CN116219075A - 可覆盖45种基因型合胞病毒的引物对、探针组合、检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可覆盖45种基因型合胞病毒的引物对、探针组合、检测方法及试剂盒，所述引物对包含第一上游引物、第二上游引物、第一下游引物和第二下游引物，所述探针组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的荧光探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的荧光探针。本发明的可覆盖45种基因型合胞病毒的引物对、探针组合、检测方法及试剂盒，能够实现单管三重PCR覆盖检测45种基因型的合胞病毒，并能区分出A亚型与B亚型，避免假阴性，保证高覆盖度、高灵敏性、高特异性和快速检出性。

Description

可覆盖45种基因型合胞病毒的引物对、探针组合、检测方法及 试剂盒

技术领域

本发明涉及人呼吸道病原体生物检测技术领域，具体来说，涉及一种可覆盖45种基因型合胞病毒的引物对、探针组合、检测方法及试剂盒。

背景技术

人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)，属于肺炎病毒属副黏液病毒科，是非节段性单股负链RNA，基因组全长约15.2kb，编码11个蛋白质，分别为非结构蛋白NS1、NS2、核衣壳蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M、小疏水蛋白SH、黏附蛋白G、融合蛋白F、M21、M22和多聚酶亚单位蛋白L，变异较大，尤其是黏附蛋白G的编码基因。RSV只有一个血清型，分为A、B两个亚型。目前国际上普遍依据黏附蛋白G第二高变区核苷酸序列对RSV进行基因分型，将RSV的A亚型分为15个基因型，RSV的B亚型分为30个基因型。

RSV是造成婴幼儿病毒性呼吸道感染住院的首要因素，也是世界范围内引起5岁以下孩童急性下呼吸道感染的重要病原体。全球范围内，几乎所有孩童在2岁前均感染过RSV。该病毒传染性强，但孩童免疫防御力弱，感染一次后还会重复感染，在每年的冬春季是北方孩童RSV感染的流行高发季节。对此，全球各大制药集团虽已在RSV疫苗和抗病毒药剂的研发上取得了一定进展，但目前仍无疫苗或有效的抗病毒药剂用于RSV感染的治疗，且唯一可用于RSV预防的人源化特异性抗体帕利珠单抗尚未引进国内临床应用。

由于不同亚型RSV的黏附蛋白G刺激机体产生的抗体不能提供亚型之间有效的交叉保护作用，不同亚型的存在是造成RSV反复感染的重要原因之一。由于不同亚型的RSV抗原结构不同，而且机体感染后产生的保护性抗体也存在显著差异。

RSV感染的临床表现差异很大，可以表现为症状轻微的上呼吸道感染或中耳炎，也可以表现为严重的下呼吸道感染，从临床上难以与其他呼吸道病原引起的感染区分，再加上各种基因型别众多，因此RSV感染的及时检出就显得格外重要。

目前可用于RSV检测的方法包括病毒分离培养、抗原抗体血清学检测、免疫荧光检测、核酸检测：

病毒分离培养，是检测RSV的传统方法，也是检测RSV感染的金标准，缺点是病毒分离费时费力，受制于出报告慢导致不适合用于临床RSV感染的诊断。并且由于RNA病毒的热不稳定性，阳性结果的取得依赖样本的质量和病毒载量。

抗原/抗体的血清学检测，采用酶联免疫反应原理，具有高灵敏度和特异性，主要用于血清流行病学监测或临床回顾性诊断，缺点是IgM抗体阳性不能单独作为临床RSV感染诊断的实验室指标，也不能用作早期快速病原诊断。

免疫荧光检测技术，一般采用的是荧光抗体技术检测样本中的RSV抗原，可分为直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。缺点是该检测不仅必须具有荧光显微镜，还需要有经验的研究人员。由于信号的荧光强度随时间的延长而逐渐消退，在普及应用上受到一定限制。

核酸检测，运用核酸检测方法进行RSV检测具有很高的灵敏度和特异性。能够同时快速地从呼吸道样本中鉴定出多种不同类型的呼吸道病原体核酸。

目前常用于临床RSV感染诊断的方法主要是抗原检测及核酸检测。抗原检测阳性意味着病毒在活跃的复制增殖状态，与临床表现相关性较好，急性期过后很快转阴性，但该方法的敏感性较核酸检测低。随着核酸检测技术平台的普及推广，RSV的核酸检测正在得到更为广泛的应用。

然而现有试剂盒虽然可以提供合胞病毒的检测，且进行A亚型与B亚型的区分，但靶序列的设计来源却仅限于A亚型的某个基因型与B亚型的某个基因型，一方面这些试剂盒所对应的检测引物及探针，在设计之初并未考虑覆盖该亚型内足够的基因型，另一方面这些试剂盒对于同属A亚型或B亚型中的其他基因型未做验证。经统计分析RSV的A亚型的传播已出现了15个基因型，B亚型的传播也出现了30个基因型。以A亚型在我国的流行统计数据为例，2008年以GA基因型流行为主，2010年至2013年以NAl基因型流行为主，如今则以0N1基因型为主(儿童呼吸道合胞病毒感染诊断、治疗和预防专家共识.中华实用儿科临床杂志，2020(04)：241-250)。不同基因型在传播过程中不断变异，WHO从2017年起先后在20多个国家和地区开展RSV监测试点，来建立和评估可行的RSV监测，发现ON1和BA9基因型已成为全球多个国家流行的优势基因型。但我国并没有加入该监测网络，这会拖慢国内对RSV的流行与变异的监控响应速度。再加上RSV属于RNA病毒，很容易变异，极易产生爆发，会很容易的从一个国家/地区传播到另一个国家/地区。如今我们面对的是人口密集，与国内外人员、物资交流频繁的高速发展时代，这就对不同基因型RSV病毒都能做到有效检出的能力提出了新的要求。

专利CN 108384898A公开了一种用于检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒及其使用方法，专利CNl01580883B公开了一种呼吸道合胞病毒实时荧光PCR检测试剂盒，但这两种试剂盒只检测A、B两个亚型并无设计及验证所覆盖具体基因型别，且检测需要2h。

发明内容

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种可覆盖45种基因型合胞病毒的引物对、探针组合、检测方法及试剂盒，能够克服现有技术的上述不足。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种可覆盖45种基因型合胞病毒的引物对和探针组合，所述引物对包含第一上游引物、第二上游引物、第一下游引物和第二下游引物，所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述探针组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的荧光探针和核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的荧光探针。

根据本发明的另一方面，提供了一种可覆盖45种基因型合胞病毒的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1所述的引物对和探针组合。

进一步地，所述试剂盒还包含内参引物探针MIX、缓冲液、逆转录酶、无核酸酶水、空白对照品、阳性对照品、内参对照品。

进一步地，所述空白对照品为生理盐水。

进一步地，所述阳性对照品为包含呼吸道合胞病毒A亚型与B亚型融合蛋白F基因序列的工程菌悬液。

进一步地，所述内参对照品为包含人核糖核酸酶P基因序列的工程菌悬液。

本发明还提供了一种非诊断目的的可覆盖45种基因型合胞病毒的检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)核酸提取：提取待检核酸样本；

(2)加样：在待测样本检测管、阴性对照检测管及阳性对照检测管中均加入合胞病毒检测引物探针MIX、内参引物探针MIX、缓冲液、逆转录酶、无核酸酶水和待测DNA；所述合胞病毒检测引物探针MIX包含引物对和探针组合，所述引物对包含第一上游引物、第二上游引物、第一下游引物、第二下游引物，所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述探针组合包含如SEQ ID NO.5所示的荧光探针和如SEQ ID NO.6所示的荧光探针；

(3)上机扩增：将步骤(3)加好样的检测管混匀、瞬时离心后，进行上机扩增；

(4)数据分析及结果判断：待反应结束后，若CT值≤37.5，则待测模板中包含呼吸道合胞病毒。

进一步地，扩增反应条件为：52℃逆转录10min，一个循环；98℃预变性2min，一个循环；98℃变性10s，60℃退火延伸及荧光检测40 s，共40个循环。

本发明的有益效果：

(1)通过对45种基因型合胞病毒所对应的239个国内外流行的病毒株系建立进化树模型及亲缘关系分析，将融合蛋白F里的一个特定区段作为检测靶标，既可以满足合胞病毒A亚型与B亚型的区分，同时还可以精准覆盖A亚型的15种基因型，以及B亚型的30种基因型，且不会受到其他非呼吸道病原微生物的序列影响，实现高覆盖度、高灵敏性、高特异性和快速检出性，使检测效率、特异性、敏感性、经济性、便捷性，相比于常规的单管多重或多管单重检测显著提高；

(2)根据上述进化及亲缘关系的分析结果，避开了即将变异的区域，从基因组全长约15.2kb里，选出大约160bp基因序列作为引物及探针的设计区域，最终确定其中的102bp为合胞病毒检测的引物探针最佳结合靶标区域；

(3)筛选出了针对合胞病毒所设计的特异性引物及探针，内参引物及探针，并经过反复调整试剂配方及反应检测程序，最终可以依靠一步法，在一管内实现单管三重PCR即可覆盖感染人呼吸道45种基因型合胞病毒的检测，并区分出A亚型与B亚型，还能避免假阴性，也可耐粗提取模板；

(4)本发明每次实验最多可以完成94个样本和2个对照(空白对照、阳性对照各一个)，且经实验验证检测包含A、B亚型在内的45种基因型别的样本，时间只需76min左右。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为RSV的A亚型所包含的15种基因型，72个株系所建立的进化树及亲缘关系；

图2为RSV的B亚型所包含的30种基因型，167个株系所建立的进化树及亲缘关系；

图3为RSV的A亚型及B亚型所包含45种基因型的引物及探针设计的范围选定区域；

图4为使用本发明所述方法可覆盖A亚型15种基因型合胞病毒的扩增曲线示意图；

图5为使用本发明所述方法可覆盖B亚型30种基因型合胞病毒的扩增曲线示意图；

图6为使用本发明所述方法可覆盖A、B两个亚型45种基因型合胞病毒的扩增曲线示意图；

图7为使用本发明所述方法检测阴性样本、内参引物的扩增曲线示意图；

图8为使用本发明所述方法检测阳性样本、合胞病毒与内参引物的扩增曲线示意图；

图9为使用本发明所述方法在低浓度下的精密度检测扩增曲线示意图；

图10为使用本发明所述方法在不同病原体检测中的扩增曲线示意图；

图11为使用本发明所述方法在不同核酸处理条件下的扩增曲线示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。

RSV感染在全球广泛流行，其流行受地理位置、温度和湿度等因素的影响。近年来，在黏附蛋白G第二高变区出现的含有碱基重复插入序列的0N1和BA9基因型成为全球多个国家流行的优势基因型。

因此，调查RSV各基因型别在全球人群中的流行规律，以及研发出可覆盖检出各国广泛流行的不同基因型的RSV，并且根据过往的基因型病毒序列，找出变异规律，预先设置检测靶点，对变异后的RSV病毒核酸也可有效检出的试剂盒就有非常重要的意义。目前，全球尚缺乏系统的RSV监测网络。

为达到检测可覆盖上述45种基因型的目的，本发明采用如下的技术路径：

待检基因型的选择：

研究表明，RSV的A、B这两个亚型在一个国家或地区，一段时间内存在以单一亚型流行为主或A、B亚型共流行的特征，且其中一个亚型流行一段时间后会被另一个亚型取代而继续流行。在我国RSV的A、B亚型呈交替流行，比如在北京2006.7-2016.6这10年间的调查显示，RSV亚型转换模式为A-A-B-B-A-A-B-AB-A-AB。而在浙江南部2009-2014年的RSV亚型转换模式为B-A-A-B-B。相邻或相同年份里，南北方流行规律相似但有不同，展开来说是每个亚型里面根据基因型又分为不同的病毒株，并且每年的优势病毒株还不停轮换，防不胜防。因此虽然临床对于RSV感染后的诊疗方案无论是A型还是B型，两者都一样。但由于该病毒属于RNA病毒，很容易变异，因此一线仍旧有每年RSV流行时各亚型分布的检出需求(比如疾控中心)，这就要求所用试剂不仅可以区分型别，同时也对所检A、B这两个亚型中各基因型的有效覆盖(A亚型分为15个基因型，B亚型分为30个基因型)，避免漏检，提出了很高的要求。

待检靶标的筛选：

为确认上述45种基因型的保守区段，找出规律性，从数据库NCBI中下载人类合胞病毒历年来世界范围内主要流行的型别的全长序列，包括RSV的A亚型的15个基因型(GA1～7、NA1～4、ON1～2、SAA1和CBA)，B亚型的30个基因型(GB1～4、BA1～14、BAc、SAB1～4、URU1～2、CB1(GB5)、CBB、BA-CCA、BA-CCB和THB)。经过初步的序列比对后发现，由于不同研究对基因型鉴定标准尚不统一，所以分型结果所对应的保守性方面也存在一定差异，这在过往研究中也有所体现，且不同流行株系的突变情况差别较大。因此，再度从NCBI下载国内和国外流行株系，并扩大到239个(A亚型15种基因型，72个株系，B亚型30种基因型，167个株系)，然后按照FASTA格式进行储存(GenBank编号参见表1)，可以全面覆盖45种基因型，每个基因型2-8个流行株系。目的是避免由于株系的变异，导致通常仅依靠少量株系进行保守性分析而使得结果不准。

表1 RSV的A亚型所包含15种基因型的72个株系，以及B亚型所包含30种基因型的167个株系NCBI中的GeneBank编号

应用ClustalX和DNAMAN 6.0软件进行序列比对，调整并剪接每个株系的序列，使之在比对后首位对齐。

建立进化树模型及亲缘关系分析并找出最合适的靶标：

将上述45种基因型的A亚型(15种基因型，72个株系)与B亚型(30种基因型，167个株系)的239个国内外流行株系的序列，分别应用MEGA 5软件，采用邻位相连法(Neighbor-joining)建立进化树，为防止进化树的拓扑结构有错误，bootstrap选择1000，建好的进化树如图1-2所示。最后使用Maximum Likelihood算法作为检验，发现两种算法的树形没有显著差别。

对亲缘关系进行分析(合胞病毒的A、B亚型的各区段进化树分析)，发现编码合成RSV两个重要膜表面糖蛋白，即黏附蛋白G、融合蛋白F的序列变异情况非常明显，尤其是黏附蛋白G。其它诸如非结构蛋白NS1、NS2、核衣壳蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M、小疏水蛋白SH、M21、M22和多聚酶亚单位蛋白L等的变异虽然不多，但在A亚型与B亚型的之间随机分布，且没有型别区分，也无规律可言。与黏附蛋白G相比，融合蛋白F无论在亚型间或是亚型内均具有较高的保守性，可以满足合胞病毒A亚型与B亚型的区分，因此，选定CDS序列里5718-7442bp之间的融合蛋白F作为范围靶标。

由于合胞病毒属于RNA病毒，自身变异率较大，不同型别间保守区域过于狭窄，倘若按照传统方案采用一个型别使用一对引物及一条Taqman探针，这就意味着为覆盖45个基因型，就需要在多管中实现45对引物及45条Taqman探针的45重PCR，一方面造成对单一型别检测的灵敏度下降，另一方面也使得试剂成本提高45倍。因此不仅要找出这些合胞病毒亚型及基因型的保守区域，还需要根据进化及亲缘关系的分析结果，找出变异规律，预先设置检测靶点，去避开即将变异的区域，从而对变异后的RSV病毒核酸也可有效检出。结合ClustalX和DNAMAN 6.0对序列的比对结果，从基因组全长约15.2kb里，挑选出大约160bp基因序列作为引物及探针设计的范围区域(如图3方框中的区域所示)，可精准覆盖A亚型的15种基因型，以及B亚型的30种基因型，最终确定其中的102bp为合胞病毒检测的引物探针最佳的结合靶标区域。

引物及探针设计：

为了达到一方面满足A、B亚型间的检出需求，同时在另一方面也可以兼顾覆盖所对应基因型，本发明采用在同一管内进行三重PCR的手段，且所用引物对、探针均对A、B亚型有区分，具体为：

第一重检测，检测是否存在A亚型的15种基因型的合胞病毒：

第一上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第一下游引物，核苷酸序列如SEQID NO.3所示，第一上游引物和第一下游引物的靶标为融合蛋白F序列，结合位点均在A亚型内高度保守，在B亚型有多个点突变，可以专一扩增出A亚型的序列，不会受到B亚型序列的影响。

检测A亚型合胞病毒的Taqman探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针的靶标为融合蛋白F序列，结合位置在A亚型内高度保守，在B亚型有连续碱基突变，可以通过荧光(如FAM基团)指示A亚型序列的存在，不会受到B亚型序列的影响。

第二重检测，检测是否存在B亚型的30种基因型的合胞病毒：

第二上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第二下游引物，核苷酸序列如SEQID NO.4所示。第二上游引物和第二下游引物的靶标为融合蛋白F序列，结合位点均在B亚型内高度保守，在A亚型有多个点突变，可以专一扩增出B亚型的序列，不会受到A亚型序列的影响。

检测B亚型合胞病毒的Taqman探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。探针的靶标为融合蛋白F序列，结合位置在B亚型内高度保守，在A亚型有连续碱基突变。可以通过荧光(如VIC基团)指示B亚型序列的存在，不会受到A亚型序列的影响。

第三重检测，检测是否存在人源样本，避免假阴性：

内参检测具体为：上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO7所示)、下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO8所示)可有效扩增人核糖核酸酶P(RNaseP)的78bp，内参基因的探针(核苷酸序列如SEQ ID NO9所示)通过荧光(如Cy5基团)指示内参的存在，进而指示人源样本的采集、提取及扩增是否在控，避免假阴性。

选择合适的检测方案及试剂：

通常情况下，对于RNA的检测，采用的是两步法，即第一步，操作者在加样后，由常规PCR仪进行RNA的反转录；然后更换检测管，操作者再进行第二步，由荧光定量仪器检测是否有目标物。两步法连续进行所用的时间通常是在3.5-6h。

然而合胞病毒的遗传物质为RNA，一旦经过核酸提取后，由于RNA本身的结构特性(RNA分子结构的糖环，比DNA分子结构的糖环多一个自由羟基)，导致天然就容易发生降解，再加上环境中大量的RNA酶，这就需要操作者尽可能快的完成检测。

因此本发明选择一步法，但由于一般商品化的一步法试剂，在一管内完成逆转录及荧光检测，不同品牌的效能差异明显，而且反应条件及效率又互有冲突(比如逆转录通常选用温度37-55℃，但荧光检测试剂用酶最适温度在72℃，再加上引物和探针退火在55-65℃等升降温的影响)，本发明对所用试剂及反应条件进行了优化与验证，技术方案如下。

实施例1

一种可覆盖45种基因型合胞病毒的引物对和探针组合，所述引物对包含第一上游引物、第二上游引物、第一下游引物和第二下游引物，所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即TCTGCAACATTGACATATTCAACC，所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，即TTTGTAACACTGACATATTCAATT，所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，即ACACAATGGCTCCTAGAGATGTG，所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，即ACACTATAGCTCCTAGAGAAGTAAT，所述探针组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的荧光探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的荧光探针，其中，核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示(即GGAGCTGCTTACATCT)的荧光探针为检测A亚型合胞病毒的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(即TGAGCTGCTTATGTCT)的探针为检测B亚型合胞病毒的探针。

上述引物对和荧光探针是采用PCR技术，经过大量筛选试验，通过来自国内外各基因型别合胞病毒的标准品核酸的验证，最终确定的最佳序列。

实施例2

一种可覆盖45种基因型合胞病毒的试剂盒，含有实施例1所述的引物对和探针组合。

实施例3

一种可覆盖45种基因型合胞病毒的试剂盒，含有实施例1所述的引物对和探针组合、内参引物探针MIX、缓冲液、逆转录酶、无核酸酶水、空白对照品、阳性对照品、内参对照品。所述空白对照品可以为生理盐水，所述阳性对照品可以为包含呼吸道合胞病毒A亚型与B亚型融合蛋白F基因序列的工程菌悬液，所述内参对照品可以为包含人核糖核酸酶P基因序列的工程菌悬液。

实施例4

一种非诊断目的的可覆盖45种基因型合胞病毒的检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)从待测口咽拭子中，提取核酸。

(2)以步骤(1)提取到的核酸作为模板，向PCR薄壁管内，添加合胞病毒检测引物探针MIX、内参引物探针MIX、缓冲液、逆转录酶，以无核酸酶水将反应体系补足到20μl。(因微量移液器的最小量程限制，实际操作时，可通过一次配制多人份的方式，保证移液的准确性)

(3)将步骤(2)加好的PCR管，盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s。

(4)将步骤(3)的PCR管，放进ABI 7500荧光定量PCR仪内。

(5)在PCR仪上设定属于一步法的反应程序：52℃逆转录10min，一个循环；98℃预变性2min，一个循环；98℃变性10s，60℃退火延伸及荧光检测40s，共40个循环。

(6)待反应结束后，若合胞病毒A亚型检测曲线的CT值≤37.5，则待测模板中包含呼吸道合胞病毒A型；若合胞病毒B亚型检测曲线的CT值≤37.5，则待测模板中包含呼吸道合胞病毒B型；若内参基因检测曲线的CT值≤36，则待测模板中包含内参，该样本的质控在控，该样本的检测结果可靠。

其中，缓冲液可采用占总反应体积1/2的

Probe qPCR Master Mix withdUTP、占反应体积1/50的SSIV buffer和1.2μM的carboxy-Xrhodamine(CXR)reference dye共同配制而成，配制成的缓冲液在总反应体积20μl中的添加量为12.5μl，缓冲液的终浓度为1×(即缓冲液中各组分在反应体系中的浓度与1×缓冲液相同)；逆转录酶可选用SuperScript IV逆转录酶，逆转录酶在反应中的总添加量为50U。

合胞病毒检测引物探针MIX的配制：按照浓度均为60μM的上游引物(由第一上游引物、第二上游引物各30μM组成)0.125μl、下游引物(由第一下游引物、第二下游引物各30μM组成)0.125μl与浓度均为100μM的检测A亚型合胞病毒的荧光探针(FAM基团)0.04μl、检测B亚型合胞病毒的荧光探针(VIC基团)0.04μl的比例构成(大量配制时，可抽取相对应的试剂，按倍数放大体积混合成为合胞病毒检测引物探针MIX)，合胞病毒检测引物探针MIX的添加量可以为0.33μl。

内参引物探针MIX由浓度均为40μM的内参基因上游引物(核苷酸序列为GCCTGGCTTTTGAACTTGTCT，如SEQ ID NO.7所示)、下游引物(核苷酸序列为TGAGGGCACTGGAAATTGTAT，如SEQ ID NO.8所示)各0.125μl，浓度为100μM内参基因(Cy5基团)探针(核苷酸序列为TAGCCCTGCTATCA，如SEQ ID NO.9所示)0.03μl，无核酸酶水0.72μl构成，添加量可以为1μl。

口咽拭子如果经过核酸提取试剂盒提取，则核酸添加量可在2-4μl之间任选，且最低添加量为2μl；口咽拭子如果经过煮沸法等采用粗提操作获得的核酸，添加量为3μl。

实施例5

核酸的提取：取外购自国际标准品(西班牙Vircell、英国NIBSC)、国内质控品的出厂已灭活的，感染人呼吸道合胞病毒及假病毒等人工合成序列，包含A亚型的15个基因型(GA1～7、NA1～4、ON1～2、SAA1和CBA)，各一管。使用全自动核酸提取仪提取合胞病毒核酸，并溶于100μl洗脱液，使用nanodrop测定核酸浓度及纯度后，按照每份20μl分装于多个0.2ml单管内，做好标记并冻存于-80℃冰箱。

核酸的稀释：吸取上一步的核酸原液，每个基因型抽取5μl，先调整到相近浓度后，再使用无核酶的超纯水，分别稀释400倍，按照每份50μl分装于多个0.2ml单管内，做好标记并冻存于-80℃冰箱。

特异性引物合成及稀释：外送英潍捷基合成针对合胞病毒检测特异性引物序列SEQ ID NO.1-4。将引物用无核酶的超纯水配制成针对合胞病毒检测的特异引物对，分为60μM的上游引物(由上游第一引物、上游第二引物各30μM组成)和60μM的下游引物(由下游第一引物、下游第二引物各30μM组成)，各一管，然后分装成多个小份后，冻存于-20℃冰箱。

特异性探针SEQ ID NO.5-6的合成及稀释：外送英潍捷基合成针对合胞病毒检测的特异性探针序列SEQ ID NO.5-6。制成浓度为100μM的Taqman探针，检测A亚型的探针采用FAM基团；检测B亚型的探针采用VIC基团。

配制合胞病毒检测引物探针MIX：按照合胞病毒特异性上游引物0.125μl、下游引物0.125μl、检测A亚型的荧光探针0.04μl、检测B亚型的荧光探针0.04μl的比例，抽取相对应的试剂，按倍数放大体积混合成为合胞病毒检测引物探针MIX。

扩增体系的配制：每种基因型的待检核酸样本，分别配制一管特异性引物探针组合的检测体系，每管均是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水2.92μl(因微量移液器的最小量程限制，实际操作时，可通过一次配制多人份的方式，保证移液的准确性，下同)，然后加入4μl的待检核酸样本。

对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水2.92μl(因微量移液器的最小量程限制，实际操作时，可通过一次配制多人份的方式，保证移液的准确性，下同)，然后加入4μl的已提取核酸的对照样本(分为空白检出对照、阳性检出对照、内参检出对照，下同)。

盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s；

荧光定量检测的反应条件设置：使用ABI公司的7500型号的荧光定量PCR仪，检测模式选择为“Quantitation”，“TaqMan Reagents”。程序设置：52℃逆转录10min，一个循环；98℃预变性2min，一个循环；98℃变性10s，60℃退火延伸及荧光检测40s，共40个循环。

结果判定：

阴性质控无扩增曲线；

阳性质控有扩增曲线；

15种基因型的样本分别检测时，特异性的A亚型探针检测出的ct范围在25.23～27.37，且具典型的“S”型扩增曲线，如图4所示。

实施例6

核酸的提取：取外购自国际标准品(西班牙Vircell、英国NIBSC)、国内质控品的出厂已灭活的，感染人呼吸道合胞病毒及假病毒等人工合成序列，包含B亚型的30个基因型(GB1～4、BA1～14、BAc、SAB1～4、URU1～2、CB1(CB5)、CBB、BA-CCA、BA-CCB和THB)，各一管。使用全自动核酸提取仪提取合胞病毒核酸，并溶于100μl洗脱液，使用nanodrop测定核酸浓度及纯度后，按照每份20μl分装于多个0.2ml单管内，做好标记并冻存于-80℃冰箱。

核酸的稀释：吸取上一步的核酸原液，每个基因型抽取5μl，先调整到相近浓度后，再使用无核酶的超纯水，分别稀释400倍，按照每份50μl分装于多个0.2ml单管内，做好标记并冻存于-80℃冰箱。

特异性引物合成及稀释：参见实施例5的操作。

特异性探针SEQ ID NO5～6的合成及稀释：参见实施例5的操作。

合胞病毒检测引物探针MIX的配制：参见实施例5的配制：

扩增体系的配制：每种基因型的待检核酸样本，分别配制一管特异性引物探针组合的检测体系，每管均是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水2.92μl，然后加入4μl的待检核酸样本。

对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水2.92μl，然后加入4μl的已提取核酸的对照样本。

盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s；

荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例5的操作。

结果判定：

阴性质控无扩增曲线；

阳性质控有扩增曲线；

30种基因型的样本分别检测时，特异性的B亚型探针检测出的ct范围在22.18～26.05且具典型的“S”型扩增曲线，如图5所示。

实施例7

核酸的提取：参见实施例5和实施例6。

核酸的稀释：吸取上一步的核酸原液，每个基因型抽取5μl，先调整到相近浓度后，再使用无核酶的超纯水，分别稀释40倍。

对于A亚型的核酸样本来说，15种基因型，每种各抽1μl，混合成15μl体系，装于0.2ml单管内，盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s，标记为A亚型的15种基因型核酸混合物。

对于B亚型的核酸样本来说，30种基因型，每种各抽1μl，混合成30μl体系，装于0.2ml单管内，盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s。标记为B亚型的30种基因型核酸混合物。

然后，从A亚型的15种基因型核酸混合物、B亚型的30种基因型核酸混合物，这两管中各抽取5μl，混合成10μl体系。盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s，标记为A与B亚型的45种基因型核酸混合物。

特异性引物合成及稀释：参见实施例5的操作。

特异性探针SEQ ID NO.5～6的合成及稀释：参见实施例5的操作。

合胞病毒检测引物探针MIX的配制：参见实施例5的配制。

合内参基因检测引物探针MIX：由浓度均为40μM的内参基因上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)各0.125μl，浓度为100μM内参基因(Cy5基团)探针(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)0.03μl，无核酸酶水0.72μl构成。

扩增体系的配制：对于A与B亚型的45种基因型核酸混合物的检测，配制一管特异性引物探针组合的检测体系，20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水1.92μl，然后加入4μl的待检核酸样本。

对于阴性对照检测管、阳性对照检测管、内参对照检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水2.92μl，然后加入4μl的已提取核酸的对照样本。

盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s；

荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例5的操作。

结果判定：

阴性质控无扩增曲线；

阳性质控有扩增曲线；

内参质控有扩增曲线；

45种基因型的混合样本检测时，内参引物探针曲线无扩增；特异性的A亚型探针检测出的ct为22.61，特异性的B亚型探针检测出的ct为20.24，且两者均具典型的“S”型扩增曲线，如图6所示。

实施例8

核酸的提取：取临床已检测为合胞病毒阴性的咽拭子分装留存样本，灭活后，使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，冻存于-80℃冰箱。

特异性引物合成及稀释：参见实施例5的操作。

特异性探针SEQ ID NO.5～6的合成及稀释：参见实施例5的操作。

合胞病毒检测引物探针MIX的配制：参见实施例5的操作。

合内参基因检测引物探针MIX：由浓度均为40μM的内参基因上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)各0.125μl，浓度为100μM内参基因(Cy5基团)探针(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)0.03μl，无核酸酶水0.72μl构成。

扩增体系的配制：对于待检测样本，配制一管特异性引物探针与内参引物探针组合的检测体系，20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水1.92μl，然后加入4μl的待检核酸样本。

对于阴性对照检测管、阳性对照检测管、内参对照检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水1.92μl，然后加入4μl的已提取核酸的对照样本。

盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s；

荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例5的操作。

结果判定：

阴性质控无扩增曲线；

阳性质控有扩增曲线；

内参质控有扩增曲线；

已知阴性的临床样本的检测管中，特异性引物探针检测无扩增曲线；内参引物探针有扩增曲线(如图7所示)。

实施例9

核酸的提取：取临床已检测为合胞病毒阳性的咽拭子分装留存样本，灭活后，使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，冻存于-80℃冰箱。

特异性引物合成及稀释：参见实施例5的操作。

特异性探针SEQ ID NO.5～6的合成及稀释：参见实施例5的操作。

合胞病毒检测引物探针MIX的配制：参见实施例5的配制。

内参基因检测引物探针MIX的配制：参见实施例8的配制。

扩增体系的配制：对于待检测样本，配制一管特异性引物探针与内参引物探针组合的检测体系，20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水1.92μl，然后加入4μl的待检核酸样本。

对于阴性对照检测管、阳性对照检测管、内参对照检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水1.92μl，然后加入4μl的已提取核酸的对照样本。

盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s；

荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例5的操作。

结果判定：

阴性质控无扩增曲线；

阳性质控有扩增曲线；

内参质控有扩增曲线；

已知阳性的临床样本的检测管中，内参引物探针有扩增曲线；特异性引物探针检测有扩增曲线，ct为33.87(如图8所示)。

实施例10

核酸的提取：参见实施例5的操作。

核酸的稀释：参见实施例5的操作，选择1个基因型(ON1)样本的稀释液，再进行5个梯度的稀释。

特异性引物合成及稀释：参见实施例5的操作。

特异性探针SEQ ID N0.5～6的合成及稀释：参见实施例5的操作。

合胞病毒检测引物探针MIX的配制：参见实施例5的配制。

扩增体系的配制：对于待检ONl基因型的核酸样本，配制1管特异性引物探针组合的检测体系，20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水2.92μl，加入4μl的待检核酸样本。

对于阴性对照检测管和阳性对照检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水2.92μl，然后加入4μl的已提取核酸的对照样本。

盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s；

荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例5的操作。

结果判定：

阴性质控无扩增曲线；

阳性质控有扩增曲线；

5个浓度梯度的样本检测结果显示，特异性引物曲线检测出的ct范围在32.74～37.08，，且相互间的差值符合梯度稀释的情况，最低浓度下依旧可以检出ct值是37.08，如图9所示。

实施例11

核酸的提取：取4支已检测为合胞病毒阴性但其他病原体阳性的样本(甲型流感、腺病毒3型、腺病毒7型、肺炎支原体)，灭活后，使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，冻存于-20℃冰箱。

核酸的稀释：参见实施例5的操作。

特异性引物合成及稀释：参见实施例5的操作。

特异性探针SEQ ID NO.5～6的合成及稀释：参见实施例5的操作。

合胞病毒检测引物探针MIX的配制：参见实施例5的配制。

内参基因检测引物探针MIX的配制：参见实施例8的配制。

扩增体系的配制：对于待检测样本，分别配制4管特异性引物探针与内参引物探针组合的检测体系，每管均是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水1.92μl，然后向这4管中，每管加入4μl的待检核酸样本。

对于阴性对照检测管、阳性对照检测管、内参对照检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水1.92μl，然后加入4μl的已提取核酸的对照样本。

盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s；

荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例5的操作。

结果判定：

阴性质控无扩增曲线；

阳性质控有扩增曲线；

内参质控有扩增曲线；

上述4个已检测为合胞病毒阴性但其他病原体阳性的样本，特异性引物检测无扩增曲线；内参引物探针有扩增曲线，如图10所示。

实施例12

核酸的提取：使用两支咽拭子，分别蘸取已经过验证为合胞病毒A亚型阳性的实施例2的灭活样本。第一支，使用全自动核酸提取仪提取核酸，并溶于100μl洗脱液，冻存于-80℃冰箱。第二支，采用粗提取核酸的方式(煮沸法)，吸取20微升，冻存于-80℃冰箱。

特异性引物合成及稀释：参见实施例5的操作。

特异性探针SEQ ID NO.5～6的合成及稀释：参见实施例5的操作。

合胞病毒检测引物探针MIX的配制：参见实施例5的配制。

内参基因检测引物探针MIX的配制：参见实施例8的配制。

扩增体系的配制：对于第一支待检测样本，配制3管特异性引物探针与内参引物探针组合的检测体系，20μl反应体系，具体为：

添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl，缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水1.92μl，加入4μl的待检核酸样本。

添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl，缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水2.92μl，加入3μl的待检核酸样本。

添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl，缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水3.92μl，加入2μl的待检核酸样本。

对于第二支待检测样本，配制1管特异性引物探针与内参引物探针组合的检测体系，20μl反应体系，具体为：

添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水2.92μl，加入3μl的待检核酸样本。

对于阴性对照检测管、阳性对照检测管、内参对照检测管，每管都是20μl反应体系，具体为：添加合胞病毒检测引物探针MIX 0.33μl、内参基因检测引物探针MIX 1μl、缓冲液12.5μl、逆转录酶0.25μl、无核酸酶水1.92μl，然后加入4μl的已提取核酸的对照样本。

盖紧盖子，上下混匀10次，瞬时离心5s；

荧光定量检测的反应条件设置：参见实施例5的操作。

结果判定：

阴性质控无扩增曲线；

阳性质控有扩增曲线；

内参质控有扩增曲线；

上述4个已检测为合胞病毒阳性的样本，特异性引物检测有扩增曲线，第二支待检测样本(粗提)ct值为30.38，第一支待检测样本(核酸添加量2～4微升)ct值范围则是33.2～34.56；内参引物探针无扩增曲线，如图11所示。

综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过对45种基因型的合胞病毒按照亚型建立进化树模型及亲缘关系分析，并进行待检片段特异性评估试验后，选择融合蛋白F区域内的102bp序列作为引物结合及检测位点，再选择高灵敏度和高效率的逆转录酶对该RNA序列区域进行反转录，之后使用兼顾保真性和高速扩增能力的试剂进行检测，加上优化PCR反应程序，最终在一管内实现单管三重PCR即可覆盖检测感染人呼吸道45种基因型的合胞病毒，还能区分出A亚型与B亚型，并可避免假阴性，且不会受其它感染人呼吸道微生物序列的影响，保证高覆盖度、高灵敏性、高特异性和快速检出性，使检测效率、特异性、敏感性、经济型、便捷性，相比于常规的多管单重或二代测序的检测性价比显著提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可覆盖45种基因型合胞病毒的引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对包含第一上游引物、第二上游引物、第一下游引物和第二下游引物，所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述探针组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的荧光探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的荧光探针。

2.一种可覆盖45种基因型合胞病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对和探针组合。

3.根据权利要求2所述的可覆盖45种基因型合胞病毒的试剂盒，其特征在于，还包含内参引物探针MIX。

4.根据权利要求2所述的可覆盖45种基因型合胞病毒的试剂盒，其特征在于，还包含缓冲液、逆转录酶、无核酸酶水。

5.根据权利要求2所述的可覆盖45种基因型合胞病毒的试剂盒，其特征在于，还包含空白对照品、阳性对照品、内参对照品。

6.根据权利要求5所述的可覆盖45种基因型合胞病毒的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为生理盐水。

7.根据权利要求5所述的可覆盖45种基因型合胞病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为包含呼吸道合胞病毒A亚型与B亚型融合蛋白F基因序列的工程菌悬液。

8.根据权利要求5所述的可覆盖45种基因型合胞病毒的试剂盒，其特征在于，所述内参对照品为包含人核糖核酸酶P基因序列的工程菌悬液。

9.一种非诊断目的的可覆盖45种基因型合胞病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）核酸提取：提取待检核酸样本；

（2）加样：在待测样本检测管、阴性对照检测管及阳性对照检测管中均加入合胞病毒检测引物探针MIX、内参引物探针MIX、缓冲液、逆转录酶、无核酸酶水和待测DNA；所述合胞病毒检测引物探针MIX包含引物对和探针组合，所述引物对包含第一上游引物、第二上游引物、第一下游引物、第二下游引物，所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述探针组合包含如SEQ ID NO.5所示的荧光探针和如SEQ ID NO.6所示的荧光探针；

（3）上机扩增：将步骤（3）加好样的检测管混匀、瞬时离心后，进行上机扩增；

（4）数据分析及结果判断：待反应结束后，若CT值≤37.5，则待测模板中包含呼吸道合胞病毒。

10.根据权利要求9所述的可覆盖45种基因型合胞病毒的检测方法，其特征在于，扩增反应条件为：52℃逆转录10min，一个循环；98℃预变性2min，一个循环；98℃变性10s，60℃退火延伸及荧光检测40s，共40个循环。

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