CN109486963B - 一种人类kir基因分型检测引物组及应用 - Google Patents
一种人类kir基因分型检测引物组及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人类KIR基因分型检测引物组，包括SEQ ID No.1‑32所示的引物16对引物；本发明基于聚合酶链式反应(荧光PCR)反应原理，引物3'末端的第一个碱基与等位基因特异性碱基互补，特异性引物对仅扩增与其相匹配的等位基因；引物设计依据美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库(Genbank)中的血型抗原基因突变数据库(dbRBC)公开的人类基因序列，选择适合的特异性突变点设计引物；PCR掺入染料法以荧光染料通过掺入DNA的扩增产物来表示DNA扩增的效果。在扩增后进行熔解曲线分析。通过熔解曲线分析能确认目的产物是否被特异性扩增，以此来判断等位基因。
Description
技术领域
本发明涉及基因诊断制品技术领域，具体为一种人类KIR基因分型检测引物组及应用。
背景技术
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是NK细胞和某些T细胞表面表达的一组特异识别人类主要组织相容性抗原MHC I类分子的受体,对NK细胞效应功能的发挥起重要免疫调节作用。KIR由一组位于人类19q13.4染色体上的多态性丰富的多基因家族所编码，其结构和功能具有多样性。每一个体含有不同种类和数目的KIR基因,而同一位点的等位基因又具有丰富的多态性，但是现有技术中缺少对人类KIR基因分型检测的全面整体性的测定试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中缺少对人类KIR基因分型检测的全面整体性的测定试剂盒的缺陷，提供一种人类KIR基因分型检测引物组及应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种人类KIR基因分型检测引物组，其特征在于，包括SEQ ID No.1-32所含的16对引物。
上述引物对可应用于制备检测人类KIR基因分型检测的制品中。
一种检测人类KIR基因分型检测的试剂盒，包括权利要求1所述的SEQ ID No.1-32序列的引物、dNTP-Buffer、甲酚红钠盐和SYBR GreenⅠ。
进一步的，每人份的检测包括16个检测孔，每孔内除放置一对等位基因引物对，还包括内参质控引物，其序列如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示。
上述试剂盒用于定性检测人类红细胞血型抗原基因分型。包含:
2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、2DP1、3DL1、3DL2、3DL3、3DS1和3DP1；
其中，检测血型2DL1的等位基因引物对2DL1F1和2DL1R1,序列分别为SEQ ID No.1和2所示；检测血型2DL2的等位基因引物对2DL2F2和2DL2R2,序列分别为SEQ ID No.3和4所示；检测血型2DL3的等位基因引物对2DL3F3和2DL3R3,序列分别为SEQ ID No.5和6所示；检测血型2DL4的等位基因引物对2DL1F4和2DL1R4,序列分别为SEQ ID No.7和8所示；检测血型2DL5的等位基因引物对2DL5F5和2DL5R5,序列分别为SEQ ID No.9和10所示；检测血型2DS1的等位基因引物对2DS1F6和2DS1R6,序列分别为SEQ ID No.11和12所示；检测血型2DS2的等位基因引物对2DS2F7和2DL1R7,序列分别为SEQ ID No.13和14所示；检测血型2DS3的等位基因引物对2DS3F8和2DS3R8,序列分别为SEQ ID No.15和16所示；检测血型2DS4的等位基因引物对2DS4F9和2DS4R9,序列分别为SEQ ID No.17和18所示；检测血型2DS5的等位基因引物对2DS5F10和2DS5R10,序列分别为SEQ ID No.19和20所示；检测血型2DP1的等位基因引物对2DP1F11和2DP1R11,序列分别为SEQ ID No.21和22所示；检测血型3DL1的等位基因引物对3DL1F12和3DL1R12,序列分别为SEQ ID No.23和24所示；检测血型3DL2的等位基因引物对3DL2F13和3DL2R13,序列分别为SEQ ID No.25和26所示；检测血型3DL3的等位基因引物对3DL3F14和3DL3R14,序列分别为SEQ ID No.27和28所示；检测血型3DS1的等位基因引物对3DS1F15和3DS1R15,序列分别为SEQ ID No.29和30所示；检测血型3DP1的等位基因引物对3DP1F16和3DP1R16,序列分别为SEQ ID No.31和32所示。
本方法基于聚合酶链式反应(荧光PCR)反应原理，引物3'末端的第一个碱基与等位基因特异性碱基互补，特异性引物对仅扩增与其相匹配的等位基因；引物设计依据美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库(Genbank)中的血型抗原基因突变数据库(dbRBC)公开的人类基因序列，选择适合的特异性突变点设计引物；PCR掺入染料法以荧光染料通过掺入DNA的扩增产物来表示DNA扩增的效果。在扩增后进行熔解曲线分析。通过熔解曲线分析能确认目的产物是否被特异性扩增，以此来判断等位基因。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明试剂盒检测时的阳性结果示例；
图2是本发明试剂盒检测时的阴性结果示例；
图3是本发明试剂盒检测时的无效结果示例。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一种检测人类KIR基因分型的试剂盒，包括SEQ ID No.1-32序列的引物、dNTP-Buffer、甲酚红钠盐和SYBR GreenⅠ。每人份的检测包括16个检测孔，每孔内除放置一对等位基因引物对，还包括内参质控引物，其序列如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示。
储存条件及有效期
试剂盒所有组份在-18℃以下保存，有效期为6个月。
样本要求：
1.本试剂盒所需样本为全血，需进行全血DNA提取，并需要测定其DNA样本浓度。
2.提取全血中DNA时，不可使用肝素抗凝的全血标本，推荐使用EDTA抗凝剂。
3.DNA样本浓度应符合40～70ng/μl，纯度A260/A280值为1.6～2.0。
4.已完成提取的DNA样本建议-18℃以下储存不要超过一年。
检验方法
1、PCR工作液配制(在试剂配制区进行)
一般按照以下表比例配置1ml，再进行分装，储存，临用前加入DNA即可。
| 人份 | 荧光PCR缓冲(μl) | Taq酶(5U/μl) | 去离子水(μl) |
| 6 | 500 | 10μl | 500 |
振荡混匀数秒，800rpm离心数秒。其它人份按照以上比例进行配制。
2、加样(在样本处理区进行)
1、取PCR工作液160ul与样本DNA 16ul(浓度:40～70ng/ul)混合，漩涡混匀工作液-DNA混合液，800rpm瞬时离心5～10秒，使管壁残留液体聚于管底。
2、剪切所需反应孔(每人份16孔)，每孔加样10ul述混合液。
3、封膜或每孔再分别加入15～20μl石蜡油，建议96孔板式离心7500rpm1分钟。
*为了避免在孔之间的交互污染，请确保将加入的样本正好覆盖在引物的上面(干燥的引物存在于每个反应管底部)。使加样枪吸头接触孔的内壁，使液体滑到管的底部。然后再用板式离心机稍作离心。
3、PCR扩增(在扩增区进行)(实时荧光定量PCR仪博日FQD-96A)
程序选择SYBER GREEN I(不含ROX)
反应体积设定：10μL
程序设定:扩增曲线采集
程序设定:96℃3min 1个循环；96℃60秒、68℃20秒5个循环；96℃20秒、66℃50秒、72℃45秒10个循环；96℃20秒、62℃70秒、72℃60秒16个循环；72℃2min 1个循环。
熔解曲线采集：每秒升温0.4℃，每0.5℃采集1次荧光值，采集温度范围60-95℃。
质量控制
内参引物在对应温度区间出现熔解峰，内参熔解峰作为成功扩增的质控手段，在阴性孔应总是可见的；阳性孔的内参熔解峰可能会很弱或者不存在，这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物竞争Taq酶等反应原料的结果。
检验结果的分析
以实时荧光定量PCR原厂软件开启原始数据，利用阳性、阴性的Tm判断值范围找出阳性的孔。
孔位、基因分型、内参Tm与阳性Tm对照表
阳性/阴性判断值
1.阳性:使用智能分析软件时，当该孔具有阳性判断值的Tm(可能同时具有阴性判断值)，则判定为阳性。采取人工分析时，当该孔具有阳性判断值范围的Tm(可能同时具有阴性判断值)，且波峰荧光导数值不低于50时，判定为阳性。
2.阴性:当该孔具有阴性判断值(内参)的Tm，波峰荧光导数值不低于50时，判定为阴性。
在图1中，虚线表内参熔解峰、实线表阳性熔解峰；阳性结果：必须在对应阳性温度区间出现熔解峰、且最高值高于导数荧光值(Y轴)50以上方为阳性。
当阳性熔解峰有较高的导数荧光值可能使内参熔解峰低于50甚至消失，仍视为内参有效、结果为阳性
图2中虚线表内参熔解峰；阴性结果：内参熔解峰必须在对应温度区间出现熔解峰、最高值高于导数荧光值(Y轴)60以上且82℃以上区间没有出现导数荧光值(Y轴)高于50的完整荧光峰值方为阴性。
图3位无效结果；在特定内参与阳性温度区间没有出现明显熔解峰。
此种情形需重新操作实验、确认试剂状态与DNA浓度质量维持在要求区间。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏中济万泰生物医药有限公司
<120> 一种人类KIR基因分型检测引物组及应用
<130> D201810261
<141> 2018-11-28
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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accattaccc agagccctat cgttctcac 29
Claims (4)
1.一种人类KIR基因分型检测引物组，其特征在于，包括SEQ ID No.1-32所含的16对引物。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测人类KIR基因分型检测的制品中的应用。
3.一种检测人类KIR基因分型检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的SEQID No.1-32序列的引物、dNTP-Buffer、甲酚红钠盐和SYBR GreenⅠ。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每人份的检测包括16个检测孔，每孔内除放置一对等位基因引物对，还包括内参质控引物，其序列如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示。
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