CN112941239A

CN112941239A - 一种快速检测牛结节性皮肤病病毒引物对、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN112941239A
Application number: CN202110376280.6A
Authority: CN
Inventors: 石远菊; 李雪平; 曹立辉
Original assignee: Guangzhou Yoyoung Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Yoyoung Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2021-04-08
Publication date: 2021-06-11

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测牛结节性皮肤病病毒引物对、探针及试剂盒。本发明基于牛结节性皮肤病病毒基因中的强保守区段作为靶基因，进行构建特异性引物对和探针，并对该探针进行荧光标记，有助于提高牛结节性皮肤病病毒的检测便捷性、灵敏度、特异性，同时缩短检测时间；另外，由该引物对和探针构建的牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，对牛结节性皮肤病病毒具有极高的检测特异性和灵敏度，其检测灵敏度达1×10^‑7ng/μL。

Description

一种快速检测牛结节性皮肤病病毒引物对、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体属于分子检测领域，涉及一种快速检测牛结节性皮肤病病毒引物对、探针及试剂盒。

背景技术

牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，LSD)是由牛结节性皮肤病病毒(lumpyskin disease virus，LSDV)引起的一种病毒性传染病，又称为牛疙瘩皮肤病、牛结节性皮炎和牛结节疹。该病是世界动物卫生组织(OIE)须通报的动物疫病，也是《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的一类传染病。

LSDV属于双链DNA病毒，基因组大小约为151kbp，由一个具有相同2.4kbp反向末端重复序列的中央编码区域156个假定基因组成，编码宿主范围、毒力和免疫逃逸的基因位于基因的末端。利用现场样本和疫苗毒株的限制性核酸内切酶对其DNA进行分析，表明其与羊痘病毒毒株之间的同源性可达80％，且与山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)的基因组核苷酸具有96％的同源性，因此简单的血清学方法很难将其区分。

现场作出初步快速诊断确认，是成功控制和根除流行地区和非流行地区LSD的基础。目前，首选的诊断工具为分子检测方法，且正逐步取代传统的检测方法。荧光定量PCR检测方法可特异性检测LSDV，而与山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒均无交叉反应，敏感性明显优于普通PCR，能够快速准确地检测LSDV，但是实时荧光定量PCR需要配套价格高昂的荧光定量PCR仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，因此难以得到全面推广。

酶促重组等温扩增((Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)技术是一种等温核酸扩增技术，它是利用抗体制药领域先进的Molecular Design、DirectedEvolution、Affinity Maturation等技术手段，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，通过不同的核酸扩增反应体系进行优化组合，从而获得核心的重组等温扩增体系，其反应体系类似于RPA，在40-42℃恒温条件下，可将微量DNA/RNA的特异性区段在数分钟内扩增数十亿倍。运用荧光ERA方法可快速鉴别LSDV，以便于及时采取相应的防控措施。

发明内容

为解决现有牛结节性皮肤病检测技术存在的耗时长、容易污染，对操作人员与操作环境要求高的问题，本发明提供一种快速检测牛结节性皮肤病引物对、探针及试剂盒，具有操作简单、耗时短，能够在现场快速检测，对于牛结节性皮肤病的高通量快速检测具有重要意义。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一组用于牛结节性皮肤病病毒快速检测的引物组，该引物组由一对特异性引物对和一条特异性探针组成，

其中，特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中，上游引物的核苷酸序列为：5’-TCACAGAAGAACAAGTTGGAGATGATTCAC-3’；所述下游引物的核苷酸序列为：5’-GAACAATCAAAAATTATGATTAATTCCATGTTG-3’；

特异性探针的核苷酸序列为：5’-AATATTCTGCTGCTCTTGCTAAAATGCCAAACGCACATGATTCCCTAATG-3’。

本发明根据Gene Bank上发表的牛结节性皮肤病毒(LSDV)全基因序列，在多序列比对分析的基础上，选取保守性强的片段作为目标扩增区段，与山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)存在碱基差异的序列设计探针，使得本发明设计的用于检测牛结节性皮肤病病毒的特异性引物对、探针，能够将牛结节性皮肤病病毒与山羊痘病毒、绵羊痘病毒进行有效区分，具有良好的检测灵敏性和特异性。

进一步地，特异性探针为荧光染料标记的探针，荧光染料为FAM、SYBR Green I、VIC、HEX、JOE、TAMRA、TET、Cy3、ROX、TEXAS-Red、Cy5中的一种；荧光猝灭基团为BHQ1。

进一步地，荧光报告基团为FAM。

本发明采用特异性荧光染料标记的探针进行检测，避免了荧光染料本身的非特异性，极大地提高了检测的特异性。

第二方面，本发明提供了上述引物组在制备牛结节性皮肤病病毒快速检测试剂盒中的应用。

进一步地，上述试剂盒为荧光ERA恒温快速检测试剂盒。

ERA技术在扩增时间、扩增特异性、扩增所需要的能耗等方面均具有明显的优势。ERA原理为通过反应体系中通常为28-35个碱基的两条特异性引物与重组酶形成复合物，在模板DNA上寻找同源序列发生链交换，并在DNA聚合酶作用下发生延伸；经过上下游引物在模板的特异性区段两端分别结合延伸，循环往复发生指数级扩增；扩增产物虽然可通过添加SYBR Green染料实现荧光信号的增加，但因荧光染料无法区分非特异性，因而本发明采用特异性荧光探针技术进行检测，从而大大提高了检测的特异性。

第三方面，本发明提供了一种牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物对和特异性探针。

进一步地，上述用于牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒还包括ERA溶解剂、ERA基础扩增试剂、阳性对照、阴性对照和激活剂。

进一步地，上述用于牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒种的阳性对照为LSDV阳性质粒，阴性对照为dd H₂O。

进一步地，上述试剂盒对牛结节性皮肤病病毒的检测灵敏度为1×10^-7ng/μL。

第四方面，本发明提供了一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的重组酶聚合酶扩增体系，该扩增体系包括前述特异性引物对和特异性探针。

进一步地，上述用于检测牛结节性皮肤病病毒的重组酶聚合酶扩增体系还包括DNA模板，该DNA模板为LSDV阳性质粒。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明以LSDV基因强保守片段为靶基因，构建特异性引物对和特异性探针，更好的区分非特异性扩增，有助于提高牛结节性皮肤病病毒的检测便捷性、灵敏度、特异性，同时缩短检测时间。

(2)与普通PCR检测方法相比，本发明的检测方法无需进行产物电泳验证，避免了假阳性结果出现，提高检测的准确度；并且本发明方法简便易行，无需操作复杂的仪器设备，节约了成本，提高了检测效率，便于在大范围内推广使用；与其他恒温扩增方法相比，本发明的检测方法所需时间更短，检测的准确率更高。

(3)本发明的检测方法依赖于酶促扩增反应，在恒定的温度下即可进行连续的扩增反应，其扩增速率远远高于常规的PCR变温反应。整个扩增在20分钟即检测完成；而且在操作上，不需要对多种参数进行设置，不需要具备很专业的技能也可以进行检测操作。

(4)本发明的反应条件为40～42℃，对温度控制无需严格控制，并且采用了特异性的荧光探针，可以更好的区分非特异性扩增；因此，对于基层测试使用更为便捷，且耗能更低，尤为适合现场操作。

附图说明

图1为本发明试剂盒对牛结节性皮肤病病毒的灵敏度检测结果图；

图2为牛结节性皮肤皮病毒的探针序列与山羊痘、绵羊痘序列对比图；

图3为本发明试剂盒对牛结节性皮肤病病毒的特异性检测结果图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1引物与探针的设计及阳性质粒的构建

1、引物与探针的设计

本发明选取牛结节性皮肤病病毒(LSDV)基因的保守序列作为靶基因，通过对LSDV基因的DNA序列进行分析比较，选定LSDV基因的高保守片段(SEQ ID NO.1)，以构建合成相应的特异性引物对和特异性探针，其中，特异性引物由交付于广州艾基生物公司合成，探针交付于湖州河马生物公司合成。

构建的特异性引物的长度为15-45核苷酸碱基，优选为28-35核苷酸碱基；探针长度为35-55个核苷酸碱基，探针中位于第28-35位的一个碱基被替换为核酸类似物，核酸类似物优选为THF，在THF的两侧分别为两个T碱基并标记荧光基团和猝灭基团，探针在3’末端通过封闭基团进行封闭。

优选的特异性引物及探针的核苷酸序列如下：

上游引物LSDV-F：

5’-TCACAGAAGAACAAGTTGGAGATGATTCAC-3’；

下游引物LSDV-R：

5’-GAACAATCAAAAATTATGATTAATTCCATGTTG-3’；

探针LSDV-P：

5’-AATATTCTGCTGCTCTTGCTAAAATGCCAA(FAM-dT)(THF)AC(BHQ1-dT)GCACATGATTCCCTAATG-3’(C3-SPACER)。

2、阳性质粒的构建

LSDV阳性质粒交付于生工生物工程(上海)股份有限公司合成，该阳性质粒中含有LSDV目的基因片段序列(SEQ ID NO.1)，将该基因片段构建至载体pBluescript II SK+中，制备成LSDV阳性质粒。具体序列及载体信息如表1所示。

表1 LSDV阳性质粒构建的序列及载体信息

实施例2一种牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒及其检测方法

本实施例基于实施例1构建的阳性质粒、特异性引物、探针制备本发明用于牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒。

1、试剂盒的组成

试剂盒的具体组成如表2所示，包括ERA预混液、ERA基础扩增试剂、阴性对照、阳性对照、激活剂，其中ERA基础扩增试剂购自苏州先达基因科技有限公司。

表2牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒的具体组成

2、试剂盒的使用方法

在每个试样管中，将43μL的ERA预混液加入ERA基础扩增试剂中，振荡混匀直至扩增试剂重悬，并短暂离心制成初级预混液；并向每个试样管的管盖上滴加2μL激活剂，再分别向试样管中加入待测核酸、阳性对照和阴性对照，分别制成相应的最终反应液，小心盖紧管盖，将最终的反应液上下颠倒混匀后，再瞬时离心后立即上机检测。用荧光扩增仪检测荧光的变化值，荧光扩增仪上设定的扩增温度为40～42℃，反应时间为20min，每30s记录一次荧光值，直至反应结束。

待测核酸可采用Takara的核酸提取试剂盒、Mini BEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver 5.0进行提取获得。

3、结果判定

当荧光检测仪阳性对照出现典型的“S”型扩增曲线，出峰时间≤15min；阴性对照为一条趋于平缓的水平直线，无任何扩增曲线出现，或出峰时间≥20min；则检测结果的判定方法如下：

阳性结果：出峰时间TT≤16min；

阴性结果：出峰时间TT≥20min；

当16min＜出峰时间TT＜20min，判定为可疑结果，需重复检测进行确认，再次检测结果仍然是16min＜出峰时间TT＜20min，应参照阴性对照出峰时间，若阴性对照出峰时间TT≥20min或无扩增曲线出现，则判定样品为阳性，其余情况判定为阴性。

实施例3试剂盒的检测灵敏度试验分析

本实施例通过对不同稀释梯度的阳性质粒进行检测，以分析本发明试剂盒的对牛结节皮肤病病毒的检测灵敏度，具体方法如下：

将实施例1中购得的4μg LSDV阳性质粒加入40μL TE(Tris-EDTA buffersolution)进行溶解，用Nano Drop标定阳性质粒的浓度，再用TE将阳性质粒稀释至10ng/μL，再10倍稀释至1ng/μL，随后10倍依次稀释至如下浓度梯度，并记为相应的质粒：

质粒1：1×10^-1ng/μL；质粒2：1×10^-2ng/μL；质粒3：1×10^-3ng/μL；质粒4：1×10^- ⁴ng/μL；质粒5：1×10^-5ng/μL；质粒6：1×10^-6ng/μL；质粒7：1×10^-7ng/μL；质粒8：1×10^-8ng/μL。

分别以上述8种不同浓度的质粒为模板，参照实施例2中试剂盒的ERA扩增方法进行灵敏度检测，结果如图1所示，表明本发明试剂盒对牛结节性皮肤病病毒的检测灵敏度为1×10^-7ng/μL。

实施例4试剂盒的检测特异性试验分析

本实施例分别以牛结节性皮肤病病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒为检测对象，以分析本发明试剂盒对牛结节性皮肤病病毒的检测特异度。

利用Takara的核酸提取试剂盒，基于Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer 5.0提取获得山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒疫苗，DNA提取过程按照试剂盒内标准抽提步骤进行，将提取好的核酸进行分装，冻存于-80℃备用。

其中，牛结节性皮肤病病毒的特异性探针与山羊痘、绵羊痘序列对比结果如图2所示，可以看出，三者之间仅仅只有一个碱基的差异，普通的检测方法难以将三者进行区分。

参照实施例2中试剂盒的使用方法对上述核酸样品以及牛结节性皮肤病病毒阳性质粒进行检测，结果如图3所示，可以看出，仅仅检测牛结节性皮肤病病毒阳性质粒出现正常扩增，阴性对照、山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒等疫苗均未出现扩增。

上述结果表明本发明试剂盒对牛结节性皮肤病病毒具有良好的特异性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州悦洋生物技术有限公司

<120> 一种快速检测牛结节性皮肤病病毒引物对、探针及试剂盒

<130> PZS2022370-

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> LSDV

<400> 1

ctcgagttaa acctgtaaat ggatactttt ttcattcaat cttttaagtc taatcattag 60

tgctgatttc actagcgaaa tatcgttgtc ggaaacgagg tctcgaagca ataccaacac 120

tttcacagaa gaacaagttg gagatgattc accaccccaa tattctgctg ctcttgctaa 180

aatgccaatc actgcacatg attccctaat gtaattttct tttttcaaca tggaattaat 240

cataattttt gattgttcaa atccaatttt agaatccaaa aacatgtttt tgacaaaagc 300

tgttagatca tttccaaata caagtgaggc atcctttttg aaagattcaa aaacaagctt 360

Claims

1.一组用于牛结节性皮肤病病毒快速检测的引物组，其特征在于，所述引物组由一对特异性引物对和一条特异性探针组成；

所述一对特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中，上游引物的核苷酸序列为：5’-TCACAGAAGAACAAGTTGGAGATGATTCAC-3’；所述下游引物的核苷酸序列为：5’-GAACAATCAAAAATTATGATTAATTCCATGTTG-3’；

所述特异性探针的核苷酸序列为：5’-AATATTCTGCTGCTCTTGCTAAAATGCCAAACGCACATGATTCCCTAATG-3’。

2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述特异性探针为荧光染料标记的探针，所述荧光染料为FAM、SYBR Green I、VIC、HEX、JOE、TAMRA、TET、Cy3、ROX、TEXAS-Red、Cy5中的一种；荧光猝灭基团为BHQ1。

3.权利要求1所述引物组在制备牛结节性皮肤病病毒快速检测试剂盒或重组聚合酶扩增体系中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为荧光ERA恒温快速检测试剂盒。

5.一种牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述用于牛结节性皮肤病病毒快速检测的一对特异性引物和一条特异性探针。

6.根据权利要求5所述牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ERA溶解剂、ERA基础扩增试剂、阳性对照、阴性对照和激活剂。

7.根据权利要求6所述牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为LSDV阳性质粒，所述阴性对照为dd H₂O。

8.根据权利要求5所述牛结节性皮肤病病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒对牛结节性皮肤病病毒的检测灵敏度为1×10^-7ng/μL。

9.一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的重组酶聚合酶扩增体系，其特征在于，所述扩增体系包括权利要求1所述特异性引物对和特异性探针。

10.根据权利要求9所述检测牛结节性皮肤病病毒的重组酶聚合酶扩增体系，其特征在于，所述扩增体系还包括DNA模板，所述DNA模板为LSDV阳性质粒。