CN109055504A

CN109055504A - 一种KIR2DS3 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒

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Publication number: CN109055504A
Application number: CN201810938968.7A
Authority: CN
Inventors: 何军; 李颖; 邱桥成; 鲍晓晶
Original assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2018-12-21

Abstract

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种KIR2DS3 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒，引物及探针的设计方法包括以下步骤：（1）运用PCR‑SSOP方法对DNA样本进行KIR基因分型，筛选出KIR2DS3阳性DNA；（2）将阳性DNA样本进行PCR扩增、电泳；（3）提取KIR2DS3特异性DNA条带，经割胶、纯化后与T载体连接，经转化、挑选菌群后抽取质粒测序；（4）测序结果与KIR/IPD数据库进行比对，证实其为特征性基因序列；（5）根据特征性KIR2DS3基因序列，运用引物设计软件，设计出引物及探针。使用设计出的引物及探针进行基因检测。该方法提高了PCR检测的特异性和准确率。

Description

一种KIR2DS3 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种KIR2DS3 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）是主要表达于NK细胞膜表面的一种跨膜糖蛋白，其与配体HLA分子相互作用，产生同种异源NK细胞，发挥GVL效应，在造血干细胞移植的预后方面产生重要作用。KIR位于人染色体19q13.4，含有2个（KIR2D）或3个（KIR3D）胞外Ig样结构域，分为抑制性KIR（inhibitory KIR, iKIR）及激活性KIR（activating KIR, aKIR）两类，iKIR 基因包括有异源反应活性功能的KIR2DL1、KIR 2DL2、KIR3DL1等，aKIR 基因包括KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1等。KIR各基因之间DNA序列80-90%相同，目前对于引物设计，多在NCBI上寻找目的基因序列，或者对该基因进行全基因测序，进而根据基因序列通过引物设计软件，设计出引物后，进行blast；这些方法在设计KIR各基因引物时均存在一定的局限性，主要表现为效率低、特异性差、准确率低。

发明内容

为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种KIR2DS3 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒，以提高KIR2DS3的检测效率以及检测的特异性。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

荧光定量PCR检测KIR2DS3 mRNA的引物和探针，其序列为：

2DS3F：5’-CTTCTGCACAGAGAGGGGAC-3’；

2DS3R：5’-CCCTGCCAGGTCTTGCC-3’；

荧光探针：5’-ATCGGTCGCATGAGG-3’。

获取权利要求1所述的引物和探针的方法，包括以下步骤：

（1）抽提正常人DNA样本，运用PCR-SSOP方法进行KIR基因分型，筛选出KIR2DS3阳性的正常人DNA样本；

（2）将筛选出的DNA样本采用市售KIR2DS3序列特异性引物扩增板（购于One Lambda）进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳；

（3）提取KIR2DS3特异性条带中的PCR产物，经割胶、纯化后，与T载体进行连接，转化受体是TOP10感受态耐链霉素的大肠杆菌，挑选菌群后，抽取质粒，使用ABI 3730XL型测序仪进行测序；

（4）测序结果与KIR/IPD数据库进行比对，证实其为特征性KIR2DS3基因序列，测序获得的具体序列为：5’-CTTCTGCACAGAGAGGGGACGTTTAACGACACTTTGCGCCTCATTG

GAGAGCACATTGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTCTCCATCGGTCGCATGAGGCAAGAC

CTGGCAGGG；

（5）根据特征性KIR2DS3基因序列，运用引物设计软件，设计出如权利要求1所述的引物及探针。

进一步的，获取本发明所述的引物和探针的方法中，PCR扩增采用的仪器为PerkinElmer GeneAmp 9700 PCR扩增仪。

进一步的，获取本发明所述的引物和探针的方法中，所述步骤（3）中使用的T载体为pMD18-T Vector。

进一步的，获取本发明所述的引物和探针的方法中，所述的引物及探针通过primerexpress软件进行设计。

本发明所述的荧光定量PCR检测KIR2DS3 mRNA的引物和探针在制备KIR2DS3 mRNA荧光定量PCR检测试剂盒中的用途。

检测KIR2DS3 mRNA的方法包括以下步骤：

（1）提取总RNA；

（2）将RNA逆转录为cDNA；

（3）使用权利要求1中的引物和探针，运用荧光定量PCR通用体系，检测KIR2DS3的mRNA转录水平。

有益效果：本发明提供了一种KIR2DS3 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒，本发明通过采用PCR-SSOP方法对正常人DNA样本进行常规KIR基因分型，筛选出KIR2DS3阳性样本后，将其DNA样本采用特异性引物进行PCR扩增、电泳，将PCR产物与T载体连接，并进行克隆性扩增、筛选、测序，由于PCR产物不专一，直接测序效果不好，PCR产物直接测序，引物端约有几十个碱基是测不出来的，如果恰好需要这段序列，直接测序将错过此段基因序列。使用PCR产物与T噬菌体连接，可避免上述问题。而且该发明最终直接找出KIR2DS3基因序列中的特征性基因序列，直接避免了扩增出其他同源性高的其他未知条带。使用本发明获得的引物和探针进行KIR2DS3 mRNA的荧光定量PCR检测，具有特异性强、准确率高的特点，同时本发明设计引物及探针的方法亦可运用予其他同源性高的KIR基因。

附图说明

图1 为本发明实施例中ABL标准品的荧光定量PCR标准曲线图，以表1的数据作为横纵坐标得出标准曲线，横坐标是以ABL标准品拷贝数的对数值表示，具体为 log10（200，2000，20000，200000，200000）=（2.3010，3.3010，4.3010，5.3010 ，6.3010），纵坐标即是ABL标准品的Ct值。

图2 为本发明进行KIR2DS3 mRNA荧光定量PCR检测的设计思路图。

图3为用本发明设计的KIR2DS3引物探针进行荧光定量PCR检测得到的KIR2DS3阳性产物的1.5%琼脂糖电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验方法：

1. DNA抽提：根据DNA抽提试剂盒（购自美国Promega公司）说明书全血提取DNA

2. PCR-SSOP进行基因分型：

该步实验使用KIR SSO基因分型试剂盒（购于One Lambda公司）进行操作。

2.1 PCR反应体系：KIR SSO扩增分Group 1、Group 2、Group 3三组，每个反应孔加D-Mix 7.5µL，Primer 2µL，Taq酶0.1µL，DNA样本2.5µL，（D-Mix、Primer购于One Lambda公司）。

2.2 经Perkin Elmer GeneAmp 9700 PCR扩增仪进行PCR扩增，PCR扩增条件：96℃3min 1个循环；96℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 20s 共5个循环；96℃ 10s，60℃，15s，72℃ 20s，共32个循环；72℃ 10min 1个循环；4℃终止。

2.3 将扩增产物使用碱性液变性后，再使用酸性液中和，之后再加微珠和荧光二抗进行孵育，洗涤后，使用Luminex 200仪器上机检测，筛选出KIR2DS3阳性的正常人DNA样本。

3. PCR扩增

3.1 PCR反应体系：PCR缓冲液115µL，ddH₂O 152µL，步骤2筛选出的KIR2DS3阳性的DNA样本31µL，Taq酶1.8µL，KIR2DS3序列特异性引物扩增板（PCR缓冲液、KIR2DS3序列特异性引物扩增板购于One Lambda公司）；

3.2 3000rpm 离心15-20s；

3.3 经Perkin Elmer GeneAmp 9700 PCR扩增仪进行PCR扩增，PCR扩增条件：预变性，95℃ 5min；PCR循环：变性，95℃ 30s；退火，68℃，30s；延伸72℃ 90s；共30个循环；

3.4 配置1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外凝胶成像仪成像，摄图并打印扩增产物电泳图，黏贴于KIR worksheet上进行结果判读；

3.5 通过结果判读，将琼脂糖凝胶上的KIR2DS3条带进行割胶、纯化处理，获得KIR2DS3基因。

4. TA克隆

4.1 连接：在微量离心管中加入pMD18-T Vector 1µL、KIR2DS3基因0.2 pmol、Solution I （pMD™18-T Vector Cloning Kit试剂盒Takara 6011 中的连接液）5µL、加ddH₂O至10µL；16℃反应30min

4.2 转化培养：取50µL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮，加入5µL连接液，冰上放置30min。42℃水浴热激45s，冰上放置3min。加500µL 2×YT无抗培养基，37℃ 220 rpm振荡培养1h。5000rpm离心5min，用枪头吸弃400µL培养菌液，剩余吹打混匀涂布在氨苄青霉素平板（已加适量IPTG和X-gal），平板在37℃下正向放置10min后倒置培养过夜12h，使用无菌10µL枪头挑取白斑6个，接菌2mL，培养过夜。

4.3 质粒抽提：根据磁珠法质粒小提试剂盒（上海硕美生物科技有限公司）说明书进行质粒抽提；

4.4 使用ABI 3730XL型测序仪进行测序，测序所得序列与KIR/IPD数据库KIR2DS3序列进行比对，证实其为特征性KIR2DS3基因序列，

测序后的具体序列为：5’-CTTCTGCACAGAGAGGGGACGTTTAACGACACTTTGCGCCTC

ATTGGAGAGCACATTGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTCTCCATCGGTCGCATGAGGC

AAGACCTGGCAGGG-3’。

5. 采用primerexpress软件对特征性KIR2DS3基因序列进行引物及探针设计，所得引物及探针的具体序列如下，

荧光探针：5’-ATCGGTCGCATGAGG-3’；

2DS3F：5’-CTTCTGCACAGAGAGGGGAC-3’；

2DS3R：5’-CCCTGCCAGGTCTTGCC-3’。

6. 荧光定量PCR

6.1 提取RNA；

6.1.1 取10mL外周血，1500rpm离心5min，弃上清；

6.1.2 加PBS缓冲液5mL，1500rpm离心5min，弃上清；

6.1.3 加PBS缓冲液1mL，1500rpm离心5min，弃上清；

6.1.4 加1mL Trizol吹打，充分裂解细胞，-20℃保存备用；

6.1.5 将要提取总RNA的备用Trizol样本放在冰上融化；

6.1.6 融化后的Trizol样本加200µL氯仿，混匀后，4℃ 12000rpm离心15min；

6.1.7 转移上清液至1.5mL EP管中，加异丙醇500µL混匀后，冰上沉淀5min，4℃12000rpm离心15min；

6.1.8 弃上清，加入75%的乙醇600µL，混匀后，4℃ 12000rpm离心5min；

6.1.9 弃上清，加无水乙醇800µL，混匀后，4℃ 12000rpm离心5min；

6.1.10 弃上清，并干燥后，加DEPC水溶解，并调整RNA浓度值0.5ug/µL。

6.2 mRNA逆转录为cDNA

6.2.1 反应体系：Random Primer 2µL、DEPC水 9µL、RNA 4µL 混匀后，3000rpm短暂离心（Random Primer购于上海生物工程有限公司）；

6.2.2 PCR上机，反应条件：70℃ 5min，4℃，终止；

6.2.3 将5×Buffer 8µL、MMLV逆转录酶 1µL、Rnasin0.5µL、dNTP 1.5µL、DEPC水15µL混匀后加入至6.2.2中（MMLV逆转录酶购于IBM公司）；

6.2.4 将6.2.3混匀，3000rpm短暂离心；

6.2.5 PCR上机，反应条件：37℃ 60min，95℃ 5min，4℃终止。

6.3 荧光定量PCR

6.3.1 PCR反应体系：96孔板，每孔加MIX（包括Mg²⁺、dNTP、Taq酶、UNG酶及ROX参比染料等）12.5µL，上游引物 0.5µL，下游引物0.5µL，探针0.3µL，cDNA 4µL，ddH2O 7.2µL；

6.3.2 3000rpm 短暂离心；

6.3.3 PCR反应条件：50℃ 2min，1个循环；95℃ 10min 1个循环；95℃ 15s，60℃1min，共40个循环；

6.3.4 使用Roche Light Cycler 480 软件分析结果。

采用本发明的试剂盒进行荧光定量PCR检测KIR2DS3的mRNA表达量分析，其结果如下：

KIR目的基因mRNA的转录水平用以下公式计算：(KIR目的基因mRNA拷贝数/ABL内参基因mRNA拷贝数)×10000，定义为在所有血液有核细胞中，每10000个ABL基因中KIR目的基因的拷贝数。

标准曲线：含有一段管家基因abl片段的已知拷贝数的T载体，稀释不同浓度梯度做标准曲线，根据曲线的斜率判断扩增效率。ABL标准品与Ct值的对应关系表如表1所示，所获得的标准曲线如图1所示，KIR2DS3的拷贝数如表2所示。荧光阈值：荧光超过本底时的临界数值，荧光阈值为基线荧光信号均值加标准差的10倍，PCR扩增达到荧光阈值时所对应的的循环数称为Ct值。

图3为用本发明设计的KIR2DS3引物探针进行荧光定量PCR检测得到的KIR2DS3阳性产物的1.5%琼脂糖电泳图，从图3中看出，电泳图与blast后KIR2DS3阳性产物为114bp的结论一致，从而说明本发明设计的引物和探针对KIR2DS3基因具有良好的识别特异性。

表1

表2

序列表

<110> 苏州大学附属第一医院

<120> 一种KIR2DS3 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒

<141> 2018-08-17

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 1

cttctgcaca gagaggggac 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 2

ccctgccagg tcttgcc 17

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(化学合成)

<400> 3

atcggtcgca tgagg 15

Claims

1.荧光定量PCR检测KIR2DS3 mRNA的引物和探针，其特征在于，其序列为：

2DS3F：5’-CTTCTGCACAGAGAGGGGAC-3’；

2DS3R：5’-CCCTGCCAGGTCTTGCC-3’；

荧光探针：5’-ATCGGTCGCATGAGG-3’。

2.获取权利要求1所述的引物和探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）将筛选出的DNA样本采用市售KIR2DS3序列特异性引物扩增板进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳；

GAGAGCACATTGATGGGGTCTCCAAGGCCAACTTCTCCATCGGTCGCATGAGGCAAGAC

CTGGCAGGG；

3.根据权利要求2所述的获取权利要求1所述的引物和探针的方法，其特征在于，PCR扩增采用的仪器为Perkin Elmer GeneAmp 9700 PCR扩增仪。

4.根据权利要求2所述的获取权利要求1所述的引物和探针的方法，其特征在于，所述步骤（3）中使用的T载体为pMD18-T Vector。

5.根据权利要求2所述的获取权利要求1所述的引物和探针的方法，其特征在于，所述的引物及探针通过primerexpress软件进行设计。

6.权利要求1所述的荧光定量PCR检测KIR2DS3 mRNA的引物和探针在制备KIR2DS3mRNA荧光定量PCR检测试剂盒中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，检测KIR2DS3 mRNA的方法包括以下步骤：

（1）提取总RNA；

（2）将RNA逆转录为cDNA；