CN113846182B

CN113846182B - 一种快速可视化检测pcv3的试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN113846182B
Application number: CN202110676978.XA
Authority: CN
Inventors: 唐中林; 刘思远; 唐义杰; 陈慕雅
Original assignee: Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Current assignee: Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Priority date: 2021-06-18
Filing date: 2021-06-18
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2041-06-18
Also published as: CN113846182A

Abstract

本发明公开了一种快速可视化检测PCV3的试剂盒及其检测方法。本发明具体地公开了一种用于检测PCV3的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包含引物PCV3‑RPA‑F和引物PCV3‑RPA‑R，还包含SEQ ID No.3‑15所示的至少任一种cap‑crRNA以及探针FAM‑N‑BHQ2。本发明试剂盒特异性好，其检测灵敏度可达到单个拷贝级别。本发明建立的快速、精准、可视化且低成本的PCV3的检测方法结合了RPA技术与Cas12a酶切技术，可以简便、高效、灵敏、特异、精准地判定待测样品中是否含有PCV3，为严格控制PCV3的传播提供了强有力的检测工具，具有重要的经济效益与社会价值。

Description

一种快速可视化检测PCV3的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速可视化检测PCV3的试剂盒及其检测方法，具体涉及一种结合RPA技术与Cas12a酶切技术的精准、简便、灵敏、可视化检测猪圆环病毒3型病毒(PCV3)核酸的专用检测试剂盒、引物探针、crRNA，及其检测方法。

背景技术

猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3，PCV3)为无囊膜单股环状DNA病毒，病毒全长为2000bp，与PCV1/2同源性低于40％，遗传进化分析位于不同的分支。PCV3基因组包括3个开放阅读框，其中ORF2主要负责编码衣壳蛋白(capsid protein，Cap)，是唯一的结构蛋白，含有抗原反应簇，能够诱导机体产生中和抗体，PCV3与猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍、断奶仔猪心脏及多系统性炎症、仔猪先天性震颤、发热性肺炎和仔猪腹泻等多种猪病可能存在潜在的关联，对养猪业造成了极大的威胁。与PCV2相同，PVC3的Cap蛋白能诱导宿主细胞发生自噬，也能使宿主的天然免疫应答被抑制，由于目前没有安全高效的PCV3疫苗，而通过血清流行病学调查可以更加快速地从更大范围来了解PCV3的感染情况，因此，PCV3的早期防控和检测工作显得尤为重要。建立一种简单、快速、精准、可视化且低成本的PCV3基因检测方法对PCV3的防控有着重要意义。

近年来，基因编辑技术发展迅速，不同亚型的CRISPR-Cas的基因编辑系统拓展了临床检测、基础研究和生物医学领域方面的应用。其中，CRISPR-Cas12a系统是第二类(V型)用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas系统，更适合用于病原微生物的快速精准检测。

重组酶聚合酶扩增(RPA，Recombinase Polymerase Amplification)是一种核酸恒温扩增技术，其原理是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与单链结合蛋白(SSB，Single StrandBinding protein)结合，防止进一步替换。在这个扩增体系中，目标基因的扩增速度非常快，由两个相对的引物起始一个合成事件，可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何精准、快速、简便、特异、灵敏和/或低成本地检测猪圆环病毒3型病毒(porcine circovirus type 3，PCV3)。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测PCV3的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测PCV3的引物对，所述引物对由引物PCV3-RPA-F和引物PCV3-RPA-R组成；所述引物PCV3-RPA-F为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物PCV3-RPA-R为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。

所述引物对可用于特异性扩增PCV3特异性的cap基因片段。

所述cap基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。

进一步地，所述引物对可通过PCR、qPCR或RPA的方法扩增所述PCV3特异性的cap基因片段。

所述引物PCV3-RPA-F为正向引物；所述引物PCV3-RPA-R为反向引物。

进一步地，所述试剂盒还包含SEQ ID No.3-15所示的至少任一种名称为cap-crRNA的crRNA。

所述cap-crRNA为cap-crRNA-04(SEQ ID No.3)、cap-crRNA-02(SEQ ID No.4)、cap-crRNA-03(SEQ ID No.5)、cap-crRNA-01(SEQ ID No.6)、cap-crRNA-05(SEQ IDNo.7)、cap-crRNA-06(SEQ ID No.8)、cap-crRNA-07(SEQ ID No.9)、cap-crRNA-08(SEQ IDNo.10)、cap-crRNA-09(SEQ ID No.11)、cap-crRNA-10(SEQ ID No.12)、cap-crRNA-11(SEQID No.13)、cap-crRNA-12(SEQ ID No.14)、cap-crRNA-13(SEQ ID No.15)。

进一步地，所述试剂盒包含cap-crRNA-04(SEQ ID No.3)。

SEQ ID No.3-15所示的序列中，n代表核糖核苷酸a、g、c或u。

SEQ ID No.3-15所示的cap-crRNA均可配合本发明所述试剂盒完成检测工作，其中cap-crRNA-4的检测效果最佳。

进一步地，所述试剂盒还包含探针FAM-N-BHQ2，所述探针FAM-N-BHQ2的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

进一步地，所述探针FAM-N-BHQ2的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LCRED640、LC RED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种。

所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种。

进一步地，所述探针FAM-N-BHQ2的5’端标记FAM，3’端标记BHQ2。

所述探针为可辅助肉眼判读结果的荧光报告器：即用于在Cas12a蛋白发生酶切反应时发生淬灭基团断裂并使荧光基团发出荧光，作为Cas12a蛋白工作时的荧光报告器。

进一步地，所述试剂盒还包含Cas12a蛋白。

进一步地，所述试剂盒可为基于RPA技术并结合Cas12a蛋白酶切技术检测PCV3核酸的试剂盒：所述试剂盒可由组合物A和组合物B两种组合物组成，其中组合物A包括本发明所述引物对；组合物B包括探针FAM-N-BHQ2、Cas12a蛋白和SEQ ID No.3-15所示的至少任一种cap-crRNA。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物A可为含有本发明所述引物对的液体，其名称为溶液A；所述组合物B可为含有探针FAM-N-BHQ2、Cas12a蛋白和SEQ ID No.3-15所示的至少任一种cap-crRNA的液体，其名称为溶液B。其中25μl的溶液A的组成可为：DNA模板(1μl)、10uM正向引物PCV3-RPA-F(1μl)、10uM反向引物PCV3-RPA-R(1μl)、6.2μl ddH2O、14.55μl A Buffer、1.25μl B Buffer；25μl的溶液B的组成可为：5μl 2.1NEB Buffer、14.8μlddH2O、250-1000nM Cas12a(1μl)、500-1000nM cap-crRNA-4(4μl)和200-1000nM的FAM-N-BHQ2(0.2μl)。

进一步地，所述试剂盒还包括携带PCV3特异性的cap基因片段的重组载体，所述cap基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。

所述携带PCV3特异性的cap基因片段的重组载体也在本发明的保护范围内。

所述携带PCV3特异性的cap基因片段的重组载体具体可为质粒pUC57-cap413，所述质粒pUC57-cap413是将pUC57载体的EcoRI和HindIII限制性核酸内切酶识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.17所示的DNA片段，保持pUC57载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组载体。

本发明还提供了用于检测PCV3的组合物，所述组合物包括所述引物对、探针FAM-N-BHQ2和crRNA，所述crRNA为SEQ ID No.3-15所示的至少任一种cap-crRNA。

本发明所述引物对也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了检测PCV3的方法，所述方法包括利用本文中任一所述的试剂盒和/或所述组合物和/或所述引物对和/或所述重组载体对待测样品进行检测。

上述方法中，所述对待测样品进行检测为：对待测样品的核酸进行RPA扩增，根据扩增产物是否被激发出绿色荧光或白色荧光来判断所述待测样品是否含有PCV3或是否为PCV3。

进一步地，上述方法中，所述根据扩增产物是否被激发出绿色荧光或白色荧光来判断所述待测样品是否含有PCV3或是否为PCV3的方法为下述任一种：

B1)如果所述扩增产物在蓝光(波长为450-520nm)下能观察到绿色荧光，则检测结果为阳性，即所述待测样品含有PCV3或为PCV3；如果扩增产物在蓝光(波长为450-520nm)下不能观察到绿色荧光，则检测结果为阴性，即所述待测样品不含有PCV3或不为PCV3；

B2)如果所述扩增产物在紫外光(波长为290-330nm)下能观察到白色荧光，则检测结果为阳性，即所述待测样品含有PCV3或为PCV3；如果扩增产物在紫外光(波长为290-330nm)下不能观察到白色荧光，则检测结果为阴性，即所述待测样品不含有PCV3或不为PCV3。

在本发明的一个实施方案中，利用本发明试剂盒检测PCV3的方法可包括如下步骤：将溶液A与溶液B直接充分混合，在37℃环境中放置20-30min后，将最终反应液放入照胶仪(蓝光发射仪，波长为450-520nm)或者紫外切胶仪(紫外切胶仪，波长为290-330nm)中进行结果的肉眼判读，通过最终反应液是否被激发出绿色荧光或白色荧光判读PCV3的特异性扩增的结果。

本发明还提供了携带PCV3特异性的cap基因片段的重组载体，所述重组载体含有核苷酸序列是SEQ ID No.17的cap基因片段。所述重组载体具体可为将所述cap基因片段插入质粒pUC57得到的重组质粒。

本发明还提供了所述引物对和/或所述组合物和/或所述重组载体在制备用于PCV3的检测或辅助检测的产品中的应用。

本发明还提供了本文中任一所述的试剂盒和/或所述引物对和/或所述组合物和/或所述重组载体在PCV3的检测或辅助检测中的应用。

本发明所述待测样品可包括鼻拭子、肛拭子、血液、组织、粪便样品或饲料样品。

本发明所述检测PCV3的方法可为以非疾病诊断为目的的检测方法，如检测饲料样品中的PCV3等。

本发明所述猪圆环病毒Cap蛋白是病毒的结构蛋白，含有多个抗原表位，宿主细胞和病毒的结合与Cap蛋白密切相关(任敏等，2021；湛洋等，2017；)，该蛋白是由一段642个碱基组成的cap基因编码而成，具有高度特异性，且与PCV1和PCV2等圆环病毒不同的基因型在碱基数目和同源性分析上具有较大差异，可作为PCV3特异性核酸序列的代表序列。

本发明针对PCV3基因组中Cap蛋白编码基因序列中的高度保守核酸序列，确定保守序列中的PAM位点，筛选并优化引导Cas12a蛋白发生酶切反应的特异性sgRNA(cap-sgRNA)，创建了一种结合RPA扩增技术、Cas12a蛋白酶切技术的新型、快速、可视化荧光检测PCV3核酸的方法。所述方法是利用RPA反应试剂、cap-crRNA、荧光淬灭报告反应器(即单链荧光报告基团FAM-N-BHQ2)对核酸样本进行PCV3核酸检测，检测结束后最终反应液由无色变为肉眼可见的绿色或白色则证明检测样品内含有猪圆环病毒3型病毒(PCV3)。

检测原理为：利用RPA扩增技术将包含PAM位点的PCV3的Cap蛋白中特异性序列进行核酸扩增，当PCV3病毒核酸与Cas12a蛋白、crRNA形成三元复合体时，该复合物中Cas12a蛋白的RuvC结构域行使DNase活性，可对RPA扩增产物进行精准酶切反应，切割带荧光信号标记的单链DNA(ssDNA reporter即上述探针FAM-N-BHQ2)，因此，可通过有无可被cap-crRNA特异性识别的PAM位点判读结果：通过检测荧光，利用荧光报告基团的显色情况进行肉眼结果判定，即可得知待检样品中是否含有猪圆环病毒3型病毒(PCV3)。

本发明建立了一套快速、精准、可视化且低成本的非PCV3基因检测方法，利用本发明所述检测试剂盒及其检测方法，可以高效、灵敏、特异、精准地判定待测样品中是否含有PCV3。

实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

本发明所提供的结合RPA技术与Cas12a酶切技术快速检测PCV3核酸的方法特异性好，灵敏度可达到单个拷贝级别，有效杜绝了上一步核酸扩增反应中非目的扩增片段的假阳性事件发生，并且无需借助昂贵的PCR仪、qPCR仪器以及漫长的反应时间，极大地节约了成本，同时本发明的试剂盒简便、特异性良好、检测结果准确，在生产饲养的一线，养殖人员可以利用本发明的试剂盒来检测样品是否带有PCV3并进行快速预判，可以实现严格控制PCV3的传播并及时止损的目的，具有重要的经济效益与社会价值。

附图说明

图1为本发明试剂盒溶液A对病毒特异性基因片段(cap)的单一RPA核酸扩增结果。M为Marker；1：检测模板为PCR阴性对照(水)；2：检测模板为pUC57-cap413质粒。

图2为普通PCR检测PCV3的灵敏度实验电泳结果图。M为Marker；

图3为本发明试剂盒溶液A与溶液B混合后对病毒特异性基因片段(cap)的灵敏度检测结果(在蓝光波长为450-520nm下的检测)。NC：检测模板为水，阴性对照；PCV3：检测模板为pUC57-cap413质粒。

图4为本发明试剂盒溶液A与溶液B混合后对不同病毒核酸样品在蓝光(波长为450-520nm)下的检测结果图(病毒检测试剂盒特异性检测)。图中均为透明无色。PRRSV：检测模板为猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸质粒模板；ASF：检测模板为非洲猪瘟病毒核酸质粒模板。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1携带PCV3保守病毒序列信息的质粒样本的获得

猪圆环病毒3型病毒(PCV3)cap基因序列经筛选后的高度保守区(PCV3特异性的cap基因片段,SEQ ID No.17)具有PCV3特异性序列的代表性，本发明用携带PCV3特异性的cap基因片段的重组质粒(质粒pUC57-cap413)作为检测样品(携带PCV3保守病毒序列信息的质粒样本)。所述重组质粒pUC57-cap413是将pUC57载体的EcoRI和HindIII限制性核酸内切酶识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.17所示的DNA片段，保持pUC57载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组载体。

本发明携带PCV3保守病毒序列的核酸信息片段利用化学方法合成，随后通过EcoRI和HindIII等两个酶切位点插入到pUC57载体中，完成重组的pUC57-cap413质粒，经测序验证序列正确。

实施例2引物、探针及crRNA的设计

1、引物和探针的设计

针对猪圆环病毒3型病毒(PCV3)cap基因高度保守区的核酸片段，设计用于检测PCV3的特异引物对和特异性识别PCV3的cap基因片段的探针FAM-N-BHQ2，引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司公司合成。

所述引物对由正向引物PCV3-RPA-F和反向引物PCV3-RPA-R组成；所述正向引物PCV3-RPA-F为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述反向引物PCV3-RPA-R为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；所述引物对可用于特异性扩增PCV3特异性的cap基因片段；所述cap基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。

所述探针FAM-N-BHQ2的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，探针FAM-N-BHQ2的5’端标记FAM，3’端标记BHQ2。

2、crRNA的设计

针对猪圆环病毒3型病毒(PCV3)cap基因高度保守区的核酸片段，设计了13个cap-sgRNA的靶DNA序列，并制备了13个cap-crRNA(SEQ ID No.3-15)。

本发明基于cap基因的具有高效特异性识别能力的cap-sgRNA的靶DNA序列如表1所示：

表1 cap-sgRNA的靶DNA序列

表1中，N代表脱氧核糖核苷酸A、G、C或T。

将设计的crRNA序列送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

制备得到SEQ ID No.3-15所示的名称为cap-crRNA的crRNA如下所示：

cap-crRNA-04(SEQ ID No.3)、cap-crRNA-02(SEQ ID No.4)、cap-crRNA-03(SEQID No.5)、cap-crRNA-01(SEQ ID No.6)、cap-crRNA-05(SEQ ID No.7)、cap-crRNA-06(SEQID No.8)、cap-crRNA-07(SEQ ID No.9)、cap-crRNA-08(SEQ ID No.10)、cap-crRNA-09(SEQ ID No.11)、cap-crRNA-10(SEQ ID No.12)、cap-crRNA-11(SEQ ID No.13)、cap-crRNA-12(SEQ ID No.14)、cap-crRNA-13(SEQ ID No.15)。

实施例3基于RPA技术和Cas12a酶切技术检测PCV3

本实施例中的反应体系和扩增程序见表2-7：

表2溶液A反应体系(96孔PCR板+10％的试剂损耗)

试剂	浓度	体积(μl)
			缓冲液A		14.55
缓冲液B		1.25
			H<sub>2</sub>O	NA	6.2
引物PCV3-RPA-F	10-20μM	1
			引物PCV3-RPA-R	10-20μM	1
DNA模板	ng/μl	1/孔
			总计		25/孔

表3溶液A单独(RPA)扩增程序

温度(℃)	时间(秒)	循环数(个)
			37	1200-1500	1

注：缓冲液A和缓冲液B来源于DNA恒温快速扩增试剂盒，南京沃博生物科技有限公司公司产品，试剂盒货号：WLB8201KIT。

表4溶液B反应体系(96孔PCR板+10％的试剂损耗)

试剂	浓度	体积(μl)
			Cas12a	250-1000nM	1
2.1NEB缓冲液	10x	5.0
			H<sub>2</sub>O	NA	14.8
FAM-N-BHQ2	200-1000nM	0.2
			cap-crRNA-4	500-1000nM	4/孔
总计		25/孔

其中，Cas12a购自NEB公司。

表5溶液A和溶液B混合扩增程序

温度(℃)	时间(秒)	循环数(个)
			37	1200-1500	1

表6普通PCR反应体系

试剂	浓度	体积(μl)
			Easy taq-Mix(2X)	/	25
核酸	/	1
			H<sub>2</sub>O	NA	20
上游引物	20nM	2
			下游引物	20nM	2
总计		50/孔

表7普通PCR扩增程序

温度(℃)	时间(秒)	循环数(个)
			95	300	1
95	30	30
			55	30	30
72	20	30
			72	420	1

1、溶液A(单一RPA扩增方法)检测PCV3

以实施例1中的质粒pUC57-cap413为检测样本，水为阴性对照(NC)，利用本发明试剂盒溶液A单独进行RPA检测，扩增体系和反应程序见表2和表3，结果如图1所示，单独利用RPA进行PCV3的核酸扩增反应，检测模板为水(阴性对照)时，核酸结果中并无目的条带(泳道1)。当扩增模板为阳性质粒pUC57-cap413时，电泳检测条带出现了清晰的单一核酸条带(泳道2，130bp大小的核酸扩增子)，表明利用本发明所述试剂盒溶液A(即利用引物PCV3-RPA-F和引物PCV3-RPA-R)进行PCV3的RPA扩增反应特异性好，灵敏度高且条带单一。

2、普通PCR检测PCV3

以实施例1中的质粒Puc57-cap413为检测样本，水为阴性对照(NC)，利用本发明试剂盒溶液A与溶液B混合检测PCV3，操作步骤如下所示：

a、取实施1中的质粒模板pUC57-cap413梯度稀释(10¹⁰个病毒拷贝/μl-1个病毒拷贝/μl)；

b、用上述质粒DNA为模板，准备Easy taq-Mix(2X)(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：P312-01)和上、下游引物(F:ATGAGACACAGACCTATATTC；R:TTAGAAGTCATTACTTTACGAG)并按照表6和表7的扩增体系和程序进行PCR扩增反应。

结果如图2所示，PCR进行PCV3的核酸扩增反应，检测模板为水(阴性对照)时，核酸结果中并无目的条带(泳道1)，当扩增模板为阳性质粒pUC57-cap413时，结果显示，PCR仅能检测到10⁶个病毒拷贝。

3、本发明试剂盒溶液A与溶液B混合检测PCV3(灵敏度检测)

以实施1中的质粒Puc57-cap413为检测样本，水为阴性对照(NC)，利用本发明试剂盒溶液A与溶液B混合检测PCV3，操作步骤如下所示：

a、取实施1中的质粒模板pUC57-cap413梯度稀释(10³个病毒基因拷贝/μl-1个病毒基因拷贝/μl)；

b、用上述质粒DNA为模板，准备溶液A和溶液B：溶液A为：1μl新提取的样品或质粒DNA(10ng/μl)作为模板，10uM正向引物PCV3-RPA-F(1μl)、10uM反向引物PCV3-RPA-R(1μl)、6.2μl ddH2O、14.55μl A Buffer、1.25μl B Buffer，总体积25μl；溶液B为：5μl 2.1NEBBuffer、250-1000nM Cas12a(1μl)、14.8μl ddH2O、500-1000nM cap-crRNA-4(4μl)和200-1000nM的FAM-N-BHQ2(0.2μl)，总体积25μl；

c、将溶液A与溶液B直接充分混合，在37℃环境中放置20-30min；

d、将最终的反应液放入照胶仪或紫外切胶仪，在蓝光(波长为450-520nm)下或者紫外光(波长290-330nm)下，肉眼判定荧光检测结果(两种判读方法)：

d-1)、如果最终的反应液在蓝光(波长为450-520nm)下能观察到绿色荧光(反应液由无色或透明转变为荧光绿色)，则检测结果为阳性，即所述待测样品含有PCV3或为PCV3；如果最终的反应液在蓝光(波长为450-520nm)下不能观察到绿色荧光(利用肉眼观察仍为无色或透明状)，则检测结果为阴性，即所述待测样品不含有PCV3或不为PCV3；

d-2)、如果最终的反应液在紫外光(波长290-330nm)下能观察到白色荧光(反应液由无色或透明转变为实质性白色)，则检测结果为阳性，即所述待测样品含有PCV3或为PCV3；如果扩增产物在紫外光(波长290-330nm)下不能观察到白色荧光(利用肉眼观察仍为无色或透明状)，则检测结果为阴性，即所述待测样品不含有PCV3或不为PCV3。

结果如图3所示，M的检测管内扩增模板为水，呈现阴性结果，其他四管内的扩增模板分别为10³个病毒基因拷贝、10²个病毒基因拷贝、10个病毒基因拷贝和1个病毒基因拷贝的PCV3病毒核酸信息模板，表明利用本发明所述试剂盒溶液A与溶液B的混合检测可针对PCV3的核酸结果进行快速、清晰、准确地判读，与普通PCR相比，其检测的灵敏度得到了大大地提高，可检测至单个病毒基因拷贝信息，证明了本发明试剂盒及检测方法具有高度的灵敏性。

4、本发明试剂盒溶液A与溶液B混合检测不同病毒核酸样品(特异性检测)

待测样品PRRSV：检测模板为猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸质粒模板，来源于实验室保存质粒。

猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸质粒模板为携带PRRSV特异性的nsp2基因片段(SEQID No.18)的重组载体pUC57-PRRSV，pUC57-PRRSV是将pUC57载体的EcoRI和HindIII限制性核酸内切酶识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.18所示的DNA片段，保持pUC57载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组载体。

待测样品ASF：检测模板为非洲猪瘟病毒核酸质粒模板，来源于实验室保存质粒。所述重组质粒pUC57-ASF是将pUC57载体的EcoRI和HindIII限制性核酸内切酶识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.19所示的DNA片段，保持pUC57载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组载体。

按照步骤3的方法，检测其他不同病毒核酸样品(PRRSV、ASF)的结果如图4所示，PRRSV和ASF在蓝光(波长为450-520nm)下检测均为无色透明液体，检测结果为阴性；本发明检测方法仅能检测出PCV3的核酸信息，且对非洲猪瘟(ASF)和蓝耳病病毒(PRRSV)的核酸信息没有任何特异性或非特异性荧光发生；本检测方法无法检测出RPPSV或ASF的核酸信息。以上结果表明利用本发明所述试剂盒溶液A与溶液B的混合检测可以对是否有PCV3的核酸结果进行快速、清晰、准确地判读，特异性高，不存在其他病毒核酸信息的干扰，本检测方法在非PCV3的核酸样品中不会的出阳性结果，仅能特异性的检测出PCV3的核酸，特异性高且稳定。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所

<120> 一种快速可视化检测PCV3的试剂盒及其检测方法

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

attacccgcc taaacgaatg ggaaactgc 29

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gtttgctgag ccggtgagat tacagggctg ag 32

<210> 3

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 3

nnnnnnnauu auaagauacu aaagaucuac aacaguagaa au 42

<210> 4

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 4

nnnnnnngug uaguaugugc cagcaucuac aacaguagaa au 42

<210> 5

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 5

nnnnnnnggg uaaugaagug guugaucuac aacaguagaa au 42

<210> 6

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 6

nnnnnnnagu augugccagc ugugaucuac aacaguagaa au 42

<210> 7

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 7

nnnnnnnucu uauaauauuc aaagaucuac aacaguagaa au 42

<210> 8

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 8

nnnnnnnuuu aguaucuuau aauaaucuac aacaguagaa au 42

<210> 9

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 9

nnnnnnnagc cggugagauu acagaucuac aacaguagaa au 42

<210> 10

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 10

nnnnnnngcu gagccgguga gauuaucuac aacaguagaa au 42

<210> 11

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 11

nnnnnnnucc aggcgccguc uagaaucuac aacaguagaa au 42

<210> 12

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 12

nnnnnnnaua agggucgucu uggaaucuac aacaguagaa au 42

<210> 13

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 13

nnnnnnnuuc guuuaggcgg guaaaucuac aacaguagaa au 42

<210> 14

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 14

nnnnnnnugc ugagccggug agauaucuac aacaguagaa au 42

<210> 15

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 15

nnnnnnngug gaacuuuccg cauaaucuac aacaguagaa au 42

<210> 16

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

ctacagtacg tc 12

<210> 17

<211> 413

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 17

atgagacaca gacctatatt cagaagaaga ccccgcccac gcagacgacg acgccacaga 60

aggcgctatg ccagaagaag actattcatt aggaggccca cagctggcac atactacaca 120

aagaaatact ccaccatgaa cgtcatctcc gttggaaccc ctcagaataa caagccctgg 180

cacgccaacc acttcattac ccgcctaaac gaatgggaaa ctgcaattag ctttgaatat 240

tataagatac taaagatgaa agttacactc agccctgtaa tctcaccggc tcagcaaaca 300

aaaactatgt tcgggcacac agccatagat ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg 360

ctccaagacg acccttatgc ggaaagttcc actcgtaaag taatgacttc taa 413

<210> 18

<211> 427

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 18

tttgagacca cccttcctga aagagtaagg ccttcagatg actgggccac tgacgaggat 60

cttgtgaata ccatccaaat cctcaggctc cctgcggcct tggacaggaa cggcgcttgc 120

ggtagcgcca agtacgtgct taaactggag ggtgagcatt ggactgtctc tgtgatccct 180

gggatgtccc ctactttgct cccccttgaa tgtgttcagg gttgttgtga acataagggc 240

ggtcttgttt ccccggatgc ggtcgaaatt tccggatttg atcctgcttg ccttgacaga 300

ctggctaagg taatgcactt gcctagcagt accatcccag ccgctctggc cgaattgtcc 360

gacaactcca accgtccggt ttccccggcc gctactacgt ggactatttc gcaattctat 420

gctcgtc 427

<210> 19

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 19

ttatgaatgc gcaagttcag ctaattgttc gtcgcttgga atgtgggact gcagggaggt 60

ggagtttttc ctttttctaa agaataccgg gaaatggtgg tgaggctcag gttgttgtac 120

atagtagcta ggaggaggtt taggtatgct cgacttgcag tcaatagtcc ggttatagta 180

aacgatggca acgatgataa gaataataat gagcaaaatc aaaatgccca ggagaatcgc 240

agttgttccg ggatatttgg cgattgtatg ggctaaaagg ccttgggtgc tttgtttaat 300

tccctcgcgg gttgacaggt tatgagaaag cagtggagac gtttcagtgt ccat 354

Claims

1.检测PCV3的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测PCV3的引物对，所述引物对由引物PCV3-RPA-F和引物PCV3-RPA-R组成；所述引物PCV3-RPA-F为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物PCV3-RPA-R为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

所述试剂盒还包含SEQ ID No.3所示的cap-crRNA；

所述试剂盒还包含探针FAM-N-BHQ2，所述探针FAM-N-BHQ2的核苷酸序列如SEQ IDNo.16所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针FAM-N-BHQ2的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针FAM-N-BHQ2的5’端标记FAM，3’端标记BHQ2。

4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括携带PCV3特异性的cap基因片段的重组载体，所述cap基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。

5.用于检测PCV3的组合物，其特征在于，所述组合物包括引物对、探针和crRNA，所述crRNA为SEQ ID No.3所示的cap-crRNA；

所述引物对由引物PCV3-RPA-F和引物PCV3-RPA-R组成；所述引物PCV3-RPA-F为SEQ IDNo.1所示的单链DNA分子；所述引物PCV3-RPA-R为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

6.检测PCV3的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-4任一所述的试剂盒对待测样品进行检测；所述方法为非疾病诊断和治疗目的方法。

7.检测PCV3的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求5所述的组合物对待测样品进行检测；所述方法为非疾病诊断和治疗目的方法。