CN107058544A - 14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分型的方法 - Google Patents

14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明基于KIR基因组全长序列的结构特点、SNPs多态性分布以及外显子两翼的内含子的长度，制定了科学的PCR扩增策略，设计具有相近退火温度的KIR基因特异性PCR引物56对。每个功能性KIR基因的全部编码区序列分别采用3～5对特异性PCR引物进行扩增；纯化后的PCR扩增产物，采用特异性正向、反向测序引物对每一外显子进行双向测序反应。设计使用的测序引物共计230条。本发明首次建立了适合于高通量化KIR测序分型的方法，全部的14个功能性KIR基因可在同一PCR扩d增条件下进行同步扩增，并且所需时间短；测序分型涵盖了每个功能性KIR基因的全部编码区；所获得的序列无背景信号和杂峰，易于识别和结果判读。在群体遗传学、疾病关联、骨髓移植等领域具有良好的应用前景。

Description

14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分 型的方法
技术领域
本发明涉及生物医学，特别是DNA测序分型领域。本发明提供一种适合于高通量化的全部14个功能性KIRs基因同步扩增、同步测序分型的方法。
背景技术
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-like receptors,KIRs)属于免疫球蛋白超家族，表达于自然杀伤细胞(NK细胞)和部分T细胞表面。按胞外结构域的数量，可分为KIR2D及KIR3D亚家族；根据胞浆区长短和免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM)的有无，KIR功能上分为抑制型(L型)和激活型(S型)。KIR分子与靶细胞表面HLAⅠ类抗原结合，传导激活或抑制信号，调节NK细胞的活性，在移植免疫、肿瘤免疫和机体抗感染中均发挥重要作用。
KIR基因家族位于人类第19号染色体上，呈共显性表达，除两个假基因2DP1和3DP1外，还包括14种功能性KIR基因(KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DL1、3DL2、3DL3、3DS1)[1]。KIR基因结构复杂：功能性KIR3D基因中除了KIR3DL3缺失第6外显子外，其余的功能性KIR3D基因(3DL1、3DL2、3DS1)均含有9个外显子、8个内含子以及5’-启动子区和3’-UTR区。各个外显子分别编码不同的肽结构域，其中第1外显子和第2外显子编码引导肽，第3外显子、第4外显子、第5外显子分别编码胞外区的D0、D1、D2结构域，第6外显子编码茎部结构域，第7外显子编码跨膜区，第8外显子和第9外显子编码胞浆区；KIR2D基因中，KIR2DS1～3、2DS1～5等8个基因的第3外显子为假外显子(pseudoexon)，不能编码相应的D0胞外结构域；KIR2DL4、2DL5均缺失第4外显子，无D1胞外结构域。
在国际IPD-KIR数据库[2](http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/ipd/kir/)中，被收录的KIR基因组序列全长为9901～17009bp。每个功能性KIR基因的编码区序列(codingsequence,CDS)全长仅915～1368bp(见表3)，而非编码区序列长达8773～15641bp(见表4)，非编码区序列中位于第6外显子两翼的第5内含子及第6内含子序列长度占相应的KIR基因组全长序列的44.0％～61.2％(见表4)。
功能性KIR基因的第1外显子(长度为34或40bp)和第2外显子(长度均为36bp)，长度短，SNPs多态性有限：2DL2、2DL4及2DS4基因第1、第2外显子无SNPs多态性，其余的存在1～3个SNPs位点。介于第1外显子、第2外显子之间的第1内含子，长度为199～2280bp。由于第1、第2外显子长度短、SNPs多态性有限，常规测序分型时并非每个KIR基因均需要检测；必要检测时宜进行PCR单独扩增，并且PCR扩增产物涵盖完整的第1外显子、第1内含子和第2外显子不会导致扩增产物片段过长。
第3、第4和第5外显子，每个外显子的长度相对较长(282～300bp)，SNPs多态性丰富，应对编码胞外结构域的外显子及外显子之间的内含子进行单独PCR扩增。鉴于KIR2DL1～3及KIR2DS1～5共8个基因的第3外显子为假性外显子，无需检测，扩增产物涵盖完整的第4外显子、第4内含子及第5外显子，对第4、第5外显子进行双向测序；KIR2DL4和2DL5无第4外显子，扩增产物涵盖完整的第3外显子、第5外显子以及介于其间的内含子序列，对第3、第5外显子进行双向测序；其余4个功能性KIR基因(KIR3DS1、3DL1～3)，扩增产物涵盖完整的第3外显子、第4外显子、第5外显子及介于其间的内含子序列，对第3、第4和第5外显子进行双向测序。
第6外显子(KIR3DL3缺失该外显子)，长度仅51bp，基于的IPD-KIR Database(Release 2.6.0)，4个KIR基因(2DS4、3DL1、3DL2及3DS1)的第6外显子无SNPs位点，其余的功能性KIR基因有1～2个SNPs位点。由于第6外显子SNPs多态性分布有限，并且位于第6外显子两翼的第5、第6内含子序列长达4937～9841bp(见表4)，因此检测第6外显子的多态性，须对第6外显子进行PCR单独扩增，以免因扩增完整的第5内含子和/或第6内含子的序列而导致扩增产物片段过长、扩增时间过长并影响扩增效率。
第7、第8、第9外显子的长度分别为102～105bp、51～53bp、8～270bp；第7、第8内含子长度分别为460～462bp、98～118bp。因此，扩增完整的第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子序列，不会导致扩增产物片段过长。
基于上述全部功能性KIR基因的基因组全长序列的结构、SNPs多态性分布以及外显子两翼内含子的长度等特征，对于制定科学、高效的PCR扩增策略至关重要。
KIR基因的多态性，体现在KIR等位基因多态性及单倍体组成上。截止2017年4月，国际IPD-KIR Database(Release 2.6.0)公布的功能性KIR等位基因总数已达698个，其中不表达KIR等位基因7个；在14个功能性KIR基因中，多态性最为丰富的KIR3DL2具有112个等位基因(表5)。
鉴定KIR等位基因具有功能性意义。不同的KIR基因表达水平不同，McErlean等[3]发现不同的KIR基因mRNA表达水平由高到低依次为：KIR3DL2>KIR2DS2>KIR3DS1>KIR2DS5>KIR2DL5>KIR2DS3>KIR2DL1>KIR3DL1>KIR2DS1>KIR2DL2>KIR2DL4>KIR2DS4>KIR2DL3。同一KIR基因中不同的等位基因其表达水平、亲和力及介导的激活/抑制能力也存在差异。Yawata等[4]报道KIR3DL1等位基因在NK细胞膜上表达水平由高到低依次为：KIR3DL1*01502>*020>*001>*007>*005，介导的抑制性作用强弱依次为：KIR3DL1*001>*005>*01502>*020>*007；KIR3DL1*005在细胞表面表达水平低，但介导的抑制能力较强。高加索人群中最常见的KIR3DL1*004等位基因，不表达于细胞表面[5]。KIR2DS4*003、*004、*006、*007、*008、*009、*010、*012和*013在第5外显子CDS nt454～nt475位置存在22bp的缺失，引起阅读框移位，编码截短的多肽不能正常表达于细胞表面[6]。鉴于不同的KIR基因表达水平不同，同一KIR基因中不同的等位基因其表达水平、介导的激活/抑制能力也存在差异，鉴定和甄别常见型无激活/抑制效应的KIR等位基因十分必要。研究和建立高通量、高分辨水平的KIR基因同步测序分型的方法，在等位基因水平的基础上开展KIR应用研究尤为迫切。
当前，普遍采用的序列特异性引物-聚合酶链反应(sequence specific primer-polymerase chain reaction,PCR-SSP)及序列特异性寡核苷酸探针-聚合酶链反应(sequence specific oligonucleotide probe-PCR,PCR-SSOP)商品化试剂盒仅能鉴定KIR基因的有无，不能达到精细的等位基因水平和甄别全部的不表达KIR等位基因及变异体。
测序分型(sequence-based typing,SBT)方法为基因分型的金标准。但迄今为止，国际上尚无商品化的KIR测序分型试剂盒及相应的判定KIR基因型的分析软件；也没有国际公认的KIR基因测序分型方法。由于KIR等位基因序列高度同源，并且基因组全长序列中内含子的序列特别长，给KIR基因特异性PCR扩增带来很大困难。目前业已报道的KIR测序分型方法存在以下问题：(1)仅对KIR基因的部分外显子进行了测序分型[7,8,9]，不能获得完整的编码区序列和分析各外显子的多态性，易出现模棱两可的测序分型结果。(2)测序分型时PCR扩增的目的基因片段虽涵盖了全部的编码区，但扩增产物片段过长，如扩增KIR3DS1第3外显子至3’-UTR的基因片段长达12.2kb，单次循环中68℃链延伸的时间达13min[10]，扩增所需的时间超过10小时，对样本DNA质量和DNA聚合酶的要求很高。(3)KIR基因的序列高度同源，有时采用的扩增目的基因片段的PCR引物存在非特异性扩增/协同扩增的现象，比如：受检者携带有KIR2DL1和2DS1基因，扩增2DL1第1～第5外显子序列的同时，2DS1的序列也被一并扩增。对于非特异性扩增产物，需设计PCR引物采用巢式PCR进行二次扩增，实验操作繁琐[11]。(4)对KIR基因各目的基因片段进行PCR扩增时，由于PCR引物的退火温度差异较大、PCR扩增目的基因片段长度的差异造成延伸时间的不同[10,11,12]，不能在同一个循环参数条件下进行PCR同步扩增、同步测序，无法实现高通量化，实验费时费力[13]。(5)鉴定存在1个或多个碱基缺失的等位基因，有的还需采用分子克隆的方法进行鉴定，不能满足简便快速的需求。
随着KIR分子的生物学功能、KIR基因与疾病关联以及移植排斥等研究的深入开展，KIR的应用研究领域日益广泛，建立高效低耗、适合于高通量化的功能性KIR基因同步测序分型的方法并实现商品化和产业化是当前急待解决的问题。
发明内容
本发明旨在解决上述问题，而首次提供一种涵盖14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRs)基因同步测序分型的方法，可广泛应用于群体遗传学、骨髓移植组织配型、疾病关联等研究领域，并且为KIR基因测序分型试剂的商品化奠定基础，改变当前国际上无KIR基因测序分型试剂应市的现状。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一、根据各KIR基因的基因组全长序列的结构、编码区单核苷酸多态性分布特点以及外显子两翼的内含子的长度，制定了科学的PCR扩增策略，每个功能性KIR基因的全部编码区序列分别采用3～5对具有相近退火温度的KIR基因特异性PCR引物，进行PCR同步扩增。针对纯化后的PCR扩增产物所含的每一外显子，分别进行正向、反向双向测序，如图1所示。
2DL1基因的编码区序列，采用5对2DL1基因特异性PCR引物进行扩增；其中第一对PCR引物扩增2DL1基因的第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列；第二对PCR引物扩增2DL1的第4外显子及其两侧翼的部分序列；第三对PCR引物扩增2DL1的第5外显子及其两侧翼的部分序列；第四对PCR引物扩增2DL1的第6外显子及其两侧翼的部分序列；第五对PCR引物扩增2DL1的第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’UTR区的序列；
2DL2、2DL3、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4及2DS5基因的编码区序列，均采用4对KIR基因特异性PCR引物进行扩增；第一对PCR特异性引物扩增第1外显子、第1内含子和第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列；第二对PCR特异性引物扩增第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2/3内含子(因第3外显子为假外显子，第2外显子与第4外显子之间的序列统称为第2/3内含子)和部分的第5内含子；第三对PCR特异性引物扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列；第四对PCR特异性引物扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’UTR区的序列；
2DL4、2DL5基因的编码区序列，均采用4对KIR基因特异性PCR引物进行扩增；第一对PCR特异性引物扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列；第二对PCR特异性引物扩增第3外显子、第3/4内含子(因第4外显子缺失，第3外显子与第5外显子之间的序列统称为第3/4内含子)、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列；第三对PCR特异性引物扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列；第四对PCR特异性引物扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’UTR区的序列；
3DL1、3DL2及3DS1基因的编码区序列，均采用4对KIR基因特异性PCR引物进行扩增；第一对PCR特异性引物扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列；第二对PCR特异性引物扩增第3外显子、第3内含子、第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列；第三对PCR特异性引物扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列；第四对PCR特异性引物扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’UTR区的序列；
3DL3基因的编码区序列，因缺失了第6外显子、该外显子无需扩增，仅用3对3DL3基因特异性PCR引物进行扩增；第一对PCR特异性引物扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列；第二对PCR特异性引物扩增第3外显子、第3内含子、第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列；第三对PCR特异性引物扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’UTR区的序列。
二、14个功能性KIR基因的特异性PCR扩增引物共计56对(112条)。除了KIR3DL3因缺失第6外显子仅用3对PCR引物、KIR2DL1采用5对PCR引物外，其余的每个功能性KIR基因均采用4对KIR基因特异性PCR引物。每条PCR引物的序列、在KIR基因组全长序列中的位置，以及扩增目的片段的长度等特征，如表1所述。
表1 14个功能性KIR基因的特异性PCR扩增引物
(1)扩增KIR2DL1基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物2DL1_PCR_Ex12_F(序列：5’-GTTCGGGAGGTTGGATCTC-3’，基因组全长序列中的位置：nt-268～nt-250)和下游引物2DL1_PCR_Ex12_R(序列：5’-CACACTGCAGCCCCTACCG-3’，nt1332～nt1350)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为1618bp。第二对PCR引物包括上游引物2DL1_PCR_Ex4_F(序列：5’-TGATTCTCCTGAGTCTCCAGAGG-3’，nt2501～nt2523)和下游引物2DL1_PCR_Ex4_R(序列：5’-TGGAAGGAGAAGAGGCAGTTTCC-3’，nt5288～nt5310)，特异性扩增第4外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为2810bp。第三对PCR引物包括2DL1_PCR_Ex5_F(序列：5’-CTGGCAGGGACCTACAGATGC-3’，nt3692～nt3712)和下游引物2DL1_PCR_Ex5_R(序列：5’-GGACAGCCATGGGCTTTCCTC-3’，nt5608～nt5628)，特异性扩增第5外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为1937bp。第四对PCR引物包括上游引物2DL1_PCR_Ex6_F(序列：5’-TCCTGATTGTGAGTTCTTGGCAT-3’，nt8082～nt8104)和下游引物2DL1_PCR_Ex6_R(序列：5’-TGAGTCAGTSAGTCGAARTGTGC-3’，nt9279～nt9301)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为1220bp。第五对PCR引物包括上游引物2DL1_PCR_Ex789_F(序列：5’-CCTCAGCACGTTCTATGGTTACT-3’，nt12880～nt12902)和下游引物2DL1_PCR_Ex789_R(序列：5’-TGTGATTGCAGCCTCAAGTAGAC-3’，nt14249～nt14271),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为1392bp。
(2)扩增KIR2DL2基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物2DL2_PCR_Ex12_F(序列：5’-AGAGGTTGGATCTGAGACGTC-3’,nt-263～nt-243)和下游引物2DL2_PCR_Ex12_R(序列：5’-GGACCGATGGAGAAGTTGGCT-3’,nt3590～nt3610)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为3873bp。第二对PCR引物包括上游引物2DL2_PCR_Ex45_F(序列：5’-GAGGCTACTAGAGACAGAGGGAC-3’,nt3207～nt3229)和下游引物2DL2_PCR_Ex45_R(序列：5’-CCCAAGCTTCGTCTTCTCTCT-3’,nt5617～nt5637)，特异性扩增第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2/3内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为2431bp。第三对PCR引物包括上游引物2DL2_PCR_Ex6_F(序列：5’-CATGCCAACATCATGCTGTC-3’,nt8530～nt8549)和下游引物2DL2_PCR_Ex6_R(序列：5’-TCCCTGTCCTAGCCTCCATAC-3’,nt9879～nt9899)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为1370bp。第四对PCR引物包括上游引物2DL2_PCR_Ex789_F(序列：5’-GAAGTTCCACTTGCCAAGGAATG-3’,nt9210～nt9232)和下游引物2DL2_PCR_Ex789_R(序列：5’-CAGCTGCTGGTACATGGGAGC-3’，nt14071～nt14091),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为4882bp。
(3)扩增KIR2DL3基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物2DL3_PCR_Ex12_F(序列：5’-GGCYGMCTGTCTGCACAGA-3’,nt-26～nt-8)和下游引物2DL3_PCR_Ex12_R(序列：5’-GGTTTCCTGTTGCTGCTGTAG-3’,nt2560～nt2580)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为2606bp。第二对PCR引物包括上游引物2DL3_PCR_Ex45_F(序列：5’-AGAGAAGAGGGAGGGAGACAGAT-3’,nt3231～nt3253)和下游引物2DL3_PCR_Ex45_R(序列：5’-GCCATCCTGTGCCCTGATC-3’,nt5651～nt5669)，特异性扩增第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2/3内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为2439bp。第三对PCR引物包括上游引物2DL3_PCR_Ex6_F(序列：5’-CCCACCTCAGGCTCTCAAAGG-3’,nt7497～nt7517)和下游引物2DL3_PCR_Ex6_R(序列：5’-GGCGTACAATGTCAGAGCTGC-3’,nt8908～nt8928)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为1432bp。第四对PCR引物包括上游引物2DL3_PCR_Ex789_F(序列：5’-ACTGAGAAAGCAGGAGAAAGCTG-3’,nt12934～nt12956)和下游引物2DL3_PCR_Ex789_R(序列：5’-CCTTCAGATTCCAGCTGCTGG-3’,nt14063～nt14083),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为1150bp。
(4)扩增KIR2DL4基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物2DL4_PCR_Ex12_F(序列：5’-GTGGTCAATGTGTCAACTGCACG-3’,nt-99～nt-77)和下游引物2DL4_PCR_Ex12_R(序列：5’-CACAGGCTCCAAGGATTACAATG-3’,nt1639～nt1661)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为1760bp。第二对PCR引物包括上游引物2DL4_PCR_Ex35_F(序列：5’-CTTTCTTCCCCATGGCTGAGTTG-3’,nt571～nt593)和下游引物2DL4_PCR_Ex35_R(序列：5’-CTTGGGCAACAAGAGTGAAACGC-3’,nt3848～nt3870)，特异性扩增第3外显子、第3/4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为3300bp。第三对PCR引物包括上游引物2DL4_PCR_Ex6_F(序列：5’-AACCTCTACCTCCAGGATTCAAG-3’,nt3904-nt3926)和下游引物2DL4_PCR_Ex6_R(序列：5’-GTAAGTGGAAGTGTCATGTGCAC-3’,nt5738～nt5760)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为1857bp。第四对PCR引物包括上游引物2DL4_PCR_Ex789_F(序列：5’-CCAAGAAATGAGAGACAATCCAC-3’,nt9442～nt9464)和下游引物2DL4_PCR_Ex789_R(序列：5’-AGGCACCAGATTTGTGGTGTG-3’,nt10540～nt10560),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为1119bp。
(5)扩增KIR2DL5基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物2DL5_PCR_Ex12_F(序列：5’-TCATAGTGAAGGACGYGAGGTGC-3’,nt-230～nt-208)和下游引物2DL5_PCR_Ex12_R(序列：5’-AGCCAATGTGTGAACCACAATAC-3’,nt1238～nt1260)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为1490bp。第二对PCR引物包括上游引物2DL5_PCR_Ex35_F(序列：5’-CAGGACAAGCCCTTGCTGTCT-3’,nt1571～nt1591)和下游引物2DL5_PCR_Ex35_R(序列：5’-GACAGAAACAAGCAGTGGGTCAC-3’,nt2993～nt3015)，特异性扩增第3外显子、第3/4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为1445bp。第三对PCR引物包括上游引物2DL5_PCR_Ex6_F(序列：5’-CATTTCCTCACCTCTCTCCTGTCCT-3’,nt5158～nt5182)和下游引物2DL5_PCR_Ex6_R(序列：5’-AAGAGCAGAGGCCAAATGCATCG-3’,nt6351～nt6373)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为1216bp。第四对PCR引物包括上游引物2DL5_PCR_Ex789_F(序列：5’-CAGATGTTGTATGTGCTTAGCTG-3’,nt7907～nt7929)和下游引物2DL5_PCR_Ex789_R(序列：5’-GGTTTTGAGACAGGGCTGTTGTC-3’,nt8937～nt8959),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为1053bp。
(6)扩增KIR2DS1基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物2DS1_PCR_Ex12_F(序列：5’-CATAGTGAAGGACGCTAGGTGTA-3’,nt-229～nt-207)和下游引物2DS1_PCR_Ex12_R(序列：5’-GAGCCCTCTGACCTGTGACCG-3’,nt2035～nt2055)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为2284bp。第二对PCR引物包括上游引物2DS1_PCR_Ex45_F(序列：5’-GTTCCTCTTCCACCCCCACAC-3’,nt3175～nt3195)和下游引物2DS1_PCR_Ex45_R(序列：5’-GAGGGTTTGGAGGTGCCCTGTCG-3’,nt5747～nt5769)，特异性扩增第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2/3内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为2595bp。第三对PCR引物包括上游引物2DS1_PCR_Ex6_F(序列：5’-TCCTGATTGTGAGTTCTTGGCAT-3’,nt8078～nt8100)和下游引物2DS1_PCR_Ex6_R(序列：5’-GTCTCCTAGATTCCAGTTACGCC-3’,nt10742～nt10764)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为2687bp。第四对PCR引物包括上游引物2DS1_PCR_Ex789_F(序列：5’-CGTGGAAAAGGCAATTCCCGA-3’,nt10765～nt10785)和下游引物2DS1_PCR_Ex789_R(序列：5’-GGAGGTGGAACAGCACGTGTC-3’,nt14330～nt14350),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为3586bp。
(7)扩增KIR2DS2基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物2DS2_PCR_Ex12_F(序列：5’-TGAGAGGTTGGATCTGAGACGTC-3’,nt-265～nt-243)和下游引物2DS2_PCR_Ex12_R(序列：5’-ACATCCAGGCTCTTATCAGCCTT-3’,nt2956～nt2978)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为3243bp。第二对PCR引物包括上游引物2DS2_PCR_Ex45_F(序列：5’-GCTTCCATGCTTCTGATAATTTTG-3’,nt2420～nt2443)和下游引物2DS2_PCR_Ex45_R(序列：5’-CTCTGGGTCTCTCCTGACCGT-3’,nt5639～nt5659)，特异性扩增第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2/3内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为3240bp。第三对PCR引物包括上游引物2DS2_PCR_Ex6_F(序列：5’-CATTCTGCTCCGTTGTTCTATGTC-3’,nt8282～nt8305)和下游引物2DS2_PCR_Ex6_R(序列：5’-GCCAGGGTTGCTTCATGACCTAT-3’,nt9024～nt9046)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为765bp。第四对PCR引物包括上游引物2DS2_PCR_Ex789_F(序列：5’-GATAGGCCATGGGGAGGTAAATT-3’,nt11463～nt11485)和下游引物2DS2_PCR_Ex789_R(序列：5’-GGGCAGACATGTTTATTTGAAGGC-3’,nt14250～nt14273),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为2811bp。
(8)扩增KIR2DS3基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物2DS3_PCR_Ex12_F(序列：5’-TGTAAACTGCATGGGCAGGGA-3’,nt-90～nt-70)和下游引物2DS3_PCR_Ex12_R(序列：5’-CTCTGACCTGTGACCATGATCAG-3’,nt2368～nt2390)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为2480bp。第二对PCR引物包括上游引物2DS3_PCR_Ex45_F(序列：5’-CTGAGCCCAGCGGCAAGGC-3’,nt3586～nt3604)和下游引物2DS3_PCR_Ex45_R(序列：5’-ATCCCTCCCTCACACCGAGGA-3’,nt6039～nt6059)，特异性扩增第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2/3内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为2474bp。第三对PCR引物包括上游引物2DS3_PCR_Ex6_F(序列：5’-TACCAGGGTTCTCCTTTCTCTAG-3’,nt7491～nt7513)和下游引物2DS3_PCR_Ex6_R(序列：5’-AGGAAGGGGACCAGGAGCG-3’,nt9878～nt9896)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为2406bp。第四对PCR引物包括上游引物2DS3_PCR_Ex789_F(序列：5’-TGATGTTGAAGGAAGAGGCTCTT-3’,nt10853～nt10875)和下游引物2DS3_PCR_Ex789_R(序列：5’-GATAGTCTGAGGGGAGGTGGAACT-3’,nt14688～nt14711),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为3859bp。
(9)扩增KIR2DS4基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物2DS4_PCR_Ex12_F(序列：5’-ACCATGTCGCTCATGGTCATCAT-3’,nt-3～nt20)和下游引物2DS4_PCR_Ex12_R(序列：5’-TTGTCCTGACCACCTTGGGGT-3’,nt3070～nt3090)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为3093bp。第二对PCR引物包括上游引物2DS4_PCR_Ex45_F(序列：5’-TCAGTTCATACCTCCTGCCAAGG-3’,nt4419～nt4441)和下游引物2DS4_PCR_Ex45_R(序列：5’-CGTGGTCAGGAGTTCCAGAGC-3’,nt7611～nt7631)，特异性扩增第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2/3内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为3213bp。第三对PCR引物包括上游引物2DS4_PCR_Ex6_F(序列：5’-CTGGACTCCCAGGGCCCAATG-3’,nt10004～nt10024)和下游引物2DS4_PCR_Ex6_R(序列：5’-AAGGTTTCCACCTCCCCAGGG-3’,nt10212～nt10232)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为229bp。第四对PCR引物包括上游引物2DS4_PCR_Ex789_F(序列：5’-GAAAGCCCGCTGAATCCTC-3’,nt12884～nt12902)和下游引物2DS4_PCR_Ex789_R(序列：5’-GCAGAAGGCTGAAAGATAGTCTG-3’,nt15726～nt15748),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为2865bp。
(10)扩增KIR2DS5基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物2DS5_PCR_Ex12_F(序列：5’-TGAGAACAATTTCCAGGAAGCCG-3’,nt-199～nt-177)和下游引物2DS5_PCR_Ex12_R(序列：5’-CCTTTCCTGTGGACACTTGTC-3’,nt2870～nt2890)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为3089bp。第二对PCR引物包括上游引物2DS5_PCR_Ex45_F(序列：5’-TCCTGCCAAGGATTCCAATTCGA-3’,nt3609～nt3631)和下游引物2DS5_PCR_Ex45_R(序列：5’-TCTGTCCATGCTTCTCTCCATCC-3’,nt6181～nt6203)，特异性扩增第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2/3内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为2595bp。第三对PCR引物包括上游引物2DS5_PCR_Ex6_F(序列：5’-CTTGAAGTCTCAAGACAGTGGGT-3’,nt9083～nt9105)和下游引物2DS5_PCR_Ex6_R(序列：5’-ATGCACTTCATACTTTGAGCTAG-3’,nt9923～nt9945)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为863bp。第四对PCR引物包括上游引物2DS5_PCR_Ex789_F(序列：5’-TGATGTKGAAGGAAGAGGCTCTG-3’,nt11029～nt11051)和下游引物2DS5_PCR_Ex789_R(序列：5’-AGGGGAGGTGGAACTGCATGAGA-3’,nt14857～nt14879),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为3851bp。
(11)扩增KIR3DL1基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物3DL1_PCR_Ex12_F(序列：5’-CGAGGTGTCAATTCTAGTGAGAG-3’,nt-215～nt-193)和下游引物3DL1_PCR_Ex12_R(序列：5’-TACCACAAACATGGCAGCG-3’,nt2689～nt2707)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为2922bp。第二对PCR引物包括上游引物3DL1_PCR_Ex345_F(序列：5’-CACCCAGGTGTGGTAGGAGCC-3’,nt1700～nt1720)和下游引物3DL1_PCR_Ex345_R(序列：5’-CTCTGTGTGGGTGAGAGGCCATG-3’,nt5684～nt5706)，特异性扩增第3外显子、第3内含子、第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为4007bp。第三对PCR引物包括上游引物3DL1_PCR_Ex6_F(序列：5’-GCCTGTAATACCACTACTCGGGT-3’,nt8050～nt8072)和下游引物3DL1_PCR_Ex6_R(序列：5’-CTAAAACACCTCGCCCTCATC-3’,nt8921～nt8941)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为892bp。第四对PCR引物包括上游引物3DL1_PCR_Ex789_F(序列：5’-GCTATAACTGAGAAAGCAGGAGG-3’,nt12700～nt12722)和下游引物3DL1_PCR_Ex789_R(序列：5’-CTGGAAAATAGTCCGAAGAAAGG-3’,nt14173～nt14195),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为1496bp。
(12)扩增KIR3DL2基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物3DL2_PCR_Ex12_F(序列：5’-TGCAAGGTGGCAATTGTAGTCAC-3’,nt-217～nt-195)和下游引物3DL2_PCR_Ex12_R(序列：5’-CGACGATAGTGACACTGAAGAGC-3’,nt1588～nt1610)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为1827bp。第二对PCR引物包括上游引物3DL2_PCR_Ex345_F(序列：5’-CCTCCTCTCTAAGGCAGTGCCTC-3’,nt1488～nt1510)和下游引物3DL2_PCR_Ex345_R(序列：5’-CGGGTTTTCCTCACCTGTGACAG-3’,nt5429～nt5451)，特异性扩增第3外显子、第3内含子、第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为3964bp。第三对PCR引物包括上游引物3DL2_PCR_Ex6_F(序列：5’-GACAGGGCACCTCCAAACCCTCT-3’,nt5584～nt5606)和下游引物3DL2_PCR_Ex6_R(序列：5’-ATTTTAGCCCAGTGACATGCACG-3’,nt9282～nt9304)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为3721bp。第四对PCR引物包括上游引物3DL2_PCR_Ex789_F(序列：5’-GCAGGAGAAAGCTGGGTCTCC-3’,nt15186～nt15206)和下游引物3DL2_PCR_Ex789_R(序列：5’-CTGGTTTTGAGACAGGGCTGTTG-3’,nt16262～nt16284),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为1099bp。
(13)扩增KIR3DL3基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物3DL3_PCR_Ex12_F(序列：5’-ACAACATCCTGTGTGCTGCTGAA-3’,nt-63～nt-41)和下游引物3DL3_PCR_Ex12_R(序列：5’-GTCAACCCCCTGTGTCGCCTG-3’,nt815～nt835)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为898bp。第二对PCR引物包括上游引物3DL3_PCR_Ex345_F(序列：5’-GGAACCACAGTCATGACCCTGAC-3’,nt1156～nt1178)和下游引物3DL3_PCR_Ex345_R(序列：5’-AAAGGGTGTAGGCGTTGCTGG-3’,nt5608～nt5630)，特异性扩增第3外显子、第3内含子、第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为4475bp。第三对PCR引物包括上游引物3DL3_PCR_Ex789_F(序列：5’-TGAGCCAGTCCCTCAAGGCTC-3’,nt9865～nt9885)和下游引物3DL3_PCR_Ex789_R(序列：5’-GTTTTACTGCTGACAGAAGGCTG-3’,nt12007～nt12029),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为2165bp。
(14)扩增KIR3DS1基因全部编码区的第一对PCR引物包括上游引物3DS1_PCR_Ex12_F(序列：5’-CGAGGTGTCAATTCTAGTGAGAG-3’,nt-215～nt-193)和下游引物3DS1_PCR_Ex12_R(序列：5’-CCTGTGACCATGATCACCAT-3’,nt2080～nt2099)，特异性扩增第1外显子、第1内含子、第2外显子，以及部分5’-启动子区和部分第2内含子的序列，目的扩增片段长度为2314bp。第二对PCR引物包括上游引物3DS1_PCR_Ex345_F(序列：5’-CAGCTGACACTTGTTGTAGGGAG-3’,nt1634～nt1656)和下游引物3DS1_PCR_Ex345_R(序列：5’-AGTGGCATGATCTCGGCTCAG-3’,nt6472～nt6492)，特异性扩增第3外显子、第3内含子、第4外显子、第4内含子、第5外显子，以及部分第2内含子和部分第5内含子的序列，目的扩增片段长度为4859bp。第三对PCR引物包括上游引物3DS1_PCR_Ex6_F(序列：5’-TGATCCGCCCACCTCCGCT-3’,nt7633～nt7651)和下游引物3DS1_PCR_Ex6_R(序列：5’-GCTGGGAGGTTTGAGCCAACG-3’,nt9048～nt9068)，特异性扩增第6外显子及其两侧翼的部分序列，目的扩增片段长度为1436bp。第四对PCR引物包括上游引物3DS1_PCR_Ex789_F(序列：5’-GCTATAACTGAGAAAGCAGGAGG-3’,nt13101～nt13123)和下游引物3DS1_PCR_Ex789_R(序列：5’-GAAGGCTGAAAGCTAGTCTGAGG-3’,nt14562～nt14584),特异性扩增第7外显子、第7内含子、第8外显子、第8内含子、第9外显子，以及部分第6内含子和部分3’-非翻译区的序列，目的扩增片段长度为1484bp。
三、所述PCR扩增反应的体系组成均为：
四、所述PCR扩增反应均可在同一循环参数条件下进行同步扩增，其循环参数为：
五、所述PCR扩增产物的纯化反应体系组成均为：
六、所述PCR扩增产物的纯化反应体系均可在同一循环参数条件下进行纯化，其循环参数为：
37℃ 45min，
85℃ 15min，
4℃ Infinite。
七、纯化后的KIR基因PCR特异性扩增产物所涵盖的外显子，分别通过十六条(KIR2DL1～5、2DS1～5和KIR3DL3)或十八条(KIR3DL1～2和KIR3DS1)特异性正向和反向测序引物对纯化后的PCR扩增产物进行双向测序反应。14个功能性KIR基因特异性正向和反向测序引物共计230条，如表2所示：
表2 14个功能性KIR基因特异性正向和反向测序引物
(1)KIR2DL1第一外显子正向测序引物2DL1_SBT_Ex1_F(序列:5’-CGTGTTCCGCTCTTGAGCG-3’，nt-177～nt-159)，第一外显子反向测序引物2DL1_SBT_Ex1_R(序列:5’-TCACTCCCTCCCTCTATTG-3’，nt50～nt68)；
KIR2DL1第二外显子正向测序引物2DL1_SBT_Ex2_F(序列:5’-TTCTTGGGTGCAGGTAGGC-3’，nt855～nt873)，第二外显子反向测序引物2DL1_SBT_Ex2_R(序列:5’-ACCCTGGTCCCCACAGAAC-3’，nt1210～nt1228)；
KIR2DL1第四外显子正向测序引物2DL1_SBT_Ex4_F(序列:5’-AAGGGGAAGCCTGACTCAA-3’，nt3400～nt3418)，第四外显子反向测序引物2DL1_SBT_Ex4_R(序列:5’-CCAATTCCTGGATCATTCAC-3’，nt3827～nt3846)；
KIR2DL1第五外显子正向测序引物2DL1_SBT_Ex5_F(序列：5’-GTTCTCAGCTCAGGTGAAG-3’，nt5240～nt5258)，第五外显子反向测序引物2DL1_SBT_Ex5_R(序列：5’-AAACAAGCAGTGGGTCACTTGAC-3’，nt5574～nt5596)；
KIR2DL1第六外显子正向测序引物2DL1_SBT_Ex6_F(序列：5’-TTTCCACTGAGTGGAGGAC-3’，nt8698～nt8716)，第六外显子反向测序引物2DL1_SBT_Ex6_R(序列：5’-TGGAGTTCGGAGATGGTGG-3’，nt8920～nt8938)；
KIR2DL1第七外显子正向测序引物2DL1_SBT_Ex7_F(序列：5’-ATGTGGTTACCTGTCAATC-3’，nt12979～nt12997)，第七外显子反向测序引物2DL1_SBT_Ex7_R(序列：5’-TCCTGCTTCCCCACATGGC-3’，nt13207～nt13225)；
KIR2DL1第八外显子正向测序引物2DL1_SBT_Ex8_F(序列：5’-CTCAGCCACCTATGGTCTC-3’，nt13533～nt13551)，第八外显子反向测序引物2DL1_SBT_Ex8_R(序列：5’-TCTCTGTGTGAAAACGCAG-3’，nt13835～nt13853)；
KIR2DL1第九外显子正向测序引物2DL1_SBT_Ex9_F(序列：5’-ACAGAACAGCGAATAGCGA-3’，nt13667～nt13685)，第九外显子反向测序引物2DL1_SBT_Ex9_R(序列：5’-TAAGATGCAGACTCATGCC-3’，nt14060～nt14078)。
(2)KIR2DL2第一外显子正向测序引物2DL2_SBT_Ex1_F(序列：5’-AGAGGTTGGATCTGAGACGTC-3’，nt-263～nt-243)，第一外显子反向测序引物2DL2_SBT_Ex1_R(序列：5’-TCTCCAACTCTGGGCCCCG-3’，nt81～nt99)；
KIR2DL2第二外显子正向测序引物2DL2_SBT_Ex2_F(序列：5’-TTCTTGGGTGCAGGTAGGC-3’，nt799～nt817)，第二外显子反向测序引物2DL2_SBT_Ex2_R(序列：5’-CCCAGTCTAACCCTGGTCC-3’，nt1163～nt1181)；
KIR2DL2第四外显子正向测序引物2DL2_SBT_Ex4_F(序列：5’-AAGGGGAAGCCTCACTCAT-3’，nt3332～nt3350)，第四外显子反向测序引物2DL2_SBT_Ex4_R(序列：5’-GGCCCCTGTGTCTGTCCTC-3’，nt3900～nt3918)；
KIR2DL2第五外显子正向测序引物2DL2_SBT_Ex5_F(序列：5’-GCTGTGACAAGGAAGATCC-3’，nt5179～nt5197)，第五外显子反向测序引物2DL2_SBT_Ex5_R(序列：5’-AAGCTCCTCAGCTAAGGCT-3’，nt5564～nt5582)；
KIR2DL2第六外显子正向测序引物2DL2_SBT_Ex6_F(序列：5’-ATCCCAGGACTCCCAGGGC-3’，nt8669～nt8687)，第六外显子反向测序引物2DL2_SBT_Ex6_R(序列：5’-GGCGTACAATGTCAGAGCTGC-3’，nt8928～nt8948)；
KIR2DL2第七外显子正向测序引物2DL2_SBT_Ex7_F(序列：5’-ATCTGGGTGCTTGTCCTAA-3’，nt12990～nt13008)，第七外显子反向测序引物2DL2_SBT_Ex7_R(序列：5’-CCTCTGCTTCGTGAGACTTAC-3’，nt13213～nt13233)；
KIR2DL2第八外显子正向测序引物2DL2_SBT_Ex8_F(序列：5’-CCCAGAAGTGCCCTCCGAG-3’，nt13628～nt13646)，第八外显子反向测序引物2DL2_SBT_Ex8_R(序列：5’-TCTCTGTGTGAAAACGCAG-3’，nt13876～nt13894)；
KIR2DL2第九外显子正向测序引物2DL2_SBT_Ex9_F(序列：5’-ACAGAACAGCGAATAGCGA-3’，nt13708～nt13726)，第九外显子反向测序引物2DL2_SBT_Ex9_R(序列：5’-GGCTGTTGTCTCCCTAGAAGACG-3’，nt14026～nt14048)。
(3)KIR2DL3第一外显子正向测序引物2DL3_SBT_Ex1_F(序列：5’-CYGMCTGTCTGCACAGA-3’，nt-24～nt-8)，第一外显子反向测序引物2DL3_SBT_Ex1_R(序列：5’-TCTCCAACTCTGGGCCCCG-3’，nt81～nt99)；
KIR2DL3第二外显子正向测序引物2DL3_SBT_Ex2_F(序列：5’-TTCTTGGGTGCAGGTAGGC-3’，nt799～nt817)，第二外显子反向测序引物2DL3_SBT_Ex2_R(序列：5’-ACCCTGGTCCCCACAGAAC-3’，nt1154～nt1172)；
KIR2DL3第四外显子正向测序引物2DL3_SBT_Ex4_F(序列：5’-CAGCAAGGGGAAGCCTCA-3’，nt3329～nt3346)，第四外显子反向测序引物2DL3_SBT_Ex4_R(序列：5’-GGCCCCTGTGTCTGTCCTC-3’，nt3901～nt3919)；
KIR2DL3第五外显子正向测序引物2DL3_SBT_Ex5_F(序列：5’-GAGCATTAGGTCATAGAGC-3’，nt5131～nt5149)，第五外显子反向测序引物2DL3_SBT_Ex5_R(序列：5’-CTCTCTGCATCTGTCCATGCTTC-3’，nt5602～nt5624)；
KIR2DL3第六外显子正向测序引物2DL3_SBT_Ex6_F(序列：5’-TACTCAGGAGTTTGAGGCC-3’，nt8310～nt8328)，第六外显子反向测序引物2DL3_SBT_Ex6_R(序列：5’-GGCGTACAATGTCAGAGCTGC-3’，nt8908～nt8928)；
KIR2DL3第七外显子正向测序引物2DL3_SBT_Ex7_F(序列：5’-TCTGGGTGCTTGTCCTAAAGG-3’，nt12969～nt12989)，第七外显子反向测序引物2DL3_SBT_Ex7_R(序列：5’-CAGGCAATGGTCTGTGAGC-3’，nt13361～nt13379)；
KIR2DL3第八外显子正向测序引物2DL3_SBT_Ex8_F(序列：5’-CTTCATCGCTGGTGCTG-3’，nt13166～nt13182)，第八外显子反向测序引物2DL3_SBT_Ex8_R(序列：5’-GCTGAGTGAGGGAGGGTGC-3’，nt13772～nt13790)；
KIR2DL3第九外显子正向测序引物2DL3_SBT_Ex9_F(序列：5’-CCCAGCCTCGTGGCTAG-3’，nt13724～nt13740)，第九外显子反向测序引物2DL3_SBT_Ex9_R(序列：5’-GGCAGGAGACAACTTTGGATCW-3’，nt13957～nt13978)。
(4)KIR2DL4第一外显子正向测序引物2DL4_SBT_Ex1_F(序列：5’-GTGGTCAATGTGTCAACTGCACG-3’，nt-99～nt-77)，第一外显子反向测序引物2DL4_SBT_Ex1_R(序列：5’-CCTGAGCCACTGGGCGCCA-3’，nt166～nt184)；
KIR2DL4第二外显子正向测序引物2DL4_SBT_Ex2_F(序列：5’-GAGCCATGTTCTGAAGCAAGT-3’，nt111～nt131)，第二外显子反向测序引物2DL4_SBT_Ex2_R(序列：5’-CACCCTCTGTGCTGCCTCC-3’，nt345～nt363)；
KIR2DL4第三外显子正向测序引物2DL4_SBT_Ex3_F(序列：5’-TACTCCTCTCTGAGGCGGC-3’，nt1140～nt1158)，第三外显子反向测序引物2DL4_SBT_Ex3_R(序列：5’-CCAGAAGCTCTGGGACTCA-3’，nt1502～nt1520)；
KIR2DL4第五外显子正向测序引物2DL4_SBT_Ex5_F(序列：5’-GGGAGGGGAGCTGTGACAA-3’，nt2275～nt2293)，第五外显子反向测序引物2DL4_SBT_Ex5_R(序列：5’-GCTTCTCTCCATCATCAGC-3’，nt2691～nt2709)；
KIR2DL4第六外显子正向测序引物2DL4_SBT_Ex6_F(序列：5’-CAGGCATCCTCATTGCCAC-3’，nt5179～nt5197)，第六外显子反向测序引物2DL4_SBT_Ex6_R(序列：5’-TGGCAGGTGCTGAGCCAAC-3’，nt5341～nt5359)；
KIR2DL4第七外显子正向测序引物2DL4_SBT_Ex7_F(序列：5’-TCGCCAGACACCTGCATGC-3’，nt9519～nt9537)，第七外显子反向测序引物2DL4_SBT_Ex7_R(序列：5’-TTTGGAGCACCAGC-3’，nt9600～nt9613)；
KIR2DL4第八外显子正向测序引物2DL4_SBT_Ex8_F(序列：5’-GAGGACCCAGAAGTGCCCT-3’，nt10030～nt10048)，第八外显子反向测序引物2DL4_SBT_Ex8_R(序列：5’-CTGGAGAGAGGGAAATCCT-3’，nt10215～nt10233)；
KIR2DL4第九外显子正向测序引物2DL4_SBT_Ex9_F(序列：5’-CCAGCCTCATGGATACAGTCT-3’，nt10150～nt10170)，第九外显子反向测序引物2DL4_SBT_Ex9_R(序列：5’-GGAAGAGTGATGCTCTAAGATGG-3’，nt10516～nt10538)。
(5)KIR2DL5第一外显子正向测序引物2DL5_SBT_Ex1_F(序列：5’-CCAAATAACATCCTGTGCGCT-3’，nt-67～nt-47)，第一外显子反向测序引物2DL5_SBT_Ex1_R(序列：5’-AGATCTCCATCCCCGCACT-3’，nt64～nt82)；
KIR2DL5第二外显子正向测序引物2DL5_SBT_Ex2_F(序列：5’-CAGCAAGGGCCTGGCTACC-3’，nt668～nt686)，第二外显子反向测序引物2DL5_SBT_Ex2_R(序列：5’-GAAAATCCCCCACCGGGCT-3’，nt872～nt890)；
KIR2DL5第三外显子正向测序引物2DL5_SBT_Ex3_F(序列：5’-ACAAGCCCTTGCTGTCTGCCT-3’，nt1575～nt1595)，第三外显子反向测序引物2DL5_SBT_Ex3_R(序列：5’-CAGATGCTCTGGGATTCAG-3’，nt1891～nt1909)；
KIR2DL5第五外显子正向测序引物2DL5_SBT_Ex5_F(序列：5’-CAGGTGTGAGGGGAGCTGT-3’，nt2665～nt2683)，第五外显子反向测序引物2DL5_SBT_Ex5_R(序列：5’-CGGGTCTGACCACTCATAGGGT-3’，nt2970～nt2991)；
KIR2DL5第六外显子正向测序引物2DL5_SBT_Ex6_F(序列：5’-TCACCTCTCTCCTGTCCTGTGT-3’，nt5165～nt5186)，第六外显子反向测序引物2DL5_SBT_Ex6_R(序列：5’-TGAGCCAATGCTTGAATCCAAGA-3’，nt5295～nt5317)；
KIR2DL5第七外显子正向测序引物2DL5_SBT_Ex7_F(序列：5’-ATCCATAAAGAGGAACTGCTATA-3’，nt7951～nt7973)，第七外显子反向测序引物2DL5_SBT_Ex7_R(序列：5’-CCTTGGTCCAGGGACCATC-3’，nt8201～nt8219)；
KIR2DL5第八外显子正向测序引物2DL5_SBT_Ex8_F(序列：5’-CACCTACGGCCTCCCGCTG-3’，nt8480～nt8498)，第八外显子反向测序引物2DL5_SBT_Ex8_R(序列：5’-GAGGGTGCTCACATTCTTCAA-3’，nt8680～nt8700)；
KIR2DL5第九外显子正向测序引物2DL5_SBT_Ex9_F(序列：5’-TGCCGGGGACAGAACAGTG-3’，nt8600～nt8618)，第九外显子反向测序引物2DL5_SBT_Ex9_R(序列：5’-CTCAAGGCCTGACTGTGGTGCTT-3’，nt8899～nt8921)。
(6)KIR2DS1第一外显子正向测序引物2DS1_SBT_Ex1_F(序列：5’-CTCCCATGATGTGGTCAAC-3’，nt-109～nt-91)，第一外显子反向测序引物2DS1_SBT_Ex1_R(序列：5’-TCTCCAACCCCACACTCCC-3’，nt61～nt79)；
KIR2DS1第二外显子正向测序引物2DS1_SBT_Ex2_F(序列：5’-TTCTTGGGTGCAGGTAGGC-3’，nt855～nt873)，第二外显子反向测序引物2DS1_SBT_Ex2_R(序列：5’-CTGCCAAGGGAATGAAAGG-3’，nt1185～nt1203)；
KIR2DS1第四外显子正向测序引物2DS1_SBT_Ex4_F(序列：5’-GGTGCCATGGATGGGATGA-3’，nt3423～nt3441)，第四外显子反向测序引物2DS1_SBT_Ex4_R(序列：5’-CAAGTCCTGGATCATTCAC-3’，nt3827～nt3845)；
KIR2DS1第五外显子正向测序引物2DS1_SBT_Ex5_F(序列：5’-AGAGCAGGGGAGTGAGTTC-3’，nt5221～nt5239)，第五外显子反向测序引物2DS1_SBT_Ex5_R(序列：5’-GGCTCTAGGATCATAGGAC-3’，nt5628～nt5646)；
KIR2DS1第六外显子正向测序引物2DS1_SBT_Ex6_F(序列：5’-TCCTCAAAGATTTCCACTGAGTG-3’，nt8684～nt8706)，第六外显子反向测序引物2DS1_SBT_Ex6_R(序列：5’-GTGAGATGCTGAGTCAACGC-3’，nt8871～nt8890)；
KIR2DS1第七外显子正向测序引物2DS1_SBT_Ex7_F(序列：5’-GTGGTTACCTGCCAATCAAG-3’，nt12981～nt13000)，第七外显子反向测序引物2DS1_SBT_Ex7_R(序列：5’-TGAGGAACACACATCCGCGT-3’，nt13236～nt13255)；
KIR2DS1第八外显子正向测序引物2DS1_SBT_Ex8_F(序列：5’-ATGGCCTCCCCCTGTTTGT-3’，nt13547～nt13565)，第八外显子反向测序引物2DS1_SBT_Ex8_R(序列：5’-GGGAATAAGACTAGCCACG-3’，nt13713～nt13731)；
KIR2DS1第九外显子正向测序引物2DS1_SBT_Ex9_F(序列：5’-CTCCTCGGCCCAGCCTCGT-3’，nt13697～nt13715)，第九外显子反向测序引物2DS1_SBT_Ex9_R(序列：5’-TCCCCTCAAGGCCTGACTG-3’，nt13971～nt13989)。
(7)KIR2DS2第一外显子正向测序引物2DS2_SBT_Ex1_F(序列：5’-ATAACATCCTGTGCGCTGC-3’，nt-63～nt-45)，第一外显子反向测序引物2DS2_SBT_Ex1_R(序列：5’-CCAACTCTGGGCCCCGATC-3’，nt78～nt96)；
KIR2DS2第二外显子正向测序引物2DS2_SBT_Ex2_F(序列：5’-AAGGGAGTCCTGGTTTGCC-3’，nt772～nt790)，第二外显子反向测序引物2DS2_SBT_Ex2_R(序列：5’-GTCAGAAATGTGGGCCGAG-3’，nt981～nt999)；
KIR2DS2第四外显子正向测序引物2DS2_SBT_Ex4_F(序列：5’-CACCTTCTAAACTCACAACC-3’，nt3268～nt3287)，第四外显子反向测序引物2DS2_SBT_Ex4_R(序列：5’-CACTCTGCAGCCCAATGAC-3’，nt3624～nt3642)；
KIR2DS2第五外显子正向测序引物2DS2_SBT_Ex5_F(序列：5’-AGAGCAGGGGAGTGAGTTC-3’，nt5030～nt5048)，第五外显子反向测序引物2DS2_SBT_Ex5_R(序列：5’-GAAGCTCCTCAGCTAAGGC-3’，nt5453～nt5471)；
KIR2DS2第六外显子正向测序引物2DS2_SBT_Ex6_F(序列：5’-CCAGGGCCCAATATTAGAT-3’，nt8465～nt8483)，第六外显子反向测序引物2DS2_SBT_Ex6_R(序列：5’-TGAGTCAACGCCTGAATCC-3’，nt8686～nt8704)；
KIR2DS2第七外显子正向测序引物2DS2_SBT_Ex7_F(序列：5’-GCCAATCAAGAAATGCGAG-3’，nt12815～nt12833)，第七外显子反向测序引物2DS2_SBT_Ex7_R(序列：5’-GTCCTGCCTCTGTGGCTCC-3’，nt13108～nt13126)；
KIR2DS2第八外显子正向测序引物2DS2_SBT_Ex8_F(序列：5’-ATGAGGACCCAGAAGTGCC-3’，nt13407～nt13425)，第八外显子反向测序引物2DS2_SBT_Ex8_R(序列：5’-CCTCCTGATGGTCTTGTTC-3’，nt13621～nt13639)；
KIR2DS2第九外显子正向测序引物2DS2_SBT_Ex9_F(序列：5’-AGGTAGGTGCTCCTCGGCC-3’，nt13512～nt13530)，第九外显子反向测序引物2DS2_SBT_Ex9_R(序列：5’-AGAAGATCCCCTCAAGGCC-3’，nt13801～nt13819)。
(8)KIR2DS3第一外显子正向测序引物2DS3_SBT_Ex1_F(序列：5’-CAGGGAGCCAAATAACATC-3’，nt-75～nt-57)，第一外显子反向测序引物2DS3_SBT_Ex1_R(序列：5’-CGCTCCCTCCCTCTATTCC-3’，nt49～nt67)；
KIR2DS3第二外显子正向测序引物2DS3_SBT_Ex2_F(序列：5’-GCCGAGAGCCCTGTTCTTG-3’，nt1182～nt1200)，第二外显子反向测序引物2DS3_SBT_Ex2_R(序列：5’-ACAGGACTTCCCTCCCGTT-3’，nt1432～nt1450)；
KIR2DS3第四外显子正向测序引物2DS3_SBT_Ex4_F(序列：5’-AGAGAGACACCTTCTAAAT-3’，nt3780～nt3798)，第四外显子反向测序引物2DS3_SBT_Ex4_R(序列：5’-ATCATTCACTCTGTGTCCG-3’，nt4152～nt4170)；
KIR2DS3第五外显子正向测序引物2DS3_SBT_Ex5_F(序列：5’-AGGAAGATCCTCCATAAGG-3’，nt5596～nt5614)，第五外显子反向测序引物2DS3_SBT_Ex5_R(序列：5’-GGCTCTAGGATCATAGGAC-3’，nt5957～nt5975)；
KIR2DS3第六外显子正向测序引物2DS3_SBT_Ex6_F(序列：5’-TCCCAGGGCCCAATATTAG-3’，nt8968～nt8986)，第六外显子反向测序引物2DS3_SBT_Ex6_R(序列：5’-CACTGAGCCCTGTGTTGGG-3’，nt9291～nt9309)；
KIR2DS3第七外显子正向测序引物2DS3_SBT_Ex7_F(序列：5’-GTGCTTGTCCTAAAGAGACGT-3’，nt13284～nt13304)，第七外显子反向测序引物2DS3_SBT_Ex7_R(序列：5’-TGAGTGGCTGCAGGGGACG-3’，nt13709～nt13727)；
KIR2DS3第八外显子正向测序引物2DS3_SBT_Ex8_F(序列：5’-GACCTCAGGCACCTATGGC-3’，nt13862～nt13880)，第八外显子反向测序引物2DS3_SBT_Ex8_R(序列：5’-GCTGAGTGAGGGAGGGTGC-3’，nt14082～nt14100)；
KIR2DS3第九外显子正向测序引物2DS3_SBT_Ex9_F(序列：5’-CGGCCCAGCCTCGTGGCTA-3’，nt14031～nt14049)，第九外显子反向测序引物2DS3_SBT_Ex9_R(序列：5’-TGTCTTGGGCCTCTGAGAAGGGG-3’，nt14196～nt14218)。
(9)KIR2DS4第一外显子正向测序引物2DS4_SBT_Ex1_F(序列：5’-ACCATGTCGCTCATGGTC-3’，nt-3～nt15)，第一外显子反向测序引物2DS4_SBT_Ex1_R(序列：5’-GGCTCATCACTCCATCTCT-3’，nt148～nt166)；
KIR2DS4第二外显子正向测序引物2DS4_SBT_Ex2_F(序列：5’-GAAGGGGCTGGCTATCAAG-3’，nt2218～nt2236)，第二外显子反向测序引物2DS4_SBT_Ex2_R(序列：5’-GACTTCCCTCCCGTTTCAG-3’，nt2404～nt2422)；
KIR2DS4第四外显子正向测序引物2DS4_SBT_Ex4_F(序列：5’-AGAGAGACACCTTCTAAAC-3’，nt4774～nt4792)，第四外显子反向测序引物2DS4_SBT_Ex4_R(序列：5’-CACCTGGGTCTCCAAGTCC-3’，nt5168～nt5186)；
KIR2DS4第五外显子正向测序引物2DS4_SBT_Ex5_F(序列：5’-AGTTCTCAGGTCAGGTGTG-3’，nt6589～nt6607)，第五外显子反向测序引物2DS4_SBT_Ex5_R(序列：5’-GGAAGCTCCTCAGCTAAGG-3’，nt7001～nt7019)；
KIR2DS4第六外显子正向测序引物2DS4_SBT_Ex6_F(序列：5’-CTGGACTCCCAGGGCCCAATG-3’，nt10004～nt10024)，第六外显子反向测序引物2DS4_SBT_Ex6_R(序列：5’-TTCCACCTCCCCAGGGTTC-3’，nt10209～nt10227)；
KIR2DS4第七外显子正向测序引物2DS4_SBT_Ex7_F(序列：5’-CGCCATTTGGGTGCTTGTC-3’，nt14317～nt14335)，第七外显子反向测序引物2DS4_SBT_Ex7_R(序列：5’-GGTGAGGAACACACATCCG-3’，nt14611～nt14629)；
KIR2DS4第八外显子正向测序引物2DS4_SBT_Ex8_F(序列：5’-AGTCTGCTGTTGGCAACTG-3’，nt14883～nt14901)，第八外显子反向测序引物2DS4_SBT_Ex8_R(序列：5’-CCTCCTGATGGTCTTGTTC-3’，nt15169～nt15187)；
KIR2DS4第九外显子正向测序引物2DS4_SBT_Ex9_F(序列：5’-CTCGGCCCAGCCTCGTGGC-3’，nt15072～nt15090)，第九外显子反向测序引物2DS4_SBT_Ex9_R(序列：5’-CAACTTTGGATCTGGGCTC-3’，nt15304～nt15322)。
(10)KIR2DS5第一外显子正向测序引物2DS5_SBT_Ex1_F(序列：5’-GGCGCCAAATAACATCCTG-3’，nt-72～nt-54)，第一外显子反向测序引物2DS5_SBT_Ex1_R(序列：5’-GCCCAGATCTCCATCCCCG-3’，nt68～nt86)；
KIR2DS5第二外显子正向测序引物2DS5_SBT_Ex2_F(序列：5’-GGCACTGAGKGTGAGTTTC-3’，nt1383～nt1401)，第二外显子反向测序引物2DS5_SBT_Ex2_R(序列：5’-TGACAGGACTTCCCTCCCG-3’，nt1606～nt1624)；
KIR2DS5第四外显子正向测序引物2DS5_SBT_Ex4_F(序列：5’-GACACCTTCTAAATTCACAAAC-3’，nt3958～nt3979)，第四外显子反向测序引物2DS5_SBT_Ex4_R(序列：5’-CTCTGCATCCCAATGACAATG-3’，nt4315～nt4335)；
KIR2DS5第五外显子正向测序引物2DS5_SBT_Ex5_F(序列：5’-CCTCCCTGAGGAAAATGCC-3’，nt5786～nt5804)，第五外显子反向测序引物2DS5_SBT_Ex5_R(序列：5’-TCATAGGACATGGGACAGC-3’，nt6129～nt6147)；
KIR2DS5第六外显子正向测序引物2DS5_SBT_Ex6_F(序列：5’-CAGGGCCCAATATTAGATAAC-3’，nt9147～nt9167)，第六外显子反向测序引物2DS5_SBT_Ex6_R(序列：5’-GGAGTATCTGGAGTTCGGAGA-3’，nt9426～nt9446)；
KIR2DS5第七外显子正向测序引物2DS5_SBT_Ex7_F(序列：5’-CTGTCAATCAAGAAATGCGAG-3’，nt13495～nt13515)，第七外显子反向测序引物2DS5_SBT_Ex7_R(序列：5’-GGAACACACACCCGCGTGC-3’，nt13740～nt13758)；
KIR2DS5第八外显子正向测序引物2DS5_SBT_Ex8_F(序列：5’-AGATAGAATGTCTGAGTCTGC-3’，nt14003～nt14023)，第八外显子反向测序引物2DS5_SBT_Ex8_R(序列：5’-ACACAGTGATCCAATTATGCG-3’，nt14329～nt14349)；
KIR2DS5第九外显子正向测序引物2DS5_SBT_Ex9_F(序列：5’-GGTAGGTGCTCCTCGGCCC-3’，nt14195～nt14213)，第九外显子反向测序引物2DS5_SBT_Ex9_R(序列：5’-ATGGGAGCTGGCAACCCGG-3’，nt14528～nt14546)。
(11)KIR3DL1第一外显子正向测序引物3DL1_SBT_Ex1_F(序列：5’-CAGGGCGCCAAATAACATC-3’，nt-74～nt-56)，第一外显子反向测序引物3DL1_SBT_Ex1_R(序列：5’-CAGATCTCCATCCCCGCAC-3’，nt65～nt83)；
KIR3DL1第二外显子正向测序引物3DL1_SBT_Ex2_F(序列：5’-AGGGCCTGGCTGCCAAGAC-3’，nt940～nt958)，第二外显子反向测序引物3DL1_SBT_Ex2_R(序列：5’-AATGTGGGCCGAGCATCCG-3’，nt1182～nt1200)；
KIR3DL1第三外显子正向测序引物3DL1_SBT_Ex3_F(序列：5’-GGGGAGAATCTTCTGGGCACT-3’，nt1736～nt1756)，第三外显子反向测序引物3DL1_SBT_Ex3_R(序列：5’-TGATGGGACCCTGACGGAC-3’，nt2167～nt2185)；
KIR3DL1第四外显子正向测序引物3DL1_SBT_Ex4_F(序列：5’-TGGAGGCACCTGCACCAGG-3’，nt3052～nt3070)，第四外显子反向测序引物3DL1_SBT_Ex4_R(序列：5’-TGGTACAGACCTCACCAAG-3’，nt3633～nt3651)；
KIR3DL1第五外显子正向测序引物3DL1_SBT_Ex5_F(序列：5’-CAGGTATGAGGGGAGCTATG-3’，nt5001～nt5020)，第五外显子反向测序引物3DL1_SBT_Ex5_R(序列：5’-CCTGTCTGCCATCCTGCGC-3’，nt5490～nt5508)；
KIR3DL1第六外显子正向测序引物3DL1_SBT_Ex6_F(序列：5’-AAGCACCCTCATTTCCTCAC-3’，nt8485～nt8504)，第六外显子反向测序引物3DL1_SBT_Ex6_R(序列：5’-CAACACTTGCATCCAAGGC-3’，nt8631～nt8649)；
KIR3DL1第七外显子正向测序引物3DL1_SBT_Ex7_F(序列：5’-CCCGCCATCTGGGTGCTTG-3’，nt12734～nt12752)，第七外显子反向测序引物3DL1_SBT_Ex7_R(序列：5’-TCCTGCTTCCCCACATGGC-3’，nt13001～nt13019)；
KIR3DL1第八外显子正向测序引物3DL1_SBT_Ex8_F(序列：5’-CCAGAAGTGCCCTCCGAGC-3’，nt13382～nt13400)，第八外显子反向测序引物3DL1_SBT_Ex8_R(序列：5’-TGTTTGGGAATAACACTAGCC-3’，nt13507～nt13527)；
KIR3DL1第九外显子正向测序引物3DL1_SBT_Ex9_F(序列：5’-CGTGGCTAGTGTTATTCCC-3’，nt13504～nt13522)，第九外显子反向测序引物3DL1_SBT_Ex9_R(序列：5’-ATGGGAGCTGGCAACTCGG-3’，nt13833～nt13851)。
(12)KIR3DL2第一外显子正向测序引物3DL2_SBT_Ex1_F(序列：5’-GCCAAATAACATCCTGTGCGC-3’，nt-68～nt-48)，第一外显子反向测序引物3DL2_SBT_Ex1_R(序列：5’-TAGGCCGAGATCTCCATCC-3’，nt71～nt89)；
KIR3DL2第二外显子正向测序引物3DL2_SBT_Ex2_F(序列：5’-GAGGCTAAGTTTACCTTCAGC-3’，nt624～nt644)，第二外显子反向测序引物3DL2_SBT_Ex2_R(序列：5’-GACTTCCCTCCTGTTTCAG-3’，nt834～nt852)；
KIR3DL2第三外显子正向测序引物3DL2_SBT_Ex3_F(序列：5’-GGCCCAGCACTGTGGTGCC-3’，nt1553～nt1571)，第三外显子反向测序引物3DL2_SBT_Ex3_R(序列：5’-GCCCATTTCCCCTGTATTC-3’，nt1930～nt1948)；
KIR3DL2第四外显子正向测序引物3DL2_SBT_Ex4_F(序列：5’-GAGAGATGCCTTCTAAACT-3’，nt3235～nt3253)，第四外显子反向测序引物3DL2_SBT_Ex4_R(序列：5’-TCTCCATAAGAATCCCACGCT-3’，nt3663～nt3683)；
KIR3DL2第五外显子正向测序引物3DL2_SBT_Ex5_F(序列：5’-CCTCCCTGAGGAAACTGCC-3’，nt5111～nt5129)，第五外显子反向测序引物3DL2_SBT_Ex5_R(序列：5’-GAAAGAGCCGAAGCATCTG-3’，nt5361～nt5379)；
KIR3DL2第六外显子正向测序引物3DL2_SBT_Ex6_F(序列：5’-CAACCTCAAAGATTTCCATTG-3’，nt8530～nt8550)，第六外显子反向测序引物3DL2_SBT_Ex6_R(序列：5’-CAACACTTGCATCCAAGGC-3’，nt8707～nt8725)；
KIR3DL2第七外显子正向测序引物3DL2_SBT_Ex7_F(序列：5’-GAGATGTTCCATGTGGTTACC-3’，nt15231～nt15251)，第七外显子反向测序引物3DL2_SBT_Ex7_R(序列：5’-GGAACACACACCCGCGTGC-3’，nt15494～nt15512)；
KIR3DL2第八外显子正向测序引物3DL2_SBT_Ex8_F(序列：5’-TCTGAGTCTGGATGTTGGC-3’，nt15764～nt15782)，第八外显子反向测序引物3DL2_SBT_Ex8_R(序列：5’-GGGTCTTGTTCATCAGAGTCC-3’，nt16046～nt16066)；
KIR3DL2第九外显子正向测序引物3DL2_SBT_Ex9_F(序列：5’-CCTCGGCCCAGCCTCACGG-3’，nt15957～nt15975)，第九外显子反向测序引物3DL2_SBT_Ex9_R(序列：5’-GACTGTGGTGCTCGTGGGC-3’，nt16216～nt16234)。
(13)KIR3DL3第一外显子正向测序引物3DL3_SBT_Ex1_F(序列：5’-ACAACATCCTGTGTGCTGCTGAA-3’，nt-63～nt-41)，第一外显子反向测序引物3DL3_SBT_Ex1_R(序列：5’-TCCCTCCCTCGATTCCCTT-3’，nt46～nt64)；
KIR3DL3第二外显子正向测序引物3DL3_SBT_Ex2_F(序列：5’-GATGTACAGATGGATCATC-3’，nt672～nt690)，第二外显子反向测序引物3DL3_SBT_Ex2_R(序列：5’-GTCAACCCCCTGTGTCGCCTG-3’，nt815～nt835)；
KIR3DL3第三外显子正向测序引物3DL3_SBT_Ex3_F(序列：5’-GCTCCACATCCTCCTCTCT-3’，nt1474～nt1492)，第三外显子反向测序引物3DL3_SBT_Ex3_R(序列：5’-ATCCCCCTTTACCCCAAAT-3’，nt1905～nt1923)；
KIR3DL3第四外显子正向测序引物3DL3_SBT_Ex4_F(序列：5’-GGGAAGCCTCACTTATTTCAG-3’，nt2996～nt3016)，第四外显子反向测序引物3DL3_SBT_Ex4_R(序列：5’-ACCTGGGGCTTCCAGTCCT-3’，nt3431～nt3449)；
KIR3DL3第五外显子正向测序引物3DL3_SBT_Ex5_F(序列：5’-GAGAGCTGTGACAASGAAG-3’，nt4900～nt4918)，第五外显子反向测序引物3DL3_SBT_Ex5_R(序列：5’-GCAGGAAGCTCCTCAGCTA-3’，nt5294～nt5312)；
KIR3DL3第七外显子正向测序引物3DL3_SBT_Ex7_F(序列：5’-GTGAGACAATTCATATAGA-3’，nt10650～nt10668)，第七外显子反向测序引物3DL3_SBT_Ex7_R(序列：5’-TGCTTCCCCACATGGCCCT-3’，nt10852～nt10870)；
KIR3DL3第八外显子正向测序引物3DL3_SBT_Ex8_F(序列：5’-GACCTCAGGCACCTATGGC-3’，nt11178～nt11196)，第八外显子反向测序引物3DL3_SBT_Ex8_R(序列：5’-GAGTGAGGGAGGGTGCTCA-3’，nt11395～nt11413)；
KIR3DL3第九外显子正向测序引物3DL3_SBT_Ex9_F(序列：5’-CRTGGCTAGTCTTATTCCC-3’，nt11358～nt11376)，第九外显子反向测序引物3DL3_SBT_Ex9_R(序列：5’-CCCTAGAAGATCCCATCAA-3’，nt11627～nt11645)。
(14)KIR3DS1第一外显子正向测序引物3DS1_SBT_Ex1_F(序列：5’-AAGCCATGCTCCGCTCTTG-3’，nt-181～nt-163)，第一外显子反向测序引物3DS1_SBT_Ex1_R(序列：5’-CAGATCTCCATCCCCGCAC-3’，nt65～nt83)；
KIR3DS1第二外显子正向测序引物3DS1_SBT_Ex2_F(序列：5’-AGTGGGGGCAGCAGGGTG-3’，nt968～nt985)，第二外显子反向测序引物3DS1_SBT_Ex2_R(序列：5’-AATGTGGGCCGAGCATCCG-3’，nt1182～nt1200)；
KIR3DS1第三外显子正向测序引物3DS1_SBT_Ex3_F(序列：5’-GGGGAGAATCTTCTGGGCACT-3’，nt1735～nt1755)，第三外显子反向测序引物3DS1_SBT_Ex3_R(序列：5’-TGATGGGACCCTGACGGAC-3’，nt2166～nt2184)；
KIR3DS1第四外显子正向测序引物3DS1_SBT_Ex4_F(序列：5’-GGAGAGAGACAGACACGGG-3’，nt3485～nt3503)，第四外显子反向测序引物3DS1_SBT_Ex4_R(序列：5’-TGGTACAGACCTCACCAAG-3’，nt4007～nt4025)；
KIR3DS1第五外显子正向测序引物3DS1_SBT_Ex5_F(序列：5’-CAGGTGTGAGGGGAGCTGT-3’，nt5403～nt5421)，第五外显子反向测序引物3DS1_SBT_Ex5_R(序列：5’-CCTGTCTGCCATCCTGCGC-3’，nt5892～nt5910)；
KIR3DS1第六外显子正向测序引物3DS1_SBT_Ex6_F(序列：5’-TCAAGACAGTGGGCATCGCAC-3’，nt8763～nt8783)，第六外显子反向测序引物3DS1_SBT_Ex6_R(序列：5’-GGGAGGTTTGAGCCAACGCTT-3’，nt9045～nt9065)；
KIR3DS1第七外显子正向测序引物3DS1_SBT_Ex7_F(序列：5’-CGCTGTATGTGGTTACCTGTG-3’，nt13165～nt13185)，第七外显子反向测序引物3DS1_SBT_Ex7_R(序列：5’-GGTGAGGAACACACACCCG-3’，nt13432～nt13450)；
KIR3DS1第八外显子正向测序引物3DS1_SBT_Ex8_F(序列：5’-CCAGAAGTGCCCTCCGAGC-3’，nt13784～nt13802)，第八外显子反向测序引物3DS1_SBT_Ex8_R(序列：5’-GCTGAGTGAGGGAGGGTGC-3’，nt13944～nt13962)；
KIR3DS1第九外显子正向测序引物3DS1_SBT_Ex9_F(序列：5’-CGTGGCTAGTGTTATTCCC-3’，nt13904～nt13922)，第九外显子反向测序引物3DS1_SBT_Ex9_R(序列：5’-GGCCTCTGAGAAGGGCGAG-3’，nt14055～nt14073)。
八、所述测序反应休系组成均为：
九、所述测序反应的循环参数均为：
本发明基于各KIR基因的基因组全长序列的结构特点、SNPs多态性分布以及外显子两翼内含子的长度，制定了科学、高效的KIR基因PCR扩增策略。通过设计KIR基因特异性PCR引物和测序引物、探索最佳的PCR扩增和测序反应条件，研究和建立KIR基因家族中全部的14个功能性KIR基因同步测序分型技术，适合于KIR高分辨水平基因分型、群体遗传学、骨髓移植组织配型、疾病关联研究等领域。
本发明的贡献在于，首次建立了适合于高通量化、高分辨水平的14个功能性KIR基因同步测序分型的方法。根据KIR基因的结构特点，制定了科学的PCR扩增策略，设计了具有相近退火温度的KIR基因特异性PCR引物，可以在同一PCR扩增条件下进行同步扩增，并且所需时间短，省时省力；由于PCR引物的特异性强，解决了因KIR序列高度同源出现的非特异性扩增问题。扩增产物经电泳可直接鉴定KIR基因的有无，无需采用商品化KIR-SSP试剂盒进行检测。该方法可对每个功能性KIR基因的全部外显子进行测序分型，解决了以往研究者报道的KIR测序分型方法中的不足，并且所获得的序列中无背景信号和杂峰，易于识别和结果判读，为下一步的商品化、产业化奠定了良好的基础。
表3 14个功能性KIR基因编码区结构及外显子长度
Del：缺失外显子；Pseudoexon：假外显子。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为14个功能性KIR基因同步测序分型技术策略图；
设计采用3～5对KIR基因特异性PCR引物(除了KIR3DL3因缺失第6外显子仅用3对PCR引物、KIR2DL1采用5对PCR引物外，其余的每个功能性KIR基因均采用4对PCR引物)，对每个功能性KIR基因的全部编码区进行特异性PCR扩增。纯化后的PCR扩增产物，分别通过十六条(KIR2DL1～5、2DS1～5和KIR3DL3)或十八条(KIR3DL1～2和KIR3DS1)特异性正向和反向测序引物对每一外显子序列进行双向测序反应。
图2为实施例1的KIRAA1基因组合型样本的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳效果图。M：DL2000Marker；A1：Amplicon 1，扩增第1外显子至第2外显子目的基因片段；A2：Amplicon2，扩增3DL1～3、3DS1、2DL4～5的第3外显子至第5外显子目的基因片段以及KIR2DL1～3和KIR2DS1～5的第4外显子至5外显子目的基因片段。特别地，KIR2DL1采用两对PCR引物分别扩增第4外显子(Amplicon 2-1)和第5外显子(Amplicon 2-2)；A3：Amplicon 3，扩增第6外显子目的基因片段；A4：Amplicon 4，扩增第7外显子至第9外显子目的基因片段；
图3-1至图3-7分别依次对应是实施例1的KIRAA1基因组合型样本的KIR2DL1、2DL3、2DL4、2DS4、3DL1、3DL2、3DL3全编码区测序序列导入Assign 3.5或4.7分析软件效果图，该样本KIR基因型为KIR2DL1*00302-2DL3*00101-2DL4*00102,011-2DS4*00101,010-3DL1*00501,01502-3DL2*00201,010-3DL3*00901,010；
图4是实施例2的KIRAB6基因组合型样本的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳效果图。M：DL2000Marker；A1：Amplicon 1，扩增第1外显子至第2外显子目的基因片段；A2：Amplicon2，扩增3DL1～3、3DS1、2DL4～5的第3外显子至第5外显子目的基因片段以及KIR2DL1～3和KIR2DS1～5的第4外显子至5外显子目的基因片段。特别地，KIR2DL1采用两对PCR引物分别扩增第4外显子(Amplicon 2-1)和第5外显子(Amplicon 2-2)；A3：Amplicon 3，扩增第6外显子目的基因片段；A4：Amplicon 4，扩增第7外显子至第9外显子目的基因片段；
图5-1至图5-14是实施例2的KIRAB6样本的14个功能性KIR基因全编码区测序序列导入Assign 3.5或4.7分析软件效果图，该样本KIR基因型为“KIR2DL1*00302,00401-2DL2*00301-2DL3*00101-2DL4*00102,00501-2DL5A*00101,B*010-2DS1*00201-2DS2*00101-2DS3*00101-2DS4*00101-2DS5*00201-3DL1*01502-3DL2*00201,00701-3DL3*01002-3DS1*01301”。图中示KIR2DS4*001纯合子样本测序分型结果：2DS4*001等位基因的第5外显子无22bp缺失，序列导入后可见第5外显子正向测序在编码区nt454及下游位置无碱基错位(图5-9A)，反向测序在nt475及上游位置亦无碱基错位(图5-9B)。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
实施例1
本实施例随机选择一例经商品化KIR-SSP试剂盒检测为KIRAA1基因组合型(KIR2DL1-2DL3-2DL4-2DS4-3DL1-3DL2-3DL3)的样本，采用本发明对该样本进行14个功能性KIR基因同步测序分型，以验证本发明的实施效果。
首先分别采用KIR基因特异性PCR扩增引物对每个功能性KIR基因的全部编码区进行PCR扩增。扩增反应于ABI 9700PCR仪进行，扩增反应体系组成均为：
所述PCR扩增反应均可在同一循环参数条件下进行同步扩增，其循环参数为：
取2μL PCR产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳，对照TakaraDL2000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR扩增产物条带，PCR扩增产物条带清晰、特异，可明确地判读该样本的基因组合为“KIR2DL1-2DL3-2DL4-2DS4-3DL1-3DL2-3DL3”，其电泳效果见图2。
电泳结果显示KIR2DL1、2DL3、2DL4、2DS4、3DL1、3DL2和3DL3等7个功能性KIR基因的各泳道均出现特异性条带，其余的KIR2DL2、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1等7个功能性KIR基因的各泳道均无任何条带，符合KIRAA1基因组合型。
电泳检出了特异性PCR扩增条带的上述7个KIR基因，进一步将PCR扩增产物进行纯化反应，其纯化反应体系组成均为：
所述PCR扩增产物的纯化反应均可在同一循环参数条件下进行纯化，其循环参数为：
37℃ 45min，
85℃ 15min，
4℃ Infinite。
纯化反应结束后，用3倍体积的无菌去离子水稀释PCR产物，并混合均匀。
PCR产物经电泳检出特异性扩增条带的各KIR基因，分别通过十六条(KIR2DL1、2DL3、2DL4、2DS4和KIR3DL3)或十八条(KIR3DL1～2)特异性正向和反向测序引物，对纯化和稀释后的扩增产物进行双向测序反应，每个测序反应体系如下：
测序反应的循环参数均为：
测序反应结束后，测序产物采用乙醇/NaOAc/EDTA沉淀法进行纯化，最后加入15μL超纯甲酰胺溶液(Hi-Di Formamide)，在PCR扩增仪上95℃变性2.5min。纯化后的测序产物于ABI 3730基因测序仪毛细管电泳检测并收集电泳后的序列数据信息。将该样本测得的所有序列导入Assign 3.5或4.7(Conexio Genomics，Western Australia)分析软件(图3)中，可清晰地判定该受检者KIR基因型为“KIR2DL1*00302-KIR2DL3*00101-KIR2DL4*00102,011-KIR2DS4*00101,010-KIR3DL1*00501,01502-KIR3DL2*00201,010-KIR3DL3*00901,010”。
图3-4中示KIR2DS4*00101，010杂合子样本测序分型结果：因2DS4*010等位基因第5外显子存在22bp缺失，而2DS4*00101则无22bp缺失，结果第5外显子正向测序在编码区nt454及下游位置出现碱基错位(图3-4A)，反向测序在nt475及上游位置出现碱基错位(图3-4B)。
实施例2
本实施例给出了随机选择一例经商品化KIR-SSP试剂盒检测为KIRAA6基因组合型(即携带全部的14个功能性KIR基因)的样本，采用本发明对该样本进行14个功能性KIR基因同步测序分型，以验证本发明的实施效果。
首先分别采用KIR基因特异性PCR扩增引物对每个功能性KIR基因的全部编码区进行PCR扩增。扩增反应于ABI 9700PCR仪进行，扩增反应体系组成均为：
所述PCR扩增反应均可在同一循环参数条件下进行同步扩增，其循环参数为：
取2μL PCR产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳，对照TakaraDL2000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR扩增产物条带，PCR扩增产物条带清晰、特异，可明确地判读该样本的基因组合为“KIR2DL1–2DL2-2DL3-2DL4-2DL5-2DS1-2DS2-2DS3-2DS4-2DS5-3DL1-3DL2-3DL3-3DS1”，其电泳效果见图4。
电泳结果显示KIR2DL1、KIR2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、KIR2DS5、3DL1、3DL2、3DL3和3DS1等14个功能性KIR基因的各泳道均检出特异性条带，符合KIRAB6基因组合型。
电泳检出的全部14个功能性KIR基因，进一步将PCR扩增产物进行纯化反应，其纯化反应体系组成均为：
所述PCR扩增产物的纯化反应均可在同一循环参数条件下进行纯化，其循环参数为：
37℃ 45min，
85℃ 15min，
4℃ Infinite。
纯化反应结束后，用3倍体积的无菌去离子水稀释PCR产物，并混合均匀。
PCR产物经电泳检出特异性扩增条带的各KIR基因，分别通过十六条(KIR2DL1～5、2DS1～5和KIR3DL3)或十八条(KIR3DL1～2和KIR3DS1)特异性正向和反向测序引物，对纯化和稀释后的扩增产物进行双向测序反应，每个测序反应体系如下：
测序反应的循环参数均为：
测序反应结束后，测序产物采用乙醇/NaOAc/EDTA沉淀法进行纯化，最后加入15μL超纯甲酰胺溶液(Hi-Di Formamide)，在PCR扩增仪上95℃变性2.5min。经纯化后的测序产物于ABI 3730基因测序仪毛细管电泳检测并收集电泳后的序列数据信息。
该样本测得的所有序列导入Assign 4.7SBT(Conexio Genomics，WesternAustralia)软件(图5-1～5-14)中，可清晰地判定该受检者的KIR基因型为“KIR2DL1*00302,00401-KIR2DL2*00301-KIR2DL3*00101-KIR2DL4*00102,00501-KIR2DL5A*00101,B*010-KIR2DS1*00201-KIR2DS2*00101-KIR2D S3*00101-KIR2DS4*00101-KIR2DS5*00201-KIR3DL1*01502-KIR3DL2*00201,00701-KIR3DL3*01002-KIR3DS1*01301”。
图5-9中示KIR2DS4*00101纯合子样本测序分型结果：2DS4*00101等位基因的第5外显子无22bp缺失，序列导入后可见第5外显子正向测序在编码区nt454及下游位置无碱基错位(图5-9A)，反向测序在nt475及上游位置亦无碱基错位(图5-9B)。
实施例3
本实施例给出采用本发明对306例南方汉族健康无关个体进行14个功能性KIR基因同步测序分型的群体遗传学调查的实例。
针对每例样本，分别采用KIR基因特异性PCR扩增引物对每个功能性KIR基因的全部编码区进行PCR扩增。扩增反应于ABI 9700PCR仪进行，扩增反应体系组成均为：
所述PCR扩增反应均可在同一循环参数条件下进行同步扩增，其循环参数为：
取2μL PCR产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳，对照TakaraDL2000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR扩增产物条带，PCR扩增产物条带清晰、特异，可明确地判读每一样本KIR基因的有无。
琼脂糖凝胶电泳检出特异性条带的每个KIR基因，进一步将PCR扩增产物进行纯化反应，其纯化反应体系组成均为：
所述PCR扩增产物的纯化反应均可在同一循环参数条件下进行纯化，其循环参数为：
37℃ 45min，
85℃ 15min，
4℃ Infinite。
纯化反应结束后，用3倍体积的无菌去离子水稀释PCR产物，并混合均匀。
PCR产物经电泳检出特异性扩增条带的各KIR基因，分别通过十六条(KIR2DL1～5、2DS1～5和KIR3DL3)或十八条(KIR3DL1～2和KIR3DS1)特异性正向和反向测序引物，对纯化和稀释后的扩增产物进行双向测序反应，每个测序反应体系如下：
测序反应的循环参数均为：
测序反应结束后，测序产物采用乙醇/NaOAc/EDTA沉淀法进行纯化，最后加入15μL超纯甲酰胺溶液(Hi-Di Formamide)，在PCR扩增仪上95℃变性2.5min。经纯化后的测序产物于ABI 3730基因测序仪毛细管电泳检测并收集电泳后的序列数据信息。
将各样本测得的所有序列导入Assign 3.5或者4.7(Conexio Genomics，WesternAustralia)分析软件中，可清晰地判定全部14个功能性KIR基因中检出的等位基因(见表6)，统计获得了各等位基因的检出频率(见表7)。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
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<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gttcgggagg ttggatctc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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tgattctcct gagtctccag agg 23
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<212> DNA
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tggaaggaga agaggcagtt tcc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctggcaggga cctacagatg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggacagccat gggctttcct c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcctgattgt gagttcttgg cat 23
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<212> DNA
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tgagtcagts agtcgaartg tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctcagcacg ttctatggtt act 23
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ggaccgatgg agaagttggc t 21
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gaggctacta gagacagagg gac 23
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cccaagcttc gtcttctctc t 21
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tccctgtcct agcctccata c 21
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ggtttcctgt tgctgctgta g 21
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agagaagagg gagggagaca gat 23
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<213> 人工序列
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gccatcctgt gccctgatc 19
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cccacctcag gctctcaaag g 21
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<212> DNA
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actgagaaag caggagaaag ctg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccttcagatt ccagctgctg g 21
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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gcagaaggct gaaagatagt ctg 23
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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tctgtccatg cttctctcca tcc 23
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 172
tttggagcac cagc 14
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<213> 人工序列
<400> 173
gaggacccag aagtgccct 19
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<213> 人工序列
<400> 174
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<213> 人工序列
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ccagcctcat ggatacagtc t 21
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 177
ccaaataaca tcctgtgcgc t 21
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<213> 人工序列
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agatctccat ccccgcact 19
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<213> 人工序列
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cagcaagggc ctggctacc 19
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<213> 人工序列
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gaaaatcccc caccgggct 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 181
acaagccctt gctgtctgcc t 21
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<213> 人工序列
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cagatgctct gggattcag 19
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<213> 人工序列
<400> 183
caggtgtgag gggagctgt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgggtctgac cactcatagg gt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 185
tcacctctct cctgtcctgt gt 22
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<213> 人工序列
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<210> 187
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 187
atccataaag aggaactgct ata 23
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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tcttgggtgc aggtaggc 18
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ctgccaaggg aatgaaagg 19
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<213> 人工序列
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ggctctagga tcataggac 19
<210> 201
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 201
tcctcaaaga tttccactga gtg 23
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 202
gtgagatgct gagtcaacgc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 203
gtggttacct gccaatcaag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 204
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 205
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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ccagggccca atattagat 19
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cgctccctcc ctctattcc 19
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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acacagtgat ccaattatgc g 21
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cctccctgag gaaactgcc 19
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<213> 人工序列
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caacacttgc atccaaggc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 303
gagatgttcc atgtggttac c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggaacacaca cccgcgtgc 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 305
tctgagtctg gatgttggc 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 306
gggtcttgtt catcagagtc c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 307
cctcggccca gcctcacgg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gactgtggtg ctcgtgggc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acaacatcct gtgtgctgct gaa 23
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<213> 人工序列
<400> 310
tccctccctc gattccctt 19
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<213> 人工序列
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gatgtacaga tggatcatc 19
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<213> 人工序列
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gtcaaccccc tgtgtcgcct g 21
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<213> 人工序列
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gctccacatc ctcctctct 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atcccccttt accccaaat 19
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<213> 人工序列
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gggaagcctc acttatttca g 21
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acctggggct tccagtcct 19
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gcaggaagct cctcagcta 19
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<213> 人工序列
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gtgagacaat tcatataga 19
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<213> 人工序列
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tgcttcccca catggccct 19
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<213> 人工序列
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gacctcaggc acctatggc 19
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<213> 人工序列
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gagtgaggga gggtgctca 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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crtggctagt cttattccc 19
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<213> 人工序列
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ccctagaaga tcccatcaa 19
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aagccatgct ccgctcttg 19
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cagatctcca tccccgcac 19
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agtgggggca gcagggtg 18
<210> 328
<211> 19
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aatgtgggcc gagcatccg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggggagaatc ttctgggcac t 21
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggagagagac agacacggg 19
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tggtacagac ctcaccaag 19
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caggtgtgag gggagctgt 19
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cctgtctgcc atcctgcgc 19
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tcaagacagt gggcatcgca c 21
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ggtgaggaac acacacccg 19
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cgtggctagt gttattccc 19
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ggcctctgag aagggcgag 19

Claims (8)

1.14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs基因同步测序分型的方法，其特征在于，根据各KIR基因的基因组全长序列的结构、编码区单核苷酸多态性分布特点以及外显子两翼的内含子的长度，制定了科学的PCR扩增策略，每个功能性KIR基因的全部编码区序列分别采用3～5对具有相近退火温度的KIR基因特异性PCR引物进行PCR同步扩增；针对纯化后的PCR扩增产物所含的每一外显子，分别进行正向、反向双向测序，如图1所示。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述KIR基因特异性PCR扩增引物，除了KIR3DL3因缺失第6外显子仅用3对PCR引物、KIR2DL1采用5对PCR引物外，其余的每个功能性KIR基因均采用4对PCR引物；PCR引物共56对，计112条；每条PCR引物的序列、在KIR基因组全长序列中的位置，以及扩增目的片段的长度等特征，如表1所述。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的体系组成均为：
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，PCR扩增条件均为：
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每10μL的PCR扩增产物纯化所采用的体系组成均为：
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增产物的纯化体系均在同一循环参数条件下进行纯化反应，其循环参数为：
37℃ 45min，
85℃ 15min，
4℃ Infinite。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，针对纯化后的PCR产物所含的每一外显子进行测序反应，14个功能性KIR基因特异性正向和反向测序引物共计230条，每条测序引物的序列及其在KIR基因组全长序列中的位置等特征，如表2所述。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，测序反应休系组成均为：
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