血液中心严力行等建立了PCR-SBT检测KIR3DL2和2DL4等位基因的方法，并用于中国人群分布的研究。Lebedeva等建立了高分辨KIR基因分型的策略，在PCR-SSO低分辨分型的基础上，参照2006年11月IPD-KIRDatabase信息，根据不同KIR基因在外显子3-5(编码D0-D2结构域)和外显子7-9(编码TM和Cytl/Cyt2结构域)多态性的水平和多态性的位置，将14个KIR基因分为4组。第一组K工R2DS3不存在等位基因的多态性，只做PCR-SSO分型(现在2DS3*002/003/004己增加到数据库)；第二组使用PCR-SBT分型，扩增片段编码D0-D2结构域KIR2DS1,KIR2DS4， KIR2DS5，KIR2DL1扩增Dl/D2结构域，KIR2DL5扩增D0/D2结构域)；第三组 KIR2DS2，KIR2DL2使用PCR-SBT分型，扩增片段编码TM和Cytl/Cyt2结构域；第四组KIR2DL3，KIR2DL4，KIR3DL1，KIR3DS1，KIR3DL2，KIR3DL3使用PCR- SBT分型，扩增片段编码D0-D2，TM和Cytl/Cyt2结构域。因为KIR基因的多态性遍及所有9个外显子，PCR-SBT产生模棱两可的结果，通过PCR-SSP方法选择扩增非测序的第1和第2外显子，及第7-9外显子某些多态性位置而得到解决。Lebedeva等利用这种高分辨KIR基因分型的策略对205个造血干细胞供者进行了KIR高分辨的分型，在4个供者发现了许多新的等位基因，主要集中于 KIR2DL4，KIR3DL2，KIR2DL3这3个框架基因和KIR3DLl。Lebedeva等高分辨KIR 基因分型检测策略体现了检测成本与效率之间的平衡。
随着新技术不断应用于KIR的分型和新KIR等位基因的不断发现，KIR的分型正在由低分辨KIR基因分型向中高分辨的KIR等位基因的分型发展。PCR-SSP 和PCR-SSO技术仍将广泛运用于KIR基因分型，PCR-SBT为进一步研究KIR等位基因的多态性，发现新的等位基因提供新的方法。KIR基因分型技术为研究KIR 的多态性在人类学、疾病关联研究和移植免疫领域的中的作用奠定了方法学的基础。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种KIR及配体基因分型实验方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明包括以下步骤：
(1)基因组DNA提取：采用基因组TIANamp Blood DNA Kit提取试剂盒，进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增KIR及配体基因：
试剂准备：DNA模板；对应目的基因的特异引物；10×PCR Buffer；2.5mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM；25mM MgCl2；水：高压灭菌去离子水；Taq DNA聚合酶：5U/μl；
操作步骤：
1.1将上述PCR试剂在冰浴中融化，并在旋涡振荡器上混匀试剂，短暂离心；
1.2配制PCR MIX；
1.3每个实验样本的KIR和配体的基因按照表2的引物组合分成12个反应组；每个反应组的体系是10μl；
a配制PCR MIX时，按照13个反应组计算，因为要考虑实验中的损耗；
b先将12个反应组的引物依次加入96孔板中，每个孔2μl；
c取一0.5ml的高压灭菌的离心管配制PCR MIX，组成如下：
d将配制PCR MIX放置于旋涡混匀器上震荡混匀，离心；然后向每个反应中加入8μlPCR MIX；
e视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油；如加入石蜡油，须将96孔板进行重离心，使液体沉入管底部；
f设定反应程序；将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增；程序如下：
94℃/3min预变性；
94℃/15s，65℃/15s，72℃/30s共循环5次；
94℃/15s，60℃/15s，72℃/30s共循环22次；
94℃/15s，55℃/1min，72℃/2min共循环4次；
72℃/7min；
结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存；
(3)PCR扩增产物电泳并观察结果：电泳缓冲液配制：10×TBE Buffer(PH8.3)；
组分浓度：890mM Tris-硼酸，20mM EDTA；配制量：1L
配置方法：
称量下列试剂，置于1L烧杯中；
Tris 108g；Na2EDTA·2H2O 7.44g；硼酸55g；
A向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；
B加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存；
琼脂糖凝胶的配制：
C配制适量的电泳及制胶用的缓冲液：0.5×TBE
D根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中；具体凝胶浓度为2％，即100ml TBE加入2克的琼脂糖粉末；
E加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50％容量)；
F在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖；加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套；小心摇动锥形瓶；使琼脂糖充分均匀熔化；此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化；
G使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓度 0.5μg/ml)；并充分混匀；
H将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子；凝胶厚度一般在3～5mm之间；
I在室温下使胶凝固(大约30min～1h)，然后放置于电泳槽中进行电泳；
上样缓冲液配制(6×Loading Buffer)
配制量：500ml
配制方法：
称量下列试剂，置于500ml烧杯中；
EDTA 4.4g；二甲苯腈蓝FF 250mg；溴酚蓝250mg；
向烧杯中加入约200ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解；
加入180ml的甘油后，使用2N NaOH调节pH值至7.0；
用去离子水定容至500ml后，室温保存；
在PCR产物中加入适量上样缓冲液，混匀；取5μl该混合物加入凝胶点样孔中，再加入低分子量DNA Ladder作为DNA Marker；
调节电源，设置电压为140V，电泳50分钟，电泳结束后，将凝胶放凝胶成像仪上拍摄记录并保存结果。
进一步，所述步骤(1)中的具体方法为：取外周静脉血5ml，放于含有EDTA 抗凝剂试管，立即进行基因组DNA提取或将血液样本保存-80℃冰箱备用；DNA 浓度≥50mg·L-1，纯度为A260/280＝1.65-1.80之间；提取的DNA产物-20℃冰箱冰冻保存。
本发明的有益效果在于：
本发明是一种KIR及配体基因分型实验方法，与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、此技术省时省力，同时还节省DNA样本量。采用多重PCR技术，同时还根据PCR产物的大小，对36对引物进行组合，最终在12个反应孔中完成扩增反应。方便应用于96孔板的扩增，使用常规的Taq酶，可在相同的反应条件下一次完成所有KIR基因及其配体的分型，大大增加了其实用性。
2、对于KIR基因采用两对引物，提高了准确率，避免了假阴性结果。
KIR基因可与靶细胞表面的MHC-I类配体分子结合，传导抑制或激活信号来调节NK细胞和T细胞活性，在造血干细胞移植、母胎耐受、抗感染免疫、肿瘤免疫及自身免疫性疾病中发挥重要调节作用。因此，KIR基因分型有助于了解KIR对肿瘤免疫、造血干细胞移植以及自身免疫性疾病的影响。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明：
本发明包括以下步骤：
(1)基因组DNA提取：采用基因组TIANamp Blood DNA Kit提取试剂盒，进行基因组DNA的提取；
(2)PCR扩增KIR及配体基因：
试剂准备：DNA模板；对应目的基因的特异引物(见表1)；10×PCR Buffer；2.5mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM；25mM MgCl2；水：高压灭菌去离子水；Taq DNA聚合酶：5U/μl；
操作步骤：
1.1将上述PCR试剂在冰浴中融化，并在旋涡振荡器上混匀试剂，短暂离心；
1.2配制PCR MIX；
1.3每个实验样本的KIR和配体的基因按照表2的引物组合分成12个反应组，见表2；每个反应组的体系是10μl；
a配制PCR MIX时，按照13个反应组计算，因为要考虑实验中的损耗；
b先将12个反应组的引物依次加入96孔板中(一个96孔板正好可以做8 人份)，每个孔2μl；
c取一0.5ml的高压灭菌的离心管配制PCR MIX，组成如下：
d将配制PCR MIX放置于旋涡混匀器上震荡混匀，离心；然后向每个反应中加入8μlPCR MIX；
e视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油；如加入石蜡油，须将96孔板进行重离心，使液体沉入管底部；
f设定反应程序；将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增；程序如下：
94℃/3min预变性；
94℃/15s，65℃/15s，72℃/30s共循环5次；
94℃/15s，60℃/15s，72℃/30s共循环22次；
94℃/15s，55℃/1min，72℃/2min共循环4次；
72℃/7min；
结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存；
(3)PCR扩增产物电泳并观察结果：电泳缓冲液配制：10×TBE Buffer(PH8.3)；
组分浓度：890mM Tris-硼酸，20mM EDTA；配制量：1L
配置方法：
称量下列试剂，置于1L烧杯中；
Tris 108g；Na2EDTA·2H2O 7.44g；硼酸55g；
A向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；
B加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存；
琼脂糖凝胶的配制：
C配制适量的电泳及制胶用的缓冲液：0.5×TBE
D根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中；具体凝胶浓度为2％，即100ml TBE加入2克的琼脂糖粉末；
E加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50％容量)；
注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一；
F在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖；加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套；小心摇动锥形瓶；使琼脂糖充分均匀熔化；此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化；
注：在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉；熔化琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全熔化，否则，会造成电泳图像模糊不清；
G使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓度 0.5μg/ml)；并充分混匀；
H将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子；凝胶厚度一般在3～5mm之间；
I在室温下使胶凝固(大约30min～1h)，然后放置于电泳槽中进行电泳；
注：凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天；
电泳
上样缓冲液配制(6×Loading Buffer)
配制量：500ml
配制方法：
称量下列试剂，置于500ml烧杯中；
EDTA 4.4g；二甲苯腈蓝FF 250mg；溴酚蓝250mg；
向烧杯中加入约200ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解；
加入180ml的甘油后，使用2N NaOH调节pH值至7.0；
用去离子水定容至500ml后，室温保存；
在PCR产物中加入适量上样缓冲液，混匀；取5μl该混合物加入凝胶点样孔中，再加入低分子量DNA Ladder作为DNA Marker；
调节电源，设置电压为140V，电泳50分钟，电泳结束后，将凝胶放凝胶成像仪上拍摄记录并保存结果。
所述步骤(1)中的具体方法为：取外周静脉血5ml，放于含有EDTA抗凝剂试管，立即进行基因组DNA提取或将血液样本保存-80℃冰箱备用；DNA浓度≥50mg·L-1，纯度为A260/280＝1.65-1.80之间；如果浓度较低扩增效果不好；提取的DNA产物-20℃冰箱冰冻保存；保存时间较长的样本扩增效果不好。
注意事项
PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。
纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。
溴乙锭是一种致癌物质。使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好手套。也可以使用其他毒性低的核酸染料。
表1 KIR及配体基因序列
表2引物组合及浓度
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.一种KIR及配体基因分型实验方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）基因组DNA提取：采用基因组TIANamp Blood DNA Kit提取试剂盒，进行基因组DNA的提取；
（2）PCR扩增KIR及配体基因：
试剂准备：DNA 模板；对应目的基因的特异引物；10×PCR Buffer；2.5mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2.5mM；25mM MgCl2；水：高压灭菌去离子水；Taq DNA聚合酶：5U/μl；
操作步骤：
1.1将上述PCR试剂在冰浴中融化，并在旋涡振荡器上混匀试剂，短暂离心；
1.2配制PCR MIX；
1.3每个实验样本的KIR和配体的基因按照表2的引物组合分成12个反应组；每个反应组的体系是10μl；
a配制PCR MIX时，按照13个反应组计算，因为要考虑实验中的损耗；
b先将12个反应组的引物依次加入96孔板中，每个孔2μl；
c取一0.5ml 的高压灭菌的离心管配制PCR MIX，组成如下：
10×PCR buffer 1.0×13=13μl
dNTP Mix(2.5mM) 0.8×13=10.4μl
MgCl2(25mM) 0.6×13=7.8μl
模板DNA 0.8×13=10.4μl
Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.05×13=0.65μl
灭菌去离子水 4.75×13=61.75μl
d将配制PCR MIX放置于旋涡混匀器上震荡混匀，离心；然后向每个反应中加入8μl PCRMIX；
e视 PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油；如加入石蜡油，须将96孔板进行重离心，使液体沉入管底部；
f设定反应程序；将上述混合液稍加离心，立即置 PCR 仪上，执行扩增；程序如下：
94℃/3min 预变性；
94℃/15s，65℃/15s，72℃/30s共循环5次；
94℃/15s，60℃/15s，72℃/30s共循环22次；
94℃/15s，55℃/1min，72℃/2min共循环4次；
72℃/7min；
结束反应，PCR 产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存；
（3）PCR扩增产物电泳并观察结果：电泳缓冲液配制：10×TBE Buffer（PH8.3）；组分浓度：890mM Tris-硼酸，20mM EDTA；配制量：1L
配置方法：
称量下列试剂，置于1L烧杯中；
Tris 108g；Na2EDTA·2H2O 7.44g；硼酸 55g；
A向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；
B加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存；
琼脂糖凝胶的配制：
C配制适量的电泳及制胶用的缓冲液：0.5×TBE
D根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中；具体凝胶浓度为2%，即100ml TBE加入2克的琼脂糖粉末；
E加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)；
F在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖；加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套；小心摇动锥形瓶；使琼脂糖充分均匀熔化；此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化；
G使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓度0.5µg/ml)；并充分混匀；
H将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子；凝胶厚度一般在3~5mm之间；
I在室温下使胶凝固(大约30min~1h)，然后放置于电泳槽中进行电泳；
上样缓冲液配制（6×Loading Buffer）
组份 浓度
EDTA 30mM
甘油 36%（V/V）
二甲苯腈蓝FF 0.05%（W/V）
溴酚蓝 0.05%（W/V）
配制量：500ml
配制方法：
称量下列试剂，置于500ml烧杯中；
EDTA 4.4g；二甲苯腈蓝FF 250mg；溴酚蓝 250mg；
向烧杯中加入约200ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解；
加入180ml的甘油后，使用2N NaOH调节pH值至7.0；
用去离子水定容至500ml后，室温保存；
在PCR产物中加入适量上样缓冲液，混匀；取5μl该混合物加入凝胶点样孔中，再加入低分子量DNA Ladder作为DNA Marker；
调节电源，设置电压为140V，电泳50分钟，电泳结束后，将凝胶放凝胶成像仪上拍摄记录并保存结果。
2.根据权利要求1所述的KIR及配体基因分型实验方法，其特征在于，所述步骤（1）中的具体方法为：取外周静脉血5 ml，放于含有EDTA抗凝剂试管，立即进行基因组DNA提取或将血液样本保存-80℃冰箱备用；DNA浓度≥50mg·L-1，纯度为A260/280=1.65-1.80之间；提取的DNA产物-20℃冰箱冰冻保存。
CN201810478080.XA 2018-05-18 2018-05-18 一种kir及配体基因分型实验方法 Pending CN108624665A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810478080.XA CN108624665A (zh) 2018-05-18 2018-05-18 一种kir及配体基因分型实验方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810478080.XA CN108624665A (zh) 2018-05-18 2018-05-18 一种kir及配体基因分型实验方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108624665A true CN108624665A (zh) 2018-10-09

Family

ID=63693662

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810478080.XA Pending CN108624665A (zh) 2018-05-18 2018-05-18 一种kir及配体基因分型实验方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108624665A (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109486963A (zh) * 2018-11-29 2019-03-19 江苏中济万泰生物医药有限公司 一种人类kir基因分型检测引物组及应用
CN110241461A (zh) * 2019-06-24 2019-09-17 厦门大学 一种构建人nk细胞免疫球蛋白样受体文库的多重pcr引物和方法
CN111088349A (zh) * 2020-02-14 2020-05-01 深圳市宝安区妇幼保健院 Kir3dl1基因分型引物组及其应用
CN112442525A (zh) * 2020-11-20 2021-03-05 江苏伟禾生物科技有限公司 用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir基因分型的试剂盒
CN112708672A (zh) * 2021-02-22 2021-04-27 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir2ds5基因分型试剂盒和分型方法
CN112708667A (zh) * 2021-02-22 2021-04-27 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir3ds1基因分型试剂盒和分型方法
CN112852932A (zh) * 2021-02-22 2021-05-28 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir3dl3基因分型试剂盒和分型方法
CN112852940A (zh) * 2021-02-22 2021-05-28 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir2ds2基因分型试剂盒和分型方法
CN112852939A (zh) * 2021-02-22 2021-05-28 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir2dl1基因分型试剂盒和分型方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103209988A (zh) * 2010-10-06 2013-07-17 圣朱德儿童研究医院 Kir等位基因及kir-配体的基于分子决定簇的分型
CN106222288A (zh) * 2016-08-15 2016-12-14 中国医学科学院输血研究所 用于kir基因pcr‑ssp分型检测的引物组合及试剂盒及方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103209988A (zh) * 2010-10-06 2013-07-17 圣朱德儿童研究医院 Kir等位基因及kir-配体的基于分子决定簇的分型
CN106222288A (zh) * 2016-08-15 2016-12-14 中国医学科学院输血研究所 用于kir基因pcr‑ssp分型检测的引物组合及试剂盒及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
N. TAJIK等: "Compound KIR-HLA genotype analyses in the Iranian population by a novel PCR–SSP assay", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF IMMUNOGENETICS》 *
唐炳华: "《分子生物学》", 31 July 2017 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109486963A (zh) * 2018-11-29 2019-03-19 江苏中济万泰生物医药有限公司 一种人类kir基因分型检测引物组及应用
CN109486963B (zh) * 2018-11-29 2021-10-22 江苏中济万泰生物医药有限公司 一种人类kir基因分型检测引物组及应用
CN110241461A (zh) * 2019-06-24 2019-09-17 厦门大学 一种构建人nk细胞免疫球蛋白样受体文库的多重pcr引物和方法
CN111088349A (zh) * 2020-02-14 2020-05-01 深圳市宝安区妇幼保健院 Kir3dl1基因分型引物组及其应用
CN112442525A (zh) * 2020-11-20 2021-03-05 江苏伟禾生物科技有限公司 用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir基因分型的试剂盒
CN112442525B (zh) * 2020-11-20 2022-11-04 江苏伟禾生物科技有限公司 用于检测人类自然杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir基因分型的试剂盒
CN112708672A (zh) * 2021-02-22 2021-04-27 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir2ds5基因分型试剂盒和分型方法
CN112708667A (zh) * 2021-02-22 2021-04-27 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir3ds1基因分型试剂盒和分型方法
CN112852932A (zh) * 2021-02-22 2021-05-28 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir3dl3基因分型试剂盒和分型方法
CN112852940A (zh) * 2021-02-22 2021-05-28 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir2ds2基因分型试剂盒和分型方法
CN112852939A (zh) * 2021-02-22 2021-05-28 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 Kir2dl1基因分型试剂盒和分型方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108624665A (zh) 一种kir及配体基因分型实验方法
JP5890821B2 (ja) 油中水型エマルジョン中の微粒子上での単分子ｐｃｒ
EP2341151A1 (en) Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing
JP2016013133A (ja) 多数の標的の増幅のためのアンプリコンレスキューマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応
JP2008538496A (ja) ウルトラディープ配列決定を用いて配列変異体を決定するための方法
Wetmur et al. Linking emulsion PCR haplotype analysis
Muro et al. Determination of ABO genotypes by real-time PCR using allele-specific primers
CN105177115B (zh) 一种用于指导伊立替康类化疗药物个体化治疗的ugt1a1联合基因位点荧光检测试剂盒
CN102277424A (zh) Cyp2c19基因扩增用引物对、含有其的cyp2c19基因扩增用试剂及其用途
CN108441565A (zh) 人类y染色体37个str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN104328182A (zh) 一种用于检测pdgfra基因热点突变的引物、探针、锁核苷酸探针、试剂盒及检测方法
EP0914468B1 (en) Method for sequencing of nucleic acid polymers
CN108060237B (zh) 基于55个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
US20060094010A1 (en) Methods and compositions for analyzing comprised sample using single nucleotide polymorphism panels
CN113373202A (zh) 防污染单管核酸恒温扩增检测系统
CN108823294B (zh) 基于20个单倍群d的y-snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
Ruan et al. Multicolor real‐time polymerase chain reaction genotyping of six human platelet antigens using displacing probes
CN102471771A (zh) 靶序列的扩增方法、多态性检测方法以及其中使用的试剂
WO2017185758A1 (zh) 用于微嵌合检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法
Hodges et al. T-cell receptor molecular diagnosis of T-cell lymphoma
Mann et al. Prenatal detection of chromosome aneuploidy by quantitative-fluorescence PCR
CN107400722B (zh) 一种检测人基因组的竞争性实时荧光pcr snp探针
CN105483279A (zh) 基于AllGlo探针的rs3909184检测分型试剂盒及其分型方法
JPWO2016038929A1 (ja) 胎児染色体の異数性の有無を検出する方法
CN109554462A (zh) 基因cyp11b1外显子的pcr引物组、试剂盒、扩增体系和检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181009

RJ01 Rejection of invention patent application after publication