CN111020050A

CN111020050A - 用于香鱼格留虫lamp-lfd检测的引物和探针序列

Info

Publication number: CN111020050A
Application number: CN202010031096.3A
Authority: CN
Inventors: 陈炯; 周前进
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2020-01-13
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2040-01-13
Also published as: CN111020050B

Abstract

本发明公开了用于香鱼格留虫LAMP‑LFD检测的引物和探针序列，特点是根据香鱼格留虫的β微管蛋白基因设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，三对LAMP的引物为Gpl‑F3、Gpl‑B3；Gpl‑FIP、Gpl‑BIP；Gpl‑LF、Gpl‑LB和一条探针为Gpl‑HP，核苷酸序列如SEQ NO1‑ NO7所示，利用上述的引物和探针，通过LAMP反应体系扩增步骤，探针杂交LAMP反应产物步骤，使用LFD检测步骤实现香鱼格留虫的可视化检测，优点是具有更高的快捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，有利于香鱼格留虫的早期诊断和检测，可满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。

Description

用于香鱼格留虫LAMP-LFD检测的引物和探针序列

技术领域

本发明涉及寄生虫诊断技术领域，尤其是涉及一种用于香鱼格留虫LAMP-LFD检测的引物和探针序列。

背景技术

香鱼格留虫是专性寄生于香鱼体内的一种微孢子虫，最早由日本学者鉴定并命名。感染该虫后，香鱼体腔内会形成一种异质孢囊，内含大量的孢子，孢子释放后，可引起淋巴细胞、巨噬细胞等单核类细胞的浸润，造成亚致死感染，破坏香鱼的体表及外观，不仅加剧了饲料消耗，导致鱼类养殖成本大幅度增加，而且感染后的鱼形体较差，市场价值缩减。

在我国，规模化、集约化的高密度人工养殖导致香鱼病害急剧增加。近年，我们首次从浙江宁海等地养殖的香鱼体内分离到了香鱼格留虫，进一步调查发现我国的香鱼养殖正面临着严重的香鱼格留虫的感染，感染率可达30-40%，高感染阶段尤其集中在幼鱼的长成期和成鱼的产卵期。鉴于香鱼为一年生洄游型鱼类，我们推测香鱼的养殖水环境污染或育种亲鱼感染是导致香鱼格留虫高感染率存在的原因。香鱼格留虫虫体大小仅有几个微米，感染以香鱼组织表面形成肉眼可见的白色异质孢囊为诊断特征。目前，主要通过组织内分离虫体，进行显微镜镜检，需要检测人员具备相当的专业知识背景和操作技能，也容易漏检，不适合于该虫体的快速筛查和及时鉴定。针对核酸的分子检测技术具有检测快速、操作便捷等优点，在针对病原的实验室诊断方面正发挥着重要作用，但其存在的仪器价格昂贵、工作环境严格及技术操作专业性要求高等问题，极大地限制了此类方法在现场快检与基层检测中的应用。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)作为一种有别于PCR原理的核酸扩增方法，在链置换DNA聚合酶的催化下，恒温条件(如65℃)中，15-60min即可实现核酸的倍数扩增(10⁹-10¹⁰倍)。除其高灵敏度、高特异性等优点之外，该方法对仪器设备的要求比较低，一台简单的水浴锅即可完成反应，被认为是实现微生物病原基层检测的重要方法。LAMP产物的检测方法有多种，如浊度仪检测白色浑浊、荧光定量PCR仪检测荧光曲线、核酸电泳分析产物带形，以及添加荧光染料肉眼观察产物颜色等。其中，肉眼观察颜色变化，无需特殊仪器，是方法能够应用于基层的关键步骤，但是比较容易出现假阳性。因此，在无需仪器设备的前提下简便快捷地判读结果是LAMP方法改进的重要方向。在横向流动试纸条 (lateral flow dipstick，LFD)上锚定特定荧光素的抗体，与LAMP产物上标记的荧光素反应，形成的颜色变化显示在LFD的检测线和质控线上，完成结果判读，即为LAMP-LFD方法。该方法只需用不同的荧光素标记的探针与荧光素标记LAMP产物进行杂交，完全摆脱了对仪器设备的依赖，同时特异性探针的存在还很大程度上降低了检测的假阳性。该方法目前已成功用于对虾白斑综合征病毒、传染性脾肾坏死病毒、河流弧菌，以及简单异尖线虫/派氏异尖线虫等水产病原微生物的检测。目前，国内外还未见报道将该技术应用于香鱼格留虫的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和准确性高的用于香鱼格留虫LAMP-LFD检测的引物和探针序列。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于香鱼格留虫LAMP-LFD检测的引物和探针序列，根据香鱼格留虫的β微管蛋白基因设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：

Gpl-F3：5’- GGAAGGTGCTGAACTCATAG -3’，

Gpl-B3：5’- TCAGCATTCAACTGACCAG -3’，

Gpl-FIP：5’- ACGGTTCAACCACAGTATCAGATGGGTACTGGTGCTGGAATG -3’，

Gpl-BIP：5’- GAGGCACTCTACAATATCTGCTCAACCGCTCATAACAAGTGATACT -3’，

Gpl-LF：5’- ACGAACACATCATCCTATCAGG -3’，

Gpl-LB：5’- TGCCTAATCCTGGTTATGCC -3’，

探针Gpl-HP：5’- CTTGTTGAAAATGCTGACG -3’，

其中，Gpl-FIP的5’端为生物素标记；探针Gpl-HP的5’端为异硫氰酸荧光素标记。

LAMP反应体系各成分的终浓度分别为：外引物Gpl-F3和Gpl-B3各0.2 µmol/L，内引物Gpl-FIP和Gpl-BIP各1.6 µmol/L，环引物Gpl-LF和Gpl-LB各0.4 µmol/L，dNTPs 1.4mmol/L，pH 8.8的Tris-HCl 20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，MgSO₄ 6.5mmol/L，(NH4)₂SO₄ 10mmol/L，Triton X-100 0.1%，8U Bst DNA聚合酶大片段和2 µL样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25 µL。

优先的，LAMP反应的温度为65℃，反应时间45min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、检测灵敏度高，本方法能够检测到2.0 fg/μL的含β微管蛋白的质粒DNA，针对香鱼格留虫基因组DNA的检测灵敏度为14.0 pg/μL；能够从感染强度达到100个虫体/克香鱼肝组织中稳定地检测到虫体。

2、检测时间短，扩增反应只需45 min，从样品基因组DNA的提取到完成结果判断，整个检测可以在55 min之内完成，比常规PCR检测技术缩短超过1.5 h，大幅度提高检测速度。

3、特异性强，所用的特异性引物根据香鱼格留虫的β微管蛋白基因的8个不同区域设计，并且还有DNA的特异性探针，可有效避免利用琼脂糖凝胶电泳、荧光染料等方法引起的假阳性问题。

4、仪器设备依赖性低，无需价格较贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统等，只需一个水浴锅，即可完成检测。

5、操作简单，结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，肉眼观察即可判断。

综上所述，使用本发明的引物和探针采用LAMP-LFD方法对香鱼格留虫进行检测，具有更高的快捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，可满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。

附图说明

图1为香鱼格留虫LAMP特异性实验结果；M：100 bp Plus DNA ladder(Fermentas, 美国)；NC：以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为模板；Gp：以香鱼格留虫的基因组DNA为模板，Nm、Ci、Eh、Ap、Ha、Va、Pp和Pa：分别以梅氏新贝尼登虫、刺激隐核虫、肝肠胞虫阳性的虾组织样品、派氏异尖线虫、内弯宫脂线虫、鳗弧菌、杀香鱼假单胞菌和健康香鱼肝组织(不含香鱼格留虫DNA)的基因组DNA为模板；

图2为香鱼格留虫LAMP-LFD特异性实验结果；NC：以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为模板；Gp：以香鱼格留虫的基因组DNA为模板，Nm、Ci、Eh、Ap、Ha、Va、Pp和Pa：分别以梅氏新贝尼登虫、刺激隐核虫、肝肠胞虫阳性的虾组织样品、派氏异尖线虫、内弯宫脂线虫、鳗弧菌、杀香鱼假单胞菌和健康香鱼肝组织(不含香鱼格留虫DNA)的基因组DNA为模板；

图3为香鱼格留虫LAMP灵敏度实验结果；M：100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, 美国)；NC：以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为模板；10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7：香鱼格留虫β微管蛋白基因的质粒标准品作为模板；

图4为香鱼格留虫LAMP-LFD灵敏度实验结果；NC：以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为模板；10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7：香鱼格留虫β微管蛋白基因的质粒标准品作为模板；

图5 为PCR灵敏度实验结果；M：100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, 美国)；NC：以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为模板；10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7：香鱼格留虫β微管蛋白基因的质粒标准品作为模板；

图6为香鱼格留虫LAMP灵敏度实验结果；M：100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, 美国)；NC：以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为模板；10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8：香鱼格留虫基因组DNA作为模板；

图7为香鱼格留虫LAMP-LFD灵敏度实验结果；NC：以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为模板；10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8：香鱼格留虫基因组DNA作为模板；

图8为香鱼格留虫LAMP时间优化实验结果；M：100 bp Plus DNA ladder (Fermentas,美国)；NC：以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为模板；20、30、35、40、45、50和60 min：以灵敏度浓度的香鱼格留虫基因组DNA作为模板；

图9为香鱼格留虫LAMP-LFD时间优化实验结果；NC：以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为模板；20、30、35、40、45、50和60 min：以灵敏度浓度的香鱼格留虫基因组DNA作为模板。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

LAMP-LFD技术检测香鱼格留虫的方法的建立

1. 引物设计：根据NCBI中已经公布的香鱼格留虫的β微管蛋白基因（GenBank登录号：MN811004）进行设计，其中，引物序列具体如下：

Gpl-F3：5’- GGAAGGTGCTGAACTCATAG -3’，

Gpl-B3：5’- TCAGCATTCAACTGACCAG -3’，

Gpl-FIP：5’- ACGGTTCAACCACAGTATCAGATGGGTACTGGTGCTGGAATG -3’，

Gpl-BIP：5’- GAGGCACTCTACAATATCTGCTCAACCGCTCATAACAAGTGATACT -3’，

Gpl-LF：5’- ACGAACACATCATCCTATCAGG -3’，

Gpl-LB：5’- TGCCTAATCCTGGTTATGCC -3’，

探针Gpl-HP：5’- CTTGTTGAAAATGCTGACG -3’，

2. 样品DNA提取：解剖新鲜香鱼，从肝脏或者性腺等器官上摘取白色异质瘤，使其破裂后获得香鱼格留虫孢子并纯化。将保存的鳗弧菌、杀香鱼假单胞菌从-80℃中取出划线，挑取单克隆培养扩大到所需浓度。按照基因组DNA提取试剂盒的说明提取香鱼格留虫、梅氏新贝尼登虫、派氏异尖线虫、内弯宫脂线虫、刺激隐核虫、鳗弧菌、杀香鱼假单胞菌、肝肠胞虫阳性的虾组织样品，以及香鱼肝组织的基因组DNA。提取的香鱼格留虫基因组DNA经测定浓度后，稀释至70 ng/μL备用。

以香鱼格留虫的基因组DNA为模板，扩增β-tubulin基因。按照琼脂糖凝胶回收试剂盒的说明回收PCR产物，将其与T Vector载体连接，构建重组质粒，转化大肠杆菌感受态细胞并涂板。挑取单克隆并测序，鉴定准确后按照质粒提取试剂盒的说明提取质粒，测定浓度后，稀释至1.0 ng/μL，作为质粒标准品备用。

3. 香鱼格留虫LAMP反应

利用步骤1设计的特异性引物，分别以香鱼格留虫β-tubulin基因质粒标准品和虫体基因组DNA为模板进行LAMP反应。

3.1 LAMP反应体系，各成分的终浓度分别为：外引物Gpl-F3和Gpl-B3各0.2 µmol/L，内引物Gpl-FIP和Gpl-BIP各1.6 µmol/L，环引物Gpl-LF和Gpl-LB各0.4 µmol/L，dNTPs1.4 mmol/L，Tris-HCl（pH 8.8）20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，MgSO₄ 6.5 mmol/L，(NH4)₂SO₄10 mmol/L，Triton X-100 0.1%，8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)和2 µL样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25 µL；

3.2 LAMP反应条件：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为65℃，扩增反应时间为60 min。

4. 探针杂交和LFD检测：扩增后将20 pmol的Gpl-HP探针加入反应体系中，65℃温育5 min，进行杂交，取5 µL杂交液加入100 µL buffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入加入杂交液的buffer中显色，判断LAMP的扩增情况。

实施例2

使用本发明的引物和探针进行香鱼格留虫LAMP-LFD检测的特异性测定

利用所设计的特异性引物和探针，分别以香鱼格留虫、梅氏新贝尼登虫、刺激隐核虫、肝肠胞虫阳性的虾组织样品、派氏异尖线虫、内弯宫脂线虫、鳗弧菌、杀香鱼假单胞菌和健康香鱼肝组织(不含香鱼格留虫DNA)等的基因组DNA为模板，按上述实施例1的步骤3和步骤4进行LAMP-LFD反应，验证引物和探针的特异性，以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为阴性对照。结果如图1和图2所示，利用电泳法（图1）和LFD（图2）都只能从香鱼格留虫的基因组DNA样品中扩增获得目的条带，其它样品无扩增条带，说明使用本发明提供的引物和探针进行LAMP-LFD检测，具有良好的特异性。

实施例3

使用本发明的引物和探针进行香鱼格留虫LAMP-LFD检测的灵敏度测定（以香鱼格留虫β-tubulin基因质粒标准品为模板）

采用上述实施例1的步骤2的方法获得香鱼格留虫β-tubulin基因质粒标准品，进行10倍梯度稀释，选择稀释倍数为质粒标准品原浓度的10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7作为模板，按上述实施例1的步骤3和步骤4进行LAMP-LFD反应，验证引物和探针的灵敏度，以不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为阴性对照。结果如图3和图4所示，使用本发明提供的引物和探针进行的LAMP-LFD检测的灵敏度为香鱼格留虫β微管蛋白基因的质粒标准品DNA的10^-5倍，即2fg/μL（图4），与LAMP的扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测获得的灵敏度一致（图3），同样与常规PCR检测方法的灵敏度一致（图5）。

实施例4

使用本发明的引物和探针进行香鱼格留虫LAMP-LFD检测的灵敏度测定（以香鱼格留虫基因组DNA为模板）

采用上述实施例1的步骤2的方法提取香鱼格留虫基因组DNA，进行10倍梯度稀释，选择香鱼格留虫基因组DNA原浓度的10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8倍作为模板，按上述实施例1的步骤3和步骤4进行LAMP-LFD反应，验证引物和探针的灵敏度，不含香鱼格留虫DNA的作为阴性对照。结果如图6和图7所示，使用本发明提供的引物和探针进行的LAMP-LFD检测的灵敏度为香鱼格留虫基因组DNA原浓度的10^-4倍，即14pg/μL（图7）。

实施例5

使用本发明的引物和探针进行香鱼格留虫LAMP-LFD检测的时间优化

采用上述实施例1的步骤2的方法提取香鱼格留虫的基因组DNA，选择灵敏度浓度的基因组DNA作为模板，按上述实施例1的步骤3和步骤4进行LAMP-LFD反应，将LAMP反应时间分别设置为20、30、35、40、45、50和60 min，不含香鱼格留虫DNA的双蒸水作为阴性对照。结果如图8和图9所示，使用本发明提供的引物和探针进行的LAMP反应的最优时间为45 min，与探针孵育的最优时间为5min，LFD上显色的时间为5min，因此LAMP-LFD的最优检测时间为55min。

实施例6

用本发明LAMP-LFD技术检测香鱼格留虫污染的香鱼肝组织

1.待检测样品基因组DNA提取

取若干份香鱼的肝脏组织(鉴定无香鱼格留虫感染)100mg加入少量无菌水，充分匀浆后，定容至1mL。将香鱼格留虫计数后，分别取1.0×10⁰，1.0×10¹，1.0×10²，1.0×10³，1.0×10⁴个虫体加入到上述肝脏组织悬液中震荡混匀。每个浓度平行制备三个样品。取香鱼格留虫污染的各肝脏组织，按照基因组DNA提取试剂盒的说明提取各样品基因组DNA，溶解于50μL的ddH₂O中，用作PCR和LAMP测试的模板。以健康香鱼的肝脏组织(鉴定无香鱼格留虫感染)匀浆液作为阴性对照。

2. LAMP反应体系配制及反应条件，按照实施例1步骤3进行。

3. LFD显色，检测结果判断，按照实施例1步骤4进行。

4. 利用PCR 产物进行DNA测序的方法进行鉴定

结果显示，分别使用1.0×10⁴，1.0×10³，1.0×10²，1.0×10¹个虫体污染时，利用LAMP-LFD和PCR方法均能够从污染的肝脏组织中稳定检测到病原；当仅使用1个香鱼格留虫孢子污染100mg香鱼肝组织时，LAMP-LFD和PCR方法均不能从污染样品中检测到虫体的存在(表1)。表明本试验建立的LAMP-LFD方法可用于香鱼格留虫的现场检测。

表1 LAMP-LFD检测香鱼格留虫人工污染的香鱼肝组织样品

注:“+”表示检测结果阳性；“-”表示检测结果阴性。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 用于香鱼格留虫LAMP-LFD检测的引物和探针序列

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gpl-F3

<400> 1

GGAAGGTGCTGAACTCATAG 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gpl-B3

<400> 2

TCAGCATTCAACTGACCAG 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gpl-FIP

<400> 3

ACGGTTCAACCACAGTATCAGATGGGTACTGGTGCTGGAATG 42

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gpl-BIP

<400> 4

GAGGCACTCTACAATATCTGCTCAACCGCTCATAACAAGTGATACT 46

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gpl-LF

<400> 5

ACGAACACATCATCCTATCAGG 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gpl-LB

<400> 6

TGCCTAATCCTGGTTATGCC 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gpl-HP

<400> 7

CTTGTTGAAAATGCTGACG 19

Claims

1.用于香鱼格留虫LAMP-LFD检测的引物和探针序列，其特征在于根据香鱼格留虫的β微管蛋白基因的编码序列设计LAMP-LFD的三对引物序列和一条探针序列，引物和探针序列具体如下：

Gpl-F3：5’- GGAAGGTGCTGAACTCATAG -3’，

Gpl-B3：5’- TCAGCATTCAACTGACCAG -3’，

Gpl-FIP：5’- ACGGTTCAACCACAGTATCAGATGGGTACTGGTGCTGGAATG -3’，

Gpl-BIP：5’- GAGGCACTCTACAATATCTGCTCAACCGCTCATAACAAGTGATACT -3’，

Gpl-LF：5’- ACGAACACATCATCCTATCAGG -3’，

Gpl-LB：5’- TGCCTAATCCTGGTTATGCC -3’，

探针Gpl-HP：5’- CTTGTTGAAAATGCTGACG -3’，

2.根据权利要求1所述的用于香鱼格留虫LAMP-LFD检测的引物和探针序列，其特征在于LAMP反应体系各成分的终浓度分别为：外引物Gpl-F3和Gpl-B3各0.2 µmol/L，内引物Gpl-FIP和Gpl-BIP各1.6 µmol/L，环引物Gpl-LF和Gpl-LB各0.4 µmol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，pH 8.8的Tris-HCl 20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，MgSO₄ 6.5mmol/L，(NH4)₂SO₄ 10 mmol/L，Triton X-100 0.1%，8U Bst DNA聚合酶大片段和2 µL样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25 µL。

3.根据权利要求1所述的用于香鱼格留虫LAMP-LFD检测的引物和探针序列，其特征在于：LAMP反应的温度为65℃，反应时间45min。