CN112176103A

CN112176103A - 一种非洲猪瘟病毒荧光era恒温快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN112176103A
Application number: CN202011038302.XA
Authority: CN
Inventors: 曲光刚; 沈志强; 赵中伟; 王文秀; 侯运专
Original assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy; Shandong Lvdu Bio Sicience & Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy; Shandong Lvdu Bio Sicience & Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2021-01-05

Abstract

本发明涉及一种利用重组酶ERA扩增技术研制的非洲猪瘟病毒的荧光ERA恒温快速检测试剂盒、使用方法及应用。本发明以非洲猪瘟基因序列的保守区域K205R基因为靶基因，根据引物、探针设计原则设计出特异性引物与探针，并通过引物探针配对筛选实验，反应条件优化、特异性、敏感性及模拟临床样品验证等试验，最终建立准确、敏感、快速、简便的非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测方法，并组装了试剂盒，本发明利用荧光定量PCR仪，仅需恒温38℃条件下反应20min即可判定出结果，敏感可达1拷贝/μL。与传统PCR和荧光定量PCR相比，操作简单，检测时间短，可实现临床现场快速检测。

Description

一种非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体属于分子检测领域，涉及一种基于重组酶聚合酶扩增技术（ERA）用于非洲猪瘟恒温快速检测的试剂盒、使用方法及应用。

背景技术：

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒感染家猪或野猪引起的一种急性、热性、高度传染性的疾病，该病病程短、死亡率高，我国已将其列为一类动物疫病。自2018年我国确诊首例ASF以来该病已在全国范围内蔓延，对我国养猪业造成了巨大经济损失。ASF疫苗研发是一个世界性难题，当前国内外尚无有效的商品化疫苗。因此，早期诊断和淘汰病猪对ASF的防控具有重要意义。

当前农业农村部批准备案的ASF检测试剂种类主要包括荧光定量PCR、等温扩增和试纸条等三大类，其中以“非洲猪瘟病毒免提取快速荧光PCR检测试剂盒（北京纳百生物）”、“非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒（武汉科前）”等为代表的荧光定量PCR类检测试剂盒占据多数；少数等温扩增类试剂盒主要以环介导等温扩增（LAMP）技术为主，如“非洲猪瘟病毒LAMP荧光检测试剂盒（广州悦洋生物）”等，另外也包括少量以RAA扩增技术为基础的检测试剂盒，如中国农科院兰州兽医研究所的“非洲猪瘟病毒实时荧光RAA检测试剂盒”；试纸条类主要包括北京森康生物技术开发有限公司的“非洲猪瘟病毒抗原检测试纸条”等产品。但是，荧光定量PCR类试剂盒虽然敏感性较高，但实际使用过程中依赖于荧光定量PCR仪等大型设备，而且样品检测前需要经历繁琐的核酸过程，耗时费力；而以LAMP为基础的等温扩增类检测试剂盒最难以克服的一个问题是极易污染污染而导致假阳性；试纸条类检测试剂盒虽然使用方便，但是敏感性最高只能达到70%。

发明内容

为了解决现有的非洲猪瘟病毒检测检测技术存在的耗时长，容易污染，对操作人员与操作环境要求高的问题。本发明提供了一种非洲猪瘟荧光恒温快速检测试剂盒，用时短，操作简单，成本低，对操作人员与环境要求低，可实现临床现场快速检测，对非洲猪瘟病毒的高通量快速准确检测具有重要意义。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

在第一方面，本发明提供了一种用于非洲猪瘟病毒ERA荧光恒温快速检测试剂盒，所述试剂盒提供了一组用于非洲猪瘟恒温快速检测的引物与探针，具体选择非洲猪瘟病毒K205R基因的高度保守片段为靶基因，应用primerprere5.0软件，设计合成一套引物与探针。

将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最合适的引物与探针，所述引物与探针包括：

序列如SEQ ID NO.1所示引物ASFV-F，其中ASFV-F的具体序列如下：5'-AGGCTATGCCCT/CTACCTTCATCAAACACGA-3'；

序列如SEQ ID NO.2所示引物ASFV-R，其中ASFV-R的具体序列如下：5'-CTCATCCAATATGGCTTGAATTTCTGGTGT-3'；

序列如SEQ ID NO.3所示引物ASFV-P，其中ASFV-P的具体序列如下：5'-ACGAATGCGATGTTCTTCACGCGTAGCGAA[FAM-dT]GG[THF]CA[BHQ1-dT]CCTCGAATACTTTTC-3Spacer-3'。

其中，所述ASFV-F、ASFV-R、ASFV-P在所述试剂盒中终浓度为10 μM。

优选的，所述探针修饰如下：（1）第31位碱基用[FAM-dT]荧光基团代替；（2）第32位碱基用[THF]代替；（3）第33位碱基用[BHQ1-dT]代替；（4）3’端修饰3 Spacer；

在第二方面，本发明还提供一种非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，试剂盒包括以上所述的两条引物与一条探针，其序列分别为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3。

在实施方案中，本发明试剂盒还包括荧光冻干试剂、溶解剂、激活剂、阳性标准品、阴性标准品、八联反应管和初级预混液制备管。

在实施方案中，本发明所用引物与探针由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

在第三方面本发明提供试剂盒使用方法，所述方法包括：

（1）按照Axygen试剂盒说明书提取待检样本DNA；

（2）使用46μL溶解剂加入至荧光冻干试剂，涡旋5s后瞬时离心5 s，制备成初级预混液；

（3）将步骤（2）制备的初级预混液取23 μL分装于八联反应管；

（4）向步骤（3）中每个八联反应管盖滴加1 μL激活剂，反应液内加入1 μL步骤（1）中提取的待检样品DNA，制成最终反应液；

（5）将步骤（4）制成的最终反应液上下颠倒混匀后瞬时离心，立即上机检测；

（6）荧光定量PCR仪于38℃反应20min（30s一个循环，共40个循环）。

（7）报告基团设置：FAM；淬灭基团：BHQ1。

在第四方面，本发明还提供了所述引物和探针或者所述恒温快速检测试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的用途。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

第一，本发明针对非洲猪瘟K205R基因设计出一对特异性引物与探针，可实现对非洲猪瘟病毒的特异性检测；本发明将特异性引物与探针添加至溶解剂中，简化了操作步骤，从而减小因操作原因导致的误差。本发明在38℃恒温反应20min即可完成检测，而实时荧光定量PCR的1.5小时，普通PCR的3小时。

第二，本发明根据非洲猪瘟病毒K205R基因的特异性核苷酸序列设计引物和荧光探针，所用探针标记了FAM荧光基团，大量扩增后的产物能够与带有荧光标记的探针相结合，从而产生特定的荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况，从而实现对非洲猪瘟病毒检测的实时观测。可根据荧光定量PCR仪最终给出的CT值来判定检测结果。

第三，本发明检测结果更加准确和灵敏。本检测发明通过冻干技术将重组酶聚合酶扩增技术(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)所用的酶（重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶）制成荧光冻干粉，将特异性引物与探针添加至溶解剂，开发出更简便易行的ERA恒温扩增技术，利用改造的DNA重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列并启动DNA合成，对模板上的目标基因进行指数式扩增。由于酶的高度特异性，减少了错配的产生，从而降低检验出错的概率。本发明相对于其它依赖于温度退火的核酸扩增技术，它充分利用生物酶促反应的高度特异性，反应抑制物更少，有效减少假阴性结果，增加了检测结果的准确性；同时结合荧光检测技术，使得检测更加灵敏，可检测到1拷贝的病毒核酸。

第四，本发明有效解决了扩增产物的污染问题。扩增产物的污染是核酸检测的控制难点。本发明采用实时荧光闭管检测，使污染得到有效控制，减少污染产生，从而大幅度提高检测结果的可靠性。

附图说明

为了更清楚的说明本发明的技术方案，下面将对文中使用的附图做简单的介绍。

图 1. 非洲猪瘟病毒恒温扩增试剂盒三组引物和探针组合对比实验：1：SEQ IDNo. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3； 2：SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7； 3：SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10； 4：阴性对照。

图2. 非洲猪瘟病毒恒温扩增试剂盒引物敏感性实验：1：1×10⁴copies/μL；2：1×10³copies/μL；3：1×10² copies/μL；4：1×10¹copies/μL；5：1copies/μL；6-8：阴性对照。

图3. 非洲猪瘟病毒恒温扩增试剂盒特异性实验：1：非洲猪瘟病毒K205R基因（1×10⁴copies/μL）；2-8：猪瘟病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪细小病毒；伪狂犬病毒；猪圆环病毒2型病毒；阴性对照。

图4. 非洲猪瘟病毒恒温扩增试剂盒重复性实验：1-3：1×10⁴copies/μL；4-6：1×10³copies/μL；7-9：1×10² copies/μL；10：阴性对照。

具体实施方案

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面将结合实施例对本发明做进一步的描述，但并不是限制本发明的范围，仅作示例说明。

其中ERA核酸检测试剂盒购自先达基因公司；非洲猪瘟病毒K205R基因探针引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

根据报道的ASFV基因序列（GenBank accession number MH766894），选取ASFVK205R基因的保守片段作为检测基因片段，其序列为SEQ ID NO：4，委托上海捷瑞生物工程有限公司将其克隆到T载体上，作为阳性标准品。

实施例1. 设计引物与探针

本发明选择ASFV K205R基因的保守片段为靶基因，通过对GenBank中报道的ASFV基因的DNA序列进行分析比较，选定ASFV基因的高度保守片段，应用primerprere5.0软件设计合成一批引物与探针。

将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针。在本次试验中，共筛选得到三组较优的引物和探针组合，其中SEQ ID NO.1-3为第一组引物，SEQ ID NO.5-7为第二组引物，SEQ ID NO.8-10为第三组引物，其具体引物和探针序列如下表1所示：

表1 ASFV荧光ERA恒温快速检测试剂盒引物与探针核苷酸序列

经过大量的反应条件优化、对比实验和验证实验，并经过大量临床样品的检测应用评估，确定扩增效率与特异性最好的一对引物和一条探针，所述引物与探针包括：

序列如SEQ ID NO.1所示引物ASFV-F；

序列如SEQ ID NO.2所示引物ASFV-R；

序列如SEQ ID NO.3所示引物ASFV-P。

其中，所述探针修饰如下：（1）第31位碱基用[FAM-dT]荧光基团代替；（2）第32位碱基用[THF]代替；（3）第33位碱基用[BHQ1-dT]代替；（4）3’端修饰3 Spacer。

实施例2. 非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测方法建立

使用10⁴copy/μL质粒为阳性标准品，分别对反应温度及引物浓度进行了优化，获得最佳温度反应条件为38℃，最佳反应体系为40个循环，30s读一次荧光。

25 μL反应体系与步骤如下所示：

使用46μL溶解剂加入至荧光冻干试剂，涡旋5s后瞬时离心5 s，制备成初级预混液。

制备的初级预混液取23 μL分装于八联反应管中。

每个八联反应管盖滴加1 μL激活剂，反应液内加入1μL提取的待检样品DNA，制成最终反应液；

制成的最终反应液上下颠倒混匀后，瞬时离心5s，立即上机检测；

荧光定量PCR仪于38℃反应20min（30s一个循环，共40个循环）。报告基团设置：FAM；淬灭基团：BHQ1。

实施例3. 敏感性实验分析

以已知拷贝数的ASFV K205R基因DNA标准质粒为模板，用无核酸酶水将阳性标准品分别进行梯度稀释至1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、1×10¹copies/μL、1copies/μL、的4个稀释度，取每个稀释度的质粒为模板，结果显示本发明提供的序列为SEQ ID No：1-3的引物与探针组合具有很好的敏感性，检测限值为1copies/μL，而其他两套引物与探针敏感性不高，只有100 copies/μL，结果如表2所示。

表2 各组引物与探针敏感性实验结果

目前，商品化的非洲猪瘟荧光定量PCR 试剂盒的敏感性达到1-10 copies/μL，而普通PCR检测试剂盒的敏感性只能达到100-1000 copies/μL，本方法所建立的非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测方法敏感性可达到1 copies/μL，与荧光定量PCR检测方法在同一水平，同时远高于普通PCR检测方法的水平。

实施例4.特异性实验

利用已建立好的反应体系进行特异性试验，使用本发明设计的最优引物和探针对ASFV阳性质粒（1×10⁴copies/μL）、猪瘟病毒核酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸、猪细小病毒核酸、伪狂犬病毒核酸、猪圆环病毒2型病毒核酸进行检测，结果显示本发明提供的引物与探针具有良好的特异性，检测结果如表3所示

表3非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒敏感性实验结果

实施例5. 重复性实验

以1×10²copies/μL、1×10³copies/μL、1×10⁴copies/μL标准阳性质粒为模板，进行重复性试验。批内重复：3个模板在一次实验分别设置三个重复孔进行检测；批间重复：3个模板分别在间隔1天、3天与5天进行检测，通过 Ct 值计算恒温快速检测方法的变异系数，分析该方法的批间重复性。批内重复检测结果如表4所示，其变异系数为1.79%~3.63%，批间重复检测结果如表5所示，其变异系数1.74%~4.02%，表明该方法重复性良好。

表4非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒批内重复性实验结果

表5非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒批间重复性试验结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 山东绿都生物科技有限公司

山东省滨州畜牧兽医研究院

<120> 一种非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggctatgcc ctctaccttc atcaaacacg a 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcatccaat atggcttgaa tttctggtgt 30

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgaatgcga tgttcttcac gcgtagcgaa ggcacctcga atacttttc 49

<210> 4

<211> 618

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggttgagc cacgcgaaca gttttttcaa gatctgcttt cagcagtgga tcaacaaatg 60

gacactgtaa aaaatgacat aaaagacatt atgaaagaaa aaacgtcttt tatggtatca 120

ttcgaaaact ttatagaacg ttacgatacc atggaaaaaa atattcaaga ccttcagaat 180

aagtacgaag aaatggcggc caaccttatg accgtcatga cggatacaaa aattcagctt 240

ggagccatta tcgcccaact tgagattcta atgataaatg gcactccact tccggcaaaa 300

aagacaacaa ttaaggaggc tatgccctta ccttcatcaa acacgaataa tgaacaaacg 360

agtcctcccg cctcaggcaa aacaagtgaa acacctaaaa aaaatcccac gaatgcgatg 420

ttcttcacgc gtagcgaatg ggcatcctcg aatacttttc gagaaaagtt tttaacacca 480

gaaattcaag ccatattgga tgagcagttt gcaaacaaga ccgggatcga aagattgcat 540

gccgagggtc tttacatgtg gagaacccaa ttctctgacg aacagaagaa aatggtcaaa 600

gagatgatga agaagtaa 618

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggctatgcc cctaccttca tcaaacacga 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catccaatat ggcttgaatt tctggtgtta 30

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacctaaaaa aaatcccacg aatgcgatgt tcacgcgtag cgaa 44

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggctatgcc cytaccttca tcaaacacga 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgctcatcca atatggcytg aatttctggt 30

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacacctaaa aaaaatccca cgaatgcgat cttcacgcgt agcg 44

Claims

1.一组用于检测非洲猪瘟病毒的引物组，其特征在于，所述引物组由一对特异性引物与一条特异性探针组成，其具体序列如下：

2.一种非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒的引物组。

3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述ASFV-F、ASFV-R、ASFV-P在所述试剂盒中终浓度为10μM。

4.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光冻干试剂、溶解剂、激活剂、阳性标准品、阴性标准品、八联反应管和初级预混液制备管。

5.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物与特异性探针按10：3的比例添加入溶解剂。

6.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

（1）按照Axygen试剂盒说明书提取待检样本DNA；

（3）将步骤（2）制备的初级预混液取23μL分装于八联反应管；

（6）荧光定量PCR仪于38℃反应20min，其中30s一个循环，共40个循环；

（7）报告基团设置：FAM；淬灭基团：BHQ1。

7.根据权利要求2-6所述的非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述非洲猪瘟病毒荧光ERA恒温快速检测试剂盒可以用于实验室对非洲猪瘟病毒进行检测和鉴定。