CN110317861A - 一种检测病原体的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测病原体的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种荧光标记的引物，所述荧光标记的引物对病原体靶标核酸进行扩增，然后利用病原体靶标核酸的扩增产物的熔解曲线实现病原体检测。本发明用基于产物的熔解曲线检测多靶标核酸，可以实现多靶标的同时检测，大大提高检测通量和效率，降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种同时检测多个靶标核酸的方法及其试剂盒。
背景技术
目前临床上常见的病原微生物感染症状有呼吸道感染，胃肠道感染，泌尿生殖道感染等，而引起这些症状的病原微生物较为复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，给疾病诊断和治疗造成极大的困难。若感染所致疾病得不到快速诊断，则只能经由临床医生的经验和现有知识给予治疗，而这些治疗方法常伴随着广谱抗生素的滥用，引起多重耐药菌的出现和医院获得性感染的发生。多种病原体同时检测的策略，以及病原体的快速、准确鉴定在疾病管理中至关重要。
传统的病原微生物检测方法技术复杂、阳性率低，而且耗时耗力，部分病原体培养条件苛刻甚至不能培养或需要专业的技术人员操作等制约条件使得其难以应用于临床早期诊断和指导治疗；免疫荧光技术、血清学试验等敏感度和特异性也很少能满足临床诊断的需要。随着生物学新技术的发展，分子诊断技术逐渐成为临床微生物实验室不可或缺的检验技术。由于临床样品中未知病原体感染以及多病原体混合感染，常规单病原体核酸检测方法往往需要进行多次筛选，相对费时费力。多重靶标检测能够实现多个病原体的快速鉴别和诊断，降低检验成本。多重靶标检测具有高效性、系统性和经济简便性等优点，已广泛应用于病原微生物的检测。常见的多重靶标检测技术有以下几种。
实时荧光PCR技术通过在PCR反应体系中加入不同的荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。具有高度灵敏、高特异性、有效解决PCR污染问题、快速等优点，是目前核酸检测广泛运用的方法。但由于受目前市场上荧光PCR仪通道的限制，单管最多只能检测4-5个靶标，不能满足临床上某一症候群相关的多种病原体或基因同时筛查的需求。
基因芯片技术又称为DNA微阵列，是通过微加工技术，将大量DNA探针固定到硅片、玻片等固态支持物上，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，获得样品的基因序列信息。此项技术可对多达上万个基因进行同时检测和分析，具有微型化、高通量等特点。但基因芯片技术仍存在一些问题，如检测灵敏度低，特异性较差，芯片制作成本高，且需要昂贵的检测仪器，这些问题使得基因芯片到目前主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床病原微生物的检测与鉴定。
高通量测序技术是近年来发展迅猛的生物技术，通过对DNA(或cDNA)随机片段化、加接头，制备测序文库，通过对文库中数以万计的克隆进行延伸反应，检测对应的信号，最终获取序列信息。该技术通量大，灵敏度高，尤其在一些新发疾病病原体的检测、未知病原体鉴别和突发疾病的防控中发挥重要作用。但目前该技术仍然存在一些待解决的问题：测序产生的海量数据需要专业的人员进行分析；测序的时间和成本仍然制约着其在临床上的广泛应用。
等温扩增是一种能够在恒定温度下，实现核酸的快速检测，其检测时效快，以及只需要在恒定温度下就可以实现越来越受到关注。目前核酸等温扩增检测有很多种方式，比如LAMP，HDA，RPA，NASBA等恒温扩增方式。不同的等温扩增系统根据应用场景有所不同，等温扩增系统，通常使用一些化学试剂，如LAMP检查用的中性红染料，电泳用到的核酸染料，在其他一些核酸等温使用分子信标系统以及Taqman自淬灭探针，这些信号检测系统由于受到仪器通道数量的限制，无法实现多重检测。
鉴于目前临床上对简便快速，灵敏度高，特异性好及多靶标检测技术的需求，而现有技术都有其局限性，不能完全满足临床的需求，因此我们亟需开发出一种快速，准确且低成本的检测技术。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种检测病原体的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种荧光标记的引物，所述荧光标记的引物对病原体靶标核酸进行扩增，然后利用病原体靶标核酸的扩增产物的熔解曲线实现病原体检测。
在一种实施方式中，所述扩增包括荧光PCR扩增、解旋酶依赖扩增或重组酶依赖扩增。
在一种实施方式中，荧光标记在所述引物的5’端到3’端之间的序列，优选地标记在所述引物5’到3’的中间位置。
在一种实施方式中，所述试剂盒是用于多种病原体检测的试剂盒，所述试剂盒包括多种荧光标记的引物，使得同一荧光通道内不同的病原体核酸的扩增产物的熔解曲线具有不同的熔点Tm值，并且同一荧光通道内的相邻不同靶标核酸的扩增产物的Tm值相差2-20℃，优选为相差2-8℃，从而实现基于荧光引物的扩增产物熔解曲线同时检测多个靶标核酸。
在一种实施方式中，所述试剂盒是用于同时沙眼衣原体和解脲脲原体的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：
，其中CT表示沙眼衣原体和UU表示解脲脲原体。
在一种实施方式中，所述试剂盒是用于同时检测常见性病病原体沙眼衣原体、解脲脲原体、奈瑟淋球菌和HSV-2单纯疱疹病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包括针对上述每个所述病原体设计特异性上、下游引物，所述上、下游引物分别如下：
，其中CT表示病原体沙眼衣原体、UU表示解脲脲原体、NG表示奈瑟淋球菌和HSV2表示HSV-2单纯疱疹病毒，IC表示内参。
在一种实施方式中，所述试剂盒是通过解旋酶依赖扩增检测病原体解脲脲原体的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：
。
在一种实施方式中，所述试剂盒是通过利用重组酶依赖扩增检测病原体奈瑟淋球菌的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：
。
在一种实施方式中，所述试剂盒包括逆转录试剂。
在一种实施方式中，所述试剂盒是检测甲型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：
本发明的主要优点如下：
1.利用基于产物的熔解曲线检测多靶标核酸，可以实现多靶标的同时检测，大大提高检测通量和效率，降低检测成本；
2.直接在引物上标记荧光，减少探针的使用，避免引物探针之间非特异结合而降低扩增效率，提高检测灵敏度；
3.利用荧光基团的自身淬灭，避免淬灭基团的使用，检测荧光信号增强，提高检测灵敏度；
4.检测体系中引物合成成本大大降低，可降低患者费用，于患者有益。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明试剂盒反应的原理图；
图2是表示CT不同方式标记荧光报告基团的FAM通道熔解曲线图；
图3是表示以FAM通道检测CT(A表示)和UU(B表示)的产物熔解曲线图；
图4是表示以FAM通道检测CT(A表示)、UU(B表示)、IC内标(C表示)的产物熔解曲线图；
图5是表示以HEX通道检测NG(A表示)和HSV2(B表示)的产物熔解曲线图；
图6是表示性病UU的HDA等温检测的扩增曲线图；
图7是表示性病UU的HDA等温检测的熔解曲线图；
图8是表示性病NG的RPA等温检测的扩增曲线图；
图9是表示性病NG的RPA等温检测的熔解曲线图；
图10是表示甲流H1N1检测扩增曲线图；
图11是表示甲流H1N1检测熔解曲线图。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。以下实施例中，所用的材料，如无特殊说明，均为本领域常规生化试剂公司购买得到的。
实施例1本发明试剂盒使用的原理图
如图1所示，图1中曲线A是本发明试剂盒的荧光变化图，曲线B是Taqman探针检测方法的荧光变化图。图1中本发明试剂盒的荧光曲线图A与Taqman探针检测方的曲线B荧光变化过程有一定相似性，但是本发明的荧光变化更明显，信号强度更高。
本发明的试剂盒使用过程包括扩增过程例如PCR过程和熔解曲线分析两个过程：
扩增过程：引物标记报告基团进行扩增反应。标记荧光基团引物DNA单链，其荧光强度可以在标记链与其互补序列杂交后增加，单链时其本底信号值较低，如图1中A1所示；带报告基团的引物与模板互补结合后，作为引物并在DNA聚合酶的作用下延伸形成DNA双链，荧光值逐渐升高，最终达到扩增曲线的平台期，如图1中A2所示；这两个过程构成了扩增过程。
熔解曲线过程：熔解曲线原始曲线如图1中的A3-A4两个过程所示，当温度低于产物Tm对应的温度的时候，即图1的A3所示，双链随着温度的升高，荧光值变化不大，即报告基团还存在于双链DNA中，所以处于高的荧光值状态。当温度到达产物熔点图1中的A3～A4的界限附近时，也就是到达产物熔点Tm值的时候，DNA双链快速打开，荧光信号值急剧下降。图1的A4所示为温度高于双链产物Tm值的信号值变化过程，由于现阶段基本都是形成只带报告基团的DNA单链，所以荧光值均低于其他状态的荧光值。对A3-A4整个过程中，进行荧光值信号的负求导，就可以获得如图3中A所示的熔解曲线。针对不同的目标核酸，设计扩增不同长度DNA产物的特异性扩增引物，标记不同的荧光通道，实现多重熔解曲线检测。
实例2本发明试剂盒的优化
在本实例中评价了多种标记方式，评价引物上标记不同数量的荧光基团、上下游引物分别标记荧光基团、下游引物标记不同荧光基团对检测效果的影响。
1.引物标记方式的设计
序列和标记方式如下表1：
表1.引物多种标记方式
表2.不同引物标记的组合方式
2.检测体系和反应条件
反应体系：1×PCR buffer，0.1mM MgSO4，200μM dNTPs、0.1μM上游引物，0.1μM下游引物，0.75U聚合酶。其上下游引物组合方式如表3所示。
3.检测结果
单引物标记不同数量的荧光基团，尝试过在CT上游引物单标记荧光基团对比，上下游引物都标记报告基团的扩增曲线灵敏度最好，到达平台期时，荧光信号值增高熔解曲线熔解峰信号值也更高。
如图2所示，在CT引物标记报告基团的6种组合中，组合3的扩增曲线和熔解曲线都是最好的；组合2虽然扩增曲线和熔解曲线的信号值较强，但是其的灵敏度是6种组合中最差的。
与上游引物单标记荧光基团对比，上下游引物都标记报告基团的扩增曲线灵敏度更高，熔解曲线熔解峰信号值也更高。
上游引物标记FAM，下游引物标记不同的报告基团，不同荧光通道的上下游引物，与单上游引物具有相同产物Tm熔解曲线。
实例4单荧光通道多靶标检测的试剂盒
本实例中，本发明试剂盒可实现单通道多靶标检测，为提高单通道检测通量提供方法。以检测性传播疾病的病原体CT和UU为例。
1.引物设计
分别针对CT和UU的保守区域设计特异性引物，并在各检测靶标基因的上游引物上标记一个荧光报告基因，如在序列中用斜体T，并设置两个扩增基因产物长度不一致，序列分别如表3所示。
表3.设计的沙眼衣原体(CT)和解脲支原体(UU)引物
2.反应体系及反应条件
反应体系：1×PCR buffer，0.1mM MgSO4，200μM dNTPs、0.1μM上游引物，0.1μM下游引物，0.75U聚合酶。
反应条件设置为：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃15秒，60℃退火延伸，同时收集荧光，重复40个循环；40-95℃熔解曲线分析，每隔0.03℃检测一次荧光信号，60℃降温1分钟
3.结果分析
本实例检测CT和UU二重质粒模板评价结果如图3所示。图3A所示是检测CT模板对应的产物熔解曲线峰，Tm值为70℃；B所示是检测UU模板对应的产物熔解曲线峰构建成二重熔解曲线，Tm值为78℃。二重熔解曲线峰图明显分开，并且熔解曲线基线平滑，仅有模板产物对应的熔解峰，说明所设计的单通道多靶标检测方式能够完成。
实例5多荧光通道多靶标检测
单通道标记报告基团中，可以实现二重熔解曲线的检测。继而我们在进行多通道多重的检测扩增评价。
1.引物设计
FAM通道：CT(Tm值≈70℃)、UU(Tm值≈78℃)、IC内参(Tm值≈83℃)
VIC通道：NG(Tm值≈75℃)、HSV2(Tm值≈87℃)。
表4.多重检测引物序列
2.反应体系及反应条件
反应体系：1×PCR buffer，0.1mM MgSO4，200μM dNTPs、0.1μM引物标记报告基团的上游引物，0.1μM下游引物，0.75U聚合酶，水。
反应条件设置为：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃15秒，55℃退火延伸，同时收集荧光，重复40个循环；40-95℃熔解曲线分析，每隔0.03℃检测一次荧光信号，60℃降温2分钟
3.结果分析
5种常见性病病原体检测熔解曲线结果如图4-5所示。其中：图4表示FAM通道的CT(A表示)、UU(B表示)、内标IC(C)的产物熔解曲线图；图5表示HEX通道的NG(A表示)和HSV2(B表示)的产物熔解曲线图。
从以上检测结果可看出，性病多重检测体系检测沙眼衣原体、解脲脲原体、奈瑟淋球菌、单纯疱疹病毒2型及内标人基因组序列(IC)，各病原体和内参均有对应的特征熔解曲线峰，说明建立的呼吸道多重检测体系可以准确有效检测各种常见的性病病原体。
实例6HDA方式检测UU靶标
本实例以解脲脲原体(UU)作为检测靶标，评价了标记报告基团引物在HDA类恒温检测系统的作用效果。
针对UU设计特异性扩增引物对，并在一条引物上标记荧光报告基团。检测体系包括为引物、模板、ddH2O、缓冲液，以及单链结合蛋白SSB、DNA解旋酶、三磷酸脱氧核糖核苷、DNA聚合酶、MutL和缓冲液，Taq聚合酶。反应条件包括65℃，1分钟，60个循环收集荧光。95℃5分钟，40℃2分钟，40℃→95℃0.03℃/s逐渐升高温度，并在整个升温过程中收集荧光信号，到达95℃后，60℃1分钟，结束运行。
表5.UU的HDA引物设计序列
基于HDA等温扩增检测技术和荧光标记引物检测UU的扩增曲线和溶解曲线分别见图6-7。荧光标记引物在HDA体系中能有效的扩增并形成较好的熔解曲线。
实例7：RPA方式检测NG扩增靶标检测
以常见的性病奈瑟淋球菌(NG)为例，设计特异性引物，上游引物标记一个报告基团，与其对应的特异下游引物一起进行RPA等温扩增。其扩增体系包括所述一对特异性引物，重组酶、结合蛋白(SSB)，链置换DNA聚合酶，扩增缓冲体系，模板，水。扩增检测反应程序包括等温扩增以及熔解分析两个步骤，其中扩增程序包括：37℃，1分钟60个循环，95℃5分钟，40℃2分钟，40℃→95℃0.03℃/s逐渐升高温度，并在整个升温过程中收集荧光信号，到达95℃后，60℃1分钟，结束运行。
表6.NG的RPA引物设计序列
基于RPA等温扩增检测技术和荧光标记引物检测NG核酸的扩增曲线和熔解曲线法分别见图8和图9，浓度为105拷贝/ml浓度带有目标基因的NG质粒，20分钟就能够扩增到达阈值。
实例12：逆转录体系检测甲型流感病毒
本实例中，本发明试剂盒可实现对RNA靶标的检测。以检测呼吸道病原体中的甲型流感病毒H1N1为例。
1.引物设计
针对H1N1的保守区域设计特异性引物，并在检测靶标基因的上游引物上标记一个荧光报告基因，如在序列中用斜体T，序列如表7所示。
表7设计的H1N1序列
2.反应体系及反应条件
反应体系：1×RT-PCR buffer，0.1mM MgSO4，200μM dNTPs、0.1μM上游引物，0.1μM下游引物，0.75U聚合酶，60U逆转录酶。
反应条件设置为：50℃30分钟；95℃10分钟；95℃15秒，60℃退火延伸，同时收集荧光，重复40个循环；40-95℃熔解曲线分析，每隔0.03℃检测一次荧光信号，60℃降温1分钟
3.结果分析
本实例检测甲流H1N1样本的核酸扩增曲线和熔解曲线分别见图10和图11。图10扩增曲线平滑，图11对应的产物特征熔解曲线峰Tm值为72℃，；说明本发明试剂盒可实现对RNA靶标的检测。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 江苏宏微特斯医药科技有限公司
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ctgctatgac tatcaaccct gc 22
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgagcaaggc agtattcaag c 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gatcttgagg ctctcatgga at 22
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaagcgtcta cgctgcagt 19
Claims (10)
1.一种检测病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一种或多种荧光标记的引物，所述荧光标记的引物对病原体靶标核酸进行扩增，然后利用病原体靶标核酸的扩增产物的熔解曲线实现病原体检测。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增包括荧光PCR扩增、解旋酶依赖扩增或重组酶依赖扩增。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，荧光标记在所述引物的5’端到3’端之间的序列，优选地标记在所述引物5’到3’的中间位置。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于多种病原体检测的试剂盒，所述试剂盒包括多种荧光标记的引物，使得同一荧光通道内不同的病原体核酸的扩增产物的熔解曲线具有不同的熔点Tm值，并且同一荧光通道内的相邻不同靶标核酸的扩增产物的Tm值相差2-20℃，优选为相差2-8℃，从而实现基于荧光引物的扩增产物熔解曲线同时检测多个靶标核酸。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于同时沙眼衣原体和解脲脲原体的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：
，
其中CT表示沙眼衣原体和UU表示解脲脲原体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于同时检测常见性病病原体沙眼衣原体、解脲脲原体、奈瑟淋球菌和HSV-2单纯疱疹病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包括针对上述每个所述病原体设计特异性上、下游引物，所述上、下游引物分别如下：
，
其中CT表示病原体沙眼衣原体、UU表示解脲脲原体、NG表示奈瑟淋球菌和HSV2表示HSV-2单纯疱疹病毒，IC表示内参。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是通过解旋酶依赖扩增检测病原体解脲脲原体的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：
。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是通过利用重组酶依赖扩增检测病原体奈瑟淋球菌的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：
。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括逆转录试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测甲型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：
。
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