CN112094946B

CN112094946B - 牛结节性皮肤病病毒的lamp检测引物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112094946B
Application number: CN202010951870.2A
Authority: CN
Inventors: 袁向芬; 吴绍强; 吕继洲; 林祥梅; 邓俊花; 王彩霞; 张舟; 孔玉方
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2040-09-11
Also published as: CN112094946A

Abstract

本发明公开牛结节性皮肤病病毒的LAMP检测引物、试剂盒及其应用。在本发明中，所述引物组包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向外引物F3和反向外引物B3，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的正向内引物FIP和反向内引物BIP，以及如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物LF和LB。本发明还公开包含上述LAMP引物组的试剂盒以及利用上述LAMP引物或LAMP试剂盒检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP方法。本发明提供的LAMP检测方法特异性强，灵敏度高，操作简单，有利于牛结节性皮肤病病毒的快速检测。

Description

牛结节性皮肤病病毒的LAMP检测引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域。更具体地，涉及牛结节性皮肤病病毒的LAMP检测引物、试剂盒及其应用。

背景技术

牛结节性皮肤病(LSDV)又被称为牛疙瘩皮肤病、牛结节性皮炎和牛结节疹。牛结节性皮肤病于1929年首次在赞比亚报道，15年后在博茨瓦纳和南非地区出现。20世纪70年代，该病向北传播到科尼亚和苏丹，向西传播到尼日利亚，随后相继传播到毛里塔尼亚、马里、加纳和利比里亚等国家。2005年后，巴林、科威特、阿曼、以色列、伊朗、土耳其等相继出现疫情。2015年以来，该病在欧洲东南部迅速蔓延，包括希腊、俄罗斯等。我国与上述部分国家毗邻并有较长的国境线接壤，所以其对我国养牛业构成了严重威胁。牛结节性皮肤病被世界动物卫生组织列为必须通报的疫病。

牛结节性皮肤病病毒为双链DNA病毒，基因组大小约为151kbp。该病毒属于痘病毒科羊痘病毒属，呈砖块状或椭圆形，大小约为260-320nm，为较小的痘病毒。通过对其DNA进行分析表明，其与羊痘病毒毒株之间的同源性可达80％，与山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)的基因组核苷酸有96％的同源性。由于羊痘病毒属的病毒核酸序列高度保守，目前国内外多为针对羊痘病毒属的检测方法，无法很好地将LSDV与GTPV、SPPV进行区分，可对3种病毒进行区分的方法较少，OIE推荐的LSDV核酸扩增检测方法为普通PCR方法，检测的灵敏度受到很大限制。

环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是由日本学者Notomi于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术利用3对不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，通过一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。中国专利申请CN111118211A公开了基于环介导等温扩增技术的牛结节性皮肤病检测试剂盒及方法，但是该方法仅使用2对引物，即内引物和外引物，实际检测效果并不理想。因此，开发出一种实际有效的用于检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP引物及试剂盒对于牛结节性皮肤病病毒进行快速、准确检测具有重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一组具有高灵敏度、高特异性的用于检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP引物。

本发明的另一个目的在于提供一种包含上述引物的用于检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP试剂盒和方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明根据NCBI公布的牛结节性皮肤病病毒LSDV基因序列(参考序列基因号：NC_003027.1)，将牛结节性皮肤病病毒的LSDV095基因作为靶基因，利用Primer Explorerversion 5在线引物设计软件进行引物设计，并筛选了一组灵敏度高、特异性强的用于检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP引物。具体的：

所述引物组包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向外引物F3和反向外引物B3，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的正向内引物FIP和反向内引物BIP，以及如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物LF和LB。

在上述引物组中，根据本发明的具体实施方式，所述引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB的摩尔比优选为：1:1:8:8:4:4。

本发明还提供上述LAMP引物组在制备用于检测牛结节性皮肤病病毒的试剂或试剂盒中的应用。

本发明进一步提供了一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP试剂盒，该试剂盒包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向外引物F3和反向外引物B3，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的正向内引物FIP和反向内引物BIP，以及如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的环引物LF和LB。这些引物可以单独包装，也可以混合包装。

此外，上述试剂盒还包括完成LAMP反应所需的其他试剂。这些试剂本领域技术人员可以根据需要进行购买或按照文献的方法进行配制。例如，所述试剂盒还包括LAMP反应液、DNA聚合酶、荧光染料或显色剂、阳性对照和阴性对照中的部分或全部。

本发明还提供了利用上述LAMP引物或LAMP试剂盒检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP方法，该方法包括以下步骤：

(1)获取待测样本基因组DNA或cDNA；

(2)配制LAMP反应体系；其中，所述体系包含上述LAMP引物；

(3)扩增反应：将配制好的LAMP体系放入等温扩增仪，设定反应温度60℃，反应时间为40min；

(4)结果判读：根据扩增曲线判定检测结果，在反应时间内，如出现典型的“S”型扩增曲线则为阳性，如无典型的“S”型扩增曲线则为阴性。

本发明的有益效果如下：

本发明针对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)建立了LAMP方法，该方法特异性强，不与绵羊痘病毒、山羊痘病毒等其它病毒发生交叉反应，特异性良好；检测操作简单，无需借助昂贵仪器，简单的恒温装置即可满足检测；反应时间短，40min内即可完成反应；灵敏度高，可检测到10^-5倍稀释的病毒基因组。本发明选用实时浊度仪LA-320c进行LAMP过程的监测和结果判定，所提供图片均为实时浊度扩增曲线，本方法同样适用于目视染料法、实时荧光法，可根据需求进行调整。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为LSDV LAMP方法与qPCR方法特异性及灵敏度比较图，其中，图A和图B为LSDVLAMP方法特异性及灵敏度图，图C和图D为qPCR方法特异性及灵敏度图。

图2为表1中组IV引物对应的LSDV LAMP方法灵敏度

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1：LAMP引物的设计和合成

本发明根据NCBI公布的牛结节性皮肤病病毒LSDV基因序列(参考序列基因号：NC_003027.1)，将牛结节性皮肤病病毒的LSDV095基因作为靶基因，利用Primer Explorerversion 5在线引物设计软件进行引物设计，共筛选了3组引物(见表1)，但经过验证，组II和组III引物出现非特异性扩增且灵敏度不够高，因此本发明最终确定组I引物为检测牛结节性皮肤病病毒的引物。组IV引物为已发布(中国专利申请CN111118211A)的引物组，作为组I引物的对比组对方法性能进行对比。本研究所涉及引物均由北京擎科生物科技有限公司完成。

表1 引物设计

实施例2检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP方法的建立

1、样品：LSDV基因组；30份牛血清样本；山羊痘病毒、绵羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、赤羽病病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒均由本实验室保存。

2、获取待测样品基因组DNA或cDNA

小反刍兽疫病毒、赤羽病病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒基因组的提取，按照病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，德国)操作说明书进行，并反转录为cDNA；30份牛血清样本、山羊痘病毒、绵羊痘病毒基因组的提取，按照DNA提取试剂盒DNeasyBlood&Tissue Kit(QIAGEN，德国)操作说明书进行。置于-80℃冰箱内保存备用。

3、LAMP方法的优化与建立

为实时监测不同反应条件下LAMP的进展情况，反应条件的优化借助环介导等温扩增实时浊度仪LA-320c进行，主要对反应的引物浓度、退火温度(59-65℃)、反应时间进行优化(表2)。

表2 温度和内引物浓度的优化

经过一系列优化，确定LAMP方法的反应体系(25μL)包括：

FIP和BIP各40pmol，F3和B3各5pmol，LF和LP各20pmol；

2×Reaction Mix 12.5μL：Tris-HCl(pH 8.8)40mM，KCl 20mM，MgSO₄ 16mM，(NH4)2SO4 20mM，Tween 20 0.2％，Betaine 1.6M，dNTPs 2.8mM)；

Bst DNA聚合酶(8×10⁶U/L)1.0μL；

模板DNA/cDNA 2μL；

余量为ddH₂O。

4、扩增反应：

将混合均匀的样品管放入等温扩增仪60℃恒温反应40min观察扩增曲线。

5、结果判读：根据扩增曲线判定检测结果，在40min反应时间内，如出现典型的“S”型扩增曲线则为阳性，如无典型的“S”型扩增曲线则为阴性。

实施例3灵敏度和特异性检测

用优化后的LAMP检测方法对上述所有病毒的基因组/cDNA样本进行检测，评估本方法的特异性，同时设置灭菌水为阴性对照。另外，按照优化后的条件和程序对本方法灵敏度进行评估，采用10倍系列稀释的LSDV基因组样本(10^-1,10^-2,……,10^-7倍稀释)进行，来确定本方法的最低检测限。同时用荧光RT-PCR方法对以上样品进行检测，进行对比分析。具体实验结果见图1。

结果显示，LAMP方法在60℃恒温条件下，40min内最低检测限达10^-5倍稀释的LSDV基因组。荧光RT-PCR方法反应时间约70min，最低检测限为10^-6倍稀释的LSDV基因组。本发明所建立的LSDV LAMP检测方法，可特异性的检测牛结节性皮肤病病毒，而不与山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)山羊痘病毒属或其它相似病毒发生交叉反应；灵敏度高，与实时荧光PCR相比，灵敏度低10倍，但完全满足临床检测需求；反应可借助简单的恒温装置在40min内完成，相比实时荧光PCR而言更加节省仪器成本和时间成本。

另外，我们还与已经公布(中国专利申请CN111118211A)的组IV引物在同等实验条件下，即使用本申请优化后的LAMP检测方法，进行了检测灵敏度比较。具体试验果见图2。

结果发现，使用组IV引物检测的灵敏度仅为10^-3。而本申请不仅设计引物针对的靶基因与CN111118211A不同，而且在引物设计时，增加了一对环引物，进一步增加了LAMP反应的扩增效率，反应时间更快，灵敏度更高(灵敏度为10^-5)，对于临床样品快检而言，具有更高的准确性和实用性。

实施例4模拟样品及临床样品的检测

用两种方法同时检测40份模拟样品(本实验室保存的病毒基因组样本以不同的量混入健康牛的不同血液、组织样本中制备而成)和30份临床样品，结果荧光PCR方法和本发明建立的LAMP方法符合率为100％。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 牛结节性皮肤病病毒的LAMP检测引物、试剂盒及其应用

<130> JLP20I0883

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgcgactt catcgattg 19

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctccaattac atcactatct tgttc 25

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaacgaaac gtcatcgcct tgcacagttg ctgtatcggt a 41

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttggtaaaga tctttgtcta gcccctatca aattttgcaa catccg 46

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctaacaac aaaaaagaag a 21

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgctgagat aatatcgt 18

Claims

1.用于检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP引物组，其特征在于，所述引物组包括如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向外引物F3和反向外引物B3，如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的正向内引物FIP和反向内引物BIP，以及如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的环引物LF和LB。

2.根据权利要求1所述的LAMP引物组，其特征在于，所述引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB的摩尔比为：1:1:8:8:4:4。

3.权利要求1或2所述的LAMP引物组在制备用于检测牛结节性皮肤病病毒的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的LAMP引物组。

5.根据权利要求4所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒还包括以下部分或全部：LAMP反应液、DNA聚合酶、荧光染料或显色剂、阳性对照和阴性对照。

6.一种非诊断目的检测牛结节性皮肤病病毒的LAMP方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获取待测样本基因组DNA或cDNA；(2)配制LAMP反应体系；其中，所述体系中包含权利要求1或2所述的LAMP引物组；(3)扩增反应；(4)结果判读。

7.根据权利要求6所述的LAMP方法，其特征在于，所述扩增反应条件为：60℃恒温下扩增40min。