CN107794305A

CN107794305A - 一种检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN107794305A
Application number: CN201711104012.9A
Authority: CN
Inventors: 徐力文; 罗丹; 刘广峰; 章晋勇
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2018-03-13

Abstract

本发明公开了一种用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了一种用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒具有良好的特异性，且批内、批间重复性试验结果的变异系数均小于2%，具有良好的重复性；而且灵敏度大大提高，最小检出浓度为1.64×10²拷贝/μL，是普通PCR的1000倍。本发明检测快速，整个反应过程从待检品提取DNA到结果分析只要1.5h；同时避免了后续电泳等步骤且整个反应过程为闭管操作，减少了污染和人为操作带来的误差。

Description

一种检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及微生物分子检测领域，具体涉及一种检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒及检测方法。

背景技术

石斑鱼肠道微孢子虫(Microsporidium sp.KR263870)，是一种细胞核内寄生虫，寄生在石斑鱼幼鱼鱼体的肠道上皮细胞中，被寄生的鱼厌食，沉于水底，鱼体严重消瘦，在肛门处可见白色粪便，经解剖后可见肠道水肿和肠壁透明。虫体暴发时引起石斑鱼幼鱼死亡率高达90％。石斑鱼肠道微孢子虫单细胞很小，仅有1.3–1.5×1.6–2.4μm，需要在高倍镜下镜检至少要1000倍左右才能看清楚，单凭肉眼无法判断。目前建立的诊断方法有电镜法、聚合酶链式反应法(PCR)等，其中电镜法仅能判断微孢子虫的有无，且操作复杂；聚合酶链式反应法(PCR)在DNA含量低的情况下不能被检测出，检测效率低，且检测结果容易出现假阳性，影响实际结果判断。上述两种检测方法都只能进行定性分析不能进行定量检测。荧光定量PCR是近年快速发展起来的一种病原分子检测技术，其优点是所需模板少，经济、快速、简便，灵敏度高以及特异性好，被广泛应用于多种疾病的检测。

发明内容

发明目的：本发明在分析和比对石斑鱼肠道微孢子虫18S rDNA基因序列的基础上，通过设计特异性引物扩增并克隆相应片段，构建由石斑鱼肠道微孢子虫基因片段和pMD-18载体连接而成的质粒标准品，建立实时荧光定量PCR方法以进一步开展石斑鱼肠道微孢子虫的早期追踪和流行病学研究等研究工作。因此，本发明所要解决的技术问题是提供了用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种石斑鱼肠道微孢子虫的检测方法。

技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：一种用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的引物对，所述引物对序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明内容还包括一种用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒，含有所述的引物对的试剂盒。

其中，所述的试剂盒包括：

(1)SYBR green I、ddH₂O及所述的引物对的混合液；

(2)标准品；

(3)阴性对照物。

其中，所述标准品是含有石斑鱼肠道微孢子虫基因片段的质粒载体。

其中，该基因片段的序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明内容还包括所述的用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒在石斑鱼肠道微孢子虫的检测方面的应用。

本发明内容还包括一种石斑鱼肠道微孢子虫的检测方法，所述检测方法是实时定量荧光PCR方法。

其中，上述检测方法具体包括以下步骤：

1)石斑鱼微孢子虫DNA的提取：在感染微孢子虫的石斑鱼肠道中，用镊子刮取肠道内壁组织，经镜检后装入1.5mlMP振荡管中，加入1×PBS溶液后用MP*FastPrep-24振荡器以最大速度6.5m/s振荡60s，停止60s，重复3次后取上清液体按QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒说明书的步骤提取DNA；

2)以提取的微孢子虫DNA作为待检品，以包含微孢子虫基因片段的质粒载体作为标准品；分别以待检样品和标准品为模板，在包含上游扩增引物WB-F、下游扩增引物WB-R和荧光染料SYBR GreenⅠ的扩增体系中进行实时荧光定量PCR扩增；

所述上游扩增引物WB-F为：5'TGAAAGTGATTAGATACCGC 3'；

所述下游扩增引物WB-R为：5'GTTTGCTGGGAATAAGAGAA3'；

3)扩增过程中PCR仪自动采集标准品和待检品的扩增产物的荧光信号；

4)根据标准品的扩增产物的荧光信号与质粒载体的对应关系建立标准曲线，然后根据待检品的荧光信号在标准曲线上的位置，确定待检品中石斑鱼肠道微孢子虫的初始含量。

其中，所述标准品是将石斑鱼肠道微孢子虫目的基因片段克隆到pMD-18T载体中获得，其中标准品的制备包括：

1a)目的基因片段的常规PCR扩增：

常规PCR扩增采用25μL反应体系：10×PCR Buffer MIX 12.5μL，WB-F0.8μL，WB-R0.8μL，DNA模板2μL，灭菌ddH2O补加至25μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，共循环30次，72℃后延伸5min。扩增结束后取5μL反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳；

1b)将步骤1a)中的PCR产物进行胶回收得到目的基因片段，将目的基因片段与PMD-18T载体进行连接、转化、菌落PCR鉴定、测序分析，序列比对正确后，采用OMEGA质粒小提试剂盒对阳性重组质粒进行提取，于-20℃保存备用；

1c)测定所述步骤1b)的重组质粒260nm/280nm的比值及浓度，260nm/280nm比值要求在1.8-2.0范围之内，并根据重组质粒的分子量将其质量浓度换算为拷贝数浓度:copies/μL＝(ng/μL×10^-9)×(6.02×10²³)/(DNA length×660)。

1d)对所述重组质粒进行10倍梯度稀释后，进行实时荧光PCR扩增，实时PCR检测仪自动生成标准曲线。

其中，上述实时荧光定量PCR扩增反应体系为20μL：SYBR Green I 10.0μL；WB-F0.8μL；W-R0.8μL；DNA模板2.0μL；ddH₂O6.4μL；所述实时荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性12s；56.2℃退火20s，72℃延伸20s；收集荧光15s，40个循环。

其中，所述标准曲线是以所述重组质粒经10倍梯度稀释后的标准品浓度对数值为横坐标，以各个标准品Ct值为纵坐标，经直线回归方程分析，得到回归方程式Y＝﹣3.501X+29.689。

其中，所述步骤3)中待检品的初始浓度是将所述待检品的Ct值代入所述回归方程式Y＝﹣3.501X+29.689中计算得出。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

1、具有良好的特异性，且批内、批间重复性试验结果的变异系数均小于2％，具有良好的重复性；

2、灵敏度大大提高，最小检出浓度为1.64×10²拷贝/μL，是普通PCR的1000倍。

3、检测快速，整个反应过程从待检品提取DNA到结果分析只要1.5h；同时避免了后续电泳等步骤且整个反应过程为闭管操作，减少了污染和人为操作带来的误差。

附图说明

图1为PCR扩增产物电泳图(M：DL2000marker，1：阳性石斑鱼肠道微孢子虫，2：阴性对照(ddH₂O))；

图2为重组质粒PCR鉴定图(M：DL 2000Marker1，1、重组质粒PCR结果(标准品扩增产物)，2：阴性对照(ddH₂O))；

图3为测序结果图(深灰色部分为插入目的片段序列，浅灰色部分为PMD-18T载体序列)；

图4为NCBI比对结果图；

图5为实时荧光定量PCR标准曲线；

图6为实时荧光定量PCR溶解曲线；

图7为实时荧光定量PCR特异性试验图(1：阴性对照ddH₂O，2-4依次为：石斑鱼微孢子虫、中华绒螯蟹肝孢子虫、对虾肝孢子虫)；

图8为实时荧光定量PCR扩增曲线(1：阴性对照ddH₂O，2～8：逐级稀释的重组质粒(标准品扩增产物)(1.64×10⁸～1.64×10²拷贝/μL)。

图9为逐级稀释的重组质粒PCR扩增产物电泳图(M：DL2000marker，1～7：1.64×10⁸～1.64×10²拷贝/μL)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。

实施例1

一、实验材料

1、石斑鱼肠道微孢子虫DNA、中华绒螯蟹肝孢子虫DNA、对虾肝孢子虫DNA

(石斑鱼肠道微孢子虫来自海南省儋州市区排浦镇石斑鱼感染病料、中华绒螯蟹肝孢子虫来自盐城市盐都区大岗镇的中华绒螯蟹的感染病料、对虾肝孢子虫来自海南省文昌市清兰镇对虾的感染病料，使用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒进行DNA的抽提)

2、主要试剂与设备

试剂:DL marker 2000，pMD-18T载体，大肠杆菌DH5α感受态细胞、QIAGEN DNeasyBlood&Tissue试剂盒。

设备：MP*FastPrep-24、伯乐T100PCR仪、Nano Drop 2000、Bio-rad CFX96荧光定量PCR仪。

二、实验方法

1、石斑鱼肠道微孢子虫的引物设计：

选取Genbank上已发表的石斑鱼微孢子虫(Microsporidium sp)、中华绒螯蟹肝孢虫(Hepatospora eriocheir)、对虾肝孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei)18S rDNA基因序列(登录号：KR263870.1、HE584635.1、KF362129.1)，利用Blast进行比对后，选择物种特异的DNA序列，利用Primer5.0设计引物，oligo6.0分析引物二级结构，将设计得到的引物利用Blast再次进行比对分析，确保引物的特异性。

引物设计结果：

WB-F为：5'CGAACATCGCCCATCTCA 3'；

WB-R为：5'AAGGCTACGAATCGCAAG 3'；

2、目的片段PCR扩增

1)微孢子虫DNA的提取：在感染微孢子虫的石斑鱼肠道中，用镊子刮取肠道内壁组织，经镜检后装入1.5mlMP振荡管中，加入1×PBS溶液后用MP*FastPrep-24振荡器以最大速度6.5m/s振荡60s，停止60s，重复3次后取上清液体按QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒说明书的步骤提取DNA。

2)以所提取DNA以模板进行常规PCR扩增，采用25μL反应体系：10×PCR BufferMIX12.5μL，WB-F0.8μL，WB-R 0.8μL，DNA模板2μL，灭菌ddH₂O补加至25μL；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s，共循环30次，72℃后延伸5min，取5μLPCR扩增反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳；如图1所示，电泳结果显示，扩增出一条大小约为91bp的明亮单一条带，与预期结果一致，该目的片段的序列如SEQ ID NO:3所示。

3、质粒模板标准品的制备

将目的PCR产物电泳后，用胶回收试剂盒回收，按照目的片段与pMD-18T载体分子比5∶1的比例进行连接、并将连接产物转化入DH5α感受态细胞，同时对转化成功的菌落进行纯化培养，并进行PCR及测序鉴定，最后对阳性重组质粒进行少量提取和纯化，于-20℃保存备用。如图2所示，电泳结果显示，扩增出一条大小约为91bp的单一清晰条带，与预期结果一致，如图3所示，测序结果显示，石斑鱼肠道微孢子虫目的基因片段插入到pMD-18T载体中，如图4所示，序列比对结果显示，与石斑鱼肠道微孢子虫18S rDNA基因序列(登录号：KR263870.1)的对应区域的同源性为100％，因此，含有石斑鱼肠道微孢子虫目的基因的重组质粒构建成功。

4、实时定量荧光PCR反应及标准曲线和回归方程的建立

将少量提取并纯化后的重组质粒在Nano Drop 2000上测得260nm/280nm比值为1.93，满足260nm/280nm值在1.8-2.0要求，测得浓度为50ng/μl，对应浓度的重组质粒拷贝数为1.67×10¹⁰拷贝/μL，将重组质粒进行10倍梯度稀释，取10⁸-10²拷贝数的重组质粒作为实时定量PCR的标准品，经过优化的实时定量PCR扩增反应体系为20μL：SYBR Green I 10.0μL；WB-F 0.8μL；WB-R0.8μL；DNA模板2.0μL；ddH₂O 6.4μL。荧光定量PCR反应条件为:反应程序为:95℃预变性3min；95℃变性12s；56.2℃退火20s，72℃延伸20s；收集荧光15s，40个循环。再按照模板浓度对数值与达到平台循环数(Ct值)建立标准曲线，横坐标代表质粒拷贝数的对数(X)，纵坐标为Ct值(Y)；在此基础上推导出相应的回归方程为Y＝﹣3.501X+29.689，回归方程与标准曲线的相关系数(R²)为0.9928，扩增效率为98.9％，具体结果如图5所示，由图6的荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线可见，标准品各个稀释度的溶解温度Tm值为76℃，无引物二聚体和非特异性扩增产物出现，所建立PCR方法的引物特异性好。

5、特异性、灵敏性、检出率及重复性试验

(1)用建立的荧光定量PCR方法对石斑鱼肠道微孢子虫、中华绒螯蟹肝孢子虫、对虾肝孢子虫的DNA进行扩增，以双蒸水作阴性对照。结果如图7所示曲线1为阴性对照、曲线2-4分别是石斑鱼肠道微孢子虫、中华绒螯蟹肝孢子虫、对虾肝孢子虫。由图可见仅有石斑鱼肠道微孢子虫曲线扩增，中华绒螯蟹肝孢子虫、对虾肝孢子虫并未扩增，表明该方法具有良好的特异性。

(2)将已计算出拷贝数的重组质粒10倍梯度稀释，作10次稀释，取10⁸-10²拷贝数的重组质粒作为实时定量PCR的标准品，在最佳反应条件下进行荧光定量PCR扩增；结果如图8所示，曲线1为阴性对照、曲线2～8所对应的重组质粒模板浓度分别为1.64×10⁸、1.64×10⁷、1.64×10⁶、1.64×10⁵、1.64×10⁴、1.64×10³、1.64×10²拷贝/μL，阴性对照无扩增，所建立的荧光定量PCR方法能检测出来的最低拷贝数为6.72×10²拷贝/μL。具有很好的灵敏度。

(3)以1.64×10⁸-1.64×10²拷贝数的重组质粒作为常规PCR的模板，采用上述常规的PCR体系和程序，扩增结束后取5μL反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。结果如图9所示，(1-7分别为1.64×10⁸、1.64×10⁷、1.64×10⁶、1.64×10⁵、1.64×10⁴、1.64×10³、1.64×10²拷贝/μL)常规PCR检测仅为1.64×10⁴拷贝/μL，实时荧光定量PCR方法检出率较高，是常规PCR方法的1000倍。实时荧光定量PCR方法具有较高的检出率。

(4)选用1.64×10⁸-1.64×10²拷贝/μL的阳性重组质粒作为模板，每个浓度重复3孔进行批内重复性检测；进行批间重复性检测时，同一次反应每个浓度重复3孔，重复3次反应，比较Ct值和Tm值的变化情况，验证该方法的重复性和稳定性，同时设阴性对照。由表1可知，3次批内和批间重复性试验的变异系数均小于2％，表明建立的荧光定量PCR的方法具有较好的重复性。

表1实时荧光定量PCR的批内与批间重复性试验

6、临床样品检测

对采集来自广东地区的疑似石斑鱼肠道微孢子虫感染病料，用已经建立的荧光定量PCR检测，得到待检品的△Ct值为19.6，代入所述回归方程式Y＝﹣3.501X+29.689中，计算得出拷贝数为759拷贝/μL，对应待检品中石斑鱼微孢子虫的初始浓度为1.26×10^﹣6ng/μL。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 一种检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒及检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游扩增引物WB-F(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaaagtgat tagataccgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游扩增引物WB-R(Artificial Sequence)

<400> 2

gtttgctggg aataagagaa 20

<210> 3

<211> 91

<212> DNA

<213> 石斑鱼肠道微孢子虫(Microsporidium sp.KR263870)

<400> 3

tgaaagtgat tagataccgc tgtaattcta gcagtaaact atgccgacaa tttttagtga 60

ctttttaaaa agtttgctgg gaataagaga a 91

Claims

1.一种用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的引物对，其特征在于，所述引物对序列如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.一种用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

（1）SYBR green I、ddH₂O及权利要求1所述的引物对的混合液；

（2）标准品；

（3）阴性对照物。

4.根据权利要求3所述的用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒，其特征在于，所述标准品是含有石斑鱼肠道微孢子虫基因片段的质粒载体。

5.根据权利要求4所述的用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒，其特征在于，该基因片段的序列如SEQ ID NO:3所示。

6.权利要求2~4任一项所述的用于检测石斑鱼肠道微孢子虫的试剂盒在石斑鱼肠道微孢子虫的检测方面的应用。

7.一种石斑鱼肠道微孢子虫的检测方法，其特征在于，所述检测方法是实时荧光定量PCR方法。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：

1）石斑鱼肠道微孢子虫DNA 的提取；

2）以提取的微孢子虫DNA作为待检品，以包含微孢子虫基因片段的质粒载体作为标准品；分别以待检样品和标准品为模板，在包含权利要求1所述的引物对和荧光染料SYBRGreenⅠ的扩增体系中进行实时荧光定量PCR扩增；

3）扩增过程中PCR仪自动采集标准品和待检品的扩增产物的荧光信号；

4）根据标准品的扩增产物的荧光信号与质粒载体的对应关系建立标准曲线，然后根据待检品的荧光信号在标准曲线上的位置，确定待检品中石斑鱼肠道微孢子虫的初始含量。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增反应体系为20μL：SYBR Green I 10.0μL；上游引物0.8μL；下游引物0.8μL；DNA模板2.0μL；ddH₂O 6.4μL。

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性12s；56.2℃退火20s，72℃延伸20s；收集荧光15s，40个循环。