CN109971889B

CN109971889B - 玉米黄花叶病毒的rt-lamp检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109971889B
Application number: CN201910302612.9A
Authority: CN
Inventors: 王建光; 胡文丽; 陈穗云; 李小琴; 章彬
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2039-04-16
Also published as: CN109971889A

Abstract

本发明公开了玉米黄花叶病毒的RT‑LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，还包括RT‑LAMP反应液，RT‑LAMP反应液和特异性RT‑LAMP引物组的混合液组成RT‑LAMP检测体系，该试剂盒可简单、快捷地检测出玉米黄花叶病毒，克服了病毒检测对仪器依赖性较强的局限性。该试剂盒可用于玉米、高粱的玉米黄花叶病毒检测。此外本发明还公开了使用该检测试剂盒检测玉米黄花叶病毒的检测方法，该方法可简便、快捷地从玉米中监测处玉米样品是否收到玉米黄花叶病毒的侵染，提高检测效率。

Description

玉米黄花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和病毒学技术领域，具体涉及玉米黄花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及其应用。

背景技术

玉米黄化花叶病毒(Maize yellow mosaic virus,MaYMV)是2015年在中国云南、贵州发现并命名的一个新病毒。该病毒侵染玉米后表现为植株黄化、花叶症状。全基因组序列分析表明，该病毒属于黄症病毒科(Family Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(GenusPolerovirus)病毒，与玉米黄矮病毒-RMV(Maize yellow dwarf virus-RMV)同源性最高，其同源性高达73％。在电镜下该病毒粒子为等轴二十面体，无包膜。2017年，在南美洲的玉米和非洲的玉米、甘蔗(Saccharumspp)和筒轴草(Rottboelliacochinchinensis)上也相继检测到该病毒。说明该病毒可能在全世界玉米和甘蔗种植区广泛分布，对玉米生产形成潜在危胁。

目前，对MaYMV的检测主要采用的是电镜观察法和RT-PCR方法，但这些检测方法需要昂贵的仪器及复杂、繁琐的操作。环介导恒温核酸扩增技术(Loop-madiated isothermalamplication,LAMP)是Notomi等2000年发明的一种新型的DNA扩增技术，2003年Fukuta等首次利用RT-LAMP检测了日本薯蓣花叶病毒(Japanese yam mosaic viruys,JYMV)，该检测结果可直通过核酸染料SYBR GreenⅠ、羟基萘酚蓝(HNB)或钙黄绿素(Calcein)的颜色变化来直接判定检测结果。

我国是一个农业大国，而云南作为传统的农业大省，农作物的收益占据很大一部分比例，研究出可有效防治极易感染玉米、高粱等农作物的玉米黄花叶病毒的生物农药对于保证农民的收入具有重大的价值。然而，目前市面上仍然缺少一种低廉的、可快速地检测出玉米黄花叶病毒的检测试剂以及检测方法以供科研单位和检测机构使用，方便科研单位快速提取该病毒并快速检测出样品中是否受到该病毒的侵染，以便指定进一步的预防措施。

发明内容

本发明为了解决上述问题，设计了检测玉米黄花叶病毒的特异性RT-LAMP引物组及包含该引物组的玉米黄花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒，通过该试剂盒可简单、快捷地检测出玉米黄花叶病毒，克服了病毒检测对仪器依赖性较强的局限性。

一种检测玉米黄花叶病毒的特异性RT-LAMP引物组，其特征在于，包括：

正向外引物F3：

5’-CAAATCCGCGTCGAGGAC-3’；

反向外引物B3：

5’-CCACTGAATGCTGCACACT-3’；

正向内引物FIP：

5’-GCGAGCCTCGTCTGACTCCATTTTTCGAAGACGAAGACGACCAA-3’；

反向内引物BIP：

5’-TTCAAAGGACTCTCTCACGGGCTTTTCTGATAAAGACGGCCCGAAG-3’。

一种包含上述引物组的玉米黄花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒，还包括RT-LAMP反应液，RT-LAMP反应液和特异性RT-LAMP引物组的混合液组成RT-LAMP检测体系，20μL RT-LAMP检测体系包括以下溶液：

(1)4μL溶液A：5×LAMP反应液：10.0mM Tris-HCl，5.0mM(NH4)₂SO₄，25.0mM KCl，5.0-10mM MgSO₄，0.05％吐温20，1.4mM dNTPs，0.5U/μL逆转录酶AMV RTtase，0.5U/μL热启动等温扩增酶；

(2)4μL溶液B：5×引物混合液包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；其中，外引物和内引物的浓度之比为1:3～1：10；

(3)11μL溶液C：去除核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的超纯水；

(4)1μL样品总RNA。

其中，RT-LAMP检测体系中外引物F3、B3的浓度均为0.2μM，内引物FIP、BIP的浓度均为0.6-2.0μM。

玉米黄花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒可用于玉米、高粱的玉米黄花叶病毒检测。

本发明了还提供了使用该检测试剂盒检测玉米黄花叶病毒的检测方法：

一种玉米黄花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测样品总RNA作为反应模板；

2)配制RT-LAMP检测体系：

按总反应体积为20μL为例，4μL溶液A：5×LAMP反应液：10.0mM Tris-HCl，5.0mM(NH₄)₂SO₄，25.0mM KCl，5.0-10mM MgSO₄，0.05％吐温20，1.4mM dNTPs，0.5U/μL逆转录酶AMV RTtase，0.5U/μL热启动等温扩增酶；4μL溶液B：5×引物混合液包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；其中，外引物和内引物的浓度之比为1:3～10；11μL溶液C：去除核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的超纯水；1μL样品总RNA；

3)取1μL步骤1)提取的样品总RNA加入到步骤2)配制RT-LAMP检测体系中，混匀，在63-65℃恒温进行RT-LAMP反应，反应60min，80℃Bst失活10min；

4)结果诊断：将2μL步骤3)扩增后的反应液电泳检测或加入绿色荧光染料显色，电泳检测有梯子状条带或紫外灯下加入绿色荧光染料显色为绿色荧光的样品表示含有玉米黄花叶病毒；无条带或紫外灯下不显色，判断为不含有玉米黄花叶病毒。

玉米黄花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法可用于玉米、高粱的检测。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过生物信息学分析筛选到能快速、稳定的检测玉米黄化花叶病毒的特异性RT-LAMP引物组，该引物组根据13个玉米黄花花叶病毒分离物外壳蛋白(Coatprotien,cp)基因序列的保守区域设计了用于RT-LAMP检测方法的2对特异性引物，利用Trizol法、市售RNA提取试剂盒或粗提RNA作为模板，建立了玉米黄化花叶病毒的RT-LAMP检测方法。本发明利用2对特异性引物，分别识别玉米黄化花叶病毒的cp基因的6个区域，具有很强的特异性；用时少，适合快速检测。

(2)本发明对设计的特异性RT-LAMP引物组的引物反应的时间、温度、各反应组份试剂浓度等进行了优化，得到最合适的反应条件；依据该引物组制备得到检测玉米黄化花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒并提供了该试剂盒的检测方法，该方法具有简单、便捷、高效，试剂盒的灵敏度高等特点，成本更低且克服了病毒检测对仪器依赖性较强的局限。

(3)本发明的反应体系只需要在62-64℃恒温下进行1小时就可完成，且扩增产物量较大。相比较RT-PCR需先反转录再变温扩增，用时少，简便，降低了二次扩增出现的污染率，结果更可靠。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1中用于筛选特异性RT-LAMP引物组的MaYMV保守序列；

图2是本发明dNTPs浓度优化梯度RT-LAMP扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果对比图。图中的M：2000bp DNA Marker；1：0.2mM dNTPs；2：0.6mM dNTPs；3：1.0mM dNTPs；4：1.4mMdNTPs；5：1.8mM dNTPs。

图3是本发明Mg²⁺浓度优化梯度RT-LAMP扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果对比图。图中的M：2000bp DNA Marker；1：2mM；2：4mM；3：6mM；4：8mM；5：10mM。

图4是本发明时间梯度优化RT-LAMP扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果对比图。图中的M：2000bp DNA Marker；1：60℃；2：61℃；3：62℃；4：63℃；5：64℃。

图5是本发明时间梯度优化RT-LAMP扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果对比图。图中的M：2000bp DNA Marker；1：30min；2：50min；3：60min；4：70min；5：90min。

图6是本发明甜菜碱浓度优化梯度RT-LAMP扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果对比图。图中的M：2000bp DNA Marker；1：0mM；2：0.4mM；3：0.8mM；4：1.2mM；5：1.6mM。

图7是本发明引物比优化RT-LAMP扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果对比图。图中的M：5000bp DNA Marker；1.1:4；2.1:5；3.1:6；4.1:7；5.1:8。

图8是本发明RT-LAMP和RT-PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果对比图，A:RT-LAMP检测；B:RT-PCR检测。图中M：1000bp DNA Marker；1：10ng/μL；2：10^-1ng/μL；3：10^-2ng/μL；4：10^-3ng/μL；5：10^-4ng/μL；6：10^-5ng/μL；7：10^-6ng/μL；8：10^-7ng/μL。

图9是本发明大田样品Trizol法提取的RNA进行的RT-LAMP检测结果对比图。a图为RT-LAMP扩增琼脂糖凝胶电泳检测，b图为加入SYBR Green I反应后在白光下的颜色变化，c图为加入SYBR Green I反应后在紫外光下的颜色变化。图中M:1000bp DNA Marker；1-7:大田样品；8:空白对照；9:阳性对照；10:健康玉米。

图10是本发明大田样品粗提RNART-LAMP检测结果对比图。a图为RT-LAMP扩增琼脂糖凝胶电泳检测，b图为加入SYBR Green I反应后在白光下的颜色变化，c图为加入SYBRGreenI反应后在紫外光下的颜色变化。图中M：1000bp DNA Marker；1-7：大田样品；8：空白对照；9：阳性对照；10：健康玉米。

具体实施例

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)玉米黄化花叶病毒的特异性RT-LAMP引物组的设计、筛选和优化过程如下：

根据GenBank上报道的玉米黄化花叶病毒(MaYMV)cp基因(所选用序列截止时间为2018年8月1日)，利用DNAMAN8.0进行序列比对分析，选取保守区域(图1)，利用在线引物设计软件PrimerExplore rV4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物，最后选取以下引物组(表1)。

表1 MaYMV RT-LAMP检测引物

(2)以总反应体积为10μL为例配制玉米黄化花叶病毒RT-LAMP检测反应体系，该检测反应体系包括：

1μL 10×ThermoPol Buffer；MgSO₄(100mM)0.52μL；dNTPs(10mM)1.4μL；FIP引物(10mM)1.2μL，BIP引物(10mM)1.2μL；F3引物(10mM)0.2μL，B3引物(10mM)0.2μL；大片段BstDNA聚合酶(8U/μL)0.4μL；M-MLV逆转录酶(200U/μL)0.5μL；DEPC H₂O 2.38μL。

(3)玉米黄花叶病毒的RT-LAMP快速检测的步骤包括：

步骤1.提取待测样品的总RNA作为反应模板。

步骤2.将1μL总RNA加入实施例2配置好的反应体系中，混匀，在64℃恒温水浴锅中进行RT-LAMP反应，反应60min，80℃Bst失活10min。

步骤3.结果诊断：

将5μL步骤2扩增的反应液在1％琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，150V电压下30min电泳检测或在恒温反应前在PCR管盖加入SYBR Green I，反应后用力混匀。电泳检测有瀑布状条带或在白光下橙色变为绿色(在紫外灯照射下绿色荧光加强)的样品表示含有玉米黄化花叶病毒，无条带或白光下颜色没有变化，即不含有玉米黄化花叶病毒。

实施例2

本实施例通过试验进一步确定MaYMV RT-LAMP反应最佳dNT Ps浓度，如下：

其它各反应条件同实施例1，本实施例中设置了不同的dNTPs浓度(0.2mM；0.6mM；1.0mM；1.4mM；1.8mM)(反应液终浓度)，由图2可知，在1.4mM的dNTPs的浓度时，有明显的梯形瀑布状条带，其他浓度下条带不明显。说明在RT-LAMP反应体系中1.4mM的dNTPs是最佳的浓度。

实施例3

本实施例通过试验进一步确定MaYMV RT-LAMP反应最佳Mg 2+浓度，如下：

在dNTPs浓度为1.4mM时，设置不同的Mg²⁺浓度(2mM；4mM；6mM；8mM；10mM)(反应液终浓度)，其他条件与实施例1相同。扩增结果由图3可知，在Mg²⁺终浓度为6-8mM时，有明显的梯形瀑布状条带，说明能特异性检测到玉米黄化花叶病毒。

实施例4

本实施例通过试验进一步确定MaYMV RT-LAMP最佳反应温度，如下：

反应体系中dNTPs浓度为1.4mM，Mg²⁺浓度为6mM，设置60℃，61℃，62℃，63℃和64℃不同的反应温度，其它反应条件不变。由图4可知，62℃，63℃和64℃能扩增出条带，说明在62℃-64℃时能特异性检测到玉米黄化花叶病毒。

实施例5

本实施例通过试验进一步确定MaYMV RT-LAMP最佳反应时间，如下：

反应体系中dNTPs浓度为1.4mM，Mg²⁺浓度为6mM，反应温度为64℃，设置不同的反应时间(30min，50min，60min，70min和90min)，由图5可知，在扩增时间大于50min时都能扩增出条带，说明当扩增时间大于50min时都能特异性检测到玉米黄化花叶病毒。

实施例6

本实施例通过试验进一步确定甜菜碱在MaYMV RT-LAMP检测体系中的效果，如下：

反应体系中dNTPs浓度为1.4mM，Mg²⁺浓度为6mM，反应温度为64℃，反应时间60min，设置不同浓度的甜菜碱(0mM，0.4mM，0.8mM，1.2mM，1.6mM)(反应液终浓度)，由图6可知不同的甜菜碱浓度对扩增效果没有明显的影响。

实施例7

本实施例通过试验进一步确定反应的引物比例对检测效果的影响，如下：

反应体系中dNTPs浓度为1.4mM，Mg²⁺浓度为6mM，反应温度为64℃，反应时间50min，不添加甜菜碱，设置不同的引物比，即F3，B3与FIP，BIP之间的比例(1:4；1:5；1:6；1:7；1:8)，由图7可知当引物比为1:4，1:5或1:6时扩增出梯形瀑布状条带较好。

实施例8

本实施例对RT-LAMP和RT-PCR检测灵敏度比较，如下：

利用以上实施例中优化好的浓度检测RT-LAMP的灵敏性，利用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定总RNA浓度，将RNA浓度调至100ng/μL作为原液，依次梯度稀释10倍作为反应模板，稀释后的浓度分别为：10ng/μL，10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^-4ng/μL，10^- ⁵ng/μL，10^-6ng/μL，10^-7ng/μL。将这些浓度分别作为模板同时进行RT-LAMP和RT-PCR扩增，检测结果如图8所示，在模板浓度为10^-4ng/μL时RT-LAMP仍有明显的瀑布条带，而RT-PCR检测，当浓度小于10^-2ng/μL时几乎观察不到特异性的条带，RT-LAMP的检测灵敏度明显RT-PCR检测灵敏度更高。

本实施例中利用MaYMV序列(登录号：KY684356.1)设计的RT-PCR特异性检测引物：

上游引物F3：5’-CAAATCCGCGTCGAGGAC-3’；

下游引物B3：5’-CCACTGAATGCTGCACACT-3’，扩增产物大小为181bp。

实施例9

本实施例通过试验进一步验证采用上述实施例优化后得到的玉米黄花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒的检测有效性，如下：

玉米黄化花叶病毒RT-LAMP检测反应体系如下：

利用Trizol法提取各采集样本的总RNA，在反应前加入1μL SYBR Green I在PCR管的盖子顶部，反应完成后把SYBR Green I与反应液混匀。由图9可知，4号样品反应后在白光下显示绿色，在紫外灯下绿色荧光增强。电泳后在阳性玉米样品能够明显的扩增出梯形条带。

实施10

本实施例通过试验进一步验证采用上述实施例优化后得到的玉米黄花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒的检测特异性，如下：

使用RNA粗提液作为模板进行RT-LAMP反应，粗提液的制备方法：100mg的玉米样品加入400μL的0.5M NaOH研磨至匀浆。10μL的匀浆被快速用490μL的100mM的Tris-CL缓冲液(pH8)稀释。

此实施例中所使用的样品与实施例9中相对应。由图10可知，4号样品反应后在白光下显示绿色，在紫外灯下荧光增强；电泳后阳性玉米样品能够明显的扩增出梯形条带。

Claims

1.一种检测玉米黄花叶病毒的特异性RT-LAMP引物组，其特征在于，包括：

正向外引物F3：

5’-CAAATCCGCGTCGAGGAC-3’；

反向外引物B3：

5’-CCACTGAATGCTGCACACT-3’；

正向内引物FIP：

5’-GCGAGCCTCGTCTGACTCCATTTTTCGAAGACGAAGACGACCAA-3’；

反向内引物BIP：

5’-TTCAAAGGACTCTCTCACGGGCTTTTCTGATAAAGACGGCCCGAAG-3’。

2.一种含有权利要求1所述的引物组的检测试剂。

3.一种含有权利要求1所述的引物组的玉米黄花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包含RT-LAMP反应液，RT-LAMP反应液和特异性RT-LAMP引物组的混合液组成RT-LAMP检测体系，20μL RT-LAMP检测体系包括以下溶液：

(1)4μL溶液A：

5×LAMP反应液：10.0mM Tris-HCl，5.0mM(NH4)2SO4，25.0mM KCl，5.0-10mM MgSO4，0.05％吐温20，5.0mM dNTPs，0.5U/μL逆转录酶AMV RTtase，0.5U/μL热启动等温扩增酶；

(2)4μL溶液B：

5×引物混合液包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；

(3)11μL溶液C：

去除核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的超纯水；

(4)1μL样品总RNA。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的4μL溶液B中，外引物与内引物的浓度之比为1:3～1:10。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP检测体系中外引物F3、B3的浓度均为0.2μM，内引物FIP、BIP的浓度均为0.6-2.0μM。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒在玉米、高粱的玉米黄花叶病毒检测中的应用。

8.一种玉米黄花叶病毒的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测样品总RNA作为反应模板；

2)配制RT-LAMP检测体系：

按总反应体积为20μL为例，4μL溶液A：5×LAMP反应液：10.0mM Tris-HCl，5.0mM(NH4)2SO4，25.0mM KCl，5.0-10mM MgSO4，0.05％吐温20，1.4mM dNTPs，0.5U/μL逆转录酶AMVRTtase，0.5U/μL热启动等温扩增酶；4μL溶液B：5×引物混合液包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP如权利要求1所述；其中，外引物和内引物的浓度之比为1:3～10；11μL溶液C：去除核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的超纯水；1μL样品总RNA；

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于该检测方法在玉米、高粱的玉米黄花叶病毒检测中的应用。