CN113846181B - 一种基于Cas12a蛋白快速可视化检测PRRSV的试剂盒及方法 - Google Patents

一种基于Cas12a蛋白快速可视化检测PRRSV的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测PRRSV的核酸的引物组合、sgRNA序列、荧光报告基因、荧光检测试剂盒及其检测方法和应用。本发明所公开的荧光检测试剂盒，包括引物组合、sgRNA序列和荧光报告基因，检测效果精准、快速、能够实现可视化；本发明公开的可视化荧光检测方法，灵敏度可达到单个拷贝级别，并且无需借助昂贵的PCR仪、qPCR仪器以及漫长的反应时间；在生产饲养的一线，养殖人员对检测样品是否带有PRRSV可以进行现场快速预判。

Description

一种基于Cas12a蛋白快速可视化检测PRRSV的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于Cas12a蛋白快速可视化检测PRRSV的试剂盒及方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)，又称为蓝耳病，是猪的重大传染性疾病之一，由PRRS病毒(Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起，发病速度较快，并且死亡率极高。健康猪在感染发病后，其精神状态不佳，食欲明显下降，严重的食欲废绝，高烧不退，咳嗽、呼吸较为急促，耳缘发绀且皮下出血；部分病猪会出现神经症状、严重的腹泻，眼结膜伴有充血现象；怀孕的母猪在发病后，2～3d内即可出现流产现象，产下胎儿为死胎，即使有部分耐过猪产下活胎，在2～3d后仔猪也会死亡，给养殖户带来巨大损失。在病毒传播的情况下，如果能够及时识别出感染了病毒的猪，并尽早将被感染的猪从畜群中隔离，往往能够避免病毒的扩大传播，减少经济损失。
现有技术中，针对PRRSV病毒的检测方法主要有病毒分离、病毒抗原抗体检测、基于PCR等逆转录及核算扩增的方法、血清抗原检测等，但是，这些方法存在检测周期长、检测仪器昂贵、检测条件要求高等问题，且不能在生产饲养一线快速检测。
因此，需要开发一种特异、敏感、肉眼易判断的检测方法，以高效、快速、准确、灵敏地获得病毒的检测结果。
发明内容
为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，基于PRRSV基因中高突变率的nsp2基因序列上的相对保守区域，确定保守序列中的PAM位点，筛选并优化出可引导Cas12a蛋白发生酶切反应的特异性sgRNA，设计了一种结合RPA扩增技术、Cas12a蛋白酶切技术以及荧光猝灭报告器的荧光检测试剂盒及检测方法，能够在生产饲养的一线快速、精准、可视化且低成本的进行PRRS病毒的检测，从而完成了本发明。
具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
第一方面，提供了一种检测PRRSV的核酸的引物组合，所述引物组合由正向引物PRRSV-RPA-F和反向引物PRRSV-RPA-R组成，
其中，所述正向引物PRRSV-RPA-F包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述反向引物PRRSV-RPA-R包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
第二方面，提供了一种检测PRRSV的sgRNA序列，所述sgRNA序列可特异性识别nsp2基因，
所述sgRNA序列选自nsp2-sgRNA1～nsp2-sgRNA50中的一种或多种。
第三方面，提供了一种检测PRRSV的核酸的荧光报告基因，其由荧光基团JOE和猝灭基团BHQ2修饰得到，在Cas12a蛋白发生酶切反应时猝灭基团断裂并使荧光基团发出荧光；
优选地，所述荧光报告基因的序列可以为JOE-N1-BHQ2～JOE-N10-BHQ2中的一种或多种，
JOE-N1-BHQ2～JOE-N10-BHQ2的序列分别如下所示：
JOE-N1-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N2-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N3-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N4-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N5-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N6-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N7-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N8-BHQ2：JOE5’-NNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N9-BHQ2：JOE5’-NNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N10-BHQ2：JOE5’-NNNN-3’BHQ2；
其中，“N”代表任意A、G、C、T核苷酸。
第四方面，提供了一种PRRSV的核酸的荧光检测试剂盒，所述荧光检测试剂盒包括第一方面所述的引物组合、第二方面所述的sgRNA序列和第三方面所述的荧光报告基因。
第五方面，提供了一种PRRSV的核酸的可视化荧光检测方法，优选采用第四方面所述的荧光检测试剂盒进行，所述方法包括以下步骤：
步骤1，对PRRSV进行核酸扩增；
步骤2，利用Cas12a蛋白对扩增产物进行酶切；
步骤3，对酶切产物进行荧光判读。
第六方面，提供了第一方面所述的引物组合、第二方面所述的sgRNA序列、第三方面所述的荧光报告基因或第四方面所述的荧光检测试剂盒在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂方面的应用。
本发明所具有的有益效果包括：
(1)本发明提供的荧光检测试剂盒，包括的引物组合和sgRNA序列，针对编码PRRSV特异性的nsp2基因序列设计，可特异性检测该基因，检测效果精准；
(2)本发明提供的荧光检测试剂盒，将被荧光基团和猝灭基团修饰的单链DNA序列作为荧光报告基因，可以在Cas12a蛋白酶切反应时发生猝灭基团断裂并使荧光基团发出荧光，辅助对检测结果进行判读，检测速率高且能实现可视化；
(3)本发明提供的PRRSV的核酸的可视化荧光检测方法，灵敏度可达到单个拷贝级别，杜绝了上一步核酸扩增反应中非目的扩增片段的假阳性事件发生，并且无需借助昂贵的PCR仪、qPCR仪器以及漫长的反应时间；
(4)本发明提供的PRRSV的核酸的可视化荧光检测方法，在生产饲养的一线，养殖人员对检测样品是否带有PRRSV可以进行现场快速预判，从而严格控制PRRSV的传播，具有重要的经济效益与社会价值。
附图说明
图1示出本发明所述方法检测包含病毒特异性基因序列的质粒模板结果图；图2示出普通PCR方法检测包含病毒特异性基因序列的质粒模板结果图；图3示出本发明实验例2的检测结果对比图；图4示出本发明实验例2中病猪1和病猪2的PRRSV核酸检测结果图。
具体实施方式
下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
本发明人发现，基因编辑技术发展迅速，不同亚型的CRISPR-Cas的基因编辑系统拓展了临床检测、基础研究和生物医学领域方面的应用。其中，CRISPR-Cas12a系统更适合用于病原微生物的快速精准检测，Cas12a(又称Cpf1蛋白)比Cas9蛋白要小，它没有HNH结构域，而有一个NUC结构域，结构域的不同导致Cas12a切割产生的是5个核苷酸突出的黏性末端，而不像Cas9切割产生的是平端。Cas12a在靶标ssDNA的第22位附近特异切割DNA(称为cis切割)，并且该切割行为不需要PAM序列的辅助。同时，一旦Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体后，该复合物就会显示出很强的“乱切”活性，并将体系中任意单链DNA切成碎片(称为trans切割)。
重组酶聚合酶扩增(RPA,Recombinase Polymerase Amplification)是一种核酸恒温扩增技术，其原理是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与单链结合蛋白结合，防止进一步替换。本发明人发现，在上述扩增体系中，目标基因的扩增速度非常快，由两个相对的引物起始一个合成事件，可在十分钟内获得可检出水平的扩增产物，同时，该体系的工作温度为37-40℃之间，37℃为最佳的反应温度，且对检测环境和设备要求很低，仅需一台简便的水浴锅或在37℃或夏季的室温环境下就可发生反应，非常适合现场检测。
因此，本发明中将RPA核酸扩增技术与Cas12a酶切技术相结合，以对猪待测样品是否带有PRRSV(PRRS病毒)进行快速预判。
本发明的第一方面，提供了一种检测PRRSV的核酸的引物组合，所述引物组合由正向引物PRRSV-RPA-F和反向引物PRRSV-RPA-R组成，
其中，所述正向引物PRRSV-RPA-F包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述反向引物PRRSV-RPA-R包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
优选地，所述正向引物PRRSV-RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物PRRSV-RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明中，所述检测PRRSV的核酸的引物组合根据编码PRRSV特异性的nsp2基因序列，按照常规的引物设计原则设计得到，由于nsp2基因序列的突变率较高，本发明对多组蓝耳病病毒毒株的基因组序列进行了比对，病筛选出nsp2基因中的保守核酸序列，根据本发明一种优选的实施方式，所述nsp2的保守序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，
优选地，所述nsp2的保守序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明的第二方面，提供了一种检测PRRSV的核酸的RPA扩增试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物组合。
根据本发明一种优选的实施方式，所述RPA扩增试剂盒还包括扩增缓冲液、ddH2O和模板。
优选地，所述模板为新提取的RNA，即提取不超过72小时的RNA。
更优选地，所述扩增缓冲液可以采用RNA恒温快速扩增试剂盒中的A Buffer和BBuffer，货号为WLRN8206KIT。
在进一步优选的实施方式中，所述检测PRRSV的核酸的RPA扩增优选按照包括以下步骤的方法进行：
将1μl新提取的RNA作为模板，加入10μM正向引物PRRSV-RPA-F、10μM反向引物PRRSV-RPA-R、5μl ddH2O、10μl A Buffer和2μl B Buffer，混合均匀后，在42℃的环境中放置30min进行扩增。
本发明人发现，在获得nsp2基因的保守序列后，可以进一步获得引导Cas12a蛋白发生酶切反应的特异性sgRNA，其具有高效的特异性识别能力。
优选地，所述特异性sgRNA通过包括下述步骤的方法获得：(1)确定nsp2基因保守序列中的PAM位点；(2)依据PAM位点，设计sgRNA,并采用对比筛选的方法优化得到特异性sgRNA。
其中，PAM指的是Protospacer Adjacent Motif，PAM序列的特征为NGG(其中N为任意核苷酸)；sgRNA(small guide RNA)是向导RNA，基因特异的sgRNA序列为位于PAM序列前间区序列邻近基序。
因此，本发明的第三方面，提供了一种用于检测PRRSV的sgRNA序列，其可特异性识别nsp2基因中的保守序列区，所述sgRNA序列选自nsp2-sgRNA1～nsp2-sgRNA50中的一种或多种；
所述nsp2-sgRNA1～nsp2-sgRNA50的序列如下所示：
nsp2-sgRNA1:5’-TTTNCGCCATCGTCAACCGGATGG-3’；
nsp2-sgRNA2:5’-TTTNAGACCACCCTTCCTGAAAGA-3’；
nsp2-sgRNA3:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA4:5’-TTTNAGCACGTACTTGGCGCCACC-3’；
nsp2-sgRNA5:5’-TTTNGATGGTGTTCACAAGATCCT-3’；
nsp2-sgRNA6:5’-TTTNAGGAAGGGTGGTCTCAAAGT-3’；
nsp2-sgRNA7:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA8:5’-TTTNNTCCCCCTTGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA9:5’-TTTNCNCCCCCTTGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA10:5’-TTTNCTNCCCCTTGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA11:5’-TTTNCTCNCCCTTGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA12:5’-TTTNCTCCNCCTTGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA13:5’-TTTNCTCCCNCTTGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA14:5’-TTTNCTCCCCNTTGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA15:5’-TTTNCTCCCCCNTGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA16:5’-TTTNCTCCCCCTNGAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA17:5’-TTTNCTCCCCCTTNAATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA18:5’-TTTNCTCCCCCTTGNATGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA19:5’-TTTNCTCCCCCTTGANTGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA20:5’-TTTNCTCCCCCTTGAANGTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA21:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATNTGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA22:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGNGTTCA-3’；
nsp2-sgRNA23:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTNTTCA-3’；
nsp2-sgRNA24:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGNTCA-3’；
nsp2-sgRNA25:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTNCA-3’；
nsp2-sgRNA26:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTNA-3’；
nsp2-sgRNA27:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCN-3’；
nsp2-sgRNA28:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCNN-3’；
nsp2-sgRNA29:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCNNN-3’；
nsp2-sgRNA30:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCNNNN-3’；
nsp2-sgRNA31:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA32:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA33:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA34:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCNNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA35:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCNNNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA36:5’-TTTNCTCCCNNNNNNNNNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA37:5’-TTTNCTCCCCNNNNNNNNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA38:5’-TTTNCTCCCCCNNNNNNNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA39:5’-TTTNCTCCCCCTNNNNNNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA40:5’-TTTNCTCCCCCTTNNNNNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA41:5’-TTTNCTCCCCCTTGNNNNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA42:5’-TTTNCTCCCCCTTGANNNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA43:5’-TTTNCTCCCCCTTGAANNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA44:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATNNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA45:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGNNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA46:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTNNNNN-3’；
nsp2-sgRNA47:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGNNNN-3’；
nsp2-sgRNA48:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTNNN-3’；
nsp2-sgRNA49:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTNN-3’；
nsp2-sgRNA50:5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCN-3’。其中，在nsp2-sgRNA1～nsp2-sgRNA50中，“N”代表任意A、G、C、T核苷酸。
更优选地，所述用于检测PRRSV的sgRNA序列为nsp2-sgRNA3。
本发明人研究发现，nsp2-sgRNA1～nsp2-sgRNA50共50条sgRNA序列均可特异性识别nsp2基因，完成PRRSV的检测工作，其中，以nsp2-sgRNA3的效果最佳。
其中，sgRNA的序列所转录的RNA序列联合5’-ATCTACAACAGTAGAAAT-3’的DNA转录产物即为crRNA，其可协助Cas12a蛋白发挥精准定位功能。
根据本发明一种优选的实施方式，可特异性识别nsp2基因的crRNA序列选自crRNA-sgRNA1～crRNA-sgRNA50中的一种或多种。
优选地，所述crRNA-sgRNA1～crRNA-sgRNA50的序列具体如下所示：
crRNA-sgRNA1:5’-UUUNCGCCAUCGUCAACCGGAUGG AUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA2:5’-UUUNAGACCACCCUUCCUGAAAGAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA3:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA4:5’-UUUNAGCACGUACUUGGCGCCACCAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA5:5’-UUUNGAUGGUGUUCACAAGAUCCUAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA6:5’-UUUNAGGAAGGGUGGUCUCAAAGUAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA7:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA8:5’-UUUNNUCCCCCUUGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA9:5’-UUUNCNCCCCCUUGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA10:5’-UUUNCUNCCCCUUGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA11:5’-UUUNCUCNCCCUUGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA12:5’-UUUNCUCCNCCUUGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA13:5’-UUUNCUCCCNCUUGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA14:5’-UUUNCUCCCCNUUGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA15:5’-UUUNCUCCCCCNUGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA16:5’-UUUNCUCCCCCUNGAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA17:5’-UUUNCUCCCCCUUNAAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA18:5’-UUUNCUCCCCCUUGNAUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA19:5’-UUUNCUCCCCCUUGANUGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA20:5’-UUUNCUCCCCCUUGAANGUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA21:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUNUGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA22:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGNGUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA23:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUNUUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA24:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGNUCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA25:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUNCAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA26:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUNAAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA27:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA28:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA29:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA30:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA31:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA32:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA33:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA34:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCNNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA35:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCNNNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA36:5’-UUUNCUCCCNNNNNNNNNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA37:5’-UUUNCUCCCCNNNNNNNNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA38:5’-UUUNCUCCCCCNNNNNNNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA39:5’-UUUNCUCCCCCUNNNNNNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA40:5’-UUUNCUCCCCCUUNNNNNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA41:5’-UUUNCUCCCCCUUGNNNNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA42:5’-UUUNCUCCCCCUUGANNNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA43:5’-UUUNCUCCCCCUUGAANNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA44:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUNNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA45:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGNNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA46:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUNNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA47:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGNNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA48:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUNNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA49:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUNNAUCUACAACAGUAGAAAU-3’；
crRNA-sgRNA50:5’-UUUNCUCCCCCUUGAAUGUGUUCN AUCUACAACAGUAGAAAU-3’。
其中，在上述序列中，“N”代表任意A、G、C、U核苷酸。
更优选地，所述crRNA-sgRNA1～crRNA-sgRNA50的序列为crRNA-sgRNA3。
其中，crRNA由nsp2基因保守序列中sgRNA的DNA序列信息决定，可完成PRRSV的检测工作，其中，以crRNA-sgRNA3的效果最佳。
为了使PRRSV病毒检测能便于日常和临床现场应用，有必要开发肉眼易判断的检测方法，因此，本发明中优选采用荧光基团和猝灭基团对单链DNA进行修饰，通过荧光报告基团的显色情况进行肉眼结果判定。
本发明的第四方面，提供了一种用于检测PRRSV的核酸的荧光报告基因，其由5’端的荧光基团JOE和3’端的荧光猝灭基团BHQ2修饰得到，在Cas12a蛋白发生酶切反应时猝灭基团断裂并使荧光基团发出荧光。
在本发明中，所述荧光报告基因可以采用现有技术常用的方法获得荧光基团和猝灭基团修饰的单链DNA，例如化学合成方法。
根据本发明一种优选的实施方式，所述用于检测PRRSV的核酸的荧光报告基因，其序列可以为JOE-N1-BHQ2～JOE-N10-BHQ2中的一种或多种，
其中，JOE-N1-BHQ2～JOE-N10-BHQ2的序列分别如下所示：
JOE-N1-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N2-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N3-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N4-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N5-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N6-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N7-BHQ2：JOE5’-NNNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N8-BHQ2：JOE5’-NNNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N9-BHQ2：JOE5’-NNNNNN-3’BHQ2；
JOE-N10-BHQ2：JOE5’-NNNN-3’BHQ2。
其中，“N”代表任意A、G、C、T核苷酸。
在进一步优选的实施方式中，所述用于检测PRRSV的核酸的荧光报告基因的序列如下所示：
JOE5’-CTACAGTACGTC-3’BHQ2(如SEQ ID NO：4所示)。
本发明的第五方面，提供了一种PRRSV的核酸的荧光检测试剂盒，所述荧光检测试剂盒包括第一方面所述的引物组合、第二方面所述的RPA扩增试剂盒、第三方面所述的sgRNA序列和第四方面所述的荧光报告基因。
根据本发明一种优选的实施方式，所述PRRSV的核酸的荧光检测试剂盒还包括酶切缓冲液和Cas12a蛋白溶液。
其中，所述酶切缓冲液可以采用现有技术中常用的缓冲液，如NEB公司生产的2.1NEB Buffer。
本发明的第六方面，提供了一种PRRSV的核酸的可视化荧光检测方法，用于非诊断或治疗目的，优选采用第五方面所述的荧光检测试剂盒进行，
所述可视化荧光检测方法包括以下步骤：
步骤1，对PRRSV进行核酸扩增。
其中，步骤1包括以下子步骤：
步骤1-1，获取待测猪的RNA。
根据本发明一种优选的实施方式，取黄豆大小猪的鼻拭子、肺脏、脾或其他内脏组织并提取其总RNA。
其中，所述组织总RNA的提取可以采用现有技术中常用的提取方法或提取试剂盒进行，优选按照包括以下步骤的方法进行：
(1)用镊子夹取新鲜的脾脏组织，并用剪刀剪取绿豆大小的组织一块放入干净EP管中，用小剪子剪碎组织，随后快速放入1000μl TRNzol溶液中；
(2)在组织和TRNzol溶液的混合液中加入5颗直径为2mm的钢珠，在50Hz/min的振幅下，分三次研磨振荡90s，取出观察看到组织基本消融无团块状，室温下静置10min；
(3)加入200μl三氯甲烷，立马上下颠倒混匀，充分混匀后放在室温下静置10min，在12000转/min条件下，离心10min取出；
(4)吸取上清液500μl，转移到新的管中，加入500μl异丙醇，上下剧烈的震荡，在室温下静置10min后，在1200转/min条件下，离心10min后取出；
(5)弃上清，留下管内沉淀；加人700μl浓度为75％的预冷乙醇，轻轻冲洗15sec，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再放入离心机中以12000转/min离心10min后弃上清，留下白色沉淀；
(6)向管中加人700μl预冷的无水乙醇，轻轻冲洗15sec，12000转/min离心10min后弃上清，留下白色沉淀，在室温下静置10min，去除残余的酒精；
(7)加入50μl预热的无RNA酶灭菌水，溶解白色沉淀。
RNA提取后经过Nanodrop-2000分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到100ng/μl于-80℃下保存备用。
步骤1-2，以猪的RNA为模板，进行RPA扩增。
所述RPA扩增优选按照包括以下步骤的方法进行：
将1μl新提取的总RNA作为模板，加入20μM正向引物PRRSV-RPA-F、20μM反向引物PRRSV-RPA-R、13.4μl ddH2O、29.1μl A Buffer和2.5μl B Buffer，混合均匀后，在37℃的环境中放置20min进行扩增。
其中，所述正向引物PRRSV-RPA-F包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述反向引物PRRSV-RPA-R包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
优选地，所述正向引物PRRSV-RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物PRRSV-RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在本发明中，所述RPA扩增反应可以在水浴锅中进行。
步骤1-3，任选地，对RPA扩增产物进行纯化。
其中，所述RPA扩增产物可以按照现有技术常用方法或相关试剂盒进行纯化，例如，可以按照QIGEN试剂盒(货号：28004)所述步骤进行，具体如下：
(1)首先将反应产物(共50μl)从水浴锅中取出，吸取100μl的PB Buffer与其充分混匀，随后将150μl的混合液转移至收集套管中，13000rpm/min离心1分钟；
(2)弃滤液，在收集管中加入750μl的PE Buffer，13000rpm/min离心1分钟，随后弃滤液；
(3)重复步骤(2)一次，随后13000rpm/min空旋离心1分钟；
(4)加入50μl的无RNA、DNA酶的无菌水，13000rpm/min离心1分钟，随后收集滤液。
其中，滤液即为纯化后的扩增产物。
步骤2，利用Cas12a蛋白对扩增产物进行酶切。
在本发明中，优选地，先将Cas12a蛋白溶液、酶切缓冲液、sgRNA、荧光报告基因和H2O混合，再将纯化或者未纯化后的RPA扩增产物加入，混合均匀，于37℃环境中放置30min，进行酶切反应。
其中，基于20μl的总反应体系，Cas12a蛋白溶液(浓度为250nM)的体积为1μl，酶切缓冲液的体积为2μl，H2O的体积为9.8μl，荧光报告基因(浓度为300nM)的体积为0.2μl，sgRNA(浓度为900nM)的体积为4μl，纯化或者未纯化后的RPA扩增产物的体积为3μl。
优选地，Cas12a蛋白溶液为现有技术中常用的市售可得的产品，例如可以购自NEB公司，货号为M0653T。
步骤3，对酶切产物进行荧光判读。
其中，将酶切后的反应溶液置于蓝光或紫外光照条件下进行结果的肉眼判读，通过观察溶液在蓝光或紫外光下的颜色判读PRRSV特异性扩增的结果。
优选地，所述蓝光或紫外光照条件可以通过照胶仪(蓝光发射仪，波长为450-520nm)或紫外切胶仪(紫外切胶仪，波长为300nm)实现。
根据本发明一种优选的实施方式，在蓝光条件下，通过肉眼观察，溶液若呈透明或无色，则表明检测样品为阴性，不存在PRRSV核酸信息；若溶液呈现绿色或荧光绿色，则表明检测样品为阳性，存在PRRSV核酸信息；
在紫外光条件下，若溶液呈透明或无色，则表明检测样品为阴性，不存在PRRSV核酸信息；若溶液呈白色或实质性白色，则表明检测样品为阳性，存在PRRSV基因。
本发明所述的PRRSV的核酸的可视化荧光检测方法，结合RPA扩增技术、Cas12a蛋白酶切技术和荧光猝灭报告器，灵敏度可达到病毒基因的单拷贝级别(3个基因片段拷贝)，特异性高，杜绝了上一步核酸扩增反应中非目的核酸片段的假阳性鉴定结果的情况发生，并且无需借助昂贵的PCR仪、qPCR仪器以及漫长的反应时间。在生产饲养的一线，养殖人员可以利用该方法来检测样品是否带有PRRSV并进行快速预判，进一步严格控制PRRSV的传播，具有重要的经济效益与社会价值。
本发明的第七方面，提供了第一方面所述的引物组合、第二方面所述的RPA扩增试剂盒、第三方面所述的sgRNA序列、第四方面所述的荧光报告基因或第五方面所述的荧光检测试剂盒在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂方面的应用。
实施例
以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1
1、检测样品
a、随机选取于湖南省怀化市通道菁芜养殖合作社(品种：二元杂(长白猪与大白猪)，性别：母)的猪脾脏组织样本；
b、携带PRRSV保守病毒序列信息的质粒样本，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2、提取a样本的RNA并纯化
采集8头份猪的脾脏组织，用于提取不同个体的总RNA；
组织RNA提取按以下步骤进行：
(2.1)用镊子夹取新鲜的脾脏组织，并用剪刀剪取绿豆大小的组织一块放入干净EP管中，用小剪子剪碎组织，随后快速放入1000μl TRNzol溶液中；
(2.2)在组织和TRNzol溶液的混合液中加入5颗直径为2mm的钢珠，在50Hz/min的振幅下，分三次研磨振荡90s，取出观察看到组织基本消融无团块状，室温下静置10min；
(2.3)加入200μl三氯甲烷，立马上下颠倒混匀，充分混匀后放在室温下静置10min，在12000转/min条件下，离心10min取出；
(2.4)吸取上清液500μl，转移到新的管中，加入500μl异丙醇，上下剧烈的震荡，在室温下静置10min后，在1200转/min条件下，离心10min后取出；
(2.5)弃上清，留下管内沉淀；加人700μl浓度为75％的预冷乙醇，轻轻冲洗15sec，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再放入离心机中以12000转/min离心10min后弃上清，留下白色沉淀；
(2.6)向管中加人700μl预冷的无水乙醇，轻轻冲洗15sec，12000转/min离心10min后弃上清，留下白色沉淀，在室温下静置10min，去除残余的酒精；
(2.7)加入50μl预热的无RNA酶灭菌水，溶解白色沉淀。
RNA提取后经过Nanodrop-2000分光光度计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到100ng/μl于-80℃下保存备用。
RNA的纯化按照试剂盒(型号：Monarch RNA Cleanup Kit,T2040L)所述步骤进行：
(1)、加入5倍体积的PB buffer，与1倍体积的RNA溶液混合充分；
(2)、再加入1倍混合液体积的无水乙醇；
(3)、将(1)和(2)中的混合溶液加入吸附柱内，13000rpm/min离心1分钟，弃滤液；
(4)、回收吸附柱并加入500ul的wash buffer,13000rpm/min离心1分钟，弃滤液；
(5)、重复第(4)步一次，再空悬吸附柱13000rpm/min离心2分钟，弃收集柱；
(6)、更换一个新的收集柱，在吸附柱中加入50ul无酶水，13000rpm/min离心1分钟，洗脱RNA，放入-20度保存。
3、RPA扩增
RPA反应体系(50孔PCR板+10％的试剂损耗)如表1所示：
表1
试剂 浓度 体积(μl)
A Buffer 29.1
B Buffer 2.5
H<sub>2</sub>O NA 13.4
RNA template 1～200ng/μl 1/well
PRRSV-RPA-F 20uM/μl 2
PRRSV-RPA-R 20uM/μl 2
Total 50/well
其中，所述A Buffer和B Buffer为RNA恒温快速扩增试剂盒(货号为WLRN8206KIT)中的缓冲液。
正向引物PRRSV-RPA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物PRRSV-RPA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
扩增参数如表2所示：
表2
温度(℃) 时间(s) 循环数
37 1200 1
4、纯化RPA反应产物
RPA反应产物纯化按照QIGEN试剂盒(货号：28004)的操作说明书进行：
(4.1)首先将反应产物(共50μl)从水浴锅中取出，吸取100μl的PB Buffer与其充分混匀，随后将150μl的混合液转移至收集套管中，13000rpm/min离心1分钟；
(4.2)弃滤液，在收集管中加入750μl的PE Buffer，13000rpm/min离心1分钟，随后弃滤液；
(4.3)重复步骤(2)一次，随后13000rpm/min空旋离心1分钟；
(4.4)加入50μl的无RNA、DNA酶的无菌水，13000rpm/min离心1分钟，随后收集滤液。
5、荧光检测
采用的荧光检测反应体系(Cas12a-sg3-FQ)如表3所示(20孔PCR板+10％的试剂损耗)：
表3
试剂 浓度 体积(μl)
Cas12a 250nM 1
2.1NEB Buffer 10x 2.0
H<sub>2</sub>O NA 9.8
JOE-N-BHQ2 300nM 0.2
PRA template NA 3/well
nsp2-sgRNA3 900nM 4/well
Total 20/well
其中，Cas12a购自NEB公司，货号为M0653T；2.1NEB Buffer为购自NEB公司的酶切缓冲液；JOE-N-BHQ2的序列为JOE5’-CTACAGTACGTC-3’BHQ2(如SEQ ID NO：4所示)。
采用的检测反应参数如表4所示：
表4
温度(℃) 时间(s) 循环数
37 1800 1
其中，酶切反应在水浴锅中进行。
6、肉眼判读检测结果
将酶切后的反应产物(共20μl)从水浴锅中取出，放入便携式照胶仪(蓝光发射仪、波长为450-520nm，或紫外切胶仪，波长为300nm)，在蓝光或者紫外光照条件下肉眼观察颜色变化：
(1)在蓝光条件下，若反应溶液呈透明或无色，则表明检测样品为阴性，检测样本中不含蓝耳病病毒基因；若反应溶液呈绿色或者荧光绿色，则表明检测样品为阳性，检测样本中含有蓝耳病病毒基因；
(2)在紫外光条件下，若溶液呈透明或无色，则表明检测样品为阴性，检测样本中不含蓝耳病病毒基因；若溶液呈白色或实质性白色，则表明检测样品为阳性，检测样本中含有蓝耳病病毒基因。
实验例
实验例1
将实施例1中样品b(携带PRRSV保守病毒序列信息的质粒样本)进行梯度稀释，分别得到1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100个PRRSV特异性拷贝片段，采用实施例1所述的方法和现有的普通PCR方法分别对上述11个PRRSV特异性拷贝片段进行检测，结果分别如图1和2所示。
其中，以水为RPA扩增反应中的阴性对照(NC)；
普通PCR方法的扩增检测体系为：94℃5min；35个循环：94℃30s,54℃30s,72℃20s；72℃7min终延伸。
具体检测体系如下：
检测引物：
nsp2-F：CTACTCTCCGCCTGCCGA(如SEQ ID NO：5所示)
nsp2-R：CCTGAACACATTCAAG(如SEQ ID NO：6所示)
试剂 浓度 体积(μl)
2X Mix NA 25
H<sub>2</sub>O NA 20
nsp2-F 10uM 2
nsp2-R 10uM 2
模板 100～10<sup>-8</sup>ng/ul 1
Total 50/well
图1为浓度梯度不同的nsp2质粒样本(由100ng/ul,随后梯度稀释10倍至10-8ng/ul，即1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100个PRRSV特异性拷贝片段)RPA扩增完后，进行的Cas12a检测结果，上排为在蓝光条件下的检测结果，下排为在紫外光下的检测结果。
由图1和2可知，与现有普通PCR方法相比，本发明所述的检测方法灵敏度可达到病毒核酸的单拷贝级别。
实验例2
采用本发明实施例1的方法对健康猪、病猪、野生小鼠进行检测，其中，健康猪和病猪的来源与实施例1中猪的来源一致，野生小鼠来源于实验室自养的野生型小鼠，检测结果如图3所示。
图3中，NC为阴性对照，以水为检测模板，小鼠是指以野生小鼠的总RNA为检测模板，正常猪是指以健康猪的总RNA为检测模板，病猪1和病猪2是指以带蓝耳病猪的总RNA为检测模板。其中，病猪1和病猪2为经PRRSV核酸检测确定为阳性的猪，其以病猪的基因组cDNA为检测模板，水为阴性对照(NC)，检测结果如图4所示。
由图3的结果可知，本发明所述的检测方法对正常猪和小鼠的总RNA样品为阴性结果，仅能检测出带蓝耳病猪的RNA样品为阳性结果，表明本发明所述的检测方法仅可检测含有nsp2基因的核酸信息，该检测方法在猪和小鼠等哺乳动物的基因组中具有高度特异性。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120> 一种基于Cas12a蛋白快速可视化检测PRRSV的试剂盒及方法
<130> 2021
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> PRRSV-RPA-F（人工序列）
<400> 1
actggagggt gagcattgga ctgtctctg 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> PRRSV-RPA-R（人工序列）
<400> 2
gatcaaatcc ggaaacttcg accgcatccg 30
<210> 3
<211> 427
<212> DNA
<213> Nsp2的保守序列（人工序列）
<400> 3
tttgagacca cccttcctga aagagtaagg ccttcagatg actgggccac tgacgaggat 60
cttgtgaata ccatccaaat cctcaggctc cctgcggcct tggacaggaa cggcgcttgc 120
ggtagcgcca agtacgtgct taaactggag ggtgagcatt ggactgtctc tgtgatccct 180
gggatgtccc ctactttgct cccccttgaa tgtgttcagg gttgttgtga acataagggc 240
ggtcttgttt ccccggatgc ggtcgaaatt tccggatttg atcctgcttg ccttgacaga 300
ctggctaagg taatgcactt gcctagcagt accatcccag ccgctctggc cgaattgtcc 360
gacaactcca accgtccggt ttccccggcc gctactacgt ggactatttc gcaattctat 420
gctcgtc 427
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> JOE-N-BHQ2（人工序列）
<400> 4
ctacagtacg tc 12
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Nsp2-F（人工序列）
<400> 5
ctactctccg cctgccga 18
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Nsp2-R（人工序列）
<400> 6
cctgaacaca ttcaag 16

Claims (3)

1.一种PRRSV的核酸的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述荧光检测试剂盒包括引物组合、sgRNA和荧光报告基因，
还包括酶切缓冲液和Cas12a蛋白溶液；
所述引物组合由正向引物PRRSV-RPA-F和反向引物PRRSV-RPA-R组成，
其中，所述正向引物PRRSV-RPA-F如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物PRRSV-RPA-R如SEQ ID NO：2所示；
所述sgRNA序列如下所述：5’-TTTNCTCCCCCTTGAATGTGTTCA -3’，
其中，“N”代表任意A、G、C、T核苷酸；
所述荧光报告基因的序列如下所示：
JOE5’-CTACAGTACGTC -3’BHQ2；
所述荧光检测试剂盒的检测灵敏度为病毒基因的单拷贝级别。
2.一种非诊断目的的检测PRRSV的核酸的可视化荧光检测方法，采用权利要求1所述的荧光检测试剂盒进行，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，对PRRSV进行核酸扩增；
步骤1包括以下子步骤：
步骤1-1，获取待测猪的RNA；
步骤1-2，以猪的RNA为模板，使用权利要求1中所述的引物组合进行RPA扩增；
步骤1-3，任选地，对RPA扩增产物进行纯化；
步骤2，利用Cas12a蛋白对扩增产物进行酶切；
先将Cas12a蛋白溶液、酶切缓冲液、权利要求1中所述的sgRNA、权利要求1中所述的荧光报告基因和H2O混合，再将纯化或者未纯化后的RPA扩增产物加入，混合均匀，于37℃环境中放置30min，进行酶切反应；
步骤3，对酶切产物进行荧光判读；
所述荧光判读为将酶切后的反应溶液置于蓝光或紫外光照条件下进行结果的肉眼判读，
在蓝光条件下，通过肉眼观察，溶液若呈透明或无色，则表明检测样品为阴性，不存在PRRSV核酸信息；若溶液呈现绿色或荧光绿色，则表明检测样品为阳性，存在PRRSV核酸信息；
在紫外光条件下，若溶液呈透明或无色，则表明检测样品为阴性，不存在PRRSV核酸信息；若溶液呈白色或实质性白色，则表明检测样品为阳性，存在PRRSV基因。
3.权利要求1所述荧光检测试剂盒在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂中的应用。
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Application publication date: 20211228

Assignee: Shenzhen Keyi Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: AGRICULTURAL GENOMICS INSTITUTE AT SHENZHEN, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2023980033884

Denomination of invention: A kit and method for rapid visual detection of PRRSV based on Cas12a protein

Granted publication date: 20220819

License type: Common License

Record date: 20230321

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