CN112458210A - 一种用于检测新冠病毒的基因保守序列、引物探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测新冠病毒的基因保守序列、引物探针、试剂盒及应用,属于分子生物学核酸检测技术,为了能够更好地特异性的检测出新冠病毒,以及检测时灵敏性等技术问题,本发明提供了一种用于检测新冠病毒的ORF1ab/N基因基因保守序列、引物探针、试剂盒及应用,属于分子生物学核酸检测技术。本发明旨在提升新冠病毒检测的特异性、灵敏度及检测效率,使整个检测的流程更加简便快捷高效。

Description

一种用于检测新冠病毒的基因保守序列、引物探针组合、试剂 盒及应用
技术领域
本发明涉及生物学医学核酸检测领域,尤指一种用于检测新冠病毒的基因 保守序列、引物探针组合、试剂盒及应用。
背景技术
2020年1月12日,世界卫生组织命名新型冠状病毒,即“2019-nCoV”。该 病毒可由呼吸道飞沫传播亦可通过密切接触传播;人群普遍易感,老年人和有 基础疾病者易发展为重症感染。
冠状病毒感染后常见的体征为呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难 等。在较严重病例中,感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭,甚至 死亡。但由于新型冠状病毒存在初始症状不明显,潜伏期长达14天等相对隐蔽 的因素,患者和携带者往往不能及时发现,从而加剧了传播。
采用快速有效的手段对感染者进行早期特异的诊断是及时发现和隔离传染 源,有效救治患者,保障社会秩序的重要手段。这就对病原体的快速诊断技术 提出了新的要求,但在烈性传染病大规模爆发时,对病原体的快速精准诊断非 常困难,尤其在某些缺乏实验室检测条件的地区这种挑战显得尤为突出。
核酸诊断技术具有快速、灵敏的优势,能够检测发现处于潜伏期的病原体 携带者。目前大多数实验室采用PCR方法对新型冠状病毒进行检测,其灵敏度 和特异性均较好,但是耗时较长,并且离不开价格昂贵的专用仪器设备,因此 难以在基层检验机构普及。近年来出现了如RPA(RecombinasePolymerase Amplification,重组酶聚合酶等温扩增)这样的核酸检测技术,该技术也可用于 检测新冠病毒。新冠病毒属于冠状病毒β属,有包膜,属正冠状病毒亚科,成为 继α-冠状病毒的HCoV-229E和HCoV-NL63,β-冠状病毒的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV之后,可以感染人类的冠状病毒科中 的第七个成员。尤其是新冠病毒和SARS病毒的感染机理相似,序列相似度高。 如何能特异性地识别新冠病毒,且具有较高的检测灵敏度是我们需要解决的问 题。
发明内容
本发明提供一种用于检测新冠病毒的基因保守序列、引物探针组合、试剂 盒及应用,通过ORF1ab/N基因的一段保守序列能够在检测新冠病毒时,特异 性的检测出新冠病毒,不会出现假阳性的技术问题。
本发明提供的技术方案如下:
一种用于检测新冠病毒基因保守序列,所述cDNA序列包括:靶标N基因 中的一段保守序列和靶标ORF1ab基因中的一段保守序列作为检测的靶标序列, 用于检测新冠病毒,所述N基因保守序列如SEQ ID No.1所示;所述ORF1ab 基因保守序列如SEQ ID No.14所示。
优选地,选取自N基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列1,所述 N基因靶标序列1用于检测新冠病毒N基因,所述N基因靶标序列组合1如 SEQ ID No.2所示;
或;
选取自N基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列2,所述N基因靶 标序列2用于检测新冠病毒N基因,所述N基因靶标序列组合2如SEQ ID No.6 所示;
或;
选取自N基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列3,所述N基因靶 标序列3用于检测新冠病毒N基因,所述N基因靶标序列组合3如SEQ ID No.10所示。
优选地,选取自ORF1ab基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列1, 所述N基因靶标序列1用于检测新冠病毒ORF1ab基因,所述ORF1ab基因靶 标序列组合1如SEQ IDNo.15所示。
或;
选取自ORF1ab基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列2,所述N 基因靶标序列2用于检测新冠病毒ORF1ab基因,所述靶标序列组合2如SEQ ID No.19所示;
或;
选取自ORF1ab基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列1,所述N 基因靶标序列3用于检测新冠病毒ORF1ab基因,所述靶标序列组合3如SEQ ID No.23所示。
一种用于检测新冠病毒的引物探针组合,所述N基因保守序列为N基因靶标 序列1时,引物探针包括:
上游引物N-3F:如SEQ ID No.3所示;
下游引物N-RAA-R3:如SEQ ID No.4所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.5所示。
一种用于检测新冠病毒的引物探针组合,所述N基因保守序列为N基因靶标 序列2时,引物探针包括:
上游引物N-4F:如SEQ ID No.7所示;
下游引物N-RAA-R4:如SEQ ID No.8所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.9所示。
一种用于检测新冠病毒的引物探针组合,所述N基因保守序列为N基因靶标 序列3时,引物探针包括:
上游引物N-RAA-F2:如SEQ ID No.11所示;
下游引物N-RAA-R2:如SEQ ID No.12所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.13所示。
一种用于检测新冠病毒的引物探针组合,所述ORF1ab基因保守序列为ORF1ab 基因靶标序列1时,引物探针包括:
上游引物N-RAA-F2:如SEQ ID No.16所示;
下游引物N-RAA-R2:如SEQ ID No.17所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.18所示。
一种用于检测新冠病毒的引物探针组合,所述ORF1ab基因保守序列为ORF1ab 基因靶标序列2时,引物探针包括:
上游引物N-RAA-F2:如SEQ ID No.20所示;
下游引物N-RAA-R2:如SEQ ID No.21所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.22所示。
一种用于检测新冠病毒的引物探针组合,所述ORF1ab基因保守序列为ORF1ab 基因靶标序列3时,引物探针包括:
上游引物N-RAA-F2:如SEQ ID No.24所示;
下游引物N-RAA-R2:如SEQ ID No.25所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.26所示。
优选地,针对N基因和ORF1ab基因设计的内参引物探针为:
内参引物探针组合1:
上游引物RNase P-F1:如SEQ ID No.27所示;
下游引物RNase P-R1:如SEQ ID No.38所示;
探针RNase P-P1:如SEQ ID No.29所示;
或;
内参引物探针组合2:
上游引物RNase P-F:如SEQ ID No.31所示;
下游引物RNase P-R:如SEQ ID No.32所示;
探针RNase P-P1:4如SEQ ID No.33所示;
或;
内参引物探针组合3:
上游引物RNase P-F2:如SEQ ID No.33所示;
下游引物RNase P-R2:如SEQ ID No.34所示;
探针RNase P-P1:如SEQ ID No.35所示。
优选地,所述探针距离5’端约30bp以及距离3’端约15bp处插入THF作 为外切酶exo的切断位点,在THF左右需为胸腺嘧啶,且胸腺嘧啶上分别修饰 荧光基团和淬灭基团。
本发明还提供一种用于检测新冠病毒的试剂盒,包括含上述任一所述的N 基因引物探针组合的RT-RPA冻干粉、复溶剂、激活剂以及阴阳性对照品;
含上述任一所述的ORF1ab基因引物探针组合的RT-RPA冻干粉、复溶剂、 激活剂以及阴阳性对照品;
含上述任一内参引物探针组合的RT-RPA冻干粉、复溶剂、激活剂以及阴 阳性对照品;
其中,所RT-RPA冻干粉包括恒温反应所需的逆转录酶、重组酶、单链结 合蛋白、聚合酶、重组酶辅酶、核酸外切酶、海藻糖、dNTPs、ATP、CK、磷 酸肌酸二钠盐。
优选地,所述试剂盒中针对N基因引物探针组合中的上游引物和下游引物 的反应终浓度为400nM-500nM,探针的反应终浓度为120nM-240nM;
所述试剂盒中针对ORF1ab基因基因引物探针组合中的上游引物和下游引 物的反应终浓度为400nM-500nM,探针的反应终浓度为120nM-240nM;
所述试剂盒中针对内参引物探针组合中的上游引物和下游引物的反应终 浓度为400nM-500nM,探针的反应终浓度为120nM-240nM。
优选地,所述试剂盒用于检测新冠病毒的ORF1ab/N基因的最低检测限为 5×102copies/mL-1×103copies/mL。
优选地,扩增程序为:42℃恒温反应,每30s采集一次荧光,循环40 次。
优选地,所述试剂盒用于检测时的扩增体系包含RT-RPA冻干粉、34μL复 溶剂、2.5μL激活剂和13.5μL待检测的核酸样品或13.5μL阴/阳性对照。
本发明所述的新冠病毒保守序列、新冠病毒引物探针组合在制备检测新冠 病毒的试剂盒或试剂中的应用。
与现有技术相比,本发明提供的一种用于检测新冠病毒的探针和引物、试 剂盒、检测方法及应用具有以下有益效果:
1、本发明通过将ORF1ab/N基因序列中一段保守序列作为靶标序列检测 新冠病毒,该段特异性序列能够有很好的特异性,并针对N基因和ORF1ab基 因上的该段特异性保守序列能够很好的检测新冠病毒,以使检测过程中能够更 加快速准确的判断检测出来的病毒是新冠病毒,本发明通过N基因序列和 ORF1ab基因序列两个基因序列来检测新冠病毒,通过对同一样本的双重检测, 以增加检测的精确度,能够更好的保证检测结果的精确。
2、本发明通过针对N基因序列和ORF1ab基因序列中保守序列各自设计 相应的靶标引物探针以及内参引物探针,以使在检测的过程中特异性更好,灵 敏度更高,能够快速精准的得到检测结果。
附图说明
图1是本发明N基因靶标序列组合1与人基因组序列同源性比较结果截图;
图2是本发明N基因靶标序列组合1与nt数据库同源性比较结果截图;
图3是本发明N基因靶标序列组合2与人基因组序列同源性比较结果截图;
图4是本发明N基因靶标序列组合2与nt数据库同源性比较结果截图;
图5是本发明N基因靶标序列组合3与人基因组序列同源性比较结果截图;
图6是本发明N基因靶标序列组合3与nt数据库同源性比较结果截图;
图7是本发明ORF1ab靶标序列组合1与人基因组序列同源性比较结果截图;
图8是本发明ORF1ab靶标序列组合1与nt数据库同源性比较结果截图;
图9是本发明ORF1ab靶标序列组合2与人基因组序列同源性比较结果截图;
图10是本发明ORF1ab靶标序列组合2与nt数据库同源性比较结果截图;
图11是本发明ORF1ab靶标序列组合3与人基因组序列同源性比较结果截图;
图12是本发明ORF1ab靶标序列组合3与nt数据库同源性比较结果截图。
具体实施方式
一种用于检测新冠病毒基因保守序列,其中cDNA序列包括:靶标N基因 中的一段保守序列和靶标ORF1ab基因中的一段保守序列作为检测的靶标序列, 用于检测新冠病毒,通过进一步选取上述保守序列中的N基因和ORF1ab基因 保守序列中的一段序列作为靶标序列,并针对对应的靶标序列设计相应的引物 探针和内参引物探针,引物设计的原则如下:
1)RPA引物长度为27~35个碱基,GC含量在40%~60%之间,避免形成 二级结构和发卡结构;
2)引物中应避免出现长串的聚嘌呤或聚嘧啶等特殊序列;
3)5’端前3~5个核苷酸应避免为聚鸟嘌呤,最好是胞嘧啶;
探针设计原则:
1)长度为46~52个碱基;
2)距离5’端约30bp以及距离3’端约15bp处插入THF(四氢呋喃)作为 外切酶exo的切断位点,在THF左右需为胸腺嘧啶,且胸腺嘧啶上分别修饰荧 光基团和淬灭基团;
3)在3’端作封闭处理阻断序列延伸。
其中,其中:i6FAMdT为6-FAM荧光素修饰的胸腺嘧啶T-残基;idSp为 无碱四氢呋喃THF残基;iBHQ1dT为BHQ1黑洞淬灭基团修饰的胸腺嘧啶T- 残基。
本发明中的N基因保守序列、ORF1ab基因保守序列、N基因靶标序列组 合、ORF1ab基因靶标序列组合、N基因靶标序列组合引物探针序列及内参引 物探针序列以及ORF1ab基因靶标序列组合引物探针序列及内参引物探针序列 如下表1所示:
Figure BDA0002825765360000081
Figure BDA0002825765360000091
Figure BDA0002825765360000101
表1
将SEQ ID No.2、SEQ ID No.6以及SEQ ID No.10所示的N基因靶标序列 与人的基因组序列进行同源性比较;数据来源美国国家生物技术信息中心(NCBI),通过比对工具:blastn(版本号:2.10.0)进行比对;数据库:nt;物种: Homo sapiens(taxid:9606);比对方法:Highly similar sequences(megablast);N 基因靶标序列1、N基因靶标序列2以及N基因靶标序列3的序列长度:181bp、 193bp、140bp。比对结果分别如图1、图3、图5所示:未发现明显相似序 列。
将SEQ ID No.2、SEQ ID No.6以及SEQ ID No.10所示的N基因靶标序列 与nt数据库进行同源性比较;比对方法说明:数据来源美国国家生物技术信息 中心(NCBI),通过比对工具:blastn(版本号:2.10.0);数据库:nt;比对方法: Highly similar sequences(megablast);序列长度分别为181bp、193bp、140bp。 具体的对比结果如图2、图4、图6所示。
将SEQ ID No.15、SEQ ID No.19以及SEQ ID No.24所示的ORF1ab基因 靶标序列与人的基因组序列进行同源性比较;数据来源美国国家生物技术信息 中心(NCBI),通过比对工具:blastn(版本号:2.10.0)进行比对;数据库:nt; 物种:Homo sapiens(taxid:9606);比对方法:Highly similar sequences(megablast); ORF1ab基因靶标序列1、ORF1ab基因靶标序列2以及ORF1ab基因靶标序列 3的序列长度:130bp、126bp、206bp。比对结果分别如图7、图9、图11所 示:未发现明显相似序列。
将SEQ ID No.15、SEQ ID No.19以及SEQ ID No.24所示的ORF1ab基因 靶标序列与nt数据库进行同源性比较;比对方法说明:数据来源美国国家生物 技术信息中心(NCBI),通过比对工具:blastn(版本号:2.10.0);数据库:nt; 比对方法:Highly similarsequences(megablast);序列长度分别为130bp、126bp、 206bp。具体的对比结果如图8、图10、图12所示。
通过上述比对,结果发现N基因各靶点以及ORF1ab各靶点与人基因组进 行核酸序列同源性比对,均未发现同源性,表明三个靶基因对于人基因组特异 性好,在进行检测时引物不会在人基因组上出现非特异性扩增。且自身保守性 好,适合作为检测靶标。
本发明还提供了一种用于检测新冠病毒的试剂盒,包括含上述任一N基因 引物探针组合和ORF1ab基因引物探针组合的RT-RPA冻干粉。
本试剂盒检测部分是基于重组酶聚合酶核酸扩增技术(RPA),在RT-RPA (逆转录重组酶聚合酶扩增)反应体系中包含有逆转录作用的反转录酶,有 DNA解链作用的重组酶,有链置换作用的DNA聚合酶,有单链结合作用的单 链结合蛋白,有DNA链外切作用的核酸外切酶,有辅助功能的重组酶辅酶以 及靶标基因特异性引物探针等主要原材料。试剂盒工作原理具体如下:
在42℃条件下,RNA在反转录酶作用下反转录生成cDNA,重组酶与引 物形成重组酶/引物复合体,搜寻到cDNA核酸模板,引物与模板结合并在聚合 酶的作用下合成cDNA的互补链,形成DNA双链模板。然后重组酶与引物形 成重组酶/引物复合体再以双链DNA为模板,在引物互补位点重组酶将DNA 双链打开,同时单链结合蛋白结合至另一条单链上,维持双链模板处于开链状 态,接下来DNA聚合酶结合到引物3’末端,开始合成新链,随后扩增的产物 又可以作为模板,如此连续反复,完成靶标基因的扩增。
试剂盒包括含任一所述的N基因引物探针组合的RT-RPA冻干粉、复溶剂、 激活剂以及阴阳性对照品;
含任一所述的ORF1ab基因引物探针组合的冻干粉、复溶剂、激活剂以及 阴阳性对照品;
含任一内参引物探针组合的RT-RPA冻干粉、复溶剂、激活剂以及阴阳性 对照品;
其中,所RT-RPA冻干粉包括恒温反应所需的逆转录酶、重组酶、单链结 合蛋白、聚合酶、重组酶辅酶、核酸外切酶、海藻糖、dNTPs、ATP、CK、磷 酸肌酸二钠盐。
本发明试剂盒中针对N基因引物探针组合中的上游引物和下游引物的反 应终浓度为400nM-500nM,探针的反应终浓度为120nM-240nM;试剂盒中 针对ORF1ab基因基因引物探针组合中的上游引物和下游引物的反应终浓度为 400nM-500nM,探针的反应终浓度为120nM-240nM;试剂盒中针对内参引物 探针组合中的上游引物和下游引物的反应终浓度为400nM-500nM,探针的反 应终浓度为120nM-240nM。
在具体实施时,将针对N基因靶标序列组合1、N基因靶标序列组合2以 及N基因靶标序列组合3设计的引物探针分别与RT-RPA冻干预混液按照如下 表2混合分别形成3组配置体系,同样的,针对ORF1ab基因靶标序列组合1、 ORF1ab基因靶标序列组合2以及ORF1ab基因靶标序列组合3设计的引物探 针分别与RT-RPA冻干预混液按照如下表2混合分别形成3组配置体系,同样 的,设计的三组内参引物探针也分别与RT-RPA冻干预混液按照如下表2混合 形成3组配置体系,体系配置好后充分混匀,按50μL/管分装至0.2mLPCR8 连管中并进行冻干,形成RT-RPA反应干粉。
组分 1人份加入量
RT-RPA冻干预混液 40μL
上游引物(10μM) 2μL
下游引物(10μM) 2μL
探针(10μM) 0.6μL
RNase free水 5.4μL
表2
在具体检测时,分别用N基因检测体系冻干品和内参基因检测体系冻干品 检测样本L1-L4,检测反应体系配置如下表3所示:
Figure BDA0002825765360000131
Figure BDA0002825765360000141
表3
而在具体检测时,新型冠状病毒2019-nCoV阳性样本核酸,N基因原始浓 度(Ct值:29.1)进行相应倍数稀释,分别稀释3倍、9倍、27倍,制备成实 验用核酸样本L1(理论Ct值:30.4)、L2理论Ct值:32.0)、L3理论Ct值: 34.5),以及将RNase free水(无核糖核酸酶水)作为阴性样本L4。
阴性样本RNase P基因原始浓度(Ct值:30.2)进行相应倍数稀释,分别 稀释3倍、9倍、27倍,制备成实验用核酸样本L1(Ct值:31.7)、L2Ct值: 33.1)、L3Ct值:34.9),以及将RNase free水(无核糖核酸酶水)作为阴性 样本L4。
首先向反应干粉管中加入34μL的A液和13.5μL的样本,再将2.5μLB 液加到管盖上。轻轻盖上管盖,上下颠倒混匀6-8次,瞬时离心10s,将液体 全部收集至管底。荧光PCR仪上机检测。每组冻干粉每个样本3个复孔检测。
具体上机检测时,ABI7500实时荧光PCR仪参数设置:42℃30s(荧光 采集)40个循环。荧光通道选择FAM,参比荧光选择none。
分别统计N基因和内参基因不同的引物探针组检测各样本的Ct值,统计 结果如下。
N基因各组检测结果统计,如表4所示:
Figure BDA0002825765360000142
表4
ORF1ab基因各组检测结果统计表5:
Figure BDA0002825765360000143
Figure BDA0002825765360000151
表5
内参基因各组检测结果统计,如表6所示:
Figure BDA0002825765360000152
表6
三种N基因靶标序列组合、三种ORF1ab基因靶标序列组合以及三种内参 引物探针检测后均能够达到特异性识别的效果,但是通过对上述检测结果统计 与比较,综合出峰时间、荧光值等因素,最终筛选出N基因检测引物探针组合 2:N-4F+N-RAA-R4+SARS-CoV2-P检测效果最好,内参基因检测引物探针 组合3:RNase P-F+RNase P-R+RNase P-P1检测效果最好,ORF1ab-组合1: HC-ORF1ab-F+CoV2-O-1R3+CoV2-O-1P-1检测效果最好。
特异性实验
本发明针对试剂盒进行交叉反应的检测,实验步骤如下:
取500μL交叉反应样本加入750μL试剂盒裂解液中,将样本与裂解液 震荡混匀,室温静置15min,上样1mL上机提取,使用含有N基因探针引物 组合的反应体系、含有ORF1ab基因探针引物组合的反应体系中以及含有内参 引物探针组合的反应体系进行检测。
上述实验的样本浓度为108copies/mL的甲型(季节性H1N1)、乙型流感 病毒(BV型)、人冠状病毒(229E、HKUI、OC43、NL63、SARS、MERS)、鼻 病毒(A型、B型、C型)、腺病毒(1型、2型、3型、4型、5型、7型、55 型)、人基因组、肠道病毒(A组、B组、C组、D组)、呼吸道合胞病毒、肺 炎衣原体、肺炎支原体;
样本浓度为105pfu/mL的新型甲型H1N1(2009)、H3N2、H5N1、H7N9、乙 型流感病毒(BY型)、副流感病毒(1型、2型、3型)、EB病毒、麻疹病毒、 人巨细胞病毒、诺如病毒、水痘-带状疱疹病毒、轮状病毒、流行性腮腺炎病毒、 博卡病毒、人偏肺病毒;
样本浓度为106cfu/mL的军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、结核分枝 杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、肺炎克雷伯菌、烟曲霉、 白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌;
上述的样本中除人冠状病毒(SARS)和人冠状病毒((MERS)为假病毒,人基因 组为灭活的293细胞,其余的均为灭活培养液。样本浓度按照技术审评要点要 求的医学相关水平浓度进行测试,或者直接采用质粒标定病毒滴度,针对上述 交叉反应的,检测结果均为阴性,表明试剂盒与测试的其他病原体均不存在交 叉反应,具有较好的特异性。
通过上述对比实验说明本发明中的特异性位点能够很好的检测新冠病毒, 在试剂盒在使用过程中与其它病原体不会出现交叉反应,使试剂盒在使用的过 程中,能够精准快速的得到检测结果,以便于使用者能够根据检测结果快速的 做出相应控制措施,降低感染风险。
灵敏性实验
取三个批次合格的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(恒温扩增法) 进行最低检测限的评估试验,三个批次分别为20200817A、20200818A以及 20200819A,并采用上海伯杰医疗科技有限公司型号为BG-Nova-X8的全自动 核酸检测分析系统进行灵敏性检测。
通过使用与上述仪器相配套的采样管以及非配套的采样管模拟样本的最 低检测限,使用从中国科学计量院得到的新型冠状病毒2019-nCoV核酸标准品GBW(E)091099(N基因浓度为1.73×106copies/mL;ORF1ab基因浓度为 6.89×105copies/mL)作为荧光PCR定量标准品,用以标定阳性样本核酸的浓 度。具体的实验如下:
配套采样管最低检测限的确定:使用配套采样管模拟样本确定试剂的最 低检测限,将临床样本用洗过阴性口咽拭子的裂解液稀释至2×104copies/mL、 5×103copies/mL、1×103copies/mL、2×102copies/mL,取1mL上样,重复检测 3次,以100%可检出的最低浓度作为估计检测限,在此浓度附近制备2×103 copies/mL、1×103copies/mL、8×102copies/mL、5×102copies/mL、4×102copies/mL, 取1mL上样,重复检测20次,以95%检出率初步判定为试剂的最低检测限。
非配套采样管最低检测限的确定:使用非配套采样管模拟样本确定试剂的 最低检测限,将临床样本使用阴性口咽拭子样本(3例)以及经液化后痰液样 本(3例)稀释至2×104copies/mL、5×103copies/mL、1×103copies/mL、2×102 copies/mL,取500μL加入750μL裂解液中,震荡混匀,室温静置15min,上 样1mL,重复检测3次,以100%可检出的最低浓度作为估计检测限,在此浓 度附近制备2×103copies/mL、1×103copies/mL、8×102copies/mL、5×102copies/mL、 4×102copies/mL。取500μL加入750μL裂解液中,震荡混匀,室温静置15min, 上样1mL,重复检测20次,以95%检出率初步判定为试剂的最低检测限。
实验用样本的制备:
配套采样管模拟样本制备:将临床样本(S1,S2,S3)用洗过阴性口咽拭子 的裂解液稀释至2×104copies/mL、5×103copies/mL、1×103copies/mL、2×102 copies/mL,用于后续实验。
非配套采样管模拟样本制备:将临床样本使用阴性口咽拭子样本以及经液 化后痰液样本稀释至2×104copies/mL、5×103copies/mL、1×103copies/mL、2×102 copies/mL,取500μL加入750μL裂解液中,震荡混匀,室温静置15min,用 于上机检测。
实验结果及统计分析:
配套采样管最低检测限的确定如下表10:
Figure BDA0002825765360000181
表10
由上述试验得知,对样本含量在1×103copies/mL以上的能稳定检出,对样 本含量在200copies/mL的样本部分检出。选取2×104copies/mL的咽拭子样本, 此浓度样本再进行梯度稀释,得到2×103copies/mL、1×103copies/mL、8×102 copies/mL、5×102copies/mL、4×102copies/mL等不同浓度的样本,每个浓度样 本进行每批试剂重复检测20次验证,实验结果如下表11。
Figure BDA0002825765360000191
Figure BDA0002825765360000201
表11
非配套采样管最低检测限的确定:
(1)口咽拭子样本最低检出限的确定,实验结果如下表12:
Figure BDA0002825765360000202
表12
由上述试验得知,对口咽拭子样本含量在1×103copies/mL以上的能稳定检 出,对口咽拭子样本含量在200copies/mL的样本无检出。选取2×104copies/mL 的样本,此浓度样本再进行稀释,得到2×103copies/mL、1×103copies/mL、8×102 copies/mL、5×102copies/mL、4×102copies/mL等不同浓度的样本,每个浓度样 本进行每批试剂重复检测20次验证,实验结果如下表13。
Figure BDA0002825765360000211
Figure BDA0002825765360000221
表13
(2)痰液样本最低检出限的确定如表14:
Figure BDA0002825765360000222
表14
由上述试验得知,对痰液样本含量在1×103copies/mL以上的能稳定检出, 对痰液样本含量在200copies/mL的样本无检出。选取2×104copies/mL的样本, 此浓度样本再进行稀释,得到2×103copies/mL、1×103copies/mL、8×102 copies/mL、5×102copies/mL、4×102copies/mL等不同浓度的样本,每个浓度样 本进行每批试剂重复检测20次验证,实验结果如下表15。
Figure BDA0002825765360000231
Figure BDA0002825765360000241
表15
由上述实验可知结合配套采样管及非配套采样管实验结果可知,该试剂盒 最佳的最低检测限设定为8×102copies/mL。
针对上述试剂盒最低检测限进行验证,具体验证如下:
具体的实验步骤同上述最低检测限确定的实验步骤,临床样本病毒核酸的 浓度确定(方法同上述试剂盒的最低检测限中样本检测时样本核酸浓度的确定 方法一致);
在检测前,需要对样本进行稀释,使用配套采样管样本制备时,对临床样 本病毒核酸根据定量结果进行用洗过阴性口咽拭子的裂解液稀释至5×102 copies/mL,用于实验。
而使用非配套采样管模拟样本制备时,对临床样本病毒核酸根据定量结果 进行用对应阴性基质稀释至8×102copies/mL,取500μL加入750μL裂解液中, 震荡混匀,室温静置15min,用于实验。
在验证样本检测时,分别用3批检测试剂对格样本各进行20次重复检测, 统计检测结果如下。
采用配套采样管分别对3批检测试剂对3个5×102copies/mL口咽拭子核酸 样本进行最低检限验证,各进行20次重复检测,结果如下表16:
Figure BDA0002825765360000242
Figure BDA0002825765360000251
表16
采用非配套采样管分别对3批检测试剂对3个8×102copies/mL口咽拭子核 酸样本以及3个8×102copies/mL痰液核酸样本进行最低检出限验证,各进行 20次重复检测,结果如下表17:
Figure BDA0002825765360000252
表17
经过对试剂盒最低检测限的确认和验证实验,综合考虑两种采样方式,确 定本试剂盒的最低检测限为8×102copies/mL。由此可知,上述所述的试剂盒在 使用的过程中灵敏度高,在检测过程中能够快速的得到检测结果,以使使用者 在使用时,能够减少检测的时间,可以针对快速检测出来的结果做出有效的控 制措施,能够降低感染者的传播。
应当说明的是,上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优 选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发 明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发 明的保护范围。

Claims (17)

1.一种用于检测新冠病毒基因保守序列,其特征在于:
所述cDNA序列包括:靶标N基因中的一段保守序列和靶标ORF1ab基因中的一段保守序列作为检测的靶标序列,用于检测新冠病毒,所述N基因保守序列如SEQ ID No.1所示;所述ORF1ab基因保守序列如SEQ ID No.14所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测新冠病毒基因保守序列,其特征在于:选取自N基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列1,所述N基因靶标序列1用于检测新冠病毒N基因,所述N基因靶标序列组合1如SEQ ID No.2所示;
或;
选取自N基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列2,所述N基因靶标序列2用于检测新冠病毒N基因,所述N基因靶标序列组合2如SEQ ID No.6所示;
或;
选取自N基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列3,所述N基因靶标序列3用于检测新冠病毒N基因,所述N基因靶标序列组合3如SEQ ID No.10所示。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测新冠病毒基因保守序列,其特征在于:
选取自ORF1ab基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列1,所述N基因靶标序列1用于检测新冠病毒ORF1ab基因,所述ORF1ab基因靶标序列组合1如SEQ ID No.15所示;
或;
选取自ORF1ab基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列2,所述N基因靶标序列2用于检测新冠病毒ORF1ab基因,所述靶标序列组合2如SEQ ID No.19所示;
或;
选取自ORF1ab基因保守序列中的一段基因序列作为靶标序列1,所述N基因靶标序列3用于检测新冠病毒ORF1ab基因,所述靶标序列组合3如SEQ ID No.23所示。
4.一种用于检测权利要求2的新冠病毒的引物探针组合,其特征在于:所述N基因保守序列为N基因靶标序列1时,引物探针包括:
上游引物N-3F:如SEQ ID No.3所示;
下游引物N-RAA-R3:如SEQ ID No.4所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.5所示。
5.一种用于检测权利要求2的新冠病毒的引物探针组合,其特征在于:所述N基因保守序列为N基因靶标序列2时,引物探针包括:
上游引物N-4F:如SEQ ID No.7所示;
下游引物N-RAA-R4:如SEQ ID No.8所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.9所示。
6.一种用于检测权利要求2的新冠病毒的引物探针组合,其特征在于:所述N基因保守序列为N基因靶标序列3时,引物探针包括:
上游引物N-RAA-F2:如SEQ ID No.11所示;
下游引物N-RAA-R2:如SEQ ID No.12所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.13所示。
7.一种用于检测权利要求3的新冠病毒的引物探针组合,其特征在于:所述ORF1ab基因保守序列为ORF1ab基因靶标序列1时,引物探针包括:
上游引物N-RAA-F2:如SEQ ID No.16所示;
下游引物N-RAA-R2:如SEQ ID No.17所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.18所示。
8.一种用于检测权利要求3的新冠病毒的引物探针组合,其特征在于:所述ORF1ab基因保守序列为ORF1ab基因靶标序列2时,引物探针包括:
上游引物N-RAA-F2:如SEQ ID No.20所示;
下游引物N-RAA-R2:如SEQ ID No.21所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.22所示。
9.一种用于检测权利要求3的新冠病毒的引物探针组合,其特征在于:所述ORF1ab基因保守序列为ORF1ab基因靶标序列3时,引物探针包括:
上游引物N-RAA-F2:如SEQ ID No.24所示;
下游引物N-RAA-R2:如SEQ ID No.25所示;
探针SARS-CoV2-P:如SEQ ID No.26所示。
10.根据权利要求探针所述的一种用于检测权利要求2或3的新冠病毒的引物探针组合,其特征在于:针对N基因和ORF1ab基因设计的内参引物探针为:
内参引物探针组合1:
上游引物RNase P-F1:如SEQ ID No.27所示;
下游引物RNase P-R1:如SEQ ID No.38所示;
探针RNase P-P1:如SEQ ID No.29所示;
或;
内参引物探针组合2:
上游引物RNase P-F:如SEQ ID No.31所示;
下游引物RNase P-R:如SEQ ID No.32所示;
探针RNase P-P1:4如SEQ ID No.33所示;
或;
内参引物探针组合3:
上游引物RNase P-F2:如SEQ ID No.33所示;
下游引物RNase P-R2:如SEQ ID No.34所示;
探针RNase P-P1:如SEQ ID No.35所示。
11.根据权利要求4-10任一所述的一种用于检测新冠病毒的引物探针组合,其特征在于:
所述探针距离5’端约30bp以及距离3’端约15bp处插入THF作为外切酶exo的切断位点,在THF左右需为胸腺嘧啶,且胸腺嘧啶上分别修饰荧光基团和淬灭基团。
12.一种用于检测新冠病毒的试剂盒,其特征在于:
包括含权利要求4-6任一所述的N基因引物探针组合的RT-RPA冻干粉、复溶剂、激活剂以及阴阳性对照品;
含权利要求7-9任一所述的ORF1ab基因引物探针组合的RT-RPA冻干粉、复溶剂、激活剂以及阴阳性对照品;
含权利要求10中的任一内参引物探针组合的RT-RPA冻干粉、复溶剂、激活剂以及阴阳性对照品;
其中,所RT-RPA冻干粉包括恒温反应所需的逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、重组酶辅酶、核酸外切酶、海藻糖、dNTPs、ATP、CK、磷酸肌酸二钠盐。
13.根据权利要求12所述的用于检测新冠病毒的试剂盒,其特征在于:
所述试剂盒中针对N基因引物探针组合中的上游引物和下游引物的反应终浓度为400nM-500nM,探针的反应终浓度为120nM-240nM;
所述试剂盒中针对ORF1ab基因基因引物探针组合中的上游引物和下游引物的反应终浓度为400nM-500nM,探针的反应终浓度为120nM-240nM;
所述试剂盒中针对内参引物探针组合中的上游引物和下游引物的反应终浓度为400nM-500nM,探针的反应终浓度为120nM-240nM。
14.根据权利要求12所述的用于检测新冠病毒的试剂盒,其特征在于:
所述试剂盒用于检测新冠病毒的ORF1ab/N基因的最低检测限为5×102copies/mL-1×103copies/mL。
15.根据权利要求12所述的用于检测新冠病毒的试剂盒,其特征在于:扩增程序为:42℃恒温反应,每30s采集一次荧光,循环40次。
16.根据权利要求12所述的用于检测新冠病毒的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒用于检测时的扩增体系包含RPA冻干粉、34μL复溶剂、2.5μL激活剂和13.5μL待检测的核酸样品或13.5μL阴/阳性对照。
17.权利要求1-3所述的新冠病毒保守序列、权利要求5-10所述的新冠病毒引物探针组合在制备检测新冠病毒的试剂盒或试剂中的应用。
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