CN110760619A

CN110760619A - 一种基于rpa方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针、试剂盒以及检测方法

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Publication number: CN110760619A
Application number: CN201911245018.7A
Authority: CN
Inventors: 杨鑫; 翟亚如; 王红宁; 马鹏; 李豪; 崔鹏飞; 张兰
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2020-02-07

Abstract

本发明公开了一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针、试剂盒以及检测方法，引物组和探针包括引物组和探针Probe；所述引物组包括正向引物RPA‑F和反向引物RPA‑R；引物组和探针Probe的总扩增产物大小为267bp；所述试剂盒，包括所述的引物组和探针；所述检测方法包括步骤：合成引物组和探针；RPA‑LFD检测方法的建立。本发明不需要复杂精细的仪器设备，减少了资金的投入；实施过程简单易操作，不需要专门的检测人员就可以现场进行检测；检测快速准确，能够实现非洲猪瘟的现场可视化检测，对非洲猪瘟病毒的防控具有重要的意义。

Description

一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针、试剂盒以及检测方法

技术领域

本发明属于非洲猪瘟病毒检测技术领域，具体涉及一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针、试剂盒以及检测方法。

背景技术

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条(侧流层析试纸条LFD)读取结果。因此RPA具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、结果读取多元化、操作简便等优点。目前在病原微生物的检测中PRA已经得到了广泛的应用，但在非洲猪瘟病毒的检测中应用较少。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。因此，RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，检测条件还需要进一步优化。

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性传染性疾病，可引起家猪的急性出血热，对家猪和各种野猪的致死率可高达100％，非洲猪瘟病毒的主要宿主是非洲野猪和疣猪，以吸食野猪血液为生的蜱虫作为传播媒介。由于非洲猪瘟对猪及其肉类的生产和贸易的国际经济和流行病学的影响，世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病(OIE,2012)，中国将其列为一类动物疾病，非洲猪瘟严重威胁了全球生猪产业，造成了巨大的经济损失。中国作为世界上最大的生猪生产国和猪肉消费国，非洲猪瘟的爆发，在一定程度上冲击着我国的生猪全产业链。目前我国对非洲猪瘟的严格防控，使得非洲猪瘟疫情得到了有效的控制，非洲猪瘟疫情大幅度下降，但是一套高效的检测方法对非洲猪瘟的防控工作具有重要的意义。

非洲猪瘟病毒引起的发热、食欲不振、精神抑郁、皮肤发绀、呼吸困难、呕吐、腹泻、流产等临床症状与经典猪瘟、蓝耳病、猪丹毒、伪狂犬、猪圆环病毒等的临床症状相似，单单只凭临床症状很难对其进行确诊，必须借助实验室检测方法进行，导致非洲猪瘟现场鉴别诊断困难。有关非洲猪瘟病毒检测方法很多，主流的检测方法为PCR、qPCR方法，这两种方法具有很好的特异性，并且qPCR方法也具有很高的灵敏性，但是两者对仪器设备的要求比较严格，需要精密的变温装置和专业技术，因此这两种方法只能在实验室条件下检测，并且需要较长的时间，限制了其在现场检测中的应用。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针、试剂盒以及检测方法，仅需要简单的恒温设备就可以实现现场检测，再结合侧向流层析技术(LFD)，通过设计的RPA引物、RPA探针，可快速、准确的实现非洲猪瘟病毒的检测和诊断的可视化。

本发明所采用的技术方案为：

一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针，包括引物组和探针Probe；所述引物组包括正向引物RPA-F和反向引物RPA-R；

正向引物RPA-F序列：

5’-ATTCTRATGATAAATGGCACTCCACTTCCGGC-3’；

反向引物RPA-R序列：

5’-CCTACTCGTCAAACGTTTGTTCTGGCCCTAGCTT-3’；

探针Probe的核苷酸序列由两部分连接而成，分别为第一部分和第二部分，其中第一部分的核苷酸序列为：

第一部分的序列：

5’-AATGAWCAAACGAGTCCTCCCGCCTCAGGAA-3’；

第二部分的序列：

5’-AACAAGTGAAACACCTAA-3’；

第一部分的5’端连接羧基荧光素，第二部分的3’端连接磷酸，第一部分的3’端和第二部分的5’端之间通过四氢呋喃连接。

进一步的，反向引物RPA-R序列的5’端用生物素修饰；引物组和探针Probe的总扩增产物大小为267bp。

进一步的，一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括所述的引物组和探针。

一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，包括步骤：

合成以下引物组和探针；

正向引物RPA-F序列：

5’-ATTCTRATGATAAATGGCACTCCACTTCCGGC-3’；

反向引物RPA-R序列：

5’-biotin-CCTACTCGTCAAACGTTTGTTCTGGCCCTAGCTT-3’；

探针Probe序列：

5’-FAM-AATGAWCAAACGAGTCCTCCCGCCTCAGGAA[THF]AACAAGTGAAACACCTAA-P-3’；

RPA-LFD检测方法的建立；

将正向引物、反向引物和探针加入到离心管中，再加入无引物再水合缓冲液，振荡并离心；将模板和灭菌水混匀后，放入上述离心管中，振荡并离心，此时的溶液为再水合溶液；将再水合溶液转移至反应微球中，吹打混匀直到整个微球重悬，然后加入醋酸镁，充分混匀，进行RPA-LFD反应恒温孵育后，得到反应产物；

将反应产物与PBST电泳缓冲液混合后得到稀释样本，将稀释样本转移至侧向流纸条的样本垫，然后将所述样本垫放入电泳缓冲液中，观察结果；若所述样本垫出现两条带为阳性；若所述样本垫只在对照线出有一条带为阴性。

进一步的，所述检测方法的反应总体系为50μL；其中浓度为10μM的正向引物RPA-F为2.1μL，浓度为10μM的反向引物RPA-R为2.1μL，浓度为10μM的探针Probe为0.6μL，无引物再水合缓冲液为29.5μL，模板1μL，无菌水为12.2μL，浓度为280mM的醋酸镁为2.5μL。

进一步的，所述恒温孵育的时间为15min。

进一步的，所述恒温孵育的温度为36℃。

进一步的，所述稀释样本是通过将2μL的反应产物与98μL的PBST电泳缓冲液混合得到的。

进一步的，所述样本垫上的稀释样本体积为10μL。

进一步的，放入样本垫的电泳缓冲液的体积为200μL。

本发明的有益效果为：本发明的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针、试剂盒以及检测方法，对仪器设备的要求不严格，仅需要简单的恒温设备就可以实现现场检测，再结合侧向流层析技术(LFD)，通过设计的RPA引物、RPA探针，可快速、准确的实现非洲猪瘟检测和诊断的可视化；本发明通过RPA-LFD的特异性检测结果显示，RPA引物不与其它病毒核酸序列反应，不产生假阳性结果；灵敏度结果显示，本发明的RPA-LFD检测线与OIE-qPCR检测线(最低可以检测10²个拷贝)一致。本发明构建的非洲猪瘟病毒RPA-LFD检测方法，最低检测到10²个拷贝模板，不需要复杂精细的仪器设备，减少了资金的投入；实施过程简单易操作，不需要专门的检测人员就可以现场进行检测；检测快速准确，30分钟内就能够实现非洲猪瘟的现场可视化检测，从而本发明对非洲猪瘟病毒的防控具有重要的意义。

附图说明

图1是不同反应时间的LFD试纸条的检测结果示意图。

图2是不同反应温度的LFD试纸条的检测结果示意图。

图3是灵敏性分析检测结果示意图。

图4是特异性分析检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。

本说明书中正向引物RPA-F序列：

5’-ATTCTRATGATAAATGGCACTCCACTTCCGGC-3’中的R等于(AG)；

探针Probe的第一部分的核苷酸序列：

5’-AATGAWCAAACGAGTCCTCCCGCCTCAGGAA-3’中的W等于(AT)。

基因合成和DNA提取

参照NCBI上公布的ASFV-SY18毒株K205R基因序列，送上海生工合成K205R全基因，将合成的基因克隆至pMD19-T中，将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中扩增，使用天根质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用Nanodrop 2000测质粒DNA浓度，此重组质粒即为K205R基因标准质粒，-20℃保存备用。

引物和探针的设计

对ASFV-SY18在内的16株NCBI上公布的ASFV毒株的K205R基因进行序列比对，参照RPA引物设计原则，设计特异性的RPA引物和探针，如表1所示。正向引物序列：

5’-ATTCT(AG)ATGATAAATGGCACTCCACTTCCGGC-3’；

反向引物序列：

5’-biotin-CCTACTCGTCAAACGTTTGTTCTGGCCCTAGCTT-3’；

探针序列：

5’-FAM-AATGA(AT)CAAACGAGTCCTCCCGCCTCAGGAA[THF]AACAAGTGAAACACCTAA-P-3’，引物和探针均送上海生工合成并标记。

表1引物列表

RPA-LFD检测方法的建立

在利用TwistAmp^TM nfo进行RPA反应时，反应总体系50μL，其中正向引物(10μM)2.1μL，反向引物(10μM)2.1μL，TwistAmp^TM nfo探针(10μM)0.6μL，无引物再水合缓冲液29.5μL，模板和水13.2μL，280mM醋酸镁2.5μL；

具体操作步骤包括：

(1)将正向引物、反向引物、探针按上述体积分别加入到离心管中，再加入29.5μl无引物再水合缓冲液，短暂振荡并快速离心；将1μL模板、12.2μL灭菌水放入PCR管中，混匀后，放入上述离心管中，短暂振荡并快速离心，此时的溶液为再水合溶液；

(2)将47.5μL再水合溶液转移至反应微球中，吹打混匀直到整个微球重悬；

(3)加入2.5μL280mM醋酸镁，并充分混匀，如果同时处理多个样品，可将醋酸镁加到反应管的盖子中，盖紧管子后，通过离心使醋酸镁进入再水合溶液中以激活反应。短暂振荡并快速离心；

(4)将反应管放入合适的恒温仪(40℃)中孵育20min；

(5)反应结束后，利用侧向流层析技术进行监测；

(6)吸取2μL反应产物，与98μL PBST电泳缓冲液混合；

(7)将10μL稀释样本转移至侧向流纸条的样本垫上；

(8)将试纸条末端的样本垫放入200μL电泳缓冲液中；

(9)2-5分钟后观察结果，阳性样品应该出现两条带，阴性样本只在对照线出有一条带。

RPA-LFD反应条件的优化

(1)为了确定最佳的反应时间，对反应时间进行优化，反应时间分别设置为5min、10min、15min、20min和25min，其他条件不变。

在进行RPA-LFD反应时间优化时，结果显示，反应时间为10min时，扩增产物即可在LFD试纸条上显示出检测结果，但是检测线并不是最明显的，反应时间为15min、20min、25min时，LFD试纸条上均有检测结果，但就检测线而言，反应时间为15min时检测线比其他时间要明显(如图1)。本实验选择15min为后续实验的反应时间。

(2)为了确定最佳的反应温度，利用优化过的时间，对反应温度进行优化，反应温度分别设置为36℃、38℃、40℃、42℃和44℃，其他条件不变。

利用优化的反应时间，进行RPA-LFD反应温度优化，结果显示，反应温度在36-44℃时，扩增产物均能在LFD试纸条上显示出检测线(如图2)，考虑到现场应用，本实验选择常规的温度36℃作为后续反应温度。即恒温孵育的时间为15min，恒温孵育的温度为36℃。

特异性评价

为了研究RPA-LFD与其他猪病毒模板之间是否会发生交叉反应，以古典猪瘟病毒，猪轮状病毒，猪流行性腹泻病毒，猪传染性胃肠炎病毒，蓝耳病毒、猪伪狂犬病毒为模板，利用优化的RPA-LFD反应条件，对RPA-LFD反应进行特异性评价，具体如下表2。

表2特异性研究中使用的毒株

附：CSFV，古典非洲猪瘟病毒；RVA，猪轮状病毒；PEDV，猪流行性腹泻病毒；TGEV，猪传染性胃肠炎病毒；PRRSV，蓝耳病毒；PRV，伪狂犬病毒；NA，未提交至GenBank。

用古典猪瘟病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、蓝耳病毒、猪伪狂犬病毒(分别对应图4中2-7)对所建立的RPA-LFD检测方法进行特异性检测结果评价；结果显示，RPA-LFD引物仅与非洲猪瘟病毒模板进行反应，LFD试纸条上显示质控线和检测线两条线，与其它病毒模板进行反应时，LFD试纸条上仅出现一条质控线，并未出现假阳性现象(如图4)。表明该检测方法不与其它猪病不发生交叉反应，具有高度的特异性。

灵敏性评价

使用NANO DROP 2000(Thermo，Shanghai，China)测量浓度的标准质粒，按照下式计算拷贝数：拷贝数(copies/ul)＝[DNA浓度(DNA ng/uL)/片段大小(bp)]×9.12×10¹¹。将标准质粒进行10倍倍比稀释，以每个稀释度的标准质粒为模板，同样用优化后的反应条件，对RPA-LFD反应进行灵敏性评价。

将保存的标准质粒进行10倍倍比稀释，不同稀释度下的标准质粒作为模板，进行RPA-LFD灵敏性评价，图3中N代表阴性对照，1-7表示标准质粒拷贝数分别为2.75×10⁷、2.75×10⁶、2.75×10⁵、2.75×10⁴、2.75×10³、2.75×10²、2.75×10¹copies/uL，结果显示，该检测方法检测的最低量为10²拷贝的模板(如图3)，OIE-qPCR最低检测线也为10²拷贝的模板，本实验建立的检测方法的检测线与OIE-qPCR检测方法检测线一致，说明本实验所建立的RPA-LFD检测方法具有较高的灵敏性。

综上，本发明以ASFV-SY18(中国分离的第一株非洲猪瘟病毒毒株)K205R基因为参考序列，与其它15株毒株的K205R基因序列进行比对，设计了特异性的RPA引物和探针，结合LFD技术，检测结果与qPCR结果一致，不利用精密的仪器设备，减少了资金的投入，操作简单，检测快速准确，实现了现场快速可视化检测。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims

1.一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针，其特征在于：包括引物组和探针Probe；所述引物组包括正向引物RPA-F和反向引物RPA-R；

正向引物RPA-F序列：

5’-ATTCTRATGATAAATGGCACTCCACTTCCGGC-3’；

反向引物RPA-R序列：

5’-CCTACTCGTCAAACGTTTGTTCTGGCCCTAGCTT-3’；

第一部分的序列：

5’-AATGAWCAAACGAGTCCTCCCGCCTCAGGAA-3’；

第二部分的序列：

5’-AACAAGTGAAACACCTAA-3’；

2.根据权利要求1所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针，其特征在于：反向引物RPA-R序列的5’端用生物素修饰；引物组和探针Probe的总扩增产物大小为267bp。

3.一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的引物组和探针。

4.一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：包括步骤：

合成以下引物组和探针；

正向引物RPA-F序列：

5’-ATTCTRATGATAAATGGCACTCCACTTCCGGC-3’；

反向引物RPA-R序列：

5’-CCTACTCGTCAAACGTTTGTTCTGGCCCTAGCTT-3’；

探针Probe序列：

5’-FAM-AATGAWCAAACGAGTCCTCCCGCCTCAGGAA[THF]AACAAGTGAAACACCTAA-P-3’；

RPA-LFD检测方法的建立；

5.根据权利要求4所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述检测方法的反应总体系为50μL；其中浓度为10μM的正向引物RPA-F为2.1μL，浓度为10μM的反向引物RPA-R为2.1μL，浓度为10μM的探针Probe为0.6μL，无引物再水合缓冲液为29.5μL，模板1μL，无菌水为12.2μL，浓度为280mM的醋酸镁为2.5μL。

6.根据权利要求5所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述恒温孵育的时间为15min。

7.根据权利要求6所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述恒温孵育的温度为36℃。

8.根据权利要求7所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述稀释样本是通过将2μL的反应产物与98μL的PBST电泳缓冲液混合得到的。

9.根据权利要求8所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述样本垫上的稀释样本体积为10μL。

10.根据权利要求9所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：放入样本垫的电泳缓冲液的体积为200μL。