CN116287439A - 朱顶红褪绿环斑病毒rt-lamp检测引物、试剂盒及其应用和方法 - Google Patents

朱顶红褪绿环斑病毒rt-lamp检测引物、试剂盒及其应用和方法 Download PDF

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Abstract

本发明“朱顶红褪绿环斑病毒RT‑LAMP检测引物、试剂盒及其应用和方法”属于分子生物学技术领域。本发明的朱顶红褪绿环斑病毒RT‑LAMP检测引物组包括：序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的外引物对HCRV‑NP‑F3‑1和HCRV‑NP‑B3‑1；序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物对HCRV‑NP‑FIP‑1和HCRV‑NP‑BIP‑1；序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物对HCRV‑NP‑LF‑1和HCRV‑NP‑LB‑1。本发明的引物组检测HCRV的灵敏度是常规RT‑PCR的100倍。

Description

朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物、试剂盒及其应用和 方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物、试剂盒及其应用和方法。
背景技术
朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspotvirus，HCRV)是2013年首次在中国云南昆明朱顶红上发现并报道的布尼亚病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)新病毒。通过流行病学调查和寄主范围研究发现，HCRV的首要传播介体是细角带蓟马(Taeniothrips eucharii)[5],目前该病毒已在云南、福建、广西、广东、海南等中国南部省份广泛扩散，对辣椒(Capsicumannuum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、烟草(Nicotiana tabacum)等许多重要农作物和蜘蛛兰(Hymenocallis littoralis)、喜林芋(Philodendron schott)、朱顶红(Hippeastrum rutilum)、君子兰(Clivia miniata)、一点红(Emilia sonchifolia)等园艺作物造成严重损害，被HCRV侵染后的植株典型症状为：叶片局部褪绿、坏死斑、同心环纹、叶片畸形等。HCRV短短几年增加了十几种寄主，扩散到云南、福建、广西等多个省份，传播速度极快，严重危害园林植物和农作物[28]。HCRV易与其他Orthotospovirus病毒复合侵染，在寄主上的症状极为相似，仅凭肉眼难以判断。尚未培育出抗性品种，防治比较困难，危害潜力极大。
筛选无毒幼苗是预防HCRV大面积传播的主要方法之一，但寄主在病毒侵染早期并没有表现出明显的症状。目前检测HCRV的方法主要包括电子显微镜检测、血清学检测、DAS-ELISA检测、分子生物学RT-PCR检测。电子显微镜检测结果耗时长、操作繁琐，难以满足生产上快速、高效、准确检测病原的要求；ELISA检测需要制备高质量的病毒血清和特异性抗体，检测时间较长；PCR检测要求大量设备仪器,对实验操作要求严格，这些缺点大大限制了这些检测方法在实际生产中的推广应用，这些方法均不适用于实际生产。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年日本学者Notomi等人发明的针对靶基因的6个区域设计6条特异引物，在恒温条件利用一种DNA链置换聚合酶(Bst DNA polymerase)即可扩增靶基因的重要检测技术，实验仪器仅需一个水浴锅，反应完成后，加入荧光染料可直接观察结果。它具有检测速度快，灵敏度高，不需要专业设备的优点，已被广泛应用于农业、临床医学、畜牧业、水产渔业、食品等各种领域检测。
然而，Tian Z,Yang L,Qi X,et al.Visual LAMP method for the detection ofVibrio vulnificus in aquatic products and environmental water[J].BMCMicrobiol,2022,22(1):256.；Wang M,Tang Z,Liao M,et al.Loop-mediated isothermalamplification for detecting the Ile-2041-Asn mutation in fenoxaprop-P-ethyl-resistant Alopecurus aequalis[J].Pest Manag Sci,2022；张双纳.苹果褪绿叶斑病毒RT-LAMP检测技术研究及侵染性克隆载体构建[D].中国农业科学院,2018等现有技术表明：不同病原体RT-LAMP检测的最佳反应引物、温度、时间和dNTP浓度、甜菜碱浓度大不相同。是否能设计筛选合适的引物决定着RT-LAMP试验的成败。李敏于2019年发表的“柑橘鳞皮病毒RT-LAMP检测技术研究及其全基因组序列分析”([D].西南大学,2019)一文中明确指出，RT-LAMP引物筛选难度大，同时本领域公知，并不是任何一种已知的检测靶标都能设计得到适于RT-LAMP检测的反应引物，上述现有技术证明，在某种检测靶标未出现LAMP应用报道之前，将LAMP应用于检测该检测靶标、筛选得到适于该靶标检测的LAMP引物存在一定的技术障碍。
目前还没有关于LAMP应用于HCRV的报道，因此有必要开发一种有效且特异的一步法RT-LAMP来鉴定样品中的HCRV。
发明内容
基于本领域现有技术存在的上述缺陷和需要，本发明提供一种朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物、试剂盒及其应用和方法
本发明的技术内容如下：
朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的外引物对HCRV-NP-F3-1和HCRV-NP-B3-1；
序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物对HCRV-NP-FIP-1和HCRV-NP-BIP-1；
序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物对HCRV-NP-LF-1和HCRV-NP-LB-1。
朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括：朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组和RT-LAMP检测试剂；
所述朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组包括：
序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.1所示的外引物对HCRV-NP-F3-1和HCRV-NP-B3-1；
序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物对HCRV-NP-FIP-1和HCRV-NP-BIP-1；
序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物对HCRV-NP-LF-1和HCRV-NP-LB-1。
所述RT-LAMP检测试剂包括：Mg2+、dNTP、甜菜碱、DNA聚合酶、反转录酶、缓冲液。
所述RT-LAMP检测试剂还包括：无RNA酶水。
所述DNA聚合酶为Bst 2.0Warm
Figure BDA0003933977670000031
DNA Polymerase；所述反转录酶为M-MLVReverse Transcriptase。
所述甜菜碱的浓度为0.6～1.4mmol/μl优选0.8mmol/μl，所述dNTP的浓度为0.2～0.6mmol/μl优选0.2mmol/μl；所述Mg2+的浓度为2～8mmol/μl优选6mmol/μl。
所述内引物对和外引物对的浓度比为3～8:1优选5:1。
所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组、和/或，所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒在检测朱顶红褪绿环斑病毒方面的应用。
一种检测朱顶红褪绿环斑病毒的方法，其特征在于，采用所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组、或所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒对待测样品进行RT-LAMP。
所述RT-LAMP的反应温度为58～68℃优选64℃，反应时间为30-50min优选50min。
本发明在前期研究基础上根据HCRV NP基因的保守区域设计两批各五组引物进行筛选，研究、优化并集成HCRV的RT-LAMP检测体系(另一批未筛出所以未展示)。最终只筛选出第一组引物可进行稳定扩增且不出现假阳性，说明RT-LAMP引物筛选难度较大，与他人试验经验相同(李敏，2019)。反应时间优化中发现温度、时间到达稳定扩增点后变化不大。而在Mg2+浓度优化中发现，当Mg2+浓度到达10mmol/μl时，阴性对照出现荧光绿及梯状条带，说明Mg2+浓度应该控制在一定范围内，过高则会导致假阳性，与RT-LAMP在新冠病毒检测中降低Mg2+浓度以减少引物二聚体形成。
具体测定结果表明，该体系无需专门的仪器，直接以待测样品RNA为模板，仅需64℃恒温条件下一步反应50min即可完成检测；荧光染色结果与凝胶电泳检测结果一致，可通过肉眼观察直接判断结果，达到可视化标准。对11种常见病毒进行了RT-LAMP体系特异性检验，阳性结果仅出现在携带HCRV的样品中，说明建立的HCRV RT-LAMP检测体系具备良好的特异性；RNA梯度稀释检测结果显示HCRV RT-LAMP检测体系比传统的RT-PCR方法灵敏100倍，说明建立的HCRV RT-LAMP检测体系具有相对较好的灵敏度,这与RT-LAMP在苹果褪绿叶斑病毒中的结果一致；进一步验证了引物的可用性，同时说明所建立的HCRV RT-LAMP检测体系不仅节约了检测时间和成本，还具有较好的灵敏度和特异性。
本发明首次报道了将RT-LAMP检测方法应用于检测HCRV，该一步法快检体系准确、简便、高效、特异性强、灵敏度高、结果可视化，可应用于实验室和田间样品HCRV的快速准确检测，弥补了HCRV检测技术的不足，有利于后续推进HCRV的早期诊断防治及动态变化的深入研究。
附图说明
图1为本发明实验例2.1节的HCRV样品和CK的RT-PCR检测的电泳结果图，图中，M为2000bp DNA Marker；1-4泳道为HCRV样品；泳道5为NC(空白对照)。
图2为本发明实验例2.2节的HCRV RT-LAMP检测体系引物筛选的检测结果图，其中A图为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；B图为荧光可视化检测结果图；图中，M为2000bp DNAMarker；编号1、3、5、7、9分别指：HCRV RT-LAMP引物组1～5的检测结果；编号2、4、6、8、10均为NC(空白对照)。
图3为本发明实验例2.3节的HCRV RT-LAMP体系反应时间优化的检测结果图；其中A图为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；B图为荧光可视化检测结果图；图中，M为2000bp DNAMarker；编号1、3、5、7、9、11分别为30～80min的检测结果；编号2、4、6、8、10、12均为NC(空白对照)。
图4为本发明实验例2.4节的HCRV RT-LAMP体系反应温度优化的检测结果图；其中A图为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；B图为荧光可视化检测结果图；图中，M为2000bp DNAMarker；编号1、3、5、7、9、11分别为58～68℃的检测结果；编号2、4、6、8、10、12均为NC(空白对照)。
图5为本发明实验例2.5节的HCRV RT-LAMP体系甜菜碱浓度优化的检测结果图；其中A图为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；B图为荧光可视化检测结果图；图中，M为2000bp DNAMarker；编号1、3、5、7、9、11、13分别为0～1.6mmol/μl的检测结果；编号2、4、6、8、10、12、14均为NC(空白对照)。
图6为本发明实验例2.6节的HCRV RT-LAMP体系dNTPs浓度优化的检测结果图；其中A图为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；B图为荧光可视化检测结果图；图中，M为2000bp DNAMarker；编号1、3、5、7、9、11分别为0～1mmol/μl的检测结果；编号2、4、6、8、10、12均为NC(空白对照)。
图7为本发明实验例2.7节的HCRV RT-LAMP体系Mg2+浓度优化的检测结果图；其中A图为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；B图为荧光可视化检测结果图；图中，M为2000bp DNAMarker；编号1、3、5、7、9、11均为NC(空白对照)；编号2、4、6、8、10、12分别为0～10mmol/μl的检测结果。
图8为本发明实验例2.8节的HCRV RT-LAMP体系内外引物浓度比优化的检测结果图；其中A图为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；B图为荧光可视化检测结果图；图中，M为2000bpDNA Marker；编号1、3、5、7、9、11、13、15均为NC(空白对照)；编号2、4、6、8、10、12、14、16分别为内外引物比1:1～8:1的检测结果。
图9为本发明实验例2.9节的HCRV RT-LAMP体系灵敏度检测结果图；其中A图为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；B图为荧光可视化检测结果图；C图为RT-PCR检测电泳结果图；图中，M为2000bp DNA Marker；编号1为NC(空白对照)；编号2～9分别为RNA浓度梯度1～10-7。
图10为本发明实验例2.10节的HCRV RT-LAMP体系特异性检测结果图；其中A图为琼脂糖凝胶电泳检测结果图；B图为荧光可视化检测结果图；图中，M为2000bp DNA Marker；编号1为NC(空白对照)；编号2～9分别为HCRV、TMV、PVY、TSWV、TZSV、ChiVMV、ToBRFV、CMV、TVBMV的RNA。
具体实施方式
下面结合具体实施例、实验例对本发明的详细内容做进一步描述，但并不以此限制本发明的保护范围。
生物材料的来源
本发明实验例使用的朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspotvirus，HCRV)系发明人自发病的植物样品中分离获得，由申请人实验室保存，也可采用“云南不同地区蜘蛛兰上朱顶红褪绿环斑病毒RNA S序列分析”一文记载的朱顶红褪绿环斑病毒；
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)系发明人自发病的植物样品中分离获得，由申请人实验室保存，也可采用“链霉菌F01菌株对TMV的抗性及其发酵条件优化”一文记载的TMV；
马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)系发明人自发病的植物样品中分离获得，由申请人实验室保存，也可采用“植物诱抗剂AHO联合茎尖培养脱除马铃薯S病毒和马铃薯Y病毒”一文记载的马铃薯Y病毒；
番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)系发明人自发病的植物样品中分离获得，由申请人实验室保存，也可采用“侵染鸢尾的番茄斑萎病毒鉴定”一文记载的番茄斑萎病毒；
番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus，TZSV)系发明人自发病的植物样品中分离获得，由申请人实验室保存，也可采用“番茄环纹斑点病毒(TZSV)侵染对辣椒防御相关物质的影响”一文记载的番茄环纹斑点病毒(TZSV)；
南美红辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)系发明人自发病的植物样品中分离获得，由申请人实验室保存，也可采用“安徽烟区烟草蚜传病毒病的检测及病毒遗传多样性分析”一文记载的ChiVMV；
番茄褐色皱纹果病毒(Tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)系发明人自发病的植物样品中分离获得，由申请人实验室保存，也可采用“番茄褐色皱纹果病毒对中国番茄产业的潜在威胁及预防措施”一文记载的毒株；
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)系发明人自发病的植物样品中分离获得，由申请人实验室保存，也可采用“黄瓜花叶病毒为骨架的弱毒疫苗对烟草病毒病的室内及田间防治效果评价”一文记载的毒株；
烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)系发明人自发病的植物样品中分离获得，由申请人实验室保存，也可采用“衣壳蛋白调控烟草脉带花叶病毒细胞间移动的分子机制”一文记载的毒株。
从上述各病毒均为已报道的植物病害领域常见的病毒，从病毒所在的发病植株中分离、纯化得到各病毒是本领域技术人员熟知的常规技术手段，本领域技术人员可以从发病植株或自然界中分离获取上述各病毒，不存在技术障碍。
上述由申请人实验室保存的各病毒，申请人承诺自本发明申请日起20年向公众发放用于验证本发明的技术效果。
第1组实施例、本发明的LAMP引物组
本组实施例提供朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组，其包括：序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的外引物对HCRV-NP-F3-1和HCRV-NP-B3-1；序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物对HCRV-NP-FIP-1和HCRV-NP-BIP-1；序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的环引物对HCRV-NP-LF-1和HCRV-NP-LB-1。
任何利用、使用、销售、许诺销售、生产、制备、扩增、合成保藏编号为序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的外引物对HCRV-NP-F3-1和HCRV-NP-B3-1；序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物对HCRV-NP-FIP-1和HCRV-NP-BIP-1；序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的环引物对HCRV-NP-LF-1和HCRV-NP-LB-1的行为均落入本发明的保护范围。
本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合分子生物学领域、分子诊断领域、分子检测领域常用技术手段选择合适的检测试剂加以配制、组合，将本发明序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的外引物对HCRV-NP-F3-1和HCRV-NP-B3-1；序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物对HCRV-NP-FIP-1和HCRV-NP-BIP-1；序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物对HCRV-NP-LF-1和HCRV-NP-LB-1制成各种符合上述领域工艺生产要求的检测试剂产品，例如，检测试剂、试剂盒、试纸条等。
第2组实施例、本发明的试剂盒
本组实施例提供朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒。本组实施例都具备如下共同特征：所述试剂盒包括：朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组和RT-LAMP检测试剂；所述朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组包括：序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.1所示的外引物对HCRV-NP-F3-1和HCRV-NP-B3-1；序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物对HCRV-NP-FIP-1和HCRV-NP-BIP-1；序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物对HCRV-NP-LF-1和HCRV-NP-LB-1。
在具体的实施例中，所述RT-LAMP检测试剂包括：Mg2+、dNTP、甜菜碱、DNA聚合酶、反转录酶、缓冲液。
在进一步的实施例中，所述RT-LAMP检测试剂还包括：无RNA酶水。
在更具体的实施例中，所述DNA聚合酶为Bst 2.0Warm
Figure BDA0003933977670000081
DNA Polymerase；所述反转录酶为M-MLV Reverse Transcriptase。
在优选的实施例中，所述甜菜碱的浓度为0.6～1.4mmol/μl优选0.8mmol/μl，所述dNTP的浓度为0.2～0.6mmol/μl优选0.2mmol/μl；所述Mg2+的浓度为2～8mmol/μl优选6mmol/μl。
在另一些实施例中，所述内引物对和外引物对的浓度比为3～8:1优选5:1。
第3组实施例、本发明引物组或试剂盒的应用
本组实施例提供第1组实施例任一项所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组、和/或，第2组实施例任一项所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒在检测朱顶红褪绿环斑病毒方面的应用。
第4组实施例、本发明的检测方法
本组实施例提供一种检测朱顶红褪绿环斑病毒的方法。本组实施例都具备如下共同特征：采用第1组实施例任一项的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组、或第2组实施例任一项所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒对待测样品进行RT-LAMP。
在具体的实施例中，所述RT-LAMP的反应温度为58～68℃优选64℃，反应时间为30-50min优选50min。
实验例、本发明的具体实验操作及效果验证
1材料与方法
1.1病毒样品
本发明中使用的朱顶红褪绿环斑病(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、番茄环纹斑点病毒(Tomato zonatespot virus，TZSV)、南美红辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)、番茄褐色皱纹果病毒(Tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)等，均由本课题组从发病的植物样品中纯化保存，样本经RT-PCR检测确认含有单一病毒分离物后，储存在-80℃。选择在室温生长的健康脱毒烟草作为阴性对照(NC)。
1.2引物设计
将HCRV的N基因保守区域(GenBank序列登录号:JX833564.1)作为引物设计的参考序列。通过在线软件Primer Explorer 5.0(http://primerexplorer.jp/e/)设计5组引物，其中F3和B3为外引物，FIP(F1C+F2)和BIP(B1C+B2)为内引物，LF/LB为(环引物)，所有引物均用PAGE法纯化，并由成都生物公司合成(表1)。
表1.HCRV的RT-LAMP和RT-PCR特异性检测引物
Figure BDA0003933977670000091
Figure BDA0003933977670000101
1.3RNA提取
参照TRNzol Universal总RNA提取试剂说明书(北京天根)从新鲜叶组织中提取总RNA。用1.2％琼脂糖凝胶电泳测定RNA的质量，RNA样本在-80℃下保存备用。
1.4RT-PCR检测
以总RNA为模板，采用TaKaRa公司的PrimeScriptTMII 1st strand cDNASynthesis Kit反转录试剂盒，进行cDNA的合成。PCR检测以等体积cDNA为模板，HCRV-F/R引物进行cDNA的PCR扩增。得到的PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测分析。
1.5RT-LAMP引物筛选
用设计出的5组RT-LAMP引物(表1)对HCRV进行扩增，体系如下：参照Bst 2.0Warm
Figure BDA0003933977670000102
DNA Polymerase说明书(美国New England Biolabs公司)：10×Thermopol Buffer2.5μl、MgSO4(100mM)0.5μl、dNTP(10mM)0.5μl、Beatine 5μl(5mM)、FIP/BIP Primers(25×)2μl、F3/B3 Primers(25×)1μl、LoopF/B Primers(25×)1.5μl、Bst 2.0Warm/>
Figure BDA0003933977670000103
DNAPolymerase 0.5μl、M-MLV Reverse Transcriptase(1000)0.2μl、Total RNA 1μl、Nuclease-free Water补足至总体积25μl。每组引物均设置一个阴性对照，62℃恒温扩增60min，扩增产物加1000×SYBR Green I 1μl进行染色，显荧光绿为阳性，橙黄色为阴性。取扩增产物4μl进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测分析，呈现梯状为阳性，无条带为阴性。筛选出一组扩增效率高且不出现假阳性的引物。
1.6RT-LAMP体系优化
为确定最佳扩增条件，采用控制单一变量法，每个条件设置3次实验重复，对RT-LAMP体系条件进行逐一全面优化。每个变量分别设置梯度实验：反应温度58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃；反应时间30min、40min、50min、60min、70min、80min；甜菜碱浓度0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/μl；dNTPs浓度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/μl；Mg2+浓度0、2、4、6、8、10mmol/μl；内外引物浓度比1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1。每个梯度各设置一个阴性对照(NC),反应结束后取扩增产物4μl进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测分析。
1.7RT-LAMP与RT-PCR灵敏度比较
在最佳反应条件下，为了评估RT-LAMP与RT-PCR的灵敏度，将HCRV的RNA稀释10、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍。分别作为RT-LAMP和RT-PCR的模板，进行灵敏度比较测试。通过SYBR Green I染色和1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.8RT-LAMP特异性检验
在最佳反应条件下，通过使用HCRV、TMV、PVY、TSWV、TZSV、ChiMV、ToBRFV、CMV、TVBMV作为扩增的模板，分析检测的交叉反应性来评估RT-LAMP的特异性。通过SYBR GreenI染色和1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2结果与分析
2.1RT-PCR检测
使用HCRV-F/R引物扩增HCRV的RNA(图1)，结果显示：扩增出样品相关DNA片段，且无杂带，电泳检测结果与目的片段大小一致(432bp)。而NC并未扩增到目标条带，说明样品被HCRV成功侵染，而NC未被HCRV侵染，可进行后续实验。
2.2引物筛选
根据琼脂糖凝胶电泳检测结果(图2A)，第一组引物扩增出明亮条带且未出现假阳性，第二、四、五组引物扩增出现假阳性，第三组引物未扩增出条带且NC出现假阳性，荧光检测与凝胶电泳检测结果一致(图2B)。所以选定第一组引物为最佳引物以进行后续优化实验。
2.3反应时间优化
反应时间优化结果表明，用第一组引物扩增时，30min开始出现较淡的梯状条带,50min开始出现明亮的梯状条带(图3A)，荧光检测与凝胶电泳检测结果一致(图3B)，所有NC未出现假阳性，结合高效性考虑，选择最佳反应时间为50min。
2.4反应温度优化
酶的活性在很大程度上受到温度的限制,因此必须优化反应温度。反应温度优化结果表明,扩增温度为58～68℃均有梯状条带产生，NC均未出现假阳性。但扩增温度为58～62℃时梯状条带较淡，扩增温度为64～68℃时梯状条带较明亮(图4A),荧光检测与凝胶电泳检测结果一致(图4B),结合实用性考虑，选择最佳反应温度为64℃。
2.5甜菜碱浓度优化
甜菜碱浓度优化结果表明，甜菜碱浓度为0mmol/μl时梯状条带较弱，从0.6～1.2mmol/μl梯状条带亮度逐渐增强，从1.4mmol/μl开始梯状条带亮度减弱，NC均未出现假阳性(图5A),荧光检测与凝胶电泳检测结果一致(图5B)。结合降低检测成本考虑，选择最佳甜菜碱浓度0.8mmol/μl。
2.6dNTPs浓度优化
dNTPs浓度优化结果表明，dNTP浓度为0mmol/μl时没有梯状条带产生，从0.2～0.6mmol/μl梯状条带较为明亮，0.8mmol/μl开始梯状条带消失。阴性对照均未出现假阳性(图6A),荧光检测与凝胶电泳检测结果一致(图6B)。结合降低检测成本考虑，选择最佳dNTPs浓度为0.2mmol/μl。
2.7Mg2+浓度优化
Mg2+浓度优化结果表明，Mg2+浓度为0mmol/μl时没有梯状条带产生，从2～8mmol/μl梯状条带亮度逐渐增强，10mmol/μl开始阴性对照出现假阳性(图7A)，荧光检测与凝胶电泳检测结果一致(图7B)。结合降低检测成本及避免假阳性考虑，选择最佳Mg2+浓度为6mmol/μl。
2.8内外引物浓度比优化
内外引物浓度比优化结果表明，内外引物浓度比为1～2:1时没有梯状条带产生，3～8:1梯状条带亮度逐渐增强，阴性对照均未出现假阳性(图8A),荧光检测与凝胶电泳检测结果一致(图8B)。结合降低检测成本考虑，选择最佳内外引物浓度比为5:1。
2.9灵敏度试验
灵敏度试验结果表明，在1～10-6稀释的模板下，RT-LAMP可以扩增出梯状条带，随着稀释梯度的增加，条带变弱,10-7时梯状条带消失,即RT-LAMP的检测限为10-6(图9A),荧光检测与凝胶电泳检测结果一致(图9B)。而RT-PCR可以在1～10-4稀释的模板下随着稀释梯度的增加，条带变弱,10-5时条带消失,即RT-PCR的检测限为10-4(图9C)。因此，本发明建立的RT-LAMP检测体系比传统的RT-PCR方法灵敏100倍。
2.10特异性检测
灵敏度试验结果表明，该RT-LAMP体系从HCRV中扩增出梯状条带，而在其他病毒(TMV、PVY、TSWV、TZSV、ChiVMV、ToBRFV、CMV、TVBMV)中，未扩增出条带(图10A),荧光检测与凝胶电泳检测结果一致(图10B)。表明建立的RT-LAMP体系具有良好的特异性。
3结论
本发明根据HCRV的N基因保守序列，设置了5组RT-LAMP引物，筛选出最佳引物组HCRV-NP-1,采用控制单一变量法，每个变量分别设置梯度实验及3次实验重复,对RT-LAMP体系条件进行逐一全面优化，优化后最终体系：10×Isothermal Aplification Buffer2.5μl、MgSO4(100mM)1.5μl终浓度6mM、dNTP Mix(10mM)1.5μl终浓度0.6mM、FIP/BIPPrimer(10×)2.5μl终浓度0.1mM、F3/B3 Primer(10×)0.5μl终浓度0.2mM、LF/LB Primer(10×)1.5μl终浓度0.6mM、甜菜碱(5mM)4μl终浓度0.8mM、Bst 2.0WarmStar DNAPolymerase(8000u/ml)0.5μl终浓度0.16u/μl、M-MLV Reverse Transcriptase(10000u/ml)0.2μl终浓度0.08u/μl、RNA 1μl、DEPC H2O 4.8μl。最佳反应温度为64℃，最佳反应时间为50min，灵敏度为普通RT-PCR的100倍。在最佳反应条件下，通过使用HCRV、TMV、PVY、TSWV、TZSV、ChiMV、ToBRFV、CMV、TVBMV作为扩增的模板，分析检测的交叉反应性来评估RT-LAMP的特异性，结果表明建立的HCRV RT-LAMP体系具有良好的特异性。

Claims (10)

1.朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的外引物对HCRV-NP-F3-1和HCRV-NP-B3-1；
序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物对HCRV-NP-FIP-1和HCRV-NP-BIP-1；
序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物对HCRV-NP-LF-1和HCRV-NP-LB-1。
2.朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括：朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组和RT-LAMP检测试剂；
所述朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组包括：
序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.1所示的外引物对HCRV-NP-F3-1和HCRV-NP-B3-1；
序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的内引物对HCRV-NP-FIP-1和HCRV-NP-BIP-1；
序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物对HCRV-NP-LF-1和HCRV-NP-LB-1。
3.根据权利要求2所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP检测试剂包括：Mg2+、dNTP、甜菜碱、DNA聚合酶、反转录酶、缓冲液。
4.根据权利要求3所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP检测试剂还包括：无RNA酶水。
5.根据权利要求3所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst 2.0Warm
Figure FDA0003933977660000011
DNA Polymerase；所述反转录酶为M-MLV ReverseTranscriptase。
6.根据权利要求3所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述甜菜碱的浓度为0.6～1.4mmol/μl优选0.8mmol/μl，所述dNTP的浓度为0.2～0.6mmol/μl优选0.2mmol/μl；所述Mg2+的浓度为2～8mmol/μl优选6mmol/μl。
7.根据权利要求2所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述内引物对和外引物对的浓度比为3～8:1优选5:1。
8.权利要求1所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组、和/或，权利要求2-7任一所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒在检测朱顶红褪绿环斑病毒方面的应用。
9.一种检测朱顶红褪绿环斑病毒的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测引物组、或权利要求2-7任一所述的朱顶红褪绿环斑病毒RT-LAMP检测试剂盒对待测样品进行RT-LAMP。
10.根据权利要求9所述的一种检测朱顶红褪绿环斑病毒的方法，其特征在于，所述RT-LAMP的反应温度为58～68℃优选64℃，反应时间为30-50min优选50min。
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