CN112662811A - 一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒及其应用 Download PDF

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张记军
朱钧
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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒及其应用。本发明通过设计新型冠状病毒ORF1ab基因与N基因的引物探针组合1以及E基因与S基因的引物探针组合2,同时检测ORF1ab、N、E、S基因4个核酸靶标,能够提高核酸检测对病毒变异的容错性,更好区分病毒变异和病毒阴性这两个不同情况,进一步提高新冠病毒感染诊断的准确率。

Description

一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种新型冠状病毒检测试剂盒,特别涉及一种通过检测新型冠状病毒4基因区段来鉴别新型冠状病毒的多重核酸检测试剂盒。本发明属于分子生物学技术领域。
背景技术
2019年年末,一种新型冠状病毒在短时间内产生了巨大的传播,并不断地持续新增,严重威胁着人类的健康,并给社会经济带来了沉重的影响,新型冠状病毒迅速成为了全球性的问题。对于新型冠状病毒所具备的极强的传播性,以及所产生的影响,做到临床早发现、早诊断、早隔离、早治疗至关重要,进而能够有效防控新冠肺炎疫情。
对此,迫切需要提出一种精准、快速、特异性强、稳定可靠的检测试剂盒,该试剂盒能够系统性增加阳性读值的出现,避免错过应需隔离患者,加强对痊愈诊断评价的严谨性,提高核酸检测对病毒变异的容错性,更好区分病毒变异和病毒阴性这两个不同情况,并减少无必要的样本复检工作,以配合临床检测,做好疫情防控工作。
冠状病毒Envelope(E)基因区段为WHO推荐广谱冠状病毒初筛区段。在筛查新冠病毒的同时可帮助甄别其他潜在冠状病毒感染;冠状病毒Spike(S)基因区段为新冠病毒最为重要的受体结合区(RBD)。在筛查新冠病毒的同时可协助监控新冠病毒流行病学改变。
目前,市场上已有一些针对新型冠状病毒的检测试剂盒,但靶标基因检测数量尚未能做到4基因区段检测,故不能够很好的区分病毒变异和病毒阴性这两个不同情况。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒,通过设计的特异性引物探针的多重组合,能够精准检测样本中是否存在新型冠状病毒的ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因。并添加内参基因的引物探针序列,监控提取样本是否为人源样本。
具体的,本发明的一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒,所述试剂盒包括新型冠状病毒ORF1ab基因与N基因的引物探针混合液1以及E基因与S基因的引物探针混合液2;其中,所述的引物探针组合混合液1包括如SEQ ID NO.1-2所示的用于扩增ORF1ab基因的引物、如SEQ ID NO.3所示的ORF1ab基因探针、如SEQ ID NO.4-5所示的用于扩增N基因的引物、如SEQ ID NO.6所示的N基因探针、如SEQ ID NO.7-8所示的用于扩增内参基因的引物以及如SEQ ID NO.9所示的内参基因探针;所述的引物探针组合混合液2包括如SEQ IDNO.10-11所示的用于扩增E基因的引物、如SEQ ID NO.12所示的E基因探针、如SEQ IDNO.13-14所示的用于扩增S基因引物、如SEQ ID NO.15所示的S基因探针、如SEQ ID NO.7-8所示的用于扩增内参基因的引物以及如SEQ ID NO.9所示的内参基因探针。
其中,优选的,所述的试剂盒中还包括PCR酶系、扩增反应液、阴性对照品和阳性对照品。
其中,优选的,所述的PCR酶系包括热启动酶、逆转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂。
其中,优选的,所述的扩增反应液包括PCR Buffer、dNTPs。
其中,优选的,所述的阴性对照品为包含内参基因片段的质粒。
其中,优选的,所述的阳性对照品包括分别含有ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因片段的质粒,所述的ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因片段是通过使用相应的本发明所述的引物扩增得到的。
其中,优选的,所述的试剂盒用于新型冠状病毒4基因区段检测时,采用荧光定量PCR方法按照如下循环反应程序进行:
50℃,5min;95℃,8sec;95℃,6-10sec,55℃,13-30sec,共进行45个循环。
其中,优选的,所述的试剂盒用于新型冠状病毒4基因区段检测时,荧光定量PCR扩增反应体系包括:
扩增反应液为4μl×n,引物探针混合液1或引物探针混合液2为2μl×n,PCR酶系为1μl×n,待检核酸样本、阴性对照或阳性对照各3μl,n为反应管数。
与市场现有同类检测目的试剂盒相比,本发明试剂盒的有益效果是:
1、本发明所述的试剂盒靶向四基因,系统性增加阳性读值的出现,避免错过应需隔离患者,加强对痊愈诊断评价的严谨性,并减少无必要的样本复检工作。
2、提高核酸检测对病毒变异的容错性,更好区分病毒变异和病毒阴性这两个不同情况。
3、Envelope(E)基因区段为WHO推荐广谱冠状病毒初筛区段。在筛查新冠病毒的同时可帮助甄别其他潜在冠状病毒感染。
4、Spike(S)基因区段为新冠病毒最为重要的受体结合区(RBD)。在筛查新冠病毒的同时可协NEI助监控新冠病毒流行病学改变。
附图说明
图1为ORF1ab基因检测限测试;
图2为N基因检测限测试;
图3为E基因检测限测试;
图4为S基因检测限测试;
图5为内参基因测试结果;
图6为ORF1ab基因、N基因特异性测试结果;
图7为E基因、S基因特异性测试结果;
图8为内参基因特异性测试结果;
图9为典型检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒
本发明通过设计的特异性引物探针的多重组合,能够精准检测样本中是否存在新型冠状病毒的ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因。并添加内参基因的引物探针序列,监控提取样本是否为人源样本。
所述一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒,包括引物探针组合混合液1、引物探针组合混合液2、PCR酶系、扩增反应液、阴性对照品和阳性对照品。
所述的引物探针组合混合液1包括如SEQ ID NO.1-2所示的用于扩增ORF1ab基因引物、如SEQ ID NO.3所示的ORF1ab基因探针、如SEQ ID NO.4-5所示的用于扩增N基因引物、如SEQ ID NO.6所示的N基因探针、如SEQ ID NO.7-8所示的用于扩增内参基因引物以及如SEQ ID NO.9所示的内参基因探针。
所述的引物探针组合混合液2包括如SEQ ID NO.10-11所示的用于扩增E基因引物、如SEQ ID NO.12所示的E基因探针、如SEQ ID NO.13-14所示的用于扩增S基因引物、如SEQ ID NO.15所示的S基因探针、如SEQ ID NO.7-8所示的用于扩增内参基因引物以及如SEQ ID NO.9所示的内参基因探针。
其中,ORF1ab基因探针以及E基因探针的5’端修饰有荧光报告基团FAM,3’端修饰有荧光淬灭基团BHQ。其中,N基因探针以及S基因探针的5’端修饰有荧光报告基团HEX,3’端修饰有荧光淬灭基团BHQ,内参基因探针的5’端修饰有荧光报告基团Cy5,3’端修饰有荧光淬灭基团BHQ。
所述的PCR酶系包括热启动酶、逆转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂。
所述的扩增反应液包括PCR Buffer、dNTPs。
所述的阴性对照品包括内参基因片段质粒。
所述的阳性对照品包括含有用上述引物扩增得到的ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因片段的质粒。
实施例2一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测方法的建立
(1)提取待检样本中的总核酸,获得待检核酸样本为反应模板。
(2)将实施例1中所述的引物探针组合混合液1、引物探针组合混合液2、PCR酶系、扩增反应液、阴性对照品和阳性对照品从-20℃冰箱中取出,室温下解冻后混匀
(3)按下列组成配制PCR反应液(n为反应管数)。
扩增反应液为4μl×n,引物探针混合液1或引物探针混合液2为2μl×n,PCR酶系为1μl×n,混匀离心数秒后将反应体系按7μl/管分装至PCR反应管中。
(4)加样,用带滤芯的吸嘴分别取待检核酸样本、阴性对照、阳性对照各3μl分别加到装有PCR反应液的PCR反应管中。盖上管盖,混匀离心数秒后,移至qPCR仪进行反应。
(5)扩增检测,实时荧光PCR反应,程序如下表1所示:
表1
Figure BDA0002861457020000051
(6)仪器检测通道选择:ORF1ab、E基因荧光信号选择FAM通道,N、S基因荧光信号选择HEX通道,内参基因荧光信号选择Cy5通道(注:ABI 7500淬灭基团和荧光校正信号选择为none)。
(7)结果判定:
如下表2:
表2 4基因区段ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因16种相关建议结果解读
Figure BDA0002861457020000052
Figure BDA0002861457020000061
实施例3一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒检测限测试
将实施例1中的阳性对照品稀释成106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、100copies/ml,并分别与1000copies/ml浓度的实施例1中的内参基因片段质粒混合制成待测样本,按照实施例2的方法测试一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒的扩增效率。
检测结果如图1-5所展示,对以上对不同浓度的新型冠状病毒假病毒样本进行检测结果分析得知,本发明的检测试剂盒的检测限为100copies/ml。
实施例4一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒灵敏度测试
将实施例1中的阳性对照品稀释成104copies/ml、5000copies/ml、1000copies/ml、100copies/ml、50copies/ml,并分别与实施例1中的1000copies/ml内参基因片段质粒混合制备成待测样本,按照实施例2的方法,对每种浓度待测样本进行20个平行测试,通过扩增曲线的有无及Ct值获得灵敏度的测试结果,见下表3。
表3灵敏度测试
浓度copies/ml 平均Ct值 检出比例
10<sup>4</sup> 28.82 20/20
5000 27.77 20/20
1000 32.13 20/20
100 35.62 20/20
50 36.49 15/20
通过表3显示结果,在104copies/ml、5000copies/ml、1000copies/ml、100copies/ml浓度条件下检出率为100%,在50copies/ml检出率条件下检出率为75%,因此得出结论:本发明的检测试剂盒在检测线范围内的检出率为100%,在样本浓度低于检测线时,仍可具有较高的检测灵敏度,降低了漏检的可能性。
实施例5一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒特异性测试
选择与新型冠状病毒2019-nCoV感染部位相同或感染症状相似的其他病原菌:冠状病毒OC43、NL63、229E、HKU1、MERS-CoV和SARS,副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、登革病毒、麻疹病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、人类基因组参考品做为特异性检测参考品,按照实施例2的方法测试本发明的检测试剂盒的特异性。
测试结果参见图6-8,使用参考品对本发明的检测试剂盒进行特异性检测,ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因检测结果均为阴性,内参基因检测结果均为阳性。结果表明本发明中试剂盒特异性检测性能良好。
实施例6一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒临床样本符合度测试
北京市疾控中心病毒实验室使用本发明所述的检测试剂盒按照实施例2所述的方法检测临床收集的新型冠状病毒阳性样本6个,加入56个非新型冠状病毒阳性样本作为阴性对照。对上述共计62个样本随机打乱并进行盲测,结果如表4所示,其中一个阳性样本的荧光定量PCR检测结果如图9所示。
表4四基因检测结果
Figure BDA0002861457020000081
Figure BDA0002861457020000091
Figure BDA0002861457020000101
采用本发明所述的检测试剂盒完成上述检测,检出6例阳性,56例阴性,且检出样本信息与北京市疾控中心病毒实验室样本信息完全符合,说明本发明中检测试剂盒检测结果与临床结果完全符合。
序列表
<110> 北京美康基因科学股份有限公司
<120> 一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒及其应用
<130> KLPI200932
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tgccacatag atcatccaaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cacagggtca ttagcacaag 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
cctaaaggat tttgtgactt aaaagg 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gttgttggcc tttaccagac at 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
ttgctgctgc ttgacagatt gaac 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
cttctaacca ggttgctgtt ct 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
aaacacgcca agtaggagta ag 22
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
aactgcacag aagtccctgt tgct 24
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
cgagcgcggc tacagct 17
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
tccttaatgt cacgcacgat tt 22
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
accaccacgg ccgagcgg 18

Claims (8)

1.一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括新型冠状病毒ORF1ab基因与N基因的引物探针混合液1以及E基因与S基因的引物探针混合液2;其中,所述的引物探针组合混合液1包括如SEQ ID NO.1-2所示的用于扩增ORF1ab基因的引物、如SEQ ID NO.3所示的ORF1ab基因探针、如SEQ ID NO.4-5所示的用于扩增N基因的引物、如SEQ ID NO.6所示的N基因探针、如SEQ ID NO.7-8所示的用于扩增内参基因的引物以及如SEQ ID NO.9所示的内参基因探针;所述的引物探针组合混合液2包括如SEQ IDNO.10-11所示的用于扩增E基因的引物、如SEQ ID NO.12所示的E基因探针、如SEQ IDNO.13-14所示的用于扩增S基因引物、如SEQ ID NO.15所示的S基因探针、如SEQ ID NO.7-8所示的用于扩增内参基因的引物以及如SEQ ID NO.9所示的内参基因探针。
2.根据权利要求1所述的多重核酸检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中还包括PCR酶系、扩增反应液、阴性对照品和阳性对照品。
3.根据权利要求2所述的多重核酸检测试剂盒,其特征在于,所述的PCR酶系包括热启动酶、逆转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂。
4.根据权利要求2所述的多重核酸检测试剂盒,其特征在于,所述的扩增反应液包括PCRBuffer、dNTPs。
5.根据权利要求2所述的多重核酸检测试剂盒,其特征在于,所述的阴性对照品为包含内参基因片段的质粒。
6.根据权利要求2所述的多重核酸检测试剂盒,其特征在于,所述的阳性对照品包括分别含有ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因片段的质粒,所述的ORF1ab基因、N基因、E基因、S基因片段是通过使用权利要求1所述的引物扩增得到的。
7.根据权利要求2所述的多重核酸检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒用于新型冠状病毒4基因区段检测时,采用荧光定量PCR方法按照如下循环反应程序进行:
50℃,5min;95℃,8sec;95℃,6-10sec,55℃,13-30sec,共进行45个循环。
8.根据权利要求2所述的多重核酸检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒用于新型冠状病毒4基因区段检测时,荧光定量PCR扩增反应体系包括:
扩增反应液为4μl×n,引物探针混合液1或引物探针混合液2为2μl×n,PCR酶系为1μl×n,待检核酸样本、阴性对照或阳性对照各3μl,n为反应管数。
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CN113073150A (zh) * 2021-04-28 2021-07-06 领航基因科技(杭州)有限公司 一种用于新型冠状病毒及其变异株的数字pcr检测试剂盒

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