CN113444841B

CN113444841B - 一种狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR试剂盒及使用方法

Info

Publication number: CN113444841B
Application number: CN202110970275.8A
Authority: CN
Inventors: 王玉茂; 于新友; 韩强; 付石军; 郭广君; 庄金秋; 王建军; 沈志强
Original assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Current assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Priority date: 2021-08-23
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2041-08-23
Also published as: CN113444841A

Abstract

本发明提供了一种狐狸逆转录病毒SYBR GreenⅠ荧光RT‑PCR试剂盒及使用方法，试剂盒包括核酸释放剂、2×One step TB Green RT‑PCR BufferⅢ、酶混合液、阴性对照、阳性对照和引物组；该引物组核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的特定碱基序列；使用方法包括准备待测样本模板、荧光RT‑PCR扩增和结果分析。将该检测引物用于SYBR GreenⅠ荧光RT‑PCR试剂盒中，使该试剂盒既具有适用性广、适用性强的优点，又具有检测的准确度高、特异性强的优点；另外，使用该试剂盒，一次加样可完成狐狸逆转录病毒检测，检测过程简单、易于操作。

Description

一种狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR试剂盒及使用方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种狐狸逆转录病毒SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR试剂盒及使用方法。

背景技术

狐狸逆转录病毒可引起狐狸严重的疾病，临床表现为狐狸生长缓慢、料肉比增加、严重的免疫抑制和抵抗力降低等，进而容易继发其它疾病，导致高死亡率。该病是近几年新发的一种严重影响狐狸养殖业经济效益的疾病，给狐狸养殖业造成了严重的经济损失。

病毒早期、快速检测是防控该病的关键。而目前的资料文献中，关于该逆转录病毒的记载和报道极少。病毒分离培养操作繁琐，且很难成功分离。为监控该病在临床上的发生和流行规律，以便及早发现该病，淘汰患病动物，将疾病消灭在萌芽之中，因此，提供一种检测准确度高、易于操作的检测方法对该狐狸逆转录病毒的防控具有重要意义。

当前国内外均没有对任何狐狸逆转录病毒检测方法，更没有狐狸逆转录病毒SYBRGreen Ⅰ荧光RT-PCR检测试剂盒，因此，本发明的研究对狐狸逆转录病毒的检测具有重大意义。染料法荧光RT-PCR与Taqman探针法荧光RT-PCR技术相比成本低，应用广泛，适用的PCR仪类型和范围广，结合熔解曲线分析，可区分不同PCR产物，是病毒核酸检测的重要方法，产品投放市场，必将获得良好的经济和社会效益。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种狐狸逆转录病毒SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR试剂盒及使用方法，该检测引物核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的特定碱基序列，使用该检测引物，使该试剂盒具有敏感性好和特异性高的优点；将该检测引物用于SYBR Green Ⅰ荧光染料试剂盒中，使该试剂盒既具有适用性广、适用性强的优点，又具有检测的准确度高、特异性强的优点；另外，使用该试剂盒，一次加样可完成狐狸逆转录病毒检测，检测过程简单、易于操作。

本发明的技术方案如下：

一种狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR试剂盒，包括核酸释放剂、2×Onestep TB Green RT-PCR Buffer Ⅲ、酶混合液、阴性对照、阳性对照和引物组。

进一步的，所述引物组核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的特定碱基序列。

进一步的，所述SEQ ID No.1为上游引物，序列为：ACCTGGGACTACGACACTG；所述SEQID No.2为下游引物，序列为：CCTGCTGGCGTCTCATCT。

优选的，在上述试剂盒中，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物浓度均为10pmol/μL；引物组中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的摩尔比为1:1。

优选的，核酸释放剂通过以下方法制备得到：

配制500mM/L的Tris-HCl溶液，加入乙二胺四乙酸二钠，使乙二胺四乙酸二钠浓度达到2.5mM/L，加入NaCl，使NaCl浓度达到120mM/L，加入1.0％(质量体积比)的十二烷基硫酸锂和2％(质量体积比)的甜菜碱，加入1.5％(质量体积比)的十二烷基磺酸钠，混匀，即可。

优选的，所述阳性对照为含有SEQ ID No.3所示基因序列的pMD-POL质粒，阴性对照为无核酸酶水。

优选的，所述SEQ ID No.3所示基因序列为狐狸逆转录病毒POL基因序列，序列为：

GGGTTCGGGTGGTCCCGACCTGGGACTACGACACTGCATGCTGGTAGGGAGCGGCTCCGTCTCTATCCCCAGGTACTCCTAGCGGGTCTCAAGGGGCAGGGCGATGCCCCACCAATTTGGCAAAGGTACGTGCTATAGTGCAGGGGAAAGATGAGACGCCAGCAGGATTTCTGGAAAAATTAATGGAAGGCTACCATATGTACACCCCCTTTGACCCCTTGGCCAAAGATCGGCAACCAGATGTAATCATGTCCTTCATCGGACAATAGGCCTCGGGTATTTGTAATAAGTTAGAGCGGTTAGAAGA。

上述试剂盒的使用方法，过程如下：

(1)准备待测样本模板：取疑似患病狐狸肾、脑、肺脏等组织研磨、制备混悬液，8000rpm/min离心2min，取上清100μL置于1.5mL离心管中，加入100μL核酸释放剂后，将离心管置恒温金属浴中，在98℃条件下加热5min，然后于12000rpm/min离心1min，取20μL上清液于灭菌离心管中，即可；

(2)荧光RT-PCR扩增：荧光RT-PCR总体系为20μL，其中，2×Onestep TB Green RT-PCR Buffer Ⅲ10μL、酶混合液1μL、引物组2μL、无核酸酶水6μL，加入到0.1mL扩增管中，平行3份，标记为扩增管Ⅰ、扩增管Ⅱ和扩增管Ⅲ；

向扩增管Ⅰ中加入阴性对照1μL，向扩增管Ⅱ中加入待测样本模板1μL，向扩增管Ⅲ中加入阳性对照1μL，加样完成后，瞬时离心，置荧光RT-PCR仪中进行扩增反应；

荧光RT-PCR扩增条件为：42℃反转录5min；95℃预变性10s，94℃变性5s；55℃退火10s；72℃延伸20s；40个循环；循环结束后，60℃1min，以0.1℃/s的速率升温，直到97℃，整个过程连续采集荧光，最后40℃冷却；

(3)结果描述及判定

若检测样品无Ct值并且无典型的扩增曲线，或Ct值>35.0但熔解曲线Tm值为82.9±0.7℃未出现熔解峰，则判为狐狸逆转录病毒核酸阴性；

若检测样品Ct值≤30.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值为82.9±0.7℃出现熔解峰，则判为狐狸逆转录病毒核酸阳性；

若检测样品30.0<Ct值≤35.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值为82.9±0.7℃出现熔解峰，则判为可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为狐狸逆转录病毒核酸阳性，否则为阴性。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的核酸释放剂，可从狐狸病料组织样本中直接裂解病毒获取核酸RNA作为模板，用于后续荧光RT-PCR扩增，避免了现有技术中模板获取需要柱式提取或磁珠法提取等复杂操作，使核酸模板制备简单、快速，质量稳定可靠。

2、本发明中，通过使用特定的引物组，使包含该引物组的该试剂盒具有敏感性高和特异性好的优点；将该检测引物用于SYBR Green Ⅰ荧光染料试剂盒中，使该试剂盒既具有适用性广、适用性强的优点，又具有检测的准确度高、特异性强的优点。

3、本发明提供的试剂盒，在使用过程中易于操作，且对操作人员要求低；另外，使用该试剂盒，一次加样可完成狐狸逆转录病毒检测，检测过程简单、易于操作，使该试剂盒更适宜于对狐狸逆转录病毒进行监控，该试剂盒具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR检测检测敏感性图谱。

图2为狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR检测检测特异性图谱。

图3为实施例4样品检测图谱。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR检测方法的建立

1、引物设计与合成

根据本实验室前期研究测得的狐狸逆转录病毒POL基因序列，经序列比对，选取保守区域设计扩增引物，引物为3对，序列分别如下：

第一对引物：

SEQ ID No.1：上游引物ACCTGGGACTACGACACTG，

SEQ ID No.2：下游引物CCTGCTGGCGTCTCATCT；

第二对引物：

SEQ ID No.5：上游引物CGGGTGGTCCCGACCTG，

SEQ ID No.6：下游引物GTCTCATCTTTCCCCTGC；

第三对引物：

SEQ ID No.7：上游引物CAAAGGTACGTGCTATAGTG，

SEQ ID No.8：下游引物CTCTAACTTATTACAAATAC；

上述引物组由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

2、阳性对照质粒的制备

阳性对照为人工合成的含有狐狸逆转录病毒POL基因序列(SEQ ID No.3)的pMD-POL质粒，阴性对照品无核酸酶水；

SEQ ID No.3所示基因序列为狐狸逆转录病毒POL基因序列，如下：

3、核酸释放剂的制备

配制500mM/L的Tris-HCl溶液，加入乙二胺四乙酸二钠，使乙二胺四乙酸二钠浓度达到2.5mM/L，加入NaCl，使NaCl浓度达到120mM/L，加入1.0％(质量体积比)的十二烷基硫酸锂和2％(质量体积比)的甜菜碱，加入1.5％(质量体积比)的十二烷基磺酸钠，混匀，即可

4、最佳引物序列筛选

以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQID No.8为引物组，以质粒拷贝数为3.2×10³pMD-POL质粒为标准品做模板，进行荧光RT-PCR扩增反应，以最低Ct值、最高荧光强度增加值(△Rn)和单一产物扩增峰的引物组合为最佳，筛选得到最优引物组合。筛选得到的最优引物组合为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

5、狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR检测方法优化

(1)引物浓度比例的优化：引物稀释后，以不同引物浓度混合，采用One step TBGreen PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒及推荐的反应体系、反应条件，以最低Ct值、较高荧光强度增加值(△Rn)、扩增效率、重复性和平台期等因素作为综合判定依据，最终确定体系中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物的浓度均为10pmol/μL，引物组中，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的摩尔比为1:1；

(2)退火温度的优化：将上述步骤中确定的阳性对照品为模板，对退火温度进行优化，将其设置在50℃～60℃范围内，采用One step TB Green PrimeScript^TM RT-PCR试剂及推荐的反应体系、反应条件，结果得到的最佳退火温度为55℃。

狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR试剂盒，包括核酸释放剂、2×One stepTB Green RT-PCR Buffer Ⅲ、酶混合液、阴性对照、阳性对照和引物组；其中，酶混合液为：PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ和Ex Taq HS(5U/μL)，两者体积比1:1。

6、狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR检测方法的建立

(1)荧光RT-PCR总体系为20mL：2×One step TB Green RT-PCR Buffer Ⅲ10μL、酶混合液1μL、引物组2μL、无核酸酶水6μL，模板1μL；

(2)荧光RT-PCR扩增条件：42℃反转录5min；95℃预变性10s，94℃变性5s；55℃退火10s；72℃延伸20s；40个循环；循环结束后，60℃1min，以0.1℃/s的速率升温，直到97℃，整个过程连续采集荧光，最后40℃冷却；

(3)结果分析：

质控标准

阴性对照：无Ct值，且无典型扩增曲线，但熔解曲线Tm值为82.9±0.7℃未出现熔解峰；

阳性对照：Ct值<30.0，并出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值在82.9±0.7℃出现熔解峰；

若阴、阳性对照组结果不成立，则视为无效检验。

结果描述及判定

若检测样品30.0<Ct值≤35.0，出现典型的扩增曲线，且熔解曲线Tm值为82.9±0.7℃出现熔解峰，则判为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为狐狸逆转录病毒核酸阳性，否则为阴性。

实施例2试剂盒敏感性分析

使用实施例1提供的试剂盒进行试验。

(1)制备pMD-POL标准溶液，分别根据pMD-POL质粒标准品浓度计算拷贝数，pMD-POL质粒拷贝数为3.2×10¹⁰拷贝/μL；

将质粒标准品以10倍比系列梯度稀释，取10⁶拷贝/μL～10^-1拷贝/μL的pMD-POL质粒标准品做质粒标准品模板，获得的模板溶液分别编号，如下：

标准品模板1：3.2×10⁶拷贝/μL的pMD-POL质粒标准品；

标准品模板2：3.2×10⁵拷贝/μL的pMD-POL质粒标准品；

标准品模板3：3.2×10⁴拷贝/μL的pMD-POL质粒标准品；

标准品模板4：3.2×10³拷贝/μL的pMD-POL质粒标准品；

标准品模板5：3.2×10²拷贝/μL的pMD-POL质粒标准品；

标准品模板6：3.2×10¹拷贝/μL的pMD-POL质粒标准品；

标准品模板7：3.2×10⁰拷贝/μL的pMD-POL质粒标准品；

标准品模板8：3.2×10^-1拷贝/μL的pMD-POL质粒标准品；

(2)荧光RT-PCR扩增：荧光RT-PCR总体系为20μL，其中，2×Onestep TB Green RT-PCR Buffer Ⅲ10μL、酶混合液1μL、引物组2μL、无核酸酶水6μL，加入到0.1mL扩增管中，制备9份，备用；记号为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#；

将步骤(1)制备8个标准品模板分别取1μL后，分别加入1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#中，使用无核酸酶水替代步骤(1)的标准溶液，加入9#中；加样完成后，瞬时离心，置荧光RT-PCR仪中进行扩增反应；

(3)结果分析：根据实施例1中的判定方法对结果进行分析判定。

如图1所示，使用本发明提供的试剂盒对pMD-POL的最低检测限度为3.2拷贝/μL，表明所建方法具有很好的敏感性。

实施例3试剂盒特异性分析

(1)准备模板：以质粒pMD-POL、犬瘟热病毒、狐细小病毒、传染性肝炎病毒、大肠杆菌、巴氏菌、葡萄球菌基因组作为模板，无核酸酶水作为对照，待用；

(2)荧光RT-PCR扩增：荧光RT-PCR总体系为20μL：2×Onestep TB Green RT-PCRBufferⅢ10μL、酶混合液1μL、引物组2μL、无核酸酶水6μL，加入0.1mL扩增管中，制备8份，待用；标记为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#待用；

将步骤(1)中的质粒pMD-POL、犬瘟热病毒、狐细小病毒、传染性肝炎病毒、大肠杆菌、巴氏菌、葡萄球菌分别加入1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#中，将无核酸酶水加入8#中，加样完成后，瞬时离心，置荧光PCR仪中进行扩增反应；

(3)结果分析：根据上述实施例1中的判定方法对结果进行分析判定。

如图2所示，质粒pMD-POL在82.9±0.7℃出现特异性峰，其余均为阴性，证明该方法特异性较好。

实施例4

使用实施例1提供的试剂盒对检测狐狸肺部组织中的狐逆转录病毒，步骤如下：

(1)制备待测样本模板：取疑似患病狐狸肺部组织研磨、制备混悬液，8000rpm/min离心2min，取上清100μL置于1.5mL离心管中，向其中加入100μL核酸释放剂，然后将离心管置恒温金属浴中，在98℃条件下加热5min，然后于12000rpm离心1min，取20μL上清液于灭菌的离心管中，即可；

(2)荧光RT-PCR总体系为20μL，其中，2×One step TB Green RT-PCR BufferⅢ10μL、酶混合液1μL、引物组2μL、无核酸酶水6μL，加入到0.1mL扩增管中，平行3份，标记为扩增管A、扩增管B、扩增管C；

分别向扩增管A加入阴性对照1μL，向扩增管B中加入待检样本模板1μL，向扩增管C中加入阳性对照1μl，加样完成后，瞬时离心，置荧光RT-PCR仪中进行扩增反应，程序设置许下：42℃反转录5min；95℃预变性10s，94℃变性5s；55℃退火10s；72℃延伸20s；40个循环；循环结束后，60℃1min，以0.1℃/s的速率升温，直到97℃，整个过程连续采集荧光，最后40℃冷却；

(3)结果分析：根据上述实施例1中的判定方法对结果进行分析判定，结合图3中的曲线1(标号1，为阳性对照曲线)观察分析扩增结果，曲线2(标号2，样本模板曲线)结果为：本实施例提供的待检样本在82.9±0.7℃出现峰值，表明狐狸逆转录病毒核酸阳性；图3中的曲线3(标号3)为阴性对照图谱。

可见，本发明提供的试剂盒，具有敏感性高和特异性高的优点，能够快速、准确的对狐狸逆转录病毒进行检测，且通过一次加样检测，即可判断样品中是否含有狐狸逆转录病毒，具有检测速度快、结果准确的优点。

尽管通过参考优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 一种狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR试剂盒及使用方法

<130> 2021

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

acctgggact acgacactg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cctgctggcg tctcatct 18

<210> 3

<211> 307

<212> DNA

<213> 狐狸逆转录病毒

<400> 3

gggttcgggt ggtcccgacc tgggactacg acactgcatg ctggtaggga gcggctccgt 60

ctctatcccc aggtactcct agcgggtctc aaggggcagg gcgatgcccc accaatttgg 120

caaaggtacg tgctatagtg caggggaaag atgagacgcc agcaggattt ctggaaaaat 180

taatggaagg ctaccatatg tacaccccct ttgacccctt ggccaaagat cggcaaccag 240

atgtaatcat gtccttcatc ggacaatagg cctcgggtat ttgtaataag ttagagcggt 300

tagaaga 307

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cgggtggtcc cgacctg 17

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtctcatctt tcccctgc 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

caaaggtacg tgctatagtg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ctctaactta ttacaaatac 20

Claims

1.一种狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括核酸释放剂、2×One step TB Green RT-PCR Buffer Ⅲ、酶混合液、阴性对照、阳性对照和引物组；

该引物组核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的特定碱基序列；

阳性对照为含有SEQ ID No.3所示基因序列的pMD-POL质粒，阴性对照为无核酸酶水。

2.如权利要求1所述的狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，SEQ ID No.1为上游引物，序列为：ACCTGGGACTACGACACTG；SEQ ID No.2为下游引物，序列为：CCTGCTGGCGTCTCATCT。

3.如权利要求1或2所述的狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物浓度均为10pmol/μL；引物组中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的摩尔比为1:1。

4.如权利要求1所述的狐狸逆转录病毒SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，核酸释放剂通过以下方法制备得到：

配制500mM/L的Tris-HCl溶液，加入乙二胺四乙酸二钠，使乙二胺四乙酸二钠浓度达到2.5mM/L，加入NaCl，使NaCl浓度达到120mM/L，加入1.0%的十二烷基硫酸锂和2%的甜菜碱，加入1.5%的十二烷基磺酸钠，混匀，即可。