CN112575120B

CN112575120B - 一种SARS-CoV-2 D614G突变检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN112575120B
Application number: CN202011209369.5A
Authority: CN
Inventors: 张永有; 宋娜杰
Original assignee: XIAMEN ZEESAN BIOTECH CO Ltd; Xiamen University
Current assignee: XIAMEN ZEESAN BIOTECH CO Ltd; Xiamen University
Priority date: 2020-11-03
Filing date: 2020-11-03
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2040-11-03
Also published as: WO2022095723A1; CN112575120A

Abstract

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2 D614G突变检测试剂盒及检测方法，本发明的SARS‑CoV‑2 D614G突变核酸检测的引物及探针序列如SEQ ID NO：1‑4所示。本发明的SARS‑CoV‑2 D614G突变检测试剂盒采用不对称PCR扩增，结合多色探针熔解曲线分析技术，可实现对SARS‑CoV‑2 S‑D614和S‑G614毒株的分型检测，具有操作简单、检测周期短、灵敏度高等优点。

Description

一种SARS-CoV-2 D614G突变检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种SARS-CoV-2 D614G突变检测试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2，SARS-CoV-2)与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)同属于β属冠状病毒。SARS-CoV-2可引起人类呼吸道感染，造成致命的肺部炎症，称为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。COVID-19是一种新发的急性呼吸道传染病，在人群中具有极强的传染性，主要通过呼吸道飞沫、呼吸道分泌物和直接接触传播。

SARS-CoV-2属于正链RNA病毒，具有5个必需基因，分别编码4种结构蛋白：核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)，及RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)。核蛋白(N)包裹RNA基因组构成核衣壳，外面围绕着病毒包膜(E)，病毒包膜包埋有基质蛋白(M)和刺突蛋白(S)等蛋白。冠状病毒的得名来自暴露于病毒脂质层外面的由棘突蛋白(spikeprotein，S蛋白)构成的冠状突起，利用S蛋白与靶细胞表面的特异性受体结合，进入细胞内复制而引起感染。经研究发现，SARS-CoV-2利用S蛋白与人类受体血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)结合进而侵入宿主细胞。RNA病毒极易发生突变，这可能与其传播和毒性相关。目前，SARS-CoV-2根据其基因组的突变情况已经进化出多个不同的典型分支，其中最重要的突变是S蛋白D614G突变。D614G突变指的是新型冠状病毒S蛋白第614氨基酸位点D(天冬氨酸)到G(甘氨酸)的突变，在病毒基因组上的改变是23403位的碱基A突变为碱基G(在MN908947.3基因组的位置，23403A->G)。D614G突变的毒株通常伴有214C->T、3037C->T和14408C->T变异。D614G变异毒株最早出现在欧洲，目前已成为世界范围内的主要流行毒株。根据GISAID数据库公布新冠病毒基因组序列，发现携带该突变的病毒株主要是G型、GR型和GH型。

综合多项研究来看，新型冠状病毒S蛋白D614G突变使棘状蛋白数量增加4-5倍，并使这些蛋白更稳定，进而使病毒更容易侵入人体细胞。在实验室环境下，D614G突变的新冠病毒感染人细胞的能力提高9-10倍，并且能够降低对个体恢复期血清的敏感性，但是D614G突变在现实环境下对新冠病毒感染力的影响仍待研究。协助SARS-CoV-2进入宿主细胞的刺突蛋白是疫苗和治疗剂的主要靶标之一，因此，持续监测D614G变异是了解SARS-CoV-2感染性和抗原性的关键。

目前，D614G突变的监测依赖于全基因组测序技术，尚无关于D614G突变检测的分子诊断试剂。全基因组测序不仅耗时长、价格高，还需要专门的仪器设备和专业的生物信息分析人员，不利于大范围开展工作，特别是对于一些基层单位。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供SARS-CoV-2 D614G突变核酸检测的引物及探针序列，其如SEQ ID NO：1-4所示。

本发明的目的之二，在于提供SARS-CoV-2 D614G突变核酸检测试剂盒，包括前述的引物及探针序列。

本发明的目的之三，在于提供SARS-CoV-2 D614G突变核酸检测方法，包括如下步骤：

1)合成所述的引物及探针序列；

2)采集样品，进行核酸提取及纯化；

3)RT-PCR反应成分及用量：

4)RT-PCR扩增和溶解程序

48-52℃，13-17min，1-3个循环；93-97℃，4-6min，1-3个循环；93-97℃,13-17s，53-57℃，13-17s,74-78℃，18-22s,45-55个循环；93-97℃，0.5-2min，1-3个循环；35-40℃，2-4min，1-3个循环；以0.02-0.06℃/s的升温速率从35-40℃升温至80-90℃，与此同时采集荧光信号；

5)结果判读。

本发明步骤2)所述的样品包括但不限于商品(例如进口冷冻食品)、环境中的样品(例如下水道、土壤)等。

本发明的再一目的，在于提供所述的检测方法在检测D614和/或G614毒株中的应用。

本发明的再一目的，在于提供所述的检测方法在检测非D614和/或G614的新型冠状病毒毒株中的应用。

本发明开发了一种基于核酸变异分析技术的新型冠状病毒D614G突变检测试剂盒及方法。本发明采用不对称PCR和多色探针熔解曲线分析技术，通过荧光通道和熔点(Tm)的二维标签，识别新型冠状病毒S-D614和S-G614毒株，具有操作简单、检测周期短、灵敏度高等优点：

(1)本发明开发的新型冠状病毒D614G突变检测试剂盒无需PCR后处理，操作简便快速，3个小时内即可得到病毒检测结果和病毒分型结果，且无需特殊设备，适用于实时分型工作。

(2)本发明所使用的引物探针均为自行设计，通过大量新冠病毒基因组序列的比对，选择S基因上覆盖D614G突变(23403A->G)的保守区域进行引物设计。并且通过将新冠病毒参考基因序列(GenBank：MN908947.3)与NCBI数据库发布的SARS-CoV(GenBank：NC_004718.3)、bat-SL-CoVZC45(GenBank：MG772933.1)基因序列比对，在新型冠状病毒保守且特异的区域设计扩增引物。因此，本发明试剂盒不仅可用于新型冠状病毒S-D614和S-G614毒株的分型检测，还可直接用于新型冠状病毒的检测。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明实施例的典型结果图。

具体实施方式

1.本发明试剂盒引物探针

本发明选取新型冠状病毒S基因上覆盖D614G突变(23403A->G)的保守区域进行引物、探针设计。针对D614和G614分别设计一条检测探针，其中D614检测探针5′端标记ROX荧光基团，3′端标记淬灭基团；G614检测探针5′端标记FAM荧光基团，3′端标记淬灭基团。经过引物探针组合大量筛选，最终确定的引物、探针序列如下表所示：

表1.SARS-CoV-2 D614G突变检测试剂盒引物、探针序列

注：“+”指LNA修饰。

2.样品处理

采集疑似COVID-19患者的鼻咽拭子、口咽拭子、前鼻和中鼻拭子、鼻咽冲洗/鼻吸取物或支气管肺泡灌洗(BAL)样品。使用厦门致善生物科技股份有限公司生产的手工提取试剂盒“病毒RNA提取试剂盒(货号：602101)”进行核酸提取及纯化。提取试剂盒的提取纯化过程包括4个步骤：裂解、结合、洗涤和洗脱。提取时，取1mL待测样品加入提取加样孔，然后按照提取试剂盒说明书中的操作方法进行提取。提取试剂盒中核酸洗脱体积为60μL，提取后获得的RNA应立即使用或储存在-70℃保存。

3.本发明试剂盒RT-PCR反应体系组分

针对RT-PCR反应中的上下游引物比例、引物用量、探针用量等进行了大量优化，最终确定的本发明的RT-PCR反应成分及用量如下表2所示。

表2.SARS-CoV-2 D614G突变检测RT-PCR组分及用量

PCR反应液成分	用量(μL)
		DEPC-H<sub>2</sub>O	5.875
One step RT-PCR buffer	12.5
		S-F(50μM)	0.025
S-R(50μM)	0.2
		S-D614-P(50μM)	0.2
S-G614-P(50μM)	0.2
		Enzyme mix	1
总量	20

注：1)向反应管中分别加入处理后的样品5μL，阳性质控品(D614和G614假病毒)5μL，阴性质控品(无核酸DEPC-H₂O)5μL；总反应体积为25μL。

2)Enzyme mix来源于上海翊圣生物科技有限公司，产品编号13110ES60，主要成分为反转录酶和热启动DNA聚合酶。

4.本发明试剂盒实时RT-PCR扩增和熔解分析反应程序

经过大量实验的对比优化，最终确定的反应条件见表3。

表3.RT-PCR扩增和熔解程序设置

5.检测结果解释

由于D614和G614毒株的基因组在探针覆盖区域只有一个碱基的差异，因此通过熔解曲线分析，每种类型的毒株都会产生FAM荧光和ROX荧光的熔解曲线，即会产生两个对应的熔点Tm值。通过荧光通道和熔点Tm值的组合，来进行检测结果的判读。

若阴性对照在FAM和ROX荧光通道均无Tm值(没有熔解曲线)则阴性对照质控合格。

若阳性对照在FAM和ROX荧光通道均有熔解曲线，且对应的Tm值落在已确定的参考值范围(参照下表4)，则阳性对照质控合格。

临床标本检验结果的评估应在阳性和阴性对照已检测并确定有效后进行。如果对照品无效，则无法解释待测样品的结果。当上述质量控制符合要求时，可根据下表4、表5对样品的检测结果进行评价。

表4.阳性参考值范围

表5.待测样品的检测结果可能情况

注：(1)*由于探针存在竞争关系，结合力弱的那条探针灵敏度可能较低，因此对于低浓度可能出现只有一个熔解峰的情况。

(2)“+”指熔解曲线分析产生的熔点落在该范围内；“-”指熔解曲线分析产生的熔点不落在该范围内。

(3)其他突变类型指在探针覆盖区域出现的非D614G单碱基突变。

(4)对于一种毒株，若在探针覆盖区域同时出现D614G突变和其他突变，该方法不能识别出这种共突变的情况，将其统一判断为其他突变类型。经序列分析，这种共突变的频率很低，因此不会影响该方法的准确性。

图1为本发明实施例的典型结果图，如图1所示：通过荧光-熔点的组合判读，本发明不仅能准确识别出D614G突变，还可识别出检测探针覆盖区域的非D614G突变。

序列表

<110> 厦门大学

厦门致善生物科技股份有限公司

<120> 一种SARS-CoV-2 D614G突变检测试剂盒及检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttcttttgg tggtgtcagt gt 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcatgaatag caacagggac t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttatcagga tgttaactgc a 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatcagggtg ttaactgca 19

Claims

1.用于SARS-CoV-2D614G突变核酸检测的引物及探针序列，如SEQ ID NO：1-4所示。

2.SARS-CoV-2D614G突变核酸检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物及探针序列。

3.用于非诊断目的的SARS-CoV-2D614G突变核酸检测方法，其包括如下步骤：

1)提供权利要求1所述的引物及探针序列；

2)采集样品，进行核酸提取及纯化；

3)RT-PCR反应成分及用量：

4)RT-PCR扩增和溶解程序

5)结果判读。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述的样品包括商品、环境中的样品。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤3)中，向不同反应管中分别加入处理后的样品5μL，阳性质控品D614和G614假病毒5μL，阴性质控品无核酸DEPC-H₂O 5μL；各反应管的总反应体积为25μL。

6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤4)所述的荧光包括FAM、ROX荧光。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤5)中，若阴性对照在FAM和ROX荧光通道均无Tm值则阴性对照质控合格；若阳性对照在FAM和ROX荧光通道均有熔解曲线，且对应的Tm值落在已确定的参考值范围，则阳性对照质控合格。

8.根据权利要求3至7任一项所述的检测方法在检测D614和/或G614毒株中的应用，其用于非诊断目的。

9.根据权利要求3至7任一项所述的检测方法在检测非D614/G614新型冠状病毒毒株中的应用，其用于非诊断目的。