CN112981009B - 一种新型冠状病毒的全基因组扩增引物、试剂盒及一步法富集及建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型冠状病毒的全基因组的扩增引物、试剂盒及一步富集及建库方法，本发明通过设计75对引物，实现一步法完成新型冠状病毒全基因组的富集，避免转管或过多的操作步骤引起的污染，测序后的数据可以覆盖新型冠状病毒10000倍以上。本发明通过引物及其引物的配比，可以提升测序数据均一性，以便于降低测序成本和提高富集成功率。本发明通过对第一次PCR程序的优化，将富集扩增中的循环数降低，减少了非特异性扩增，提高测序数据利用率。
Description
技术领域
本发明涉及新冠病毒全基因组建库领域，尤指一种新型冠状病毒的全基因组的扩增引物、试剂盒及一步法富集及建库方法。
背景技术
国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组将新冠病毒命名为：严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coron-avirus 2,SARS-CoV-2)，由其所致的疾病由世界卫生组织(WHO)命名为COVID-19，其中“Co”代表冠状，“Vi”为病毒，“D”为疾病。大多数感染患者呈现高热特征，有些患者呼吸困难，胸片显示双肺有侵袭性病变。因此，SARS-CoV-2的病原学诊断对我国传染病防控至关重要，发全基因组测序配套的富集建库试剂盒具有重大的社会和经济意义。
冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，长度从2.6万到3.2万个碱基不等，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ、δ四个属。SARS-CoV-2属于β属，全长29903bp。
针对新型冠状病毒全基因组的富集和建库方法，目前已发布的专利公开号为CN111676318A的新型冠状病毒全基因组的扩增引物和方法，提供了一组适用于二代和三代测序的引物组。缺点是需要逆转录、富集、建库三步完成整个测序前的样本处理过程；且未对均一性进行优化。ARTIC发布的扩增子方法的缺点是需要逆转录、富集、建库三步完成整个测序前的样本处理过程；且测序数据严重不均一。华大智造发布的探针捕获方法：对变异的兼容性较好，但是灵敏度差、实验周期长、操作复杂。
发明内容
本发明提供一种新型冠状病毒的全基因组的扩增引物、试剂盒及一步法富集及建库方法，将解决现有的新型冠状病毒富集过程中容易造成污染、测序数据均一性差等问题。
本发明提供的技术方案如下：
一种用于新冠病毒的检测引物组合，所述引物组合包括由表1 SEQ ID NO.1-150所示的75对引物序列组成，其中37对偶数对的引物组成第一引物组，38对奇数对引物组成第二引物组。
优选地，每对所述引物的扩增长度分布在500-548bp，且每对相邻的引物扩增产物重叠区域的范围为75-147bp。
优选地，所述引物组合中的各引物体积配比如表1所示。
根据上述所述的检测引物组合在制备检测新型冠状病毒的产品中的应用。
优选地，所述产品包括试剂或试剂盒。
一种新型冠状病毒全基因组的一步富集方法，包括如下步骤：
采集待测样本，提取待测样本中的病毒核酸后，并将提取核酸等量置于两个离心管中，并通过病毒核酸逆转录和全基因组富集的试剂配方，以及采用第一次PCR程序对两个离心管中的核酸依次进行逆转录、变性、扩增富集、延伸后得到富集产物，其中，第一次PCR程序中两个离心管中试剂配方中分别包括上述任一应用中所述的第一引物组和所述的第二引物组。
优选地，所述第一组引物组和所述第二组引物组中的每对引物的上游引物和下游引物中分别对应设计一条通用序列；
其中，上游引物的通用序列为：CTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；下游引物的通用序列为：CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
优选地，所述第一次PCR程序中的试剂配方包括25μL 2倍的PLatinumTM SuperFiTMRT-PCR Master Mix(ThermoFisher)、0.5μLSuperScriptTM IV RT Mix(ThermoFisher)、5μL第一引物组/第二引物组、19.5μL新型冠状病毒RNA核酸。
优选地，所述第一次PCR程序中逆转录的温度为50℃，时间为10min，循环数1次；
所述第一次PCR程序中预变性的温度为98℃，时间为2min，循环数2次；
所述第一次PCR程序中扩增富集分为两步，第一步的温度为98℃，时间为10s，第二步的温度为65℃，时间为4min,循环数28次；
所述第一次PCR程序后延伸的温度为72℃，时间为5min,循环数为1次。
本发明还提供一种新型冠状病毒全基因组的建库方法，包括如下步骤：
S10、将上述所述的一种新型冠状病毒全基因组的一步富集方法获得的两组富集产物合并到一起后，使用0.8倍体积的Agencourt AMPure XP的磁珠进行纯化，获得所需的PCR富集产物；
S20、通过第二次PCR程序将测序标签及接头连接到S10中的富集产物中；
S30、使用0.8倍体积的Agencourt AMPure XP的磁珠对S20中的产物进行纯化，然后使用Qubit dsDNA HS Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒，对文库进行定量，并根据定量结果进行文库稀释后上机测序。
优选地，所述S20中第二次PCR的反应体系包括25μL PrimeSTAT Max DNAPoLymerase(Takara)、20μL纯化后的富集产物、5μL测序接头序列。
优选地，所述第二次PCR反应条件为1个循环：98℃，45s；9个循环：98℃，15s、60℃，30s、72℃，30s；1个循环：72℃，1min。
与现有技术相比，本发明提供的一种新型冠状病毒的全基因组的扩增引物、试剂盒及一步法富集及建库方法具有以下有益效果：
1、本发明通过设计75对引物，实现一步法完成新型冠状病毒全基因组的富集，避免转管或过多的操作步骤引起的污染，测序后的数据可以覆盖新型冠状病毒10000倍以上。
2、本发明通过设计引物及引物的配比，可以提升测序数据均一性，以便于降低测序成本和提高富集成功率。
3、本发明通过对第一次PCR程序的优化，将富集扩增中的循环数降低，减少了非特异性扩增，提高测序数据利用率。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种新型冠状病毒的全基因组的扩增引物、试剂盒及一步法富集及建库方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
图1是本发明S1样本引物配比调整前全基因组深度分布图；
图2是本发明样本扩增富集的循环数为35时的文库片段分布图；
图3是本发明S1样本文库片段分布图；
图4是本发明S2样本文库片段分布图；
图5是本发明S3样本文库片段分布图；
图6是本发明S1样本全基因组深度分布图；
图7是本发明S2样本全基因组深度分布图；
图8是本发明S3样本全基因组深度分布图。
具体实施方式
实施例1
根据本发明提供的一种实施例，本发明提供了一种新型冠状病毒全基因组的一步富集方法，包括如下步骤：
采集待测样本，提取待测样本中的病毒核酸后，将提取核酸等量置于两个离心管中，并通过病毒核酸逆转录和全基因组富集的试剂配方，以及采用第一次PCR程序对两个离心管中的核酸依次进行逆转录、变性、扩增富集、延伸后得到富集产物，其中，第一次PCR程序中两个离心管中试剂配方中分别包括应用在产品中第一引物组和所述的第二引物组；具体如下：
本方案中为了考虑样本核酸的保存稳定性和扩增产物的均一性，以NCBI数据库编号为NC_045512.2的序列作为参考基因组，按照基因组位置设计了用于新冠病毒的检测引物组合，即如表1SEQ ID NO.1-150所示的75对富集引物，每对序列中的引物序列编号如表1的p.1-75(F/R)所示，每对引物的扩增产物长度分布在500-548bp。每对相邻的引物扩增产物有75-147bp左右的重叠区域，以保证全基因组范围的完整覆盖。并且将75对引物分为第一引物组和第二引物组，其中37对偶数对的引物组成第一引物组，38对奇数对引物组组成第二引物组；其中，本发明引物组合中的各对引物及其配比具体如下表1所示，其他步骤同实施例1中的步骤，仅仅是对引物的体积配比进行调整，调整后的每对引物的配比使上述用于新冠病毒的检测引物组合进行全基因组扩增的时候，可以得到深度更加均一的测序数据，其中，表1中的配比数值是以所有引物对为整体时的初始引物浓度中各引物对在整体引物对之间所占的体积比值，并对调整前后测序数据的均一性进行对比，我们使用实施例样本S1(即下文实施例2中的样本S1)做了对比测试，调整前后的测序数据深度分布图见图1和图6所示。
表1
为了在富集之后更方便的完成测序标签和接头序列的连接，我们提前在每对引物的上游引物和下游引物中分别对应设计一条通用序列；其中，
上游引物的通用序列为：CTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG，下游引物的通用序列为：CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
使用提取试剂提取新型冠状病毒核酸后，在具体使用时，提取试剂可以为QIAampViraL RNA Mini Kit(Qiagen)，其他的试剂也是可以实现本发明的功能，也在本发明的保护范围内；新型冠状病毒核酸为RNA，一般需要先进行逆转录，将RNA转化为cDNA，但是为了更加方便的操作，和减少转管等操作过程中引入的污染，本发明对第一次PCR体系中的试剂配方作出如下表2所示的调整，实现对目标核酸的一步反转录和富集。
表2
同时，本发明利用优化过的PCR程序对上述试剂体系进行第一次PCR处理，以得到新型冠状病毒全基因组的富集产物，第一次PCR程序如下表3所示：
表3
针对上述新型冠状病毒全基因组富集程序(即第一次PCR程序)，本发明对以往的扩增富集循环数做了修改，修改后的扩增循环数如表3所示，从原来的35循环，降低到了28循环，以减少非特异性扩增，提高测序数据利用率，因为引物对数比较多，在对循环数35时的文库做了片段分析时发现，循环数上升后，出现了非特异性扩增，如图2所示。
一种新型冠状病毒全基因组的建库方法，包括如下步骤：
S10、将新型冠状病毒全基因组的一步富集方法获得的两组富集产物合并到一起后，使用0.8倍体积的Agencourt AMPure XP的磁珠进行纯化，获得所需的PCR富集产物；
S20、通过第二次PCR程序将测序标签及接头连接到S10中的富集产物中；
第二次PCR程序中的体系配置如下表4：
| 试剂成分 | 体积 |
| PrimeSTAT Max DNA PoLymerase(Takara) | 25μL |
| 纯化后的富集产物 | 20μL |
| 测序接头序列 | 5μL |
| 合计 | 50μL |
表4
第二次PCR程序如表5所示：
表5
S30、使用0.8倍体积的Agencourt AMPure XP的磁珠对S20中的产物进行纯化，然后使用Qubit dsDNA HS Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒，对文库进行定量，并根据定量结果进行文库稀释后上机测序。
实施例2：
共收集3例样本核酸(编号分别为S1、S2、S3)，分别来源于口咽拭子、灭活疫苗、鼻咽拭子，3个样本使用qPCR的方法进行病毒载量的测定，ct值分别为20.03，26.26，32.73，利用本发明提供的方法对这三例待测样本进行新型冠状病毒全基因组富集和建库。
第一轮PCR
将第一引物组和第二引物组分成两个反应管，分别取名叫T1和T2，将T1和T2两管引物组分别对三例待测样本核酸进行富集反应，按照实施例1中的体系配置和PCR程序进行富集，将T1管反应产物与T2管反应产物合并，并使用0.8倍体积的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，同时使用200μL新鲜配置的80％乙醇漂洗磁珠两遍，然后自然晾干并进行洗脱纯化产物。
第二轮PCR
按照实施例1中的步骤S20的配置体系和PCR程序进行第二轮的PCR将测序标签及接头连接到S10中的富集产物中。
文库纯化
使用0.8倍体积的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，同时使用200μL新鲜配置的80％乙醇漂洗磁珠两遍，然后自然晾干并进行洗脱纯化产物。
文库定量与质控
使用Qubit dsDNA HS Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒，对文库进行定量，定量结果如下表6。并用AgiLent 4150TapeStation仪器进行片段分析，片段分析结果如下图3-5所示；
在本实施例中，利用表1中提供的引物组和引物配比对待检测样本S1-S3进行PCR扩增富集，将得到的富集产物进行第二轮PCR扩增富集添加测序标签，纯化后即可进行测序，测序数据可以覆盖新型冠状病毒10000×以上，S1-S3的全基因组深度分布图如图6-8所示。
| 样本编号 | 文库定量浓度 |
| S1 | 16.5ng/μL |
| S2 | 8.22ng/μL |
| S3 | 3.1ng/μL |
表6
采用MiSeqDx测序仪对纯化后的文库进行测序，并获得了约2Gb的测序数据，每个样本约获得700Mb的数据，详细数据信息见下表7。
| 样本编号 | 测序质量Q20(％) | 测序reads数 | 测序碱基数 |
| S1 | 94.68 | 1.06M | 634.43Mb |
| S2 | 93.74 | 1.59M | 952.64Mb |
| S3 | 84.85 | 0.7M | 422.94Mb |
表7
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种用于新冠病毒的检测引物组合，其特征在于：所述引物组合包括由表1 SEQ IDNO .1-150所示的75对引物序列组成，其中37对偶数对的引物组成第一引物组，38对奇数对引物组成第二引物组。
2.根据权利要求1所述的一种用于新冠病毒的检测引物组合，其特征在于：每对所述引物的扩增长度分布在500-548bp，且每对相邻的引物扩增产物重叠区域的范围为75-147bp。
3.根据权利要求2所述的检测引物组合在制备检测新型冠状病毒产品中的应用，其特征在于：所述引物组合中的各引物体积配比如表1所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。
5.一种非诊断方式的新型冠状病毒全基因组的一步富集方法，其特征在于，包括如下步骤：
采集待测样本，提取待测样本中的病毒核酸后，将提取的核酸等量置于两个离心管中，并通过病毒核酸逆转录和全基因组富集的试剂配方，以及采用第一次PCR程序对两个离心管中的核酸依次进行逆转录、变性、扩增富集、延伸后得到富集产物，其中，第一次PCR程序中两个离心管中试剂配方分别包括权利要求3-4任一应用中所述的第一引物组和所述的第二引物组。
6.根据权利要求5所述的一种非诊断方式的新型冠状病毒全基因组的一步富集方法，其特征在于：
所述第一组引物组和所述第二组引物组中的每对引物的上游引物和下游引物中分别对应设计一条通用序列；
其中，上游引物的通用序列为：CTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；
下游引物的通用序列为：CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
7.根据权利要求5所述的一种非诊断方式的新型冠状病毒全基因组的一步富集方法，其特征在于：所述第一次PCR程序中的试剂配方包括25μL 2倍的 厂家为ThermoFisher的PLatinum™ SuperFi™ RT-PCR Master Mix、0.5μL厂家为ThermoFisher的SuperScript™IV RT Mix、5μL第一引物组/第二引物组、19.5μL新型冠状病毒RNA核酸。
8.根据权利要求5所述的一种非诊断方式的新型冠状病毒全基因组的一步富集方法，其特征在于：
所述第一次PCR程序中逆转录的温度为50℃，时间为10min，循环数1次；
所述第一次PCR程序中预变性的温度为98℃，时间为2min，循环数1次；
所述第一次PCR程序中扩增富集分为两步，第一步的温度为98℃，时间为10s，第二步的温度为65℃，时间为4min,循环数28次；
所述第一次PCR程序后延伸的温度为72℃，时间为5min,循环数为1次。
9.一种新型冠状病毒全基因组的建库方法，其特征在于，包括如下步骤：
S10、将权利要求6-8中一种新型冠状病毒全基因组的一步富集方法获得的两组富集产物合并到一起后，使用0.8倍体积的Agencourt AMPure XP的磁珠进行纯化，获得所需的PCR富集产物；
S20、通过第二次PCR程序将测序标签及接头连接到S10中的富集产物中；
S30、使用0.8倍体积的Agencourt AMPure XP的磁珠对S20中的产物进行纯化，然后使用Qubit dsDNA HS Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒，对文库进行定量，并根据定量结果进行文库稀释后上机测序。
10.根据权利要求9所述的一种新型冠状病毒全基因组的建库方法，其特征在于：所述S20中第二次PCR的反应体系包括25μL 厂家为Takara的PrimeSTAT Max DNA PoLymerase、20μL纯化后的富集产物、5μL测序接头序列。
11.根据权利要求9所述的一种新型冠状病毒全基因组的建库方法，其特征在于：所述第二次PCR反应条件为1个循环：98℃，45s；9个循环：98℃，15s、60℃，30s、72℃，30s；1个循环：72℃，1min。
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