CN116676423B - 一种apv1检测引物组及应用 - Google Patents
一种apv1检测引物组及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116676423B CN116676423B CN202310776298.4A CN202310776298A CN116676423B CN 116676423 B CN116676423 B CN 116676423B CN 202310776298 A CN202310776298 A CN 202310776298A CN 116676423 B CN116676423 B CN 116676423B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- apv1
- reaction
- lamp
- primer
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 241001043388 Asian prunus virus 1 Species 0.000 title claims abstract description 27
- 244000080767 Areca catechu Species 0.000 claims abstract description 48
- 235000006226 Areca catechu Nutrition 0.000 claims abstract description 47
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 30
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 24
- 240000008154 Piper betle Species 0.000 claims abstract description 18
- 235000008180 Piper betle Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 15
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims description 14
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical group CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 claims description 11
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 10
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 9
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 8
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 7
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 7
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 7
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 7
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 7
- 241001455595 Sorghum mosaic virus Species 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 5
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 4
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 4
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241000233788 Arecaceae Species 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101710151833 Movement protein TGBp3 Proteins 0.000 description 2
- 238000012339 Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 2
- 241000973027 Closteroviridae Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101000636168 Grapevine leafroll-associated virus 3 (isolate United States/NY1) Movement protein p5 Proteins 0.000 description 1
- 101001113903 Grapevine leafroll-associated virus 3 (isolate United States/NY1) Protein P4 Proteins 0.000 description 1
- 101710092268 Heat shock protein 70 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000839464 Leishmania braziliensis Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710163458 Movement protein Hsp70h Proteins 0.000 description 1
- 101800004803 Papain-like protease Proteins 0.000 description 1
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 1
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 241000867909 Securinega Species 0.000 description 1
- 241000439034 Velarivirus Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物检测领域，具体涉及APV1检测引物组及应用。一组引物，包括两条外引物APV1‑F3和APV1‑B3，两条内引物APV1‑FIP和APV1‑BIP。本发明针对槟榔隐症病毒1型基因设计一套RT‑LAMP反应试剂盒，然后利用试剂盒进行RT‑LAMP扩增反应，通过肉眼观察反应液颜色或电泳分析是否出现梯形条带来判断待测样品中是否含有槟榔隐症病毒1型。本发明具有特异性强、灵敏度高、操作简便、不需要高端仪器、检测周期短和检测结果可视化的特点，非常适用于基层实验室和田间快速检测诊断，及时监测槟榔发病情况，具有良好的商业推广与应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及了生物检测领域，具体涉及一种APV1检测引物组及应用。
背景技术
槟榔（Areca catechu L.）属棕榈科（Palmae）多年生常绿乔木，主要生长在热带和亚热带地区，在我国，槟榔种植主要分布在海南、台湾和云南等地，其中海南省槟榔种植面积占到95%以上。槟榔作为珍贵的南药资源，经济价值颇高，槟榔种植业的迅猛发展为当地农民增收和乡村振兴作出了重要贡献，已经成为南方部分省份重要的支柱产业。然而，槟榔病虫害特别是槟榔黄化病是影响槟榔生长和产量的重要因素之一，槟榔隐症病毒1型（Areca palm velarivirus 1, APV1）是造成槟榔黄化现象的病害因子之一，由APV1引起的槟榔病毒病发生普遍，发生率为75%左右，部分槟榔园发病率甚至达到100%，严重影响了槟榔产业的发展。因此，对于槟榔隐症病毒1型的鉴定及预防具有非常重要的意义。
槟榔隐症病毒1型（APV1）是长线形病毒科（Closteroviridae）新成员，基因组全长约16~17kb，编码papain-like蛋白酶（L-PRO）、RNA甲基转移酶（MTR）、RNA解旋酶（HEL）、核糖核酸依赖的核糖核酸聚合酶（RdRp）、p4（4-kDa蛋白）、热休克蛋白70同系物（HSP70h）、p60（59.7-kDa蛋白）、外壳蛋白（CP）、小外壳蛋白（CPm）、p21（21.3-kDa蛋白）、p26（25.7-kDa蛋白）、p18（17.5-kDa蛋白）和p19（19.3-kDa蛋白）十三个蛋白，该病毒侵染槟榔后初始症状为中下层叶片尖端发黄，黄化沿叶片维管组织扩散，中脉呈绿色，形成黄绿色边界，后期黄化扩展到幼叶和底层的叶片，老叶的绿黄色边界变得不清晰，新生叶发育不良，冠幅明显减少，出现束顶状。
目前植物病毒检测方法主要包括传统生物学方法、血清学方法和分子生物学方法等。然而，传统生物学方法耗时长，检测灵敏度不高，检测结果易受其他因素干扰；血清学方法操作步骤多，耗时长，结果容易出现假阳性，只适合初筛；分子生物学方法特异性强、灵敏度高、检测速度快、操作简便，广泛应用于检测领域。现有APV1分子生物学检测方法主要有反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），但这两种方法需要昂贵的检测设备和分析仪器，操作程序复杂且耗时较长，对检测人员的技术水平及熟练程度要求较高，大大限制了此类检测方法的推广应用。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）是Notomi等发明的一种新型的核酸扩增方法。逆转录–环介导等温扩增技术（ReverseTranscription and Loop-mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）是基于LAMP建立的RNA检测技术，两者原理相同，但RT-LAMP反应体系添加了逆转录酶，可使RNA逆转录和LAMP扩增在同一反应管中完成反应。与常规PCR相比，RT-LAMP具有特异性强、灵敏度高、操作简便、不需要高端仪器、检测周期短和检测结果可视化的特点，非常适用于基层实验室和田间快速检测诊断，及时监测槟榔发病情况，具有良好的商业推广与应用价值。目前，还未有针对APV1的RT-LAMP检测产品。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种APV1检测引物组及应用，该引物组是针对APV1的外壳蛋白基因核苷酸保守序列设计得到，具有很好的特异性和稳定性，能够对APV1进行有效快速的检测。
本发明涉及的一种引物组，包括两条外引物APV1-F3和APV1-B3，两条内引物APV1-FIP和APV1-BIP；
所述外引物APV1-F3的序列如SEQ ID NO:1所示，所述外引物APV1-B3的序列如SEQID NO:2所示，所述内引物APV1-FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，所述内引物APV1-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种上述引物组在检测槟榔隐症病毒1型中的应用。
进一步地，包括使用所述引物组构建RT-LAMP试剂盒，进行RT-LAMP扩增反应。
进一步地，所述RT-LAMP试剂盒中外引物的浓度和内引物的浓度比为1：8。在实际实施过程中，所述外引物和内引物的浓度分别为0.2μmol/L和1.6μmol/L。
进一步地，所述RT-LAMP试剂盒还包括RT-LAMP反应预混液、酶溶液、阳性对照液、阴性对照液、空白对照和核酸染料。
进一步地，所述RT-LAMP反应预混液包括40mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L的KCl、20mmol/L的(NH4)2SO4、12mmol/L MgSO4、0.2% 的Triton X-100、2.8mmol/L的dNTPs，所述Triton X-100的pH值为8.8。
进一步地，所述酶溶液包括8U Bst DNA聚合酶和5U AMV逆转录酶。
进一步地，所述阳性对照为含APV1的槟榔叶片总核酸，所述阴性对照为健康槟榔叶片总核酸，所述空白对照为不含核酸酶的超纯水。
进一步地，所述核酸染料为SYBR Green I，所述核酸染料在反应产物中加入量为0.008μL/μL。
进一步地，引物组在检测检测槟榔隐症病毒1型中具体包括以下步骤，
S1、提取待测样品总RNA；
S2、逆转录环介导等温扩增反应：25μL反应体系，包括RT-LAMP反应预混液12.5μL，酶溶液1μL，25×引物混合液1μL，待测总RNA模板1μL，加无核酸酶超纯水至25μL，获得反应液；设置阳性对照、阴性对照和空白对照，将反应液混匀并离心，然后于62℃~67℃反应40min~90min；优选地，于64℃恒温反应60min；
S3、结果判断：通过肉眼观察反应液颜色或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯形条带来判断检测结果；反应结束，在反应产物中加入0.2μL核酸染料SYBR Green I溶液，若反应液呈绿色或电泳出现梯形条带，表示结果为阳性，待测样品中含有槟榔隐症病毒1型；若反应液颜色呈橙色或电泳无条带，表示结果为阴性，待测样品中不含槟榔隐症病毒1型。
本发明还涉及利用上述引物组制备的检测试剂、检测试纸、试剂盒。
本发明的有益之处在于：
（1）特异性强：本发明所提供的引物组是针对槟榔隐症病毒1型的外壳蛋白基因核苷酸保守序列的6个区域设计的4条引物，应用上述4条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能完成扩增，故其特异性强。
（2）灵敏度高：本发明所提供的槟榔隐症病毒1型的RT-LAMP检测方法灵敏度较RT-PCR提高100倍，最低可检出1.74×10-3ng/μL含APV1的感病槟榔叶片总RNA，可检测出无症状槟榔苗是否携带APV1。
（3）操作简便：本发明仅需一台恒温金属浴或恒温水浴锅，无需使用热循环仪等昂贵的专业仪器，实验步骤简单易操作，无需预先进行逆转录等繁琐步骤。
（4）检测周期短：整个扩增反应在40min~90min内即可完成。
（5）检测结果可视化：通过肉眼观察反应液颜色或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯形条带即可直接判断结果，适用于基层实验室和田间检测。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2 RT-LAMP反应温度优化结果图。
其中，A区域为琼脂糖凝胶电泳检测结果，B区域为SYBR Green I荧光染色结果，M：2000bp DNA Marker，59℃~68℃：反应温度，NC：阴性对照，NTC：空白对照。
图2为实施例2 RT-LAMP反应时间优化结果图。
其中，A区域为琼脂糖凝胶电泳检测结果，B区域为SYBR Green I荧光染色结果，图中，M：2000bp DNA Marker，20min~90min：反应时间，NC：阴性对照，NTC：空白对照。
图3为实施例3 RT-LAMP特异性检测结果图。
其中，A区域为琼脂糖凝胶电泳检测结果，B区域为SYBR Green I荧光染色结果。图中，M：2000bp DNA Marker，1~3：3份不同来源的槟榔感病叶片样品，ANRSV：槟榔坏死环斑病毒样品，ANSSV：槟榔坏死梭斑病毒样品，SrMV：高粱花叶病毒样品，PC：阳性对照，NC：阴性对照，NTC：空白对照。
图4为实施例4 RT-LAMP和RT-PCR灵敏度检测结果图。
其中A区域为RT-LAMP SYBR Green I荧光染色结果，B区域为RT-LAMP琼脂糖凝胶电泳检测结果，C区域为RT-PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中，M：2000bp DNA Marker，1：17.4ng/μL，2：1.74ng/μL，3：1.74×10-1ng/μL，4：1.74×10-2ng/μL，5：1.74×10-3ng/μL，6：1.74×10-4ng/μL，7：1.74×10-5ng/μL，8：1.74×10-6ng/μL，9：1.74×10-7ng/μL，NC：阴性对照，NTC：空白对照，注：1~9为不同浓度的感病槟榔叶片总RNA。
图5为实施例5中田间槟榔叶样品的RT-LAMP检测结果图。
其中A区域为琼脂糖凝胶电泳检测结果，B区域为SYBR Green I荧光染色结果图中，M：2000bp DNA Marker，1~14：田间槟榔叶样品，PC：阳性对照，NC：阴性对照，NTC：空白对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1槟榔隐症病毒1型RT-LAMP检测试剂盒的建立。
一种用于快速检测槟榔隐症病毒1型的RT-LAMP试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-LAMP反应预混液、酶溶液、阳性对照、阴性对照、空白对照和核酸染料。
所述试剂盒的制备过程如下：
(1)RT-LAMP引物设计
以槟榔隐症病毒1型（APV1）的外壳蛋白基因（CP）保守序列为靶基因，利用引物设计软件设计APV1特异性RT-LAMP引物，引物序列如表1所示。
表1 APV1特异性RT-LAMP引物序列表
(2)RT-LAMP引物组包括外引物对APV1-F3、APV1-B3和内引物对APV1-FIP、APV1-BIP；所述外引物对和内引物对的终浓度比为1:8；所述外引物对和内引物对的终浓度分别为0.2μmol/L和1.6μmol/L；所述RT-LAMP引物组配置成25×引物混合液，包括40μmol/LAPV1-FIP、40μmol/L APV1-BIP、5μmol/L APV1-F3、5μmol/L APV1-B3，溶于超纯水。
(3)RT-LAMP反应预混液（2×）包括40mmol/L Tris-HCl、20mmol/L KCl、20mmol/L(NH4)2SO4、12mmol/L MgSO4、0.2% Triton X-100(pH 8.8)、2.8mmol/L dNTPs。
(4)酶溶液包括8U Bst DNA聚合酶和5U AMV逆转录酶。
(5)阳性对照为含APV1的槟榔叶片总核酸，所述阴性对照为健康槟榔叶片总核酸，所述空白对照为不含核酸酶的超纯水。
(6)核酸染料为SYBR Green I（10000×）。
实施例2槟榔隐症病毒1型RT-LAMP检测方法的建立与优化
用实施例1中的试剂盒按以下步骤对槟榔隐症病毒1型进行检测：
S1、提取待测样品总RNA：采用市售的植物RNA提取试剂盒提取待测样品的总RNA。
S2、RT-LAMP反应体系的建立：25μL反应体系，包括RT-LAMP反应预混液12.5μL，酶溶液1μL，25×引物混合液1μL，待测总RNA模板1μL，加无核酸酶超纯水至25μL，获得反应液；设置阳性对照、阴性对照和空白对照，将反应液配制完成后混匀并离心。
S3、RT-LAMP反应条件优化：
用步骤S2的RT-LAMP反应体系对含有APV1的槟榔叶片总RNA进行扩增，反应时间设定为60min，扩增反应温度分别设定为59、60、61、62、63、64、65、66、67和68℃。结果如图1所示，在反应温度为61℃~67℃时扩增产物呈绿色（阳性）；在反应温度为63℃~66℃时扩增产物电泳后均呈明显的梯形条带（阳性）；在反应温度为61℃时扩增产物电泳无明显条带（难以判断结果）；在反应温度为62℃和67℃时扩增产物电泳条带较浅（阳性）；在反应温度为59℃、60℃和68℃时扩增产物呈橙色（阴性），电泳无条带（阴性）；因此，反应温度选择62℃~67℃均可，但从电泳条带清晰明亮程度和提高反应灵敏度以及节约能源考虑，选择中间值最适，因此扩增反应温度优选64℃。
用步骤S2的RT-LAMP反应体系对含有APV1的槟榔叶片总RNA进行扩增，反应温度设定为64℃，扩增反应时间分别设定为20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min和90min。结果如图2所示，在反应时间为40min~90min时扩增产物均呈绿色（阳性），电泳后均呈梯形条带（阳性）；在反应时间为20min和30min时扩增产物呈橙色（阴性），电泳无条带（阴性）；因此，反应时间选择40min~90min均可，但从电泳条带清晰明亮程度和提高反应灵敏度以及节约时间考虑，选择中间值为宜，因此扩增反应时间优选60min。
综上所述，采用实施例1中的试剂盒进行逆转录环介导等温扩增反应，RT-LAMP反应条件为62℃~67℃反应40min~90min，优选地，于64℃恒温反应60min。
S4、结果判断：通过肉眼观察反应液颜色或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯形条带来判断检测结果；反应结束，在反应产物中加入0.2μL核酸染料SYBR Green I溶液，若反应液呈绿色或电泳出现梯形条带，表示结果为阳性，待测样品中含有槟榔隐症病毒1型；若反应液颜色呈橙色或电泳无条带，表示结果为阴性，待测样品中不含槟榔隐症病毒1型。
实施例3 试剂盒特异性实验
按照实施例2中的检测方法，采用实施例1中的试剂盒分别对3株不同来源的含有APV1的槟榔叶片总RNA、槟榔坏死环斑病毒（ANRSV）、槟榔坏死梭斑病毒（ANSSV）、高粱花叶病毒（SrMV）、阳性对照、阴性对照和空白对照进行检测，反应条件均为64℃恒温反应60min。
结果如图3所示，3株不同来源的含有APV1的槟榔叶片总RNA和阳性对照4管反应液颜色呈绿色（阳性），电泳后呈明显的梯形条带（阳性），而槟榔坏死环斑病毒、槟榔坏死梭斑病毒、高粱花叶病毒、阴性对照和空白对照5管反应液呈橙色（阴性），电泳也未出现梯形条带（阴性），说明试剂盒仅检测出目标病毒APV1，不能检测出ANRSV、ANSSV和SrMV，表明本发明所提供的引物组具有较强的特异性，检测出APV1的准确率高。
实施例4试剂盒灵敏度实验
按照实施例2检测方法提取含有APV1的槟榔叶片总RNA，并使用微量分光光度计测量浓度，按照10倍比例进行梯度稀释，得到浓度为17.4ng/μL、1.74ng/μL、1.74×10-1ng/μL、1.74×10-2ng/μL、1.74×10-3ng/μL、1.74×10-4ng/μL、1.74×10-5ng/μL、1.74×10-6ng/μL和1.74×10-7ng/μL共9个样品。分别进行RT-LAMP和常规RT-PCR检测，设置阴性对照和空白对照。
结果如图4所示，采用RT-LAMP方法检测浓度为17.4ng/μL、1.74ng/μL、1.74×10- 1ng/μL、1.74×10-2ng/μL、1.74×10-3ng/μL的样品反应液颜色均呈绿色（阳性），同时电泳后均出现梯形条带（阳性），而浓度为1.74×10-4ng/μL、1.74×10-5ng/μL、1.74×10-6ng/μL和1.74×10-7ng/μL的样品以及阴性对照和空白对照反应液颜色均呈橙色（阴性），同时电泳后也未出现梯形条带（阴性），表明本发明的试剂盒的灵敏度为可检出1.74×10-3ng/μL含APV1的感病槟榔叶片总RNA；采用RT-PCR方法检测，扩增产物经电泳检测浓度为17.4ng/μL、1.74ng/μL和1.74×10-1ng/μL的样品均有目标条带（500bp），其余浓度样品均未出现目标条带，表明采用RT-PCR方法可检出1.74×10-1ng/μL含APV1的感病槟榔叶片总RNA。因此，本发明的RT-LAMP检测方法比常规RT-PCR检测方法的灵敏度高100倍。
实施例5槟榔隐症病毒1型RT-LAMP检测试剂盒的应用
采集田间槟榔叶样品14份，其中1-8为疑似染病样品，9-14为可能携带APV1无症状样品和健康无APV1样品，采用实施例1中的试剂盒以及实施例2中的检测方法对采集的样品进行RT-LAMP检测，设置阳性对照、阴性对照和空白对照。
结果如图5所示，阳性对照反应液颜色呈绿色，电泳后出现梯形条带，14份槟榔叶样品中，1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13号样品反应液颜色均呈绿色（阳性），同时电泳后均出现深浅不一的梯形条带（阳性）；阴性对照和空白对照反应液颜色呈橙色，电泳后也未出现条带，14份槟榔叶样品中，3、9、14号样品反应液颜色均呈橙色（阴性），同时电泳后也没有条带（阴性）。其中，3号疑似样品检测结果为阴性，表明未检出APV1病毒，10、11、12、13号4个无症状样品检测结果为阳性，表明检出APV1病毒，说明RT-LAMP方法能特异性的检出目标病毒。
最后应当说明的是，以上所述仅是本发明的优选实施方式而非对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种引物组，其特征在于：包括两条外引物APV1-F3和APV1-B3，两条内引物APV1-FIP和APV1-BIP；
所述外引物APV1-F3的序列如SEQ ID NO:1所示，所述外引物APV1-B3的序列如SEQ IDNO:2所示，所述内引物APV1-FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，所述内引物APV1-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示。
2.权利要求1中的引物组在检测槟榔隐症病毒1型中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：使用所述引物组构建RT-LAMP试剂盒，进行RT-LAMP扩增反应。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述RT-LAMP试剂盒中外引物的浓度和内引物的浓度比为1：8。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述RT-LAMP试剂盒还包括RT-LAMP反应预混液、酶溶液、阳性对照液、阴性对照液、空白对照和核酸染料。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述RT-LAMP反应预混液包括40mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L的KCl、20mmol/L的(NH4)2SO4、12mmol/L MgSO4、0.2% 的Triton X-100、2.8mmol/L的dNTPs，所述Triton X-100的pH值为8.8。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述阳性对照为含APV1的槟榔叶片总核酸，所述阴性对照为健康槟榔叶片总核酸，所述空白对照为不含核酸酶的超纯水。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述核酸染料为SYBR Green I，所述核酸染料在反应产物中加入量为0.008μL/μL。
9.根据权利要求2-8任一项所述的应用，其特征在于：包括
S1、提取待测样品总RNA；
S2、逆转录环介导等温扩增反应：25μL反应体系，包括RT-LAMP反应预混液12.5μL，酶溶液1μL，25×引物混合液1μL，待测总RNA模板1μL，加无核酸酶超纯水至25μL，获得反应液；设置阳性对照、阴性对照和空白对照，将反应液混匀并离心，然后于62℃~67℃反应40min~90min；
S3、结果判断：通过肉眼观察反应液颜色或通过琼脂糖凝胶电泳分析是否出现梯形条带来判断检测结果；反应结束，在反应产物中加入0.2μL核酸染料SYBR Green I溶液，若反应液呈绿色或电泳出现梯形条带，表示结果为阳性，待测样品中含有槟榔隐症病毒1型；若反应液颜色呈橙色或电泳无条带，表示结果为阴性，待测样品中不含槟榔隐症病毒1型。
10.利用权利要求1所述的引物组制备的检测试剂、检测试纸、试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310776298.4A CN116676423B (zh) | 2023-06-28 | 2023-06-28 | 一种apv1检测引物组及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310776298.4A CN116676423B (zh) | 2023-06-28 | 2023-06-28 | 一种apv1检测引物组及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116676423A CN116676423A (zh) | 2023-09-01 |
| CN116676423B true CN116676423B (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=87790890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310776298.4A Active CN116676423B (zh) | 2023-06-28 | 2023-06-28 | 一种apv1检测引物组及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116676423B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110184387A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-08-30 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 用于检测anssv的rt-lamp检测引物及其应用、检测试剂和检测方法 |
| CN111187756A (zh) * | 2020-01-13 | 2020-05-22 | 海南大学 | 一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法 |
| CN117147832A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-12-01 | 海南大学 | 检测槟榔apv1病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法 |
-
2023
- 2023-06-28 CN CN202310776298.4A patent/CN116676423B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110184387A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-08-30 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 用于检测anssv的rt-lamp检测引物及其应用、检测试剂和检测方法 |
| CN111187756A (zh) * | 2020-01-13 | 2020-05-22 | 海南大学 | 一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法 |
| CN117147832A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-12-01 | 海南大学 | 检测槟榔apv1病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Rapid detection of two emerging viruses associated with necrotic symptoms in Areca catechu L. by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP);Guangyuan Zhao等;J Virol Methods;第281卷;113795 * |
| Transmission of Areca Palm Velarivirus 1 by Mealybugs Causes Yellow Leaf Disease in Betel Palm ( Areca catechu);Huaiwen Zhang等;Phytopathology;第112卷(第3期);700-707 * |
| 我国部分地区梅树病毒病的病原初步检测;王程安等;植物保护;第44卷(第02期);170-176 * |
| 槟榔APV1病毒多克隆抗体制备及酶联免疫检测;陈阳等;分子植物育种;第20卷(第2期);518-523 * |
| 槟榔隐症病毒1型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立;林兆威等;热带作物学报;第42卷(第11期);3087-3092 * |
| 槟榔黄化病病原及检测方法研究进展;车海彦等;热带农业科学;第37卷(第02期);67-72 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116676423A (zh) | 2023-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Rapid detection of tobacco mosaic virus using the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method | |
| CN111321249A (zh) | 一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及方法 | |
| CN108060257B (zh) | 一种基于环介导等温扩增技术检测强雄腐霉的引物组合物及其检测方法 | |
| CN104450961A (zh) | 草鱼呼肠孤病毒i型ii型iii型rt-lamp可视化检测试剂盒及其检测方法 | |
| WO2019228542A1 (zh) | 引物5'端反向互补的荧光pcr及试剂盒 | |
| CN111206106A (zh) | 一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN109439801B (zh) | 一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN111270011B (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒的引物组和检测试剂盒 | |
| CN107338287B (zh) | Taqman-MGB探针检测绵羊BMPR-IB基因A746G突变的试剂盒和方法 | |
| CN116676423B (zh) | 一种apv1检测引物组及应用 | |
| CN111676315A (zh) | 检测新型冠状病毒ORF1ab基因的引物和探针及其试剂盒和方法 | |
| CN112195278A (zh) | 一种六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒及使用方法 | |
| CN107236826A (zh) | 一种检测百合无症病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN105525036B (zh) | 一种乙型肝炎病毒hbv实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| CN116287475A (zh) | 芸薹黄化病毒rt-lamp-crispr等温检测的核酸序列组合、试剂盒及应用 | |
| CN111057788B (zh) | 一种检测三七锈腐病菌的lamp引物组及检测方法 | |
| CN111321239B (zh) | 一种用于检测根串珠霉菌的lamp引物组及检测方法 | |
| CN111424116B (zh) | 用于检测黄热病毒疫苗株的rt-lamp试剂盒及其专用引物和应用 | |
| CN108754021A (zh) | 一种鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测试剂 | |
| CN110656186B (zh) | 一种快速鉴定核桃黑斑蚜的试剂盒及方法 | |
| KR102217158B1 (ko) | 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트 및 이를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출 방법 | |
| CN113444841B (zh) | 一种狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR试剂盒及使用方法 | |
| AU2021106577A4 (en) | Primer probe set and kit for rt-pcr detection of human tryptase beta (tpsb) mrna | |
| CN111139316B (zh) | 用于检测黄热病毒的rt-lamp试剂盒及其专用引物 | |
| CN105969912A (zh) | 小西葫芦黄花叶病毒rt-lamp检测试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |