CN110592286B

CN110592286B - 一种检测结节性皮肤病病毒的raa引物探针及检测方法

Info

Publication number: CN110592286B
Application number: CN201911002650.9A
Authority: CN
Inventors: 吴晓东; 樊晓旭; 李林; 南文龙; 赵洋; 蔡禹希; 郭利川; 应清界; 吴发兴
Original assignee: Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co ltd; CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Current assignee: Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co ltd; CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2039-10-21
Also published as: CN110592286A

Abstract

本发明公开了一种RAA荧光法检测结节性皮肤病病毒的引物、探针及检测方法，其中引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出结节性皮肤病病毒质粒，与支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒、牛呼吸合胞体病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒无交叉反应，特异性达100％；检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明提供的基于RAA荧光法快速检测结节性皮肤病病毒DNA的方法，灵敏度高，每反应检测灵敏度达到10copies/反应。

Description

一种检测结节性皮肤病病毒的RAA引物探针及检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测结节性皮肤病病毒的RAA引物探针及检测方法。

背景技术

结节性皮肤病(Knopvelsiekte，LSD)是一种牛的痘病，该病和羊痘都是由山羊痘病毒属成员引起的全身性感染疾病；其特征表现为发热，皮肤、黏膜和内脏器官出现结节，机体消瘦，淋巴结肿大，皮肤水肿，有时发生死亡。该病可损坏皮张并降低生产性能，尤其对奶牛损害更大，已被公认为OIE列出的跨境疾病，因而具有重要的经济意义。LSD病毒(LSDV)的基因组包含长大约150,000碱基对(bp)的双链DNA。LSDV和绵羊痘、山羊痘的地理分布不同，LSD的毒株，通常只见于牛；LSDV的传播主要是以节肢动物为媒介。LSD的发病率有一定的季节性，病死率达10％，主要发生在非本地牛。

LSDV的起源未知，历史上，LSD一直是非洲的流行病，然而，由于尚未知的因素，其范围已大幅扩大，自2012年以来，该疾病传播迅速广泛分布于中东、巴尔干地区、高加索和俄罗斯南部地区，由于其发病率高，导致非洲，亚洲，中东，俄罗斯和欧洲经济损失严重。据报道，2019年8月12日，经中国动物卫生与流行病学中心确诊，新疆维吾尔自治区伊犁州发生牛结节性皮肤病疫情，再次引起广泛关注。

在国际控制LSD期间获得的流行病经验表明：一旦在可疑动物中怀疑有皮肤病，及时诊断就会起到关键作用，及早发现病毒对于启动适当的疫情控制措施至关重要。

目前LSD主要诊断方法包括有：

a.现场诊断

严重的羊痘和LSD均有特征性的临床症状。但当两种疾病的症状表现轻微时，就容易与副痘病毒引起的绵羊和山羊传染性化脓性皮炎或牛的伪牛痘和丘疹性口腔炎混淆。大量昆虫叮咬或有荨麻疹时，也可能出现类似羊痘病毒感染的症状。

b.实验室诊断

实验室检测：在活体检测或死后剖检时，可从皮肤丘疹、肺部病变或淋巴结中采集病料，进行病毒分离和抗原检测。利用透射电镜观察典型羊痘病毒颗粒可对羊痘病毒进行实验室确诊。琼脂免疫扩试验(AGID)可以检测沉淀抗原(以羊痘早期病例的活检淋巴结为材料)和特异性免疫血清，但与副痘病毒有交又反应。羊痘病毒可以在绵羊、山羊和牛源组织培养物上生长，尽管野外毒株需要长达14d的生长期，或者需要一种或多种组织培养传代。目前已开发了用多克隆抗血清与重组的羊痘病毒免疫优势抗原反应检测抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)。利用山羊痘病毒针对融合蛋白基因和结合蛋白基因设计的引物进行基因检测的方法也有报道。

病毒中和试验是最特异的血清学检测方法。但由于羊痘病毒感染以细胞免疫为主，因此，当感染病毒动物体内只有低水平中和抗体产生时，中和试验检测就不够敏感。由于与其他痘病毒抗体有交叉反应，AGID和IFAT就不够特异。利用羊痘病毒P32抗原与检测血清进行的免疫印迹试验结果敏感、特异，但成本昂贵，普及困难。

LSD的诊断最初取决于临床症状，可通过病毒分离，电子显微镜检查；也可以通过免疫荧光，血清中和，琼脂凝胶沉淀，抗原捕获ELISA和Dot ELISA等方法确定抗原来进行明确诊断；此外，包括已经用于检测LSDV的常规方法：实时聚合酶链式反应(PCR)。但是所有上述方法都不适合在田间条件下或在检疫站进行，并需要高技能的员工和设备齐全的实验室；基于现有检测技术存在时间长、操作不方便及假阳性高等缺点，提供一种准确、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测LSD的RAA荧光法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种RAA荧光法检测结节性皮肤病病毒的引物、探针及检测方法，可实现在39℃条件下20min内完成结节性皮肤病病毒的检测，具有快速、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测的特点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供一种检测结节性皮肤病病毒的RAA荧光法扩增用的引物，包含有：

上游引物：5’-CTTATCCAAGACAGAATCGAACGGATTTAG-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物：5’-ATGTTGTGTATTTTTTATATAGCTAGATTATG-3’(SEQ ID NO：4)；

本发明还提供用于检测上述引物扩增产物的探针，所述探针序列如下：

5’-TTCCAAACATGAAGGAGATAAGCTTTTGCATTGGAAACATTA-3’(SEQ ID NO：6)；

所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5′端碱基数25bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3′端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基T，其中T用四氢呋喃残基替换；

修饰后的探针为：

5’-TTCCAAACATGAAGGAGATAAGCT/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/GCATTGGAAACATTA-3’。

进一步，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。

优选地，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

上述的引物和探针用于制备RAA荧光检测试剂盒。

进一步，本发明还他提供一种RAA荧光法检测尼帕病毒的方法，具体步骤如下：

1)提取待检测对象的核酸样品；

2)将恒温荧光基因检测仪接通电源进行预热，对反应参数进行设置；反应参数设置为39℃，反应时间：20min；

3)在25μL反应缓冲液中加入13.7μL水，浓度为10μM的2.1μL上述的上下游引物和0.6μL探针，充分混合后添加到RAA荧光基础反应试剂中混合，得到反应预混液；

4)在反应管盖上加2.5μL的Mg+，将4μL所述步骤1)中得到的核酸样品与所述步骤3)中得到的反应预混液充分混合，得到的反应体系放入恒温荧光基因检测仪检测荧光信号；

5)根据RAA-F1620检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mV判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mV的判定为阴性。

进一步，所述上游引物和下游引物的使用浓度为1～50μM。

优选地，所述上游引物和下游引物的使用浓度为10μM。

进一步，所述探针的浓度为1～50μM。

优选地，所述探针的浓度为10μM。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种RAA荧光法检测结节性皮肤病病毒的引物、探针及检测方法：

(1)本发明提供的引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出结节性皮肤病病毒，与支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒、牛呼吸合胞体病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒无交叉反应，特异性达100％；

(2)本发明提供的检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明提供的基于RAA荧光法快速检测尼帕病毒的方法，灵敏度高，每反应检测灵敏度达到10copies/反应；

(3)本发明提供的一种RAA荧光法快速检测结节性皮肤病病毒的方法，能方便快速准确地鉴定结节性皮肤病病毒，操作简便，检测时间短，20min内完成检测；无需像PCR一样，通过高温95℃变性使DNA解旋，再在50～60℃退火，最后在72℃完成延伸，只需在39℃下进行等温扩增即可完成检测；也无需像LAMP技术一样使用4～6条引物在65℃情况下进行扩增且容易产生假阳性。

附图说明

图1：本发明引物探针组合筛选结果图；

图2：本发明不同浓度结节性皮肤病病毒质粒灵敏度检测结果图；

图3：本发明结节性皮肤病病毒质粒重复性检测结果图；

图4：本发明结节性皮肤病病毒核酸的特异性检测结果图；

图5：本发明结节性皮肤病病毒临床样本检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

实施例1

选择结节性皮肤病病毒LSDV002 gene保守序列进行引物、探针设计在Genebank中找到相应的全基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用DNASTAR软件进行同源性分析和Blast序列分析，筛出结节性皮肤病病毒LSDV002 gene高度保守序列如下：

ATATTGTCTTGGATTTTTTCATCCTTATCCAAGACAGAATCGAACGGATTTAGGTTTCCAAACATGAAGGAGATAAGCTTTTGCATTGGAAACATTAATAATGAATACAAACTATATATAATTAAATTACATAATCTAGCTATATAAAAAATACACAACAT(SEQ ID NO.1)；

以筛选获得的高度保守序列作为检测目的基因片段，合成阳性质粒并进行引物、探针设计筛选检测。

以上结节性皮肤病病毒LSDV002 gene保守序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成DNA质粒，质粒大小3106bp。

(1)引物设计

设计RAA方法检测用的引物，上游引物和下游引物长度30～35bp；根据结节性皮肤病病毒LSDV002 gene保守序列，引物设计包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物各设计序列如下：

RAA-F1：5’-TTTTCATCCTTATCCAAGACAGAATCGAACG-3’；SEQ ID NO.2；

RAA-F2：5’-CTTATCCAAGACAGAATCGAACGGATTTAG-3’；SEQ ID NO.3；

RAA-R1：5’-ATGTTGTGTATTTTTTATATAGCTAGATTATG-3’；SEQ ID NO.4；

RAA-R2：5’-TAGCTAGATTATGTAATTTAATTATATATAG-3’；SEQ ID NO.5；

将上述引物组合成4个引物组合，引物组合见表1。

表1结节性皮肤病病毒特异性引物信息表

如图1所示，通过引物组合1、2、3、4分别与山羊痘病毒特异性检测，除组合3无明显扩增外，其他3组均有明显扩增，所以组合3的特异性较好，更优选为组合3，具体为：

RAA-F2：5’-CTTATCCAAGACAGAATCGAACGGATTTAG-3’；SEQ ID NO.3；

RAA-R1：5’-ATGTTGTGTATTTTTTATATAGCTAGATTATG-3’；SEQ ID NO.4。

(2)探针设计

1)采用RAA技术探针设计原则设计探针，根据结节性皮肤病病毒LSDV002gene保守序列，设计的探针序列为：

5’-TTCCAAACATGAAGGAGATAAGCTTTTGCATTGGAAACATTA-3’；SEQ ID NO.6。

2)选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团

根据实验仪器采用的是无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的RAA-F1620荧光基因检测仪，所检测的荧光为FAM荧光，因此荧光修饰基团选为FAM，荧光淬灭基团选为BHQ1；

也可以根据仪器检测荧光的性能，将荧光修饰基团选择为HEX、TET、JOE或VIC；荧光淬灭基团选择BHQ2或BHQ3；

但优选荧光修饰基团为FAM，优选荧光淬灭基团为BHQ1。

3)所述探针的修饰方法包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数25bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基T，碱基T用四氢呋喃残基替换；

5’-TTCCAAACATGAAGGAGATAAGCT/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/GCATTGGAAACATTA-3’。

(3)引物、探针及质粒均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

(4)基于RAA荧光法快速检测结节性皮肤病病毒的检测试剂，包括RAA荧光基础反应试剂、反应缓冲液、纯化水、乙酸镁、阳性质控品、阴性质控品、引物和探针；

RAA荧光基础反应试剂为经过低温冷冻干燥的冻干粉，购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为RAA-F1620，反应规格为50μL，使用前用反应缓冲液进行重溶，反应缓冲液为RAA荧光基础反应试剂配套试剂。

阳性质控品为含有结节性皮肤病病毒LSDV002 gene的重组质粒，浓度为1×10⁴copies/μL。LSDV质粒通过转接大肠杆菌培养并提取，得到质粒后用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算，按浓度梯度稀释制备1×10⁰copies/μl～1×10¹⁰copies/μL标准品备用。

阴性质控品为ddH2O或纯化水。上游引物和下游引物的浓度为10μM；探针的浓度为10μM。

实施例2

一种RAA荧光法检测LSDV病毒的方法，包括如下步骤：

(1)将待检样本组织均浆，按组织提取DNA方法提取核酸，-20℃保存备用；如样本为全血、血清、血浆采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；

(2)将恒温荧光基因检测仪RAA-F1620接通电源进行预热，对反应参数进行设置，反应参数设置为39℃，反应时间：20min；

(3)在25μL反应缓冲液中加入13.7μL的水，浓度为10μM的2.1μL上下游引物和0.6μL探针，充分混合后添加到RAA荧光基础反应试剂中混合，得到反应预混液；

(4)在反应管盖上加2.5μL的Mg²⁺，将4μL所述步骤(1)中得到的核酸提取液与所述步骤(3)中得到的反应预混液充分混合，得到的反应体系放入恒温荧光基因检测仪RAA-F1620检测荧光信号；

(5)根据RAA-F1620检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mV判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mV的判定为阴性。

相对荧光值＝测定荧光值-起始扩增荧光值(实际值标准化为500mV)

下面对本发明引物对探针的灵敏度、重复性和特异性进行检测。

1、灵敏度实验

(1)引物

上游引物：5’-CTTATCCAAGACAGAATCGAACGGATTTAG-3’；SEQ ID NO.3；

下游引物：5’-ATGTTGTGTATTTTTTATATAGCTAGATTATG-3’；SEQ ID NO.4。

(2)探针

探针序列为：

5’-TTCCAAACATGAAGGAGATAAGCTTTTGCATTGGAAACATTA-3’；SEQ ID NO.6。

采用荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(BHQ1)修饰探针；

修饰的探针为：

5’-TTCCAAACATGAAGGAGATAAGCT/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/GCATTGGAAACATTA-3’。

(3)制备质粒工作标准品，分别为：

工作标准品1，含有1×10⁶copies/μL LSDV病毒质粒非传染性DNA片段。

工作标准品2，含有1×10⁵copies/μL LSDV病毒质粒非传染性DNA片段。

工作标准品3，含有1×10⁴copies/μL LSDV病毒质粒非传染性DNA片段。

工作标准品4，含有1×10³copies/μL LSDV病毒质粒非传染性DNA片段。

工作标准品5，含有1×10²copies/μL LSDV病毒质粒非传染性DNA片段。

工作标准品6，含有1×10¹copies/μL LSDV病毒质粒非传染性DNA片段。

(4)灵敏度实施方法：

步骤1、配制反应液(按7个反应进行配制)：

从反应缓冲液中吸取175μL加入预先准备好的1.5mL EP管，分别加入95.9μL水，14.7μL引物，4.2μL探针(引物的浓度为10μM，探针的浓度为10μM)，充分混匀，得混匀后的反应液。

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

准备7个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45.5μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的7个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。

步骤3、加样反应

在以上7个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管盖上加2.5μL Mg+后，分别向管中加入4μL阴性质控品、4μL标准工作品6、4μL标准工作品5、4μL标准工作品4、4μL标准工作品3、4μL标准工作品2、4μL标准工作品1为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

将混匀的7个反应管放入恒温荧光基因检测仪RAA-F1620中，设定反应温度为39℃，反应时间20min。

根据RAA-F1620检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mV判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mV的判定为阴性。

检测结果如图2所示；结果显示20min内所有标准工作品均有扩增，结合几次灵敏性实验的重复结果进行分析，即在每个反应管中存在10copies，就可以在20min内检测出来，实现快速灵敏的检出结果。

2、重复性实验

(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。

(2)采用工作标准品6，(含有1×10copies/μL LSDV质粒非传染性DNA片段)进行8个验证重复性：

(3)重复性实施方法：

步骤1、配制反应液(按9个反应进行配制)：

从反应缓冲液中吸取225μL加入预先准备好的1.5mL EP管，分别加入123.3μL的水，18.9μL引物，5.4μL探针(引物的浓度为10μM，探针的浓度为10μM)，充分混匀，得混匀后的反应液。

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

准备9个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45.5μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的9个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。

步骤3、加样反应

在以上9个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管盖上加2.5μL Mg+后，在以上9个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中的一个加入4μL阴性质控品、其他8个反应管中分别加入4μL标准工作品3为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

将混匀的9个反应管放入恒温荧光基因检测仪RAA-F1620中，设定反应温度为39℃，反应时间20min。

检测结果如图3所示：结果显示全部在20min内均有扩增，重复性较好。

3、特异性实验

(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。

(2)特异性实验中LSDV、支原体、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛呼吸合胞体病毒(BRSV)、山羊痘病毒(GPV)、绵羊痘病毒(SPV)的样本核酸由国家外来动物疫病研究中心提供。

(3)样本提取方法：

组织样本先进行均浆，再按天根商品化组织提取DNA方法提取核酸；全血、血清、血浆按采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；-20℃保存备用。

(4)特异性实验实施方法：

步骤1、配制反应液(按9个反应进行配制)：

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

步骤3、加样反应

在以上9个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管盖上加2.5μL Mg+后，在以9个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中的1个加入4μL阴性质控品、其他8个反应管中分别加入4μL LSDV、支原体、IBRV、BVDV、BPIV、BRSV、GPV、SPV的样本核酸，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

检测结果如图4所示：结果显示只有LSDV核酸有明显扩增，其他如支原体、IBRV、BVDV、BPIV、BRSV、GPV、SPV的样本核酸均没有明显扩增，显示出良好的特异性。

实施例3实际样本检测

(1)引物、探针及阴性质控品序列与实施例1相同。

(2)实验中临床样本1～15共计15个，由国家外来动物疫病研究中心提供；

(3)样本提取方法：

组织样本先进行均浆，再按天根商品化组织提取DNA方法提取核酸；血清、血浆按采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；-20℃保存备用；

(4)实施方法

步骤1、配制反应液(按16个反应进行配制)：

从反应缓冲液中吸取400μL加入预先准备好的1.5mL EP管，分别加入219.2μL的水，33.6μL引物，9.6μL探针(引物的浓度为10μM，探针的浓度为10μM)，充分混匀，得混匀后的反应液。

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

准备16个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45.5μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的16个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。

步骤3、加样反应

在以上16个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管盖上加2.5μL Mg+后，在以上16个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中的一个加入4μL阴性质控品、其他15个反应管中分别加入4μL提取的核酸为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

将混匀的16个反应管放入恒温荧光基因检测仪RAA-F1620中，设定反应温度为39℃，反应时间20min。

检测结果如图5所示：结果显示15例LSDV样本核酸通过RAA检测方法和qPCR检测方法的结果一致性为100％；阴性对照样品无扩增，而阳性对照样品出现目标曲线。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国动物卫生与流行病学中心江苏奇天基因生物科技有限公司

<120> 一种检测结节性皮肤病病毒的RAA引物探针及检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atattgtctt ggattttttc atccttatcc aagacagaat cgaacggatt taggtttcca 60

aacatgaagg agataagctt ttgcattgga aacattaata atgaatacaa actatatata 120

attaaattac ataatctagc tatataaaaa atacacaaca t 161

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttttcatcct tatccaagac agaatcgaac g 31

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttatccaag acagaatcga acggatttag 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgttgtgta ttttttatat agctagatta tg 32

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tagctagatt atgtaattta attatatata g 31

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttccaaacat gaaggagata agcttttgca ttggaaacat ta 42

Claims

1.一种引物对和探针在制备检测结节性皮肤病病毒的试剂盒中的应用，其特征在于，所述的引物对是序列为SEQ ID NO：3的上游引物和序列为SEQ ID NO：4的下游引物；所述的探针的序列为SEQ ID NO：6；所述的探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，其中荧光报告基团修饰在探针序列离5′端碱基数25 bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3′端碱基数16 bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基T，其中T用四氢呋喃残基替换。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。