CN107557451A - 荧光定量PCR检测KIR2DS1‑mRNA的试剂盒所用扩增引物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了荧光定量PCR检测KIR2DS1‑mRNA的试剂盒所用扩增引物的制备方法，包括以下步骤：（1）DNA抽提；（2）将步骤（1）中提取的DNA标本运用PCR‑SSO方法进行KIR基因分型筛选出KIR2DS1阳性DNA标本；（3）将筛选出的DNA标本进行PCR扩增，电泳分析，分离纯化；（4）将步骤（3）得到的KIR2DS1基因与T载体进行连接，转化，挑选菌群后，抽取质粒，测序；（5）采用软件对所得产物进行引物及荧光探针设计。本方法可以直接找到KIR2DS1的特征性序列，进而设计引物探针，成功避免了与其同源性极高的KIR2DL1基因序列对引物及探针设计的干扰。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒所用扩增引物的制备方法。
背景技术
杀伤细胞免疫球蛋白样受体（the killer cell immunoglobulin-likereceptor, KIR）是主要表达于NK细胞膜表面的一种跨膜糖蛋白，其与配体人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）分子相互作用，产生同种异源反应活性功能的NK细胞，发挥移植物抗白血病效应（graft versus leukemia,GVL），在造血干细胞移植的预后方面产生重要作用。KIR基因位于人染色体19q13.4的白细胞受体复合物内，分为抑制性KIR（inhibitory KIR, iKIR）及激活性KIR（activating KIR, aKIR）两类，iKIR 基因包括有异源反应活性功能的KIR2DL1、KIR 2DL2、KIR3DL1等，aKIR 基因包括KIR2DS1、KIR2DS2、KIR3DS1等。由于KIR各基因之间DNA序列80-90%相同，及目前对于引物设计，多在NCBI上寻找目的基因序列，或者对该基因进行全基因测序，进而根据基因序列通过引物设计软件，设计出引物后，进行blast。故采用常规这些方法在设计KIR各基因引物时均存在一定的局限性，主要表现效率低，特异性差，准确率低。
发明内容
要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒所用扩增引物的制备方法，通过本方法找到KIR2DS1的特征性序列，进而设计了用于检测KIR2DS1-mRNA表达的引物探针。
技术方案：荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒所用扩增引物的制备方法，包括以下步骤：
（1）DNA抽提：根据DNA抽提试剂盒说明书全血提取DNA；
（2）将步骤（1）中提取的DNA标本运用PCR-SSO方法进行KIR基因分型筛选出KIR2DS1阳性DNA标本；
（3）将筛选出的DNA标本采用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，通过割胶获取电泳条带上特异性的KIR2DS1基因条带并将KIR2DS1基因进行分离纯化；
（4）将步骤（3）得到的KIR2DS1基因与T载体进行连接，转化受体是TOP10感受态耐链霉素的大肠杆菌，挑选菌群后，抽取质粒，使用ABI 3730XL型测序仪进行测序，其中，测序所得序列为：SEQ ID NO: 1；
（5）采用primerexpress软件对步骤（4）所得产物进行引物及荧光探针设计，其中，所述上游引物序列为：SEQ ID NO: 2；下游引物序列为：SEQ ID NO: 3；荧光探针序列为：SEQ IDNO: 4。
荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒，包括：权利要求1 所述的上游引物0.5ul、下游引物0.5ul、荧光探针0.3ul、MIX 12.5ul和ddH2O:7.2ul，其中，MIX包括1.5ulMg2+、0.3ul dNTP、0.25ul Taq酶、0.1ul UNG酶、0.05 ul ROX、7.8ul ddH2O和2.5ul 10x缓冲液。
3. 荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1：测试体RNA的提取；
S2：将mRNA逆转录为cDNA；
S3：荧光定量PCR
（3-1）在上面制备的试剂盒中加入4ul S2中得到的cDNA，进行荧光定量PCR扩增；
（3-2）PCR反应条件：50℃ 2min，1个循环；95℃ 10min 1个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环；
（3-3）使用7500 system Software 软件分析结果。
有益效果：本方法首次公开了用于荧光定量PCR检测KIR2DS1在mRNA水平表达所需引物和探针的方法，运用本方法可以直接找到KIR2DS1的特征性序列，进而设计引物探针，成功避免了与其同源性极高的KIR2DL1基因序列对引物及探针设计的干扰。
附图说明
图1是以表1的数据作为横纵坐标得出的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒所用扩增引物的制备方法，包括以下步骤：
（1）DNA抽提：根据DNA抽提试剂盒说明书全血提取DNA；
（2）将步骤（1）中提取的DNA标本运用PCR-SSO方法进行KIR基因分型筛选出KIR2DS1阳性DNA标本，具体步骤如下：
（2-1）PCR反应体系：KIR SSO扩增分Group 1、Group 2和Group 3三组，每个反应孔加D-Mix 7.5ul、Primer 2ul、Taq酶0.1ul和DNA样本2.5ul（D-Mix、Primer购于Onelambea公司）；
（2-2）经Perkin Elmer GeneAmp 9700 PCR扩增仪进行PCR扩增，PCR扩增条件：96℃3min 1个循环；96℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 20s 共5个循环；96℃ 10s，60℃，15s，72℃ 20s，共32个循环；72℃ 10min 1个循环；4℃ forever；
（2-3）将扩增产物使用碱性液变性后，再使用酸性液中和，之后再加微珠和荧光二抗进行孵育，洗涤后，使用Luminex 200仪器上机检测；
（3）将筛选出的DNA标本采用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，通过割胶获取电泳条带上特异性的KIR2DS1基因条带并将KIR2DS1基因进行分离纯化，具体步骤如下：
（3-1）PCR反应体系：PCR缓冲液115ul、ddH2O 152ul、DNA样本31ul、Taq酶1.8ul、KIR2DS1序列特异性引物扩增板（PCR缓冲液、KIR2DS1序列特异性引物扩增板购于Onelambea公司）；
（3-2）3000rpm 离心15-20s；
（3-3）经Perkin Elmer GeneAmp 9700 PCR扩增仪进行PCR扩增，PCR扩增条件：预变性，95℃ 5min；PCR循环：变性，95℃ 30s；退火，68℃，30s；延伸72℃ 90s；共30个循环；
（3-4）配置1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外凝胶成像仪成像，摄图并打印扩增产物电泳图，黏贴于KIR worksheet上进行结果判读；
（3-5）通过结果判读，抽取KIR2DS1阳性孔中的PCR产物备用；
（4）将步骤（3）得到的KIR2DS1基因与T载体进行连接，转化受体是TOP10感受态耐链霉素的大肠杆菌，挑选菌群后，抽取质粒，使用ABI 3730XL型测序仪进行测序，具体步骤如下：
（4-1）采用primerexpress软件对步骤（4）所得产物进行引物及荧光探针设计，其中，所述上游引物序列为：SEQ ID NO: 2；下游引物序列为：SEQ ID NO: 3；荧光探针序列为：SEQID NO: 4；
（4-2）连接液：在微量离心管中加入pMD18-T Vector 1µl、PCR产物0.2 pmol、SolutionI 5µl、加ddH2O至 10µl；16℃反应 30min；
（4-3）转化培养：取50ul感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮，加入5ul连接液，冰上放置30min，42℃水浴热激45s，冰上放置3min，加 500ul 2YT无抗培养基，37℃ 220 rpm振荡培养1h，5000rpm，离心5min，用枪头吸弃400μl培养菌液，剩余吹打混匀涂布在氨苄青霉素平板（已加适量 IPTG和 X-gal），平板在37℃下正向放置10min后倒置培养过夜12h，使用无菌10ul枪头挑取白斑6个，接菌2ml，培养过夜；
（4-4）质粒抽提：根据磁珠法质粒小提试剂盒说明书进行质粒抽提；
（4-5）使用ABI 3730XL型测序仪进行测序，测序所得序列与KIR/IPD数据库KIR2DS1序列进行比对，证实其为特征性KIR2DS1基因序列，其中，测序所得序列为：SEQ ID NO: 1；
（5）采用primerexpress软件对步骤（4）所得产物进行引物及荧光探针设计，其中，所述上游引物序列为：SEQ ID NO: 2；下游引物序列为：SEQ ID NO: 3；荧光探针序列为：SEQ IDNO: 4。
荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒，包括：权利要求1 所述的上游引物0.5ul、下游引物0.5ul、荧光探针0.3ul、MIX 12.5ul和ddH2O:7.2ul，其中，MIX包括1.5ulMg2+、0.3ul dNTP、0.25ul Taq酶、0.1ul UNG酶、0.05 ul ROX、7.8ul ddH2O和2.5ul 10x缓冲液。
3. 荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1：测试体RNA的提取，步骤如下：
（1-1）取10ml外周血，1500rpm离心5min，弃上清液；
（1-2）加PBS缓冲液5ml，1500rpm离心5min，弃上清液；
（1-3）加PBS缓冲液1ml，1500rpm离心5min，弃上清液；
（1-4）加1ml Trizol吹打，充分裂解细胞，-20℃保存备用；
（1-5）将要提取总RNA的备用Trizol样本放在冰上融化；
（1-6）融化后的Trizol样本加200ul氯仿，混匀后，4℃ 12000rpm离心 15min；
（1-7）转移上清液至1.5ml EP管中，加异丙醇500ul混匀后，冰上沉淀5min，4℃12000rpm离心 15min；
（1-8）弃上清液，加入75%的乙醇600ul，混匀后，4℃ 12000rpm离心 5min；
（1-9）弃上清液，加无水乙醇800ul，混匀后，4℃ 12000rpm离心 5min；
（1-10）弃上清液，并干燥后，加DEPC水溶解，并调整RNA 浓度值0.5ug/ul；
S2：将mRNA逆转录为cDNA，步骤如下：
（2-1）反应体系：Random Primer 2ul、DEPC水 9ul、RNA 4ul 混匀后，3000rpm短暂离心（Random Primer购于上海生物工程有限公司）；
（2-2）PCR上机，反应条件：70℃ 5min，4℃，forever；
（2-3）将5×Buffer 8ul、MMLV 1ul、Rnasin0.5ul、dNTP 1.5ul、DEPC水 15ul混匀后加入至（2-2）中（MMLV逆转录酶购于IBM公司）；
（2-4）将（2-3）混匀，3000rpm短暂离心；
（2-5）PCR上机，反应条件：37℃ 60min，95℃ 5min，4℃ forever；
S3：荧光定量PCR，步骤如下：
（3-1）在上面制备的试剂盒中加入4ul S2中得到的cDNA，进行荧光定量PCR扩增；
（3-2）PCR反应条件：50℃ 2min，1个循环；95℃ 10min 1个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环；
（3-3）使用7500 system Software 软件分析结果。
结果分析：
荧光定量PCR检测KIR2DS1的mRNA表达结果的实例：
表1
表2
标准曲线：含有一段管家基因ABL片段的已知拷贝数的T载体，稀释不同浓度梯度做标准曲线，根据曲线的斜率判断扩增效率。
荧光阈值：荧光超过本底时的临界数值，在荧光扩增曲线上人为设置的值（本实验室取值0.08），Ct值表示达到阈值对应的循环数。
图1以表1的数据作为横纵坐标得出的标准曲线。横坐标是以ABL标准品拷贝数的对数值表示，具体为 log10（250,2500,25000,250000,250000）=（2.3979，3.3979，4.3979，5.3979 ，6.3979），纵坐标即是ABL标准品的Ct值。
表2 六个样本代表6个病人案例，Ct值为达到荧光阈值时所对应的Ct值，我们从表中可以看出，ABL拷贝数和ABL-ct值与图1标准曲线对应。KIR2DS1/ABL*10000即是KIR目的基因拷贝数/ABL基因拷贝数×10000：表示在外周血有核细胞中，每10000个ABL基因中KIR基因的拷贝数。
序列表
<110> 苏州大学附属第一医院
<120> 荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒所用扩增引物的制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 104
<212> DNA
<213> 化学合成(人染色体19q13.4的白细胞受体)
<400> 1
cttctccatc agtcgcatga agcaagacct ggcagggacc tacagatgct acggttctgt 60
tactcactcc ccctatcagt tgacagctcc cagtgaccct ctgg 104
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 化学合成(人染色体19q13.4的白细胞受体)
<400> 2
cttctccatc agtcgcatga a 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 化学合成(人染色体19q13.4的白细胞受体)
<400> 3
ccagagggtc actgggagct gtca 24
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 化学合成(人染色体19q13.4的白细胞受体)
<400> 4
tggcagggac ctacag 16
Claims (3)
1.荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒所用扩增引物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）DNA抽提：根据DNA抽提试剂盒说明书全血提取DNA；
（2）将步骤（1）中提取的DNA标本运用PCR-SSO方法进行KIR基因分型筛选出KIR2DS1阳性DNA标本；
（3）将筛选出的DNA标本采用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，通过割胶获取电泳条带上特异性的KIR2DS1基因条带并将KIR2DS1基因进行分离纯化；
（4）将步骤（3）得到的KIR2DS1基因与T载体进行连接，转化受体是TOP10感受态耐链霉素的大肠杆菌，挑选菌群后，抽取质粒，使用ABI 3730XL型测序仪进行测序，其中，测序所得序列为：SEQ ID NO: 1；
（5）采用primerexpress软件对步骤（4）所得产物进行引物及荧光探针设计，其中，所述上游引物序列为：SEQ ID NO: 2；下游引物序列为：SEQ ID NO: 3；荧光探针序列为：SEQ IDNO: 4。
2. 荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒，其特征在于：包括：权利要求1 所述的上游引物 0.5ul、下游引物0.5ul、荧光探针0.3ul、MIX 12.5ul和ddH2O:7.2ul，其中，MIX包括1.5ul Mg2+、0.3ul dNTP、0.25ul Taq酶、0.1ul UNG酶、0.05 ul ROX、7.8ul ddH2O和2.5ul10x缓冲液。
3.荧光定量PCR检测KIR2DS1-mRNA的试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：测试体RNA的提取；
S2：将mRNA逆转录为cDNA；
S3：荧光定量PCR
（3-1）在权利要求2的试剂盒中加入4ul S2中得到的cDNA，进行荧光定量PCR扩增；
（3-2）PCR反应条件：50℃ 2min，1个循环；95℃ 10min 1个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环；
（3-3）使用7500 system Software 软件分析结果。
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