CN114231664A - 一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒rgnnv检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒rgnnv检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒RGNNV检测试剂盒及其检测方法，包括RGNNV引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；还包括在正向引物前段加上T7启动子序列，所述T7启动子序列如SEQ ID NO.3所示，得到添加了T7启动子序列的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示。本发明检测方法，包括以下步骤：S1.RGNNV病毒RNA的提取、病毒RNA逆转录、核酸扩增、体外转录；S2.CRISPR‑Cas13a检测体系的建立；S3.将待测样品RNA添加到步骤S2得到的混合物中；S4.检测荧光值。本发明检测方法特异性好、灵敏度高、重复性好,准确度高,可快速地检测RGNNV检测成本低,具有较高的应用价值和推广前景。

Description

一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒RGNNV检测试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及水产疾病监控及检测技术领域，具体涉及一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒RGNNV检测试剂盒及检测方法。
背景技术
赤点斑石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)是一种RNA病毒，这种病毒主要感染鱼类的中枢神经系统和视网膜神经系统，该病对鱼类养殖危害极大，可通过垂直传播和水平传播两种途径进行传播，每年的3～8月为发病高峰期，各种石斑鱼类均可感染此病，对仔鱼的致死率可达100％。病鱼表现出临床症状，包括游动行为异常和鱼体色变暗。不仅感染石斑鱼，还感染其他许多海洋经济鱼类，如黑鲈、海鲈等鱼类。
随着东南亚石斑鱼养殖技术的提高和养殖模式的不断创新，石斑鱼养殖业发展迅速。目前,石斑鱼养殖在中国的年产量达到10万吨以上,其中育苗约2.5亿尾,行业主要集中在海南、福建、广东等南方省份。但神经坏死病毒对石斑鱼鱼苗的致命打击长期以来一直是阻碍石斑鱼养殖业发展的绊脚石，严重影响了石斑鱼产业的发展。
关于RGNNV检测手段的研究报道相对较多。基于有无核酸扩增，可以分为三种检测方法。ELISA，原位杂交和分子信标属于无需核酸扩增的检测方法。ELISA是基于这种抗体捕获抗原的检测方法，但不足的是抗体的制备较为繁琐，难以真正推广；原位杂交利用DIG标记的探针与组织中的靶序列结合，从而进行定性及定量分析；分子信标实验利用分子信标与特异性靶序列结合，产生的信号通过光学仪器自动捕捉，通过信号强弱对结果进行判断。其无需扩增过程，缩短了检测时间，但无论是原位杂交还是分子信标试验，最后检测信号的强度取决于起始的模板量，因此，其检测灵敏度低于以核酸扩增为基础的检测方法的灵敏度。第二种是基于核酸扩增，主要包括RT-PCR、RT-qPCR、RPA和LAMP等。但是，传统PCR以及随后发展起来的实时荧光定量PCR等方法在用于动物疫病诊断时仍存在一定局限，如需要依赖昂贵的专业温控设备、所需时间相对较长、对实验室条件及操作人员的专业技能具有较高的要求等，不适合疾病现场快速诊断。因此，开发适用于在现场对病原进行快速检测的新方法十分必要。
近几年发展起来的CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats)规律成簇的间隔短回文重复是出色的基因组编辑工具,其层出不穷的科研进展及其应用更新给生物学界造成革命性风暴,这也给病毒检测方面带来了巨大的应用前景。Cas12a、Cas12b、Cas13a和Cas14等几种Cas核酸酶具有特殊的侧切活性，可以非特异性地切割附近的单链DNA或RNA分子，这是由特异结合引导RNA(gRNA，一种嵌合RNA，由目标匹配的crRNA和反式作用的tracrRNA组成，通过精确碱基配对，与CRISPR相关(Cas)蛋白复合物结合到同源DNA或RNA靶上。随着检测技术的不断发展,利用CRISPR-Casl3a检测方法的优越性也逐渐凸显出来。CRISPR-Cas13a检测平台开发成为了RNA病毒病的检测的一种新的策略。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒RGNNV检测试剂盒及检测方法。
本发明的技术方案为：
一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒RGNNV检测试剂盒，包括RGNNV引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ IDNO.2所示。SEQ ID NO.1为：5'-AATGGTGGGAAAGCAGAA-3'；SEQ ID NO.2为：5'-ATGATGGGAGCGGTAGTC-3'。
进一步的，所述引物组中，还包括在正向引物前段加上T7启动子序列，所述T7启动子序列如SEQ ID NO.3所示，得到添加了T7启动子序列的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示。SEQ ID NO.3为5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，SEQ ID NO.4为5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATGGTGGGAAAGCAGAA-3'。
进一步的，还包括，根据RGNNV基因序列选择高度保守区域基因的序列,设计crRNA，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.5所示。SEQ ID NO.5为：5'-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACACACACAGGAGUAUCAGCCG-3’。
进一步的，还包括，淬灭荧光报告分子RNA，所述淬灭荧光报告分子RNA的序列如SEQ ID NO.6所示，其中5’端修饰为FAM,3’端修饰为BHQ1。SEQ ID NO.6为5'-UUUUUU-3'。
进一步的，所述试剂盒中，包括纯化的Cas13a蛋白120nM、特异性crRNA250nM、淬灭荧光RNA报告分子500nM、和检测缓冲液的总体积20ul。
本发明还提供一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒RGNNV的检测方法，包括以下步骤：
S1.RGNNV病毒RNA的提取、病毒RNA逆转录、核酸扩增、体外转录；
S2.CRISPR-Cas13a检测体系的建立：包括即将纯化的Cas13a蛋白、设计的crRNA的序列、淬灭荧光报告分子RVA序列、检测缓冲液混合得到的混合物；
S3.将待测样品RNA添加到步骤S2得到的混合物中；
S4.检测荧光值：对步骤S3的混合物进行实时荧光检测，设置FAM通道检测程序，激发光波长450-490nm，发射光波长515-530nm，37摄氏度下孵育60分钟，每隔1分钟收集一次荧光值；
S5.结果判断：检测到发荧光表示样品含有RGNNV病毒，不发荧光表示样品中不含有RGNNV病毒。
本发明中，当待测样品中含有RGNNV病毒的RNA时,由crRNA序列可与指定的靶标RNA结合,CRISPR-Casl3a检测体系只需要微量级的样本就可以在1个小时内得出结果,所以与其它分子生物学基因诊断方法相比,具有特异、快速、准确、简便的特点。本发明的试剂盒，利用Casl3a附属活性,在该系统中引入淬灭荧光RNA报告分子,一般它不会发出荧光,但是体系中若含有靶标RNA，crRNA引导Cas l3a识别与靶标位置结合,并切割由crRNA序列互补的靶标RNA。同时激活Cas 13a的附属活性，即暴露的HEPN催化位点可切割体系中其他的非靶标的RNA,这时体系中的淬灭荧光RNA报告分子就会被切割,释放出荧光,表明此样本中含有RGNNV。该方法特异性高、灵敏度、重复性好，同时简单快速,具有较高的应用价值和推广前景。
与现有技术相比,本发明的有益效果为：
1)本发明检测方法特异性好、灵敏度高、重复性好,准确度高,可快速地检测RGNNV检测成本低,具有较高的应用价值和推广前景。
2)本发明检测方法设计了RGNNV特异性crRNA,可与RGNNV保守序列特异性形成互补双链,与其他病毒不存在交叉反应，提高了RGNNV检测的特异性。
3)本发明检测方法在体系中引入了淬火荧光RNA报告分子,利用Cas l3a的附属RNA酶活性，可以放大体系中的检测信号，且优化后检测体系中的灵敏度可达到100fM。
附图说明
图1为本发明实施例1中广东地区患RGNNV鱼样品检测结果图；
图2为本发明实施例2中福建地区患RGNNV鱼样品检测结果图；
图3为本发明实施例3中海南地区患RGNNV鱼样品检测结果图；
图4为本发明实施例1灵敏度检测数据结果图。
具体实施方式
本发明人以Cas13a为研究中心,,根据RGNNV基因序列RNA2编码衣壳蛋白(CP)的设计了一段特异性crRNA。用获得RGNNV的RNA验证了Cas 13a在体外也具有RNA酶切活性,可以特异的、准确的检测出RGNNV,在此基础上完成了发明。下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细叙述,给出的实施例阐明本发明的具体使用方法。
第一步:基于CRISPR-Cas13a的赤点斑石斑鱼神经坏死病毒RGNNV检测方法的引物设计；
(1)crRNA的设计：
根据RGNNV基因序列选择高度保守区域基因的序列,设计crRNA；
序列为:5'-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACACACACAGGAGUAUCAGCCG-3’。
(2)RGNNV引物设计：
根据RGNNV基因序列设计检测引物,在RGNNV的高度保守区设计一对特异性鉴定引物,并在正向引物前段加上T7启动子序列，引物序列为：
T7启动子序列：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；
正向引物F：5'-AATGGTGGGAAAGCAGAA-3'；
添加了T7启动子序列的正向引物
F1:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATGGTGGGAAAGCAGAA-3'；
反向引物R:5'-ATGATGGGAGCGGTAGTC-3',预期扩增片段大小为217bp。
(3)淬灭荧光RNA报告分子设计：
序列为:5'-UUUUUU-3',5’端修饰为FAM,3'端修饰为BHQ1。
第二步:RGNNV的RNA提取以及扩增；
1.病毒RNA的提取：
按照Takara公司的RNAiso plus说明书提取样品眼部或者脑部组织RNA。
a.加入与样品匹配的适量的RNAiso Plus，加入无RNA酶的磁珠充分匀浆。
b.将匀浆液转移至离心管中，室温(15-30℃)静置5分钟。
c.12,000g 4℃离心5分钟。小心吸取上清液,切勿吸取沉淀,移入新的离心管中。
d.向上述步骤c的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量),盖紧离心管盖,混合至溶液乳化呈乳白色。
e.室温静置5分钟。
f.12,000g 4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,即:无色的上清液(含RNA)中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相。
g.吸取上清液转移至另-新的离心管中，切勿吸出白色中间层。
h.向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后,室温下静置10分钟。
i.12,000g 4℃离心10分钟。一般在离心后,试管底部会出现RNA沉淀。
j.小心弃去上清,切勿触及沉淀,残留少量异丙醇没有关系。加入与RNAiso Plus等量75％乙醇,轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7,500xg 4℃离心5分钟后小心弃去上清，切勿触及沉淀。该步骤重复2次。
k.打开离心管盖,室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后,加入适量的RNase-free水溶解沉淀。
l.提取的RNA经分光光度计NanoDrop以确定其纯度，OD260/OD280的比值在1.7与2.1之间为合适范围，将其置于-80℃的环境中保存备用。
2.病毒RNA逆转录
使用TOYOBO公司逆转录试剂ReverTra Ace qPCR RT Kit，按照说明书将RNA逆转录为cDNA，将其置于-20℃的环境中保存备用。
a.把RNA在65℃条件下进行5分钟后，立即放于冰上冷却。
b.按下表配制反应体系:
Nuclease-free Water up to 10ul
5X RT Buffer 2ul
RT Enzyme Mix 0.5ul
Primer Mix 0.5ul
RNA 0.5pg-14ug
Total volume 10ul
c.逆转录反应在37℃条件下，进行15分钟的逆转录反应。在98℃条件下，进行5分钟的酶失活反应。反应结束之后,保存于-20℃条件下。
3.核酸扩增
使用第一步所设计带T7启动子序列用以扩增RGNNV片段的一对引物PCR扩增cDNA。
a.按下表配制反应PCR反应体系：
TaKaRa LA Taq 0.5ul
10xLA PCR Buffer II 5ul
dNTP Mixture 5ul
模板DNA 0.5ul
上游引物 0.5ul
下游引物 0.5ul
灭菌蒸馏水 38ul
b.仪器程序为
95℃，10min；
95℃，30s，56℃，30s，72℃，30s；共38个循环；
72℃，10min；
12℃，∞；
c.得到的pcr产物进行切胶回收。
4.体外转录：
使用Vazyme公司T7 High Yield RNA Transcription kit将PCR扩增后切胶回收得到的DNA，体外转录为RNA以达到扩增RNA的目的。
a.将除T7 RNA Polymerase Mix外的组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用。
b.根据体系配置溶液，DNA模板加入0.1-1ug:
10x Reaction Buffer 2ul
ATP Solution 2ul
GTP Solution 2ul
UTP Solution 2ul
CTP Solution 2ul
DNA模板 x ul
T7 RNA Polymerase Mix 2ul
RNase-free ddH<sub>2</sub>O Up to 20ul
c.用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，37℃孵育4h或更长时间，16h过夜反应不会影响产物。
d.在反应体系中加入1ul的DNaseⅠ,37℃孵育15min,消化转录的DNA模板。
第三步:CRISPR-Cas 13a检测体系的建立；
CRISPR-Cas13a检测体系由纯化的商用Cas13a蛋白120nM、特异性crRNA 250nM、淬灭荧光RNA报告分子500nM、和检测缓冲液组成。将上述组分(总体积20uL)加入200ul的pcr管中混匀后在CFX Connect real-time PC detection System(Bio-Rad,CA,USA)进行实时荧光检测，设置程序为37摄氏度下孵育60分钟，每隔1分钟收集一次荧光值，每个处理重复三次。
第四步:本发明方法特异性检测；
选取相似RNA病毒以及RGNNV扩增后样品做为检测的对象，加入无RNA酶H20作阴性对照,RGNNV的RNA做阳性对照,验证该方法的特异性。加入RGNNV的RNA组随着时间的增加荧光信号增强,而阴性对照以及其他组则无显著性差异。说明本发检测方法用于识别RGNNV病毒的crRNA具有良好的特异性。
第五步:本发明方法灵敏度的检测；
选取实施例1中已扩增后的RGNNV样品。按照10倍梯度稀释法稀释检测样本,设置7组标准品,每组3个复孔，评估本实验方法的灵敏度。证明本方法可检测到的RGNNV RNA浓度为100fM。检测数据结果图如图4所示。
实施例1
广东地区患病鱼样品，经过RGNNV的RNA提取以及扩增后，加入本发明的检测体系中进行检测，检测结果同PCR检测结果。荧光数据如图1所示。
实施例2
福建地区患病鱼样品，经过RGNNV的RNA提取以及扩增后，加入本发明的检测体系中进行检测，检测结果同PCR检测结果。荧光数据如图2所示。
实施例3
海南地区患病鱼样品，经过RGNNV的RNA提取以及扩增后，加入本发明的检测体系中进行检测，检测结果同PCR检测结果。荧光数据如图3所示。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过本领域任一现有技术实现。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒RGNNV检测试剂盒及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatggtggga aagcagaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgatgggag cggtagtc 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatacgact cactataggg 20
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taatacgact cactataggg aatggtggga aagcagaa 38
<210> 5
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac acacacagga guaucagccg 50
<210> 6
<211> 6
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uuuuuu 6

Claims (10)

1.一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒RGNNV检测试剂盒，其特征在于，包括RGNNV引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的RGNNV检测试剂盒，其特征在于，所述引物组中，还包括在正向引物前段加上T7启动子序列，所述T7启动子序列如SEQ ID NO.3所示，得到添加了T7启动子序列的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的RGNNV检测试剂盒，其特征在于，还包括，根据RGNNV基因序列选择高度保守区域基因的序列，设计crRNA，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求3所述的RGNNV检测试剂盒，其特征在于，还包括，淬灭荧光报告分子RNA，所述淬灭荧光报告分子RNA的序列如SEQ ID NO.6所示，其中5’端修饰为FAM,3’端修饰为BHQ1。
5.根据权利要求4所述的RGNNV检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，包括纯化的Cas13a蛋白120nM、特异性crRNA 250nM、淬灭荧光RNA报告分子500nM、和检测缓冲液的总体积20ul。
6.一种赤点斑石斑鱼神经坏死病毒RGNNV的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.RGNNV病毒RNA的提取、病毒RNA逆转录、核酸扩增、体外转录；
S2.CRISPR-Cas13a检测体系的建立：包括即将纯化的Cas13a蛋白、设计的crRNA的序列、淬灭荧光报告分子RVA序列、检测缓冲液混合得到的混合物；
S3.将待测样品RNA添加到步骤S2得到的混合物中；
S4.检测荧光值：对步骤S3的混合物进行实时荧光检测，设置FAM通道检测程序，激发光波长450-490nm，发射光波长515-530nm，37摄氏度下孵育60分钟，每隔1分钟收集一次荧光值；
S5.结果判断：检测到发荧光表示样品含有RGNNV病毒，不发荧光表示样品中不含有RGNNV病毒。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述RGNNV病毒RNA的提取的提取方法包括以下步骤：
a.加入与样品匹配的适量的RNAiso Plus，加入无RNA酶的磁珠充分匀浆；
b.将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟；
c.12,000g 4℃离心5分钟；小心吸取上清液,切勿吸取沉淀,移入新的离心管中；
d.向上述步骤c的匀浆裂解液中加入氯仿,盖紧离心管盖,混合至溶液乳化呈乳白色；
e.室温静置5分钟；
f.12,000g 4℃离心15分钟；从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,即:无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；
g.吸取上清液转移至另-新的离心管中；
h.向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后,室温下静置10分钟；
i.12,000g 4℃离心10分钟；一般在离心后,试管底部会出现RNA沉淀；
j.小心弃去上清,切勿触及沉淀,残留少量异丙醇没有关系；加入与RNAiso Plus等量75％乙醇,轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7,500xg 4℃离心5分钟后小心弃去上清，切勿触及沉淀；该步骤重复2次；
k.打开离心管盖,室温干燥沉淀；沉淀干燥后,加入适量的RNase-free水溶解沉淀；
l.提取的RNA经分光光度计NanoDrop以确定其纯度，OD260/OD280的比值在1.7与2.1之间为合适范围，将其置于-80℃的环境中保存备用。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述病毒RNA逆转录的方法包括以下步骤：把RNA在65℃条件下进行5分钟后，立即放于冰上冷却；按下表配制反应体系:
Nuclease-free Water up to 10ul 5X RT Buffer 2ul RT Enzyme Mix 0.5ul Primer Mix 0.5ul RNA 0.5pg-14ug
逆转录反应在37℃条件下，进行15分钟的逆转录反应。在98℃条件下，进行5分钟的酶失活反应。反应结束之后,保存于-20℃条件下。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述核酸扩增的方法包括以下步骤：
使用所设计带T7启动子序列用以扩增RGNNV片段的一对引物PCR扩增cDNA；按下表配制反应PCR反应体系：
TaKaRa LA Taq 0.5ul 10xLA PCR Buffer II 5ul dNTP Mixture 5ul 模板DNA 0.5ul 上游引物 0.5ul 下游引物 0.5ul 灭菌蒸馏水 38ul
设定仪器程序为：
95℃，10min；
95℃，30s，56℃，30s，72℃，30s；共38个循环；
72℃，10min；
12℃，∞；
得到的PCR产物进行切胶回收。
10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述体外转录的方法包括以下步骤：将除T7 RNA Polymerase Mix外的组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用；
根据体系配置溶液，DNA模板加入0.1-1ug:
10x Reaction Buffer 2ul ATP Solution 2ul GTP Solution 2ul UTP Solution 2ul CTP Solution 2ul DNA模板 x ul T7 RNA Polymerase Mix 2ul RNase-free ddH<sub>2</sub>O Up to 20ul
用移液器轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，37℃孵育4h或更长时间；在反应体系中加入1ul的DNaseⅠ,37℃孵15min,消化转录的DNA模板。
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