CN112941242A - 一种检测呼吸道合胞病毒引物、探针、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测呼吸道合胞病毒引物对，属于微生物检测技术领域。所述引物对，包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物选自分别具有SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的引物中的至少一种；所述下游引物选自分别具有SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的引物中的至少一种。本发明还公开了靶向所述引物对的扩增产物的探针，包括所述引物对和探针的试剂盒，以及所述引物对和探针在检测呼吸道合胞病毒中的应用。本发明克服了现有检测技术存在时间长、操作不方便及假阴性高等缺点，使呼吸道合胞病毒检测更快速、更灵敏、操作更简便、更加适用于实验室及现场快速检测。

Description

一种检测呼吸道合胞病毒引物、探针、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测呼吸道合胞病毒引物、探针、试剂盒及应用。

背景技术

急性呼吸道感染是各年龄段患者就诊和住院的常见原因，也是导致全世界人类发病和死亡的主要原因。其中，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是引起下呼吸道感染的主要病毒。RSV属副粘病毒科肺病毒亚科肺炎病毒属，是有包膜的单股负链RNA病毒。RSV病毒体在电子显微镜下呈不规则的球形和长丝状结构，直径约为100-350nm。RSV基因组约有15191-15226个核苷酸(nt)，可编码10种蛋白质，包括三种包膜蛋白(G、F、SH)，两种基质蛋白(M、M2)，三种衣壳蛋白(N、P、L)和两种非结构蛋白(NS1、NS2)。

由RSV引起的呼吸道感染可导致支气管炎、支气管肺炎和重症肺炎，甚至危及生命，且临床症状(如：咳嗽、鼻塞、鼻漏、咽喉痛和呼吸困难)难以与其他呼吸道病毒引起的肺炎区分开来。一些研究表明由RSV引起的婴幼儿肺炎和支气管炎比其他病原微生物比例高。全球5岁以下儿童RSV相关的急性下呼吸道感染的统计数据结果显示，约有22％的急性下呼吸道感染病例是RSV引起的，其中发展中国家的发病率是发达国家两倍以上。

目前尚无特异有效的RSV疫苗上市也无特异的治疗方法，因此RSV感染仍然是一个尚未解决的全球健康问题。快速、准确地检测RSV对监测和控制RSV的流行具有重要意义，也可为临床早期诊断提供可靠的依据，从而为医生选择合理的治疗方案提供依据。

目前对RSV的检测方法主要为三种，分别为分离培养鉴定、免疫学检测和分子生物学检测。此病毒的分离培养鉴定具有费时长，敏感性低，成本高，早期诊断易漏诊等缺点，不适用于现场疾病的快速诊断。免疫学检测技术主要包括免疫荧光检测技术(IFA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)和胶体金免疫层析等。用免疫学检测技术直接检测RSV病毒抗原，通常使用鼻咽分泌物样本，此类分泌物中病毒滴度较低且有其他与RSV共存的微生物存在，易出现假阳性，使诊断RSV感染较困难。另外，免疫荧光法检测技术对实验操作要求高，需要使用高质量的试剂和特殊设备(荧光显微镜)，因此，无法在基层或医疗条件差的地区应用推广。分子生物学检测技术兼具敏感性强、特异性高等优点，大大缩短了检测时间，提高了呼吸道感染病原体的检出率。但是像PCR、实时荧光定量PCR技术这类需要经过变性、退火、延伸的热循环步骤才能实现核酸扩增的分子检测方法，不仅试剂仪器成本昂贵，而且需要精密的检测设备和严格的操作流程，无法满足现场快速检测和大规模监测的需求。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明的采取的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种用于基于等温扩增检测呼吸道合胞病毒的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物选自分别具有SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的引物中的至少一种；所述下游引物选自分别具有SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的引物中的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，所述上游引物具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。进一步地，所述上游引物和所述下游引物核苷酸序列序列不超过30bp。在本发明的一些具体实施方案中，所述上游引物由SEQ ID NO.4所示核苷酸序列组成；所述下游引物由SEQ ID NO.7所示核苷酸序列组成。

本发明第二方面提供一种靶向本发明第一方面任一所述引物对的扩增产物的探针，所述探针具有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列，并且所述探针具有荧光修饰基因和荧光淬灭基团。

在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基TA，碱基A用四氢呋喃残基(Tetrahydrofuran，THF)替换；3’端利用阻断物修饰，抑制聚合酶对DNA链的延伸。

修饰后的探针为：

GTACTGTGACAATGCAGGATCAGTATCCTT[FAM-dT]T[THF][BHQ-dT]CCCACAAGCTGAAAC[C3-spacer]

实时荧光RAA检测体系中的探针长度一般为46-52个核苷酸碱基，3’端需要标记阻断物修饰，如C3-间隔、磷酸盐等，抑制聚合酶对DNA链的延伸。探针内部设计四氢呋喃(THF)脱碱基位点，该位点两侧分别为荧光基团和淬灭基团，荧光基团通常为FAM，淬灭基团通常为BHQ，核酸外切酶通过识别并切割探针上的THF位点来分离荧光基团和淬灭基团，产生荧光信号。只有当探针与模板DNA呈绑定状态，才发生切割。

本发明的第三方面提供一种基于等温扩增检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，包括本发明第一方面所述的引物对和第二方面所述的探针。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性质控品和/或阴性质控品。任选地，所述阳性质控品为含有呼吸道合胞病毒F基因的重组质粒，优选地，所述重组质粒的浓度为3×10⁴拷贝/μL，更优选地，重组质粒通过转接大肠杆菌培养并提取，得到质粒后用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算。任选地，所述阴性对照为水，优选地，为超纯水。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括反应缓冲液。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括Mg²⁺。

本发明第四方面提供一种检测呼吸道合胞病毒的方法，包括以下步骤：

S1，获得待测样本的核酸样本；

S2，以步骤S1获得的核酸样本为模板，利用本发明第一方面所述的引物对和本发明第二方面所述的探针进行等温扩增；

S3，根据扩增曲线，判断所述待测样本中呼吸道合胞病毒是否为阳性：

若有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mV判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mV的判定为阴性，其中：

相对荧光值＝测定荧光值－起始扩增荧光值。

在本发明的一些实施方案中，利用荧光基因检测仪进行等温扩增，并利用荧光基因检测仪中的阳性判定方法，按扩增曲线进行判断。在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光基因检测仪为江苏奇天基因生物科技有限公司的QT-F7200荧光基因检测仪。

在本发明的一些实施方案中，步骤S2中，等温扩增的体系为：25μL反应缓冲液，加入13μL纯水，浓度为10μM的上游引物和下游引物各2μL，1μL探针，以及2μL的RNA模板，充分混合后得到反应预混液，总反应体积为45μL。

在本发明的一些实施方案中，步骤S2中，等温扩增在37～40℃进行。

在本发明中，所述检测呼吸道合胞病毒的方法基于非诊断非治疗目的。

本发明的第五方面提供本发明第一方面所述的引物对和本发明第二方面所述的探针在制备用于检测受试者是否感染呼吸道合胞病毒的试剂盒中的应用。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明的RAA荧光法检测RSV的引物、探针及应用，克服了现有检测技术存在时间长、操作不方便及假阴性高等缺点，使RSV检测更快速、更灵敏、操作更简便、更加适用于实验室及现场快速检测。

利用本发明检测RSV，无需像普通PCR一样需通过高温、退火、延伸，只需在39℃下进行等温扩增即可完成检测。

利用本发明检测RSV易实现高通量，检测成本大大降低；且灵敏度高，每反应检测灵敏度达到20拷贝/反应。

附图说明

图1示出了本发明一个实施例设计的引物对扩增结果。框线为扩增效果较好的引物组合。

图2示出了本发明一个实施例中不同引物组合灵敏度检测结果。

图3示出了本发明一个实施例不同浓度呼吸道合胞病毒核酸灵敏度检测结果。

图4示出了本发明一个实施例呼吸道合胞病毒的特异性检测结果图。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1呼吸道合胞病毒引物和探针设计

在Genebank(www.ncbi.nlm.nih.gov))中找到呼吸道合胞病毒相应的全基因序列，运用DNASTAR软件进行同源性分析和Blast序列分析，筛出呼吸道合胞病毒F基因高度保守序列如下：

CTTGTTGGAAACTGCACACATCCCCTCTATGTACAACCAACACAAAGGAAGGGTCCAACATCTGTTTAACAAGAACCGACAGAGGATGGTACTGTGACAATGCAGGATCAGTATCTTTCTTCCCACTAGCTGAAACATGTAAAGTTCAATCGAATCGAGTATTTTGTGACACAATGAACAGTTTAACATTACCAAGTGAAGTAAATCTCTGCAACATTGACATATTCAACCCCAAATATGATTGCAAAATTATGACTTCAAAAACAGATGTAAGCAGCTCCGT(SEQ ID NO.1)

以筛选获得的高度保守序列作为检测目的基因片段，合成阳性质粒并进行引物、探针设计筛选检测。

根据以上呼吸道合胞病毒F基因保守序列合成DNA质粒，质粒大小6395bp。

(1)引物设计

设计RAA方法检测用的引物，上游引物和下游引物长度30～35bp；根据呼吸道合胞病毒F基因保守序列，引物设计包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物各设计序列如下：

F1：5’-AAACTACACACATCCCCTCTATGTACAACCAA-3’(SEQ ID NO.2)；

F2：5’-GAAGGATCCAACATCTGCTTAACAAGAACCGA-3’(SEQ ID NO.3)；

F3：5’-CTTGTTGGAAACTACACACATCCCCTCTAT-3’(SEQ ID NO.4)；

R1：5’-TGAATATGTCAATGTTGCAGAGATTTACCTCACTT-3’(SEQ ID NO.5)；

R2：5’-TTGAATATGTCAATGTTGCAGAGATTTACCTCAC-3’(SEQ ID NO.6)；

R3：5’-TGAATATGTCAATGTTGCAGAGATTTACCTCAC-3’(SEQ ID NO.7)。

将上述引物组合成9个引物组合，引物组合见表1。

表1呼吸道合胞病度特异性引物信息表

如图1所示，通过观察电泳条带大小及亮度，筛选出3对灵敏度较好的引物：第6组(F2和R3)，第7组(F3和R1)和第9组(F3和R3)。

通过比较三组引物出峰时间先后和荧光值高低，进一步对重复性、灵敏度进行验证(如图2所示)，发现F3和R3组成的引物对扩增效果更好。

(2)探针设计

1)根据呼吸道合胞病度F基因保守序列，设计的探针序列为：

5’-GTACTGTGACAATGCAGGATCAGTATCCTTTTATCCCACAAGCTGAAAC-3’(SEQ ID NO.8)

2)选择荧光报告基团和荧光淬灭基团

选择荧光报告基团选为FAM，荧光淬灭基团选为BHQ1。

3)所述探针的修饰方法包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基TA，碱基A用四氢呋喃残基替换；

修饰的探针为：

GTACTGTGACAATGCAGGATCAGTATCCTT[FAM-dT]T[THF][BHQ-dT]CCCACAAGCTGAAAC[C3-spacer]

(3)试剂盒

上述引物和探针可以制备成基于RAA荧光法快速检测呼吸道合胞病毒的检测试剂盒，还包括RAA荧光基础反应试剂、反应缓冲液、纯化水、乙酸镁、阳性质控品、阴性质控品、引物和探针。

阳性质控品为含有呼吸道合胞病毒F基因的重组质粒，浓度为3×10⁴拷贝/μL。质粒通过转接大肠杆菌培养并提取，得到质粒后用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算。

阴性质控品为超纯水。

实施例2RAA荧光法检测呼吸道合胞病毒

本实施例提供一种RAA荧光法检测呼吸道合胞病毒的方法，包括如下步骤：

(1)构建含目的基因片段的重组质粒，获得质粒提取液。

(2)将恒温荧光基因检测仪(江苏奇天基因生物科技有限公司，QT-F7200)接通电源预热，反应参数设置为39℃，反应时间：16min；

(3)在25μL反应缓冲液(杭州众测生物科技有限公司，S004ZC)中加入13μL的水，浓度为10μM的上下游引物各2μL(实施例1的F3和R3)和1μL探针(实施例1经修饰的探针)，以及2μL的RNA模板，充分混合后得到反应预混液，总反应体积为45μL；

(4)在反应管盖上加2.5μL的Mg²⁺，将4μL所述步骤(1)中得到的核酸提取液与所述步骤(3)中得到的反应预混液充分混合，得到的51.5μL的反应体系放入恒温荧光基因检测仪检测荧光信号；

(5)根据检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mV判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mV的判定为阴性。

相对荧光值＝测定荧光值-起始扩增荧光值(实际值标准化为500mV)

实施例3灵敏度实验

引物采用实施例1的F3和R3，探针使用实施例1经修饰的探针。

(1)制备质粒标准品，分别为：

标准品1，含有3×10³拷贝/μL呼吸道合胞病毒质粒非传染性DNA片段。

标准品2，含有300拷贝/μL呼吸道合胞病毒质粒非传染性DNA片段。

标准品3，含有100拷贝/μL呼吸道合胞病毒质粒非传染性DNA片段。

标准品4，含有50拷贝/μL呼吸道合胞病毒质粒非传染性DNA片段。

标准品5，含有20拷贝/μL呼吸道合胞病毒质粒非传染性DNA片段。

(2)灵敏度实验方法：

步骤1、配制反应液(按6个反应进行配制)：

从反应缓冲液中吸取255μL加入1.5mL EP管，再分别加入120μL超纯水，上下游引物各10μL，5μL探针，充分混匀，得混匀后的反应液。

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

准备6个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取40μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的6个RAA荧光基础反应试剂管中，充分溶解并混匀，构建反应体系。

步骤3、加样反应

在以上6个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管盖上加2.5μL Mg²⁺后，分别向管中加入4μL阴性质控品、4μL标准品1、4μL标准品2、4μL标准品3、4μL标准品4、4μL标准品5为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

将混匀的6个反应管放入恒温荧光基因检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间15分钟。

根据检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mV判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mV的判定为阴性。

相对荧光值＝测定荧光值-起始扩增荧光值(实际值标准化为500mV)

检测结果如图3所示：结果显示最快5分钟明显有扩增，15分钟内所有标准品均有较好扩增效果，结合几次灵敏性实验的重复结果进行分析，每个反应管灵敏度在95％的概率下可以达到30拷贝，即在每个反应管中存在30拷贝，就可以在15分钟内检测出来，实现快速灵敏的检出结果。

实施例4特异性实验

(1)引物、探针及阴性质控品序列与灵敏性实验相同。

(2)特异性实验中，腺病毒(ADV)、流感病毒A型和B型(FluA、FluB)、人鼻病毒(HRV)、副流感病毒(PIV)、冠状病毒(COV)、人偏肺病毒(HMPV)、人博卡病毒(HBoV)样本核酸由国家外来动物疫病研究中心提供。

(3)样本提取方法：

全血、血清、血浆按采用裂解、磁珠富集、洗涤、洗脱等步骤提取核酸；-20℃保存。

(4)特异性实验实施方法：

步骤1、配制反应液：

从反应缓冲液中吸取255μL加入1.5mL EP管，再分别加入120μL超纯水，20μL引物，5μL探针，充分混匀，得混匀后的反应液。

步骤2、RAA荧光基础反应试剂重溶

准备RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45.5μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的RAA荧光基础反应试剂管中，充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。

步骤3、加样反应

在以上配制好的RAA荧光基础反应试剂试管盖上加2.5μL Mg⁺后，在配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中的一个加入4μL阴性质控品、其他反应管中分别加入4μL呼吸道合胞病毒质粒、腺病毒、流感病毒A型和B型、人鼻病毒、副流感病毒、冠状病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒样本核酸，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

步骤4、检测及结果

将混匀的反应管放入恒温荧光基因检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间15分钟。

根据检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mV判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mV的判定为阴性。

相对荧光值＝测定荧光值-起始扩增荧光值(实际值标准化为500mV)

结果显示，只有呼吸道合胞病毒质粒有扩增，阴性对照没有扩增，其他如腺病毒、流感病毒A型和B型、人鼻病毒、副流感病毒、冠状病毒等病毒样本核酸均没有扩增，显示出良好的特异性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 美格医学检验所（广州）有限公司

<120> 一种检测呼吸道合胞病毒引物、探针、试剂盒及应用

<130> XYD202110370

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 283

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F gene

<400> 1

cttgttggaa actgcacaca tcccctctat gtacaaccaa cacaaaggaa gggtccaaca 60

tctgtttaac aagaaccgac agaggatggt actgtgacaa tgcaggatca gtatctttct 120

tcccactagc tgaaacatgt aaagttcaat cgaatcgagt attttgtgac acaatgaaca 180

gtttaacatt accaagtgaa gtaaatctct gcaacattga catattcaac cccaaatatg 240

attgcaaaat tatgacttca aaaacagatg taagcagctc cgt 283

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 2

aaactacaca catcccctct atgtacaacc aa 32

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 3

gaaggatcca acatctgctt aacaagaacc ga 32

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 4

cttgttggaa actacacaca tcccctctat 30

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 5

tgaatatgtc aatgttgcag agatttacct cactt 35

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 6

ttgaatatgt caatgttgca gagatttacc tcac 34

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 7

tgaatatgtc aatgttgcag agatttacct cac 33

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Probe

<400> 8

gtactgtgac aatgcaggat cagtatcctt ttatcccaca agctgaaac 49

Claims (10)

1.一种用于基于等温扩增检测呼吸道合胞病毒的引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物选自分别具有SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的引物中的至少一种；所述下游引物选自分别具有SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的引物中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述上游引物具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。

3.一种靶向权利要求1或2所述引物对的扩增产物的探针，其特征在于，所述探针具有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列，并且所述探针具有荧光修饰基因和荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间的碱基A用四氢呋喃残基替换。

5.一种基于等温扩增检测呼吸道合胞病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对和权利要求3所述探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和/或阴性质控品。

7.一种检测呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，获得待测样本的核酸样本；

S2，以步骤S1获得的核酸样本为模板，利用权利要求1所述的引物对和权利要求3所述的探针进行等温扩增；

S3，根据扩增曲线，判断所述待测样本中呼吸道合胞病毒是否为阳性：

若有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mV判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mV的判定为阴性，其中：

相对荧光值＝测定荧光值－起始扩增荧光值。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S2中，等温扩增的体系为：25μL反应缓冲液，加入13μL纯水，浓度为10μM的上游引物和下游引物各2μL，1μL探针，以及2μL的RNA模板，充分混合后得到反应预混液，总反应体积为45μL。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤S2中，等温扩增在37～40℃进行。

10.权利要求1所述的引物对和权利要求3所述的探针在制备用于检测受试者是否感染呼吸道合胞病毒的试剂盒中的应用。

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