CN101946006A - 可编程的寡核苷酸微阵列 - Google Patents

可编程的寡核苷酸微阵列 Download PDF

Info

Publication number
CN101946006A
CN101946006A CN2007801023579A CN200780102357A CN101946006A CN 101946006 A CN101946006 A CN 101946006A CN 2007801023579 A CN2007801023579 A CN 2007801023579A CN 200780102357 A CN200780102357 A CN 200780102357A CN 101946006 A CN101946006 A CN 101946006A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
target nucleic
acid probes
group
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2007801023579A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101946006B (zh
Inventor
Z·H·孙
W·王
H·廖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Honeywell International Inc
Original Assignee
Honeywell International Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Honeywell International Inc filed Critical Honeywell International Inc
Publication of CN101946006A publication Critical patent/CN101946006A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101946006B publication Critical patent/CN101946006B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明提供DNA微阵列的可编程探针设计和检测方法。设计与靶DNA互补的DNA探针并依据最佳杂交温度归类到组。探针按组排列并固定到DNA微阵列的底物表面。控制系统、成像系统和温度控制系统可编程为在检测过程中相互协作。该设计提高了平行分析系统的检测能力。

Description

可编程的寡核苷酸微阵列
背景技术
核酸的定量测试在基础生物学研究以及在诸如临床微生物学领域中都非常重要。二十世纪九十年代中期已开发了实时聚合酶链反应(实时PCR)方法，通过提供样本中任意靶DNA的拷贝数的可靠、准确的定量测量以改善最初的PCR方法。在实时PCR中，将仅在结合到靶DNA时才具有活性的荧光探针加入到PCR缓冲液中。这些荧光探针是DNA单链，其中间部分具有与靶DNA互补的核苷酸序列。在该中间部分的任意一端，是彼此互补的延伸核苷酸序列，以致于未结合的探针可自我折叠成发夹构型。该荧光探针在其一端具有荧光分子，在另一端具有荧光淬灭分子。未结合的折叠探针具有相互邻近的发荧光分子和淬灭分子，因此当未结合的探针被照射时，没有荧光发出。然而，当荧光探针结合到它的靶DNA上时，它是展开的，发荧光和淬灭分子相互隔开。当用合适波长的光照射结合的探针时，荧光分子就发出荧光。通过给特定靶DNA提供足够的荧光探针，并在PCR的每个阶段测量结合的探针的荧光，即可以测得反应每个阶段的扩增子的数量。这样的测试方法可用于非常精确地确定初始样本中的DNA拷贝数，因为扩增子的数量达到预定临界值的分部循环数(fractional number of cycles)与初始样本中的拷贝数的对数之间呈直线关系。
附图说明
参照以下解释本发明的实施方式的说明和附图，将能更好地理解这些实施方式。附图中：
图1所示为解链温度(Tm)-探针-扩增子复合物比例的曲线图；
图2所示为在PCR过程的起始阶段，能够以渐消波(evanescentwave)检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒(cartridge)的截面视图；
图3所示为利用PCR过程的第一组靶核酸探针的杂交温度(Th1)，在退火和延伸阶段末期，能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒的截面视图；
图4所示为在第一组靶核酸探针的PCR过程的变性阶段，能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒的截面视图；
图5所示为在第一组靶核酸探针的PCR过程的检测阶段，能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒的截面视图；
图6所示为利用PCR过程的第二组靶核酸探针的杂交温度(Th2)，在退火和/或延伸阶段末期，能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒的截面视图；
图7所示为在第二组靶核酸探针的PCR过程的变性阶段，能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒的截面视图；
图8所示为在第二组靶核酸探针的PCR过程的检测阶段，表现渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒的截面视图；
图9所示为利用PCR过程的第三组靶核酸探针的杂交温度(Th3)，在退火和/或延伸阶段末期，能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒的截面视图；
图10所示为在第三组靶核酸探针的PCR过程的变性阶段，能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒的截面视图；
图11所示为在第三组靶核酸探针的PCR过程的检测阶段，表现渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒的截面视图。
定义
本文中所使用的某些术语具有如下含义。本说明书中使用的所有其它术语和短语具有本领域的技术人员理解的一般含义。这种一般含义可参考技术词典得知，如Hawley’s Condensed Chemical Dictionary第11版，Sax和Lewis，VanNostrand Reinhold，New York，N.Y.，1987，以及The Merck Index，第11版，Merck&Co.，Rahway N.J.1989。
本文使用的术语“和/或”是指任意一个项目、项目的任意组合，或者与该项目相关的所有项目。
本文使用的单数形式“一”可包括复数形式，除非上下文清楚地指明不包括。因此，例如，一种制剂可包括多个这样的制剂，从而化合物X的制剂可包括化合物X的多种制剂。
本文使用的术语“约”是指特定数值的10％的变化范围，例如，约50％的变化范围是45-55％。对于整数范围，该术语“约”可包括大于和小于所述整数的1或2个整数。
本文使用的术语“扩增子”是指聚合酶链反应(PCR)的产物。扩增子是利用扩增技术(如带有两个引物的双链DNA)合成的DNA片段。例如，扩增子可包括用荧光分子在5’端标记的引物。
本文使用的术语“阵列”和“微阵列”是指元件(即实体)在材料或装置中的排列。换句话说，术语“阵列”是指底物上的两个或多个测定区域的有序排列(如排和列)。
本文使用的术语“互补的”或“互补性”的使用涉及按照碱基配对原则相关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。
本文使用的术语“临界角”是指大于发生全内反射角度的入射角。
本文使用的术语“渐消的”是指随距离呈指数衰减的近场驻波。如在光学中所用，当正弦波以大于临界角的角度从界面上发生内反射从而发生全内反射时，渐消波产生。
本文使用的术语“杂交”是指互补核酸的配对。
本文使用的术语“Th”是指“杂交温度”。该杂交温度通常比核酸的Tm(解链温度)低约10℃。
本文使用的术语“核酸分子”是指含有包括但不限于DNA或RNA分子的任意核酸。该术语包括诸如含有DNA和RNA的任何已知的碱基类似物的序列。本文所使用的术语“聚合酶链反应”(PCR)是指美国专利4,683,195、4,683,202和4,965,188公开的K.B.Mullis的方法。
本文使用的术语“DNA聚合酶”是指在发生作用时具有高于40℃的最佳温度的热稳定DNA聚合酶。
本文使用的术语“引物”是指能够在合适条件下作为模板引导DNA合成的起始位点作用的单链多核苷酸。
本文使用的术语“探针”是指能够通过一种或多种化学键结合到互补序列的靶核酸的核酸，其通常是通过互补的碱基配对且通常是通过氢键形成，从而形成双股结构。探针结合或杂交到“探针结合位点”。可以利用可检测的标签对探针进行标记，以容易地检测探针，尤其是当探针与其互补靶链杂交的时候。结合到探针的标签可包括本领域已知的多种不同标签的任意一种，例如，该标签可通过化学或物理方式检测。能结合到探针的标签可包括如荧光和冷光材料。探针在大小上可显著变化。一些探针相对短。通常，探针的长度至少是7-15个核苷酸。其它探针的长度至少是20、30或40个核苷酸。有些探针的长度更长，至少是100、150、200或更多个核苷酸的长度。探针的长度也可以是落入前述范围内的任意的特定长度。
本文使用的术语“底物”是指能够支持相关测试要素(如测定区域、细胞、测试化合物等)的材料。例如，在一些实施方式中，底物可包括平面(即2维)玻璃、金属、合成物、塑料、硅石或其它生物兼容或不起生物反应(或起生物反应)的组合物。所述底物通常是扁平的，但也可呈现多种替代表面构型。也可以选择底物和其表面以提供合适的光吸收性能。例如，所述底物可以是聚合的Langmuir Blodgett膜、功能化玻璃、玻璃、石英、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅、或任意一种宽范围内的凝胶或聚合物，例如(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯等聚烯烃，或者其组合。
本文使用的术语“靶核酸”是指待检测病原体固有的多核苷酸。该多核苷酸是包括例如DNA/RNA、线粒体DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA以及质粒DNA的遗传材料。
本文使用的术语“靶核酸探针”是指与靶核酸互补的多核苷酸。
本文使用的术语“Tm”是指“解链温度”。解链温度是在该温度下双链核酸分子的总量半数解离成单链的温度。计算核酸Tm的公式在本领域内是公知的(参见Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization，in Nucleic Acid Hybridization(1985))。对于固定的寡核苷酸探针，一般地Tm(℃)＝2(腺苷和胸苷残基的数量)+4(鸟苷和胞核嘧啶残基的数量)。
具体实施方式
本发明提供一种能够实时、同时、定量测量来自样品中一种或多种病原体的多个靶核酸的方法、装置和系统。
在一个实施方式中，利用聚合酶链反应(PCR)扩增样本中的靶核酸。PCR是一种扩增脱氧核糖核酸(DNA)的一个或多个链的公知方法。通过将靶核酸置于缓冲液中开始PCR，所述缓冲液含有核苷酸腺苷(ATP)、胸苷(TTP)、胞嘧啶(CTP)以及鸟苷(GTP)(统称dNTPs)、DNA聚合酶和引物。引物是DNA短链，具有与待扩增的靶核酸互补的序列。引物启动靶核酸的复制。
在一个实施方式中，靶核酸引物可在5’端用荧光分子进行荧光标记。在另一个实施方式中，靶核酸引物之一可在5’端用荧光分子进行荧光标记。在另一个实施方式中，dNTPs被荧光标记。
PCR过程具有三个主要步骤：变性、退火和延伸。在变性步骤中，混合物被加热到94℃(摄氏度)，在该点，靶DNA分开成为单链。混合物被迅速冷却。当温度下降到约60℃，退火步骤发生，其中可被荧光标记的引物杂交或结合到靶核酸上的它们的互补序列。延伸步骤可以在约60℃下，或者可升温到72-78℃的范围进行。在这个步骤中，DNA聚合酶利用溶液中的dNTPs延伸退火的引物，并形成被称为扩增子的DNA新链，所述引物可被荧光标记。混合物再次简单地被加热到约94℃，以将新形成的双螺旋链分开成单链的核酸，其开始PCR过程的另一轮循环。随着PCR过程每个循环，起始靶核酸的拷贝数大致上加倍。
对于靶核酸的实时定量分析，多种使用渐消波检测技术的方法已被公开，包括例如，Xu(美国专利申请公开文本2006/0088844)描述的技术，以及2007年11月05日申请的申请号为PCT/CN2007/003124，题为“寡核苷酸微阵列的定量方法”的PCT专利申请中描述的技术。
在一个实施方式中，PCR缓冲液还含有荧光标记引物，即具有与其结合的荧光染料分子的引物，从而一旦每个PCR循环完成，产生的扩增子被荧光标记。靶核酸的扩增子利用已知作为靶核酸探针的DNA探针链定位。靶核酸探针具有与靶核酸同样互补的核苷酸序列。靶核酸探针以熟知的二维图案固定到底物表面上，所述底物表面形成含有PCR成分的反应小室的一部分。
在PCR过程的退火和延伸阶段，靶扩增子杂交到其相应的靶核酸探针。用合适波长的光的渐消波照射杂交的荧光标记扩增子，以激活荧光标记引物或荧光标记dNTPs的荧光染料分子。在经固定靶核酸探针的底物表面进入反应小室后，该渐消波的能量呈指数衰减，其有效穿透范围约300nm。这意味着渐消波能穿透足够远以进入反应小室内，以激活与那些靶核酸探针杂交的荧光标记扩增子，但是它不激活反应小室主体内的溶液中的荧光标记分子(如荧光标记引物或荧光标记dNTPs)。通过监测底物表面上的各个位置处的荧光的强度，可检测相应靶核酸的扩增子的当前丰度。这可在PCR进行的过程中实时地完成。所述结果用于以类似于实时PCR计算的方式，获得初始样本中的特定靶链丰度的定量测量。
在另一实施方式中，靶核酸探针被设计为与从选自细菌、病毒、真菌和原生动物的病原体中分离出的多核苷酸互补。在又一实施方式中，靶核酸探针被设计为与从以下病原体中分离的多核苷酸的特定区域互补：立克次氏体(Rickettsia)、衣原体(Chlamydia)、支原体(Mycoplasma)、螺旋体(Spirochete)、链球菌(Streptococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitides)、大肠杆菌(E.coli)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、细螺旋体(Leptospira)、变形杆菌(Proteus)、厌氧杆菌(Anaerobacter)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、肠球菌(Enterococcus)、脊髓灰质炎病毒1型(H.poliovirus 1)、肠病毒71型(H.enterovirus 71)、肠病毒70(H.enterovirus 70)、艾柯病毒2型(H.echovirus 2)、艾柯病毒4型(H.echovirus 4)、艾柯病毒6型(H.echovirus 6)、艾柯病毒9型(H.echovirus 9)、艾柯病毒11型(H.echovirus 11)、艾柯病毒12型(H.echovirus 12)、艾柯病毒26型(H.echovirus26)、柯萨基病毒A13型(H.coxsackievirus A13)、柯萨基病毒A15型(H.coxsackievirus A15)、柯萨基病毒A18型(H.coxsackievirusA18)、柯萨基病毒A20型(H.coxsackievirus A20)、柯萨基病毒A21型(H.coxsackievirus A21)、柯萨基病毒B3-A型(H.coxsackievirus B3-A)、柯萨基病毒B3-C型(H.coxsackievirus B3-C)、HSV-1及HSV-2。
在一个实施方式中，PCR使用的探针包括选自SEQ ID NO：1-9(表1)的寡核苷酸：
Figure BPA00001207006200071
本发明还提供一种提高在寡核苷酸微阵列或实时PCR微阵列中的检测界限和特异性的方法。
在一个实施方式中，可设计不同靶核酸的探针，并将它们分类为几个组。每个组中的探针的最佳杂交温度大致相当。也就是说，每组靶核酸可包括一个或多个最佳杂交温度的靶核酸探针，其具有相互温度差异在10％以内、或相互温度差异在5％以内、或相互温度差异在3％以内、或相互温度差异在2％以内。
使用常规方法设计和合成每个靶分子的探针序列。一般地，为每个靶分子设计一个或多个不同的探针。
当寡核苷酸的数量小于20时，每个探针的解链温度(Tm)可利用以下的公式计算：Tm(℃)＝2(腺苷和胸苷残基的数量)+4(鸟苷和胞嘧啶残基的数量)。各组中的探针在底物上排列，以使具有等同杂交温度(Th)的探针在一个位置排列，如一条线上。解链温度(Tm)表示在该温度下50％的核酸分子是双链形式(如探针-扩增子复合物)的温度。
最佳杂交温度(Th)通常比核酸的解链温度(Tm)低约10-20℃，这受链长、碱基组成和化学环境(如盐和甲酰胺浓度)的影响。最佳杂交温度(Th)通过杂交动力学分析进行核实。可对每个探针进行杂交动力学分析，例如，可采用以下的方式进行。首先，使相应的靶扩增子与每个探针在一系列不同温度下杂交合适长度的时间。如图1所示，随着杂交温度的降低，形成了更多探针-扩增子复合物。杂交温度(Th)表示满足高特异性的杂交信号的温度，例如在最高温度获得最大信号的80％。其次，在该温度下，不会发生具有其它种类扩增子的非特异性的结合信号。这可利用某种浓度的其它不包括在该靶组内的靶扩增子和干扰扩增子得到核实。
通常，具有高解链温度(Tm)的探针具有高的杂交温度(Th)。杂交温度(Th)可作为解链温度(Tm)函数设定，例如Th＝Tm-15。这可以通过杂交动力学分析核实并进行调整。
为了减小杂交温度(Th)核实和探针设计的工作量，可从候选组中选择具有相似解链温度(Tm)的探针以减少数量。可在低同一性区中设计那些高同一性的靶分子的探针，以增加其特异性。
在一个实施方式中，DNA阵列是固定的，而光学检测系统是可移动的。以每组杂交温度(Th)逐渐降低为顺序，以组的方式排列探针，并将探针固定在DNA微阵列的底物表面上。在指定数量的扩增循环之后，光学检测系统移动到第一组探针上。小室和含有试剂的缓冲溶液被加热到约90℃的变性温度，并在该温度下维持数秒。将小室和含有试剂的缓冲溶液冷却到第一组探针的杂交温度，并在该温度下维持几秒。使用光学检测系统检测第一组探针的应答(response)。接下来，光学检测系统移动到第二组探针。将小室和含有试剂的缓冲溶液冷却到第二组探针的杂交温度，并在该温度维持几秒。例如，使用Th1＞Th2＞Th3，因为具有高交杂温度的探针组在高温下最早被检测到，且在Th2或Th3下的潜在非特异性结合将不被检测和记录。使用光学检测系统检测第二组探针的应答。持续这个循环，直到检测完所有的探针组。为优化反应和检测效率，可通过计算机程序来控制系统参数，例如检测前的扩增循环数、检测频率(如每个检测循环之间的扩增循环数)、温度、时间、加热和冷却速率以及光学检测系统的移动。
在另一实施方式中，光学检测系统是固定的，而DNA微阵列是可移动的。在又一实施方式中，光学检测系统和DNA微阵列都是可移动的。尽管在上述的实施方式中使用Th1＞Th2＞Th3，但在其它的实施方式中可使用Th1＜Th2＜Th3。
图2为能够以渐消光检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒的截面视图，包括反应盒10、具有底物表面12的底物11、第一组具有杂交温度(Th1)的三个靶核酸探针13、第二组具有杂交温度(Th2)的三个靶核酸探针14、第三组具有杂交温度(Th3)的三个靶核酸探针15，其中Th1＞Th2＞Th3、缓冲液16、第一靶核酸链18、第二靶核酸链19、第三靶核酸链20、dNTPs22、任选荧光标记dNTPs24、荧光标记引物26、热稳定DNA聚合酶28、加热元件30、冷却元件31。在一些实施方式中，加热元件30和冷却元件31可以组合为一个元件，例如可以用于或加热或冷却的半导体冷却器。
虽然图2示出了三组三个靶核酸探针，但也可以利用其它组合，例如两组两个靶核酸探针、两组三个靶核酸探针、三组两个靶核酸探针、四组两个靶核酸探针、四组三个靶核酸探针、四组四个靶核酸探针等。换言之，对靶核酸探针的组数和每组中靶核酸探针数没有任何限制。
为了简化图2-11中的附图，仅示出每组的一个靶核酸探针的一个扩增子。然而，应当理解，每组中其它靶核酸探针的其它扩增子也可能产生。
在一个实施方式中，底物12由比缓冲液16光密度大的材料制成，从而可以如下详述地利用渐消光检测。底物12可以例如是玻璃，或者合适地以塑料或聚合物涂层。
第一、第二和第三组靶核酸探针13、14和15每组各自包含数个DNA链，每个DNA链分别具有用它们来检测的靶DNA链18、19和20之一的特定核苷序列。在一个实施方式中，这些靶核酸探针是非延伸的。换言之，所述核苷酸不能被添加到靶核酸探针的任何一端。构成每组的靶核酸探针可以是天然的或以合成方法构造的多核苷酸、带有人工碱基和/或人工碳水化合物的多核苷酸、肽核酸(PNAs)、双环核酸(BNAs)，或其它核苷酸类似物，其利用例如购自Genomic Solutions，Inc.of Ann Arbor，Mich的POLYPLEX合成器等商用寡核苷酸合成器构建。或者，所述探针可以是但不限于从DNA序列库中选择的序列，例如已知具有某些生物意义的表达序列标签(EST)库。
第一、第二和第三组靶核酸探针13、14和15各自排列在底物表面12上。在一个实施方式中，构成每组靶核酸探针13、14和15的探针通过利用例如购自Genomic Solutions，Inc.of Ann Arbor，Mich的OMNIGRID微阵列仪等商用微阵列技术的自动化印刷(robotic printing)以小点排列在底物上。
构成每组靶核酸探针13、14和15的探针可以通过熟知的技术固定到底物表面12，例如但不限于将活性甲硅烷基部分共价结合到靶核酸探针。经过手工或自动沉积后，这些硅烷化分子立刻固定到玻璃表面上。或者，构成每组靶核酸探针13、14和15的探针可以通过利用合适涂层合适地使表面带电而固定，涂层例如硅烷、聚L-赖氨酸、链霉亲和素、多糖、硫醇，或它们的组合。
荧光标记引物26或任选荧光标记dNTPs24是可以用荧光染料标记的核苷酸，例如荧光素或罗丹明绿色染料，或者具有类似荧光或冷光特征的类似相关化合物，如功能化或嵌合染料和发冷光的功能化纳米颗粒(量子点)。任选荧光标记dNTPs24可以具有四种荧光标记的碱基核苷酸dGTP、dCTP、dATP和dTTP中的一种、两种、三种或四种。
加热元件30可以是任何合适的当电流流过时提供热量的电阻材料，例如碳。加热元件30必须能够在数分钟内加热反应盒到94℃。冷却元件31可以是任何合适的固态冷却元件，例如熟知的作为热力泵起作用的Peltier固态元件。加热元件30和冷却元件31也可以位于反应盒10的外部。在一些实施方式中，加热元件30和冷却元件31可以结合成一个元件，例如可用于或加热或冷却的半导体冷却器。
图3是利用PCR过程的第一组靶核酸探针13的杂交温度(Th1)，能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒10的截面视图，其还包括第一荧光标记扩增子32。荧光检测器50位于邻近底物12的位置，以便能够监测第一组靶核酸探针13的PCR过程。
第一荧光标记扩增子32是具有为第一靶核酸链18的一特定区域的互补拷贝的核苷酸序列的DNA链，也就是说，对于第一靶核酸链18的一特定区域中的每一个腺苷(A)核苷酸，在第一荧光标记扩增子32中存在胸苷(T)核苷酸，反之亦然。类似地，对于第一靶核酸链18的一特定区域中的每一个胞苷(C)核苷酸，在第一荧光标记扩增子32的一特定区域中存在鸟苷(G)核苷酸。例如，若靶链18是1000个碱基对(bp)，扩增子32可以是例如200个碱基对(bp)，用于杂交的片段可以是例如20个碱基对(bp)。
利用第一组靶核酸探针13的杂交温度(Th1)，第一荧光标记扩增子32将与构成第一结靶核酸探针13的相应探针杂交。比如，在表面位点36，第一荧光标记扩增子32杂交到第一靶核酸组13。然而，也有第二和第三组核酸探针14和15(各自与它们相应的扩增子)的杂交发生。对于第二和第三组核酸探针14和15，它们的最佳杂交温度(Th2)和(Th3)低于(Th1)，故在(Th1)它们的杂交信号少于它们的最佳杂交信号。
构成如组13、14和15的靶核酸探针设计为，例如通过将它们的3’端固定到底物或通过具有3’端的去氧修饰或通过添加稳定基团到3’端或任何其它已知的使靶核酸探针在特定引物存在下不参与PCR过程的方法，使其在PCR过程中不扩增。
图4是在PCR过程的退火阶段能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒10的截面视图。在该阶段，反应盒10中的混合物已被加热到接近100℃，优选地到约94℃。在该温度，DNA变性，也就是说，它分开成为单个的单链。当冷却到第一组靶核酸探针13的杂交温度(Th1)时，第一靶核酸链18以及每个第一荧光标记扩增子32将与荧光标记引物26退火。由于热稳定的DNA聚合酶28添加合适的核苷酸，退火的荧光标记引物26会延伸，直到第一靶核酸链18和第一荧光标记扩增子32杂交形成新的扩增子，其为初始第一靶核酸链18的拷贝或互补拷贝。扩增也可以发生于检测循环过程中。这样，所述检测循环可以通过例如设计检测前的扩增循环数和检测频率(如每次检测循环之间的扩增循环数)来进行。
图5是在第一组核酸探针13的PCR过程的检测阶段表现出渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒10的截面视图，其还包括入射光束40、入射角42、反射光束44、光渐消波46、荧光束48和荧光检测器50。所述检测阶段可以与退火和/或延伸阶段一致。
入射光束40选为具有适于激发用于标记荧光标记引物16或任选荧光标记dNTPs24的荧光团的波长。在一个实施方式中，入射光束40是氩离子激光的488nm光谱线，接近匹配用于标签或标记荧光标记引物16或任选荧光标记dNTPs24的荧光染料的最大激发(494nm)。
入射光束40的入射角42选为大于底物到缓冲界面的临界角。入射临界角是全内反射发生的角度，并取决于形成界面材料的折射系数。根据Snell折射定律，入射临界角＝sin-1(n1/n2)，其中n1和n2是界面两侧材料的折射系数。在本发明的一个实施方式中，底物12由玻璃构成，具有约1.5的折射系数，而缓冲液16主要由具有约1.3的折射系数的水构成，从而入射临界角为约61度。
当光线以度数大于临界角的入射角42从底物表面12反射离开时，以致于全内反射发生，渐消波46形成并通过底物表面12传播。渐消波46的强度根据离底物表面12的距离每增加130nm而呈系数“e”(即数学常量)减弱。因此，仅非常接近底物表面12的目标被渐消波46照射。在本发明的一个实施方式中利用该属性照射杂交到第一组靶核酸探针13的荧光标记扩增子32。荧光48由荧光标记扩增子32发射，可以被荧光检测器50检测和分析。荧光检测器50一般地可包括光学收集元件，例如显微镜物镜，其聚焦光线到检测系统，如光电倍增管或电耦装置(CCD)相机或光敏二极管。
收集的荧光的起点和强度可用于估计发射荧光分子的数量，并由此通过利用如在实时或动力学PCR分析中使用的熟知的定量技术估计当下杂交到特定类型寡核苷酸探针的荧光标记扩增子的数量。在实时或动力学PCR分析中，反应的特征在于，在循环中首次检测到PCR产物的扩增而非经过固定循环数之后累积的PCR产物的量的时间点。初始样品中靶核酸拷贝数越大，越快观察到荧光的显著增加。
在第一组靶核酸探针13的杂交循环完成之后，荧光检测器50移动到如图6所示的位置以监测第二组靶核酸探针14。
图6是利用PCR过程的第二组靶核酸探针14的杂交温度(Th2)，在退火和/或延伸阶段末期，能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒10的截面视图，其还包括第二荧光标记扩增子33。
第二荧光标记扩增子33是具有为第二靶核酸链19的互补拷贝的核苷酸序列的DNA链，也就是说，对于第二靶核酸链19中的每一个腺苷(A)核苷酸，在第二荧光标记扩增子33中存在胸苷(T)核苷酸，反之亦然。类似地，对于第二靶核酸链19中的每一个胞嘧啶(C)核苷酸，在第二荧光标记扩增子33中存在鸟苷(G)核苷酸。例如，若靶链19是1000个碱基对(bp)，则扩增子33可以是例如200个碱基对(bp)，用于杂交的片段可以是例如20个碱基对(bp)。
在PCR过程的退火和/或延伸阶段末期，利用第二组靶核酸探针14的杂交温度(Th2)，由退火的荧光标记引物26的延伸产生的第二荧光标记扩增子33保持杂交到其相应的构成第二组靶核酸探针14的探针。另外，在PCR过程的前期循环中产生的扩增子杂交到构成第二组靶核酸探针14的固定的相应探针。例如，在表面位点37，第二荧光标记扩增子33杂交到第二靶核酸探针组14。然而，第三组核酸探针15没有杂交发生，因为第二组靶核酸探针14的杂交温度(Th2)低于第三组靶核酸探针15的杂交温度(Th3)。
图7是在PCR过程的变性阶段能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒10的截面视图。在该阶段，反应盒10内的混合物已被加热到接近100℃，最佳到约94℃。在该温度下，DNA变性，也就是说，它分开形成单个的单链。当在PCR过程的下一阶段冷却到第二组靶核酸探针14的杂交温度(Th2)时，第二靶核酸链19及每个第二荧光标记扩增子33将与荧光标记引物26退火。由于热稳定的DNA聚合酶28添加合适的核苷酸，退火的荧光标记引物26将延伸，直到第二靶核酸链19和第二荧光标记扩增子33杂交至新的扩增子，新的扩增子是初始第二靶核酸链19的拷贝或互补拷贝。扩增也可能发生在检测循环中。这样，检测循环通过例如设计检测前扩增循环数和检测频率(即每个检测循环之间的扩增循环数)进行。
图8是在第二组靶核酸探针14的PCR过程的检测阶段表现出渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒10的截面视图，其还包括入射光束40、入射角42、反射光束44、光渐消波46、荧光束48和荧光检测器50。检测阶段可以与退火和/或延伸阶段一致。
在第二组靶核酸探针14的杂交完成后，荧光检测器50移动到如图9所示的位置以监测第三组靶核酸探针15。
图9是利用PCR过程的第三组靶核酸探针15的杂交温度(Th3)，在退火和/或延伸阶段末期，能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒10的截面视图，其还包括第三荧光标记扩增子34。
第三荧光标记扩增子34是具有为第三靶核酸链20的互补拷贝的核苷酸序列的DNA链，也就是说，对于第三靶核酸链20的每一个腺苷(A)核苷酸，在第三荧光标记扩增子34中存在胸苷(T)核苷酸，反之亦然。类似地，对于第三靶核酸链20中的每一个胞嘧啶(C)核苷酸，在第三荧光标记扩增子34中存在鸟苷(G)核苷酸。例如，若靶链20是1000个碱基对(bp)，则扩增子34可以是例如200个碱基对(bp)，用于杂交的片段可以是例如20个碱基对(bp)。
利用PCR过程的第三组靶核酸探针15的杂交温度(Th3)，在退火和/或延伸阶段末期，由退火的荧光标记引物26的延伸产生的第三荧光标记扩增子34保持杂交到其相应的构成第三组靶核酸探针15的探针。另外，在PCR过程的前期循环中产生的扩增子杂交到构成第三组靶核酸探针15的固定的相应探针。例如，在表面位点38，第三荧光标记扩增子38杂交到第三靶核酸探针组15。
图10是在PCR过程的变性阶段能够以渐消波检测微阵列PCR过程的荧光标记扩增子的反应盒10的截面视图。在该阶段，反应盒10中的混合物已被加热到接近100℃，最佳到约94℃。在该温度下，DNA变性，也就是说，它分开形成单个的单链。当在PCR过程的下一阶段冷却到第三组靶核酸探针15的杂交温度(Th3)时，第三靶核酸链20及每个第三荧光标记扩增子34将与荧光标记引物26退火。由于热稳定的DNA聚合酶28添加合适的核苷酸，退火的荧光标记引物26将延伸，直到第三靶核酸链20和第三荧光标记扩增子34杂交到新的扩增子，新的扩增子是初始靶核酸链20的拷贝或互补拷贝。扩增也可以发生于检测循环。这样，检测循环通过例如设计检测前的扩增循环数和检测频率(例如每个检测循环间的扩增循环数)进行。
图11是在第三组靶核酸探针15的PCR过程的检测阶段能够以渐消波检测微阵列PCR过程中的荧光标记扩增子的反应盒10的截面视图，其还包括入射光束40、入射角42、反射光束44、光渐消波46、荧光束48和荧光检测器50。检测阶段可以与退火和/或延伸阶段一致。
本发明也提供检测来自一种或多种病原体的两种或多种靶核酸的试剂盒。所述试剂盒可包括至少一个引物对和可包括两组或多组靶核酸探针的寡核苷酸微阵列。虽然前述讨论已用DNA作为核酸，但对于本领域中的普通技术人员显而易见的是，将在此公开的方法应用到其它核酸，包括RNA序列或RNA和DNA序列的组合。
应当理解，为了简洁的目的排除其它元素，本发明的某些描述已被简化以仅阐明与清楚理解本发明相关的那些元素和限制。当考虑到本发明的描述，本领域的普通技术人员会认识到，可能需要其它元素和/或限制以实施本发明。然而，由于该其它元素和/或限制可容易地被普通技术人员基于考虑本发明的描述而确定，且对本发明的完整理解是不必要的，本文并未提供这类元素和限制的讨论。
实施例
以下实施例用作说明上述发明。本领域的普通技术人员很容易地认识到，实施例中描述的技术和试剂建议本发明可能实施的多种其它途径。应当理解，在本发明的范围内可做多种变型和改型。
实施例1
该实施例说明用于九种细菌的平行检测的可编程的寡核苷酸微阵列的应用。为表1列出的每种细菌的特定序列区域设计探针。这些探针设计为具有不同长度和鸟苷-胞嘧啶(GC)比。为每个探针计算解链温度(Tm)和理论的杂交温度(Th)。探针分别按照相应的杂交温度(Th)59、69和63℃分为三组。各探针的实际杂交温度(Th)通过杂交动力学分析核实。杂交动力学分析以下面的方式进行。
首先，各探针被合成并固定到玻璃平板的表面上。该玻璃平板构成微阵列反应室的杂交和检测组件。探针的固定化利用吸气-分散阵列仪(aspirate-dispensing arrayer)完成，其具有在合适缓冲液中的20μM浓度以优化玻璃表面上的探针和功能分子间的反应。玻璃用其它小室部分装配，例如塑料筒，以形成完整的微阵列反应室。处理玻璃以移除未结合探针。完整的微阵列反应室的表面经钝化处理以减少非特异性结合。
其次，对于每个探针，将相应的靶分子制备成两种特定的浓度。靶分子的一浓度在检测范围的中间，并用于特异性信号检测。靶分子的另一浓度位于检测范围的高端，用于非特异性信号检测。所有这些靶分子为由常规PCR制备的荧光标记扩增子。
第三，对于每个探针，添加具有检测范围中间值浓度的相应靶分子以在一系列杂交温度(Th)下测试特异性杂交信号。对于每个杂交温度(Th)，在适当时间记录特异性杂交信号以提供特异性杂交信号-杂交温度(Th)的曲线。最高杂交温度(Th)通常在非常低的温度下获得，例如Th＜Tm-30。
对于每个探针，加入高浓度的八种不同靶分子，以在一系列杂交温度(Th)下测试非特异性杂交信号。对于每个杂交温度(Th)，在适当时间记录非特异性杂交信号。通过这种方式，获得非特异性杂交信号-杂交温度的八个曲线。随着温度降低，非特异性杂交增加。与未包括在检测谱中的其它非相关性靶分子的非特异性结合反应也可以这种方式完成。
各探针的合适杂交温度(Th)通过以下方式准则确定。首先，特异性杂交信号应当高，例如大于最高杂交信号的约70％。其次，非特异性杂交信号不应被检测到。各探针的最佳杂交温度(Th)应当被核实并按需调整。若实际杂交温度(Th)与理论的杂交温度(Th)相似，该探针可按上面讨论的分为三组。因此，所有这些探针与一种或多种任选内部对照探针可一起被固定到玻璃的功能化表面以形成反应室，其可直接用于检测。所述探针按组排列，例如，同一组的探针位于同一直线。
反应室可用于任意种类细菌的存在及其浓度的检测。为校准目的，可添加已知浓度的一种或多种任选内部对照靶分子到样品中以用于测试。
检测系统中使用的可编程的检测文件可用于提高检测效率。通过利用该程序，检测可在合适数量的扩增循环末期进行。小室及其中试剂的温度将升高至约90℃并保持数秒。在该温度下，核酸分子变性成为单链。将该温度冷却到杂交温度(Th1)，其是探针组1的平均杂交温度(Th)，并具有最高杂交温度(Th)。在该温度下，组1中的靶探针将达到它们的最佳杂交温度(Th1)。
将用于激活杂交位点附近的荧光分子的激光移动到相应位置。在该位置，激光束的入射可激活探针组1中的荧光分子，而不能激活其它探针组中的荧光分子。结果，仅检测和记录到探针组1的杂交信号。
随后，温度下降到杂交温度(Th2)，其是探针组2的平均杂交温度并具有温度范围中间值的杂交温度(Th)。在该温度下，组2中的靶探针将达到它们的最佳杂交温度(Th2)。
将用于激活杂交位点附近的荧光分子的激光移动到相应位置。在该位置，激光束的入射可激活探针组2中的荧光分子，而不能激活其它探针组中的荧光分子。结果，仅检测和记录到探针组2的杂交信号。
随后，温度下降到杂交温度(Th3)，其是探针组3的平均杂交温度并具有温度范围低端值的杂交温度(Th)。在该温度下，组3中的靶探针将达到它们的最佳杂交温度(Th3)。
将用于激活杂交位点附近的荧光分子的激光移动到相应位置。在该位置，激光束的入射可激活探针组3中荧光分子，而不能激活其它探针组中的荧光分子。结果，仅检测和记录到探针组3的杂交信号。
随后，温度下降到任选内部对照探针之一的杂交温度(Thc)。在该实施例中，Thc＜Th3＜Th2＜Th1。然而，其它各种组合也是可能的，包括例如Th3＜Thc＜Th2＜Th1、Th3＜Th2＜Thc＜Th1和Th3＜Th2＜Th1＜Thc。在杂交温度(Thc)下，该内部对照探针将达到它们的最佳杂交温度。
将用于激活杂交位点附近的荧光分子的激光移动到相应位置。在该位置，激光束的入射可激活任选内部对照探针组之一的荧光分子，而不能激活其它探针组中的荧光分子。结果，仅检测和记录到任选内部对照探针组之一的杂交信号。
在此实施例中，使用任选内部对照探针之一。然而，可以利用两种或多种任选内部对照探针，它们相应的杂交温度范围可从低于Th3至大于Th1。
该检测过程可在循环模式下完成。例如，可以每三个扩增循环进行检测，直到可疑的靶分子的杂交信号达到阀值。CT数是可疑的靶分子达到其阀值的扩增循环数。用可疑的靶分子的标准曲线和校正曲线(内部对照靶分子的标准曲线)，通过比较可疑的靶分子的CT和内部对照分子的CT数，可推断可疑靶分子的实际浓度。
例如，可疑靶分子的CT数可能表明可疑靶分子浓度为约10000拷贝/ml。同时，校正曲线可以显示估计低，如约10倍的任选内部对照靶的浓度。因此，可疑靶分子的实际浓度为约100,000拷贝/ml。
参考不同的具体实施方式和技术对本发明进行了详细的说明。然而，应当理解，在本发明的精神和范围内可作多种变型和改型。

Claims (20)

1.一种分析靶核酸的定量方法，其包括
在底物上表面的独立区域内固定两组或更多组靶核酸探针；
在每组的杂交温度下将一个或多个荧光标记靶扩增子独立退火至每组靶核酸探针；
在每组的杂交温度下独立激活来自与每组靶核酸探针杂交的一个或多个荧光标记靶扩增子的荧光应答；
在每组靶核酸探针的杂交温度下独立检测用于一个或多个靶核酸定量分析的各荧光应答；
其中，各荧光应答的独立激活是通过利用预定波长的渐消波。
2.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述每组靶核酸探针包括具有相互温度差异在10％以内的杂交温度的一个或多个靶核酸探针。
3.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述每组的杂交温度是每组中一个或多个靶核酸探针的杂交温度的平均值。
4.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述退火发生于聚合酶链反应过程中。
5.根据权利要求4所述的定量方法，其特征在于，所述各荧光应答的检测发生于聚合酶链反应的退火步骤或延伸步骤中。
6.根据权利要求5所述的定量方法，其特征在于，所述聚合酶链反应是实时聚合酶链反应。
7.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述底物包括选自硅石、塑料、玻璃、石英玻璃、陶瓷、橡胶、金属、聚合物、杂交膜或它们的组合的材料。
8.根据权利要求2所述的定量方法，其特征在于，利用微阵列打印机将一个或多个靶核酸探针打印并固定到底物上。
9.根据权利要求8所述的定量方法，其特征在于，所述底物用选自硅烷、抗生物素蛋白、聚L-赖氨酸、链霉亲和素、多糖、硫醇或它们的组合的试剂进行化学修饰。
10.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，每组靶核酸探针包括一个或多个靶核酸探针。
11.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述一个或多个靶核酸从一种或多种病原体得到，其中一种或多种病原体为病毒、细菌、古生菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒、寄生有机物或它们的组合。
12.根据权利要求11所述的定量方法，其特征在于，所述一种或多种病原体为立克次氏体、衣原体、支原体、螺旋体、链球菌、葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、伯氏疏螺旋体、细螺旋体、变形杆菌、厌氧杆菌、沙门氏菌、结核分枝杆菌、肠球菌、脊髓灰质炎病毒、肠病毒、柯萨基病毒、HSV-1、HSV-2，或它们的组合。
13.一种定量分析靶核酸的装置，其包括：
底物，其具有上、下表面和大于水的折射系数的折射系数；
实质上与底物上表面接触的缓冲液，所述缓冲液能够支持多个扩增反应和多个核苷酸杂交反应，并包含一种或多种荧光标记引物、一种或多种任选的荧光标记dNTPs和一种或多种靶核酸；
在底物上表面的独立区域和缓冲液中的两组或更多组靶核酸探针，其中每组靶核酸探针包括一个或多个靶核酸探针，且其中每组靶核酸探针包含具有等同杂交温度的一个或多个靶核酸探针；
其中，每组靶核酸探针中的一个或多个靶核酸探针具有与靶核酸的核苷酸序列相应或互补的核苷酸序列；
光线，具有选定波长以激活一个或多个荧光标记靶扩增子，以选定角度入射到底物和缓冲液之间的界面，以便渐消波传播进入缓冲液；
检测器，其能够检测由一个或多个荧光标记靶扩增子发射的荧光。
14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，还包括能够使缓冲液温度循环的加热元件，由此使多个扩增反应成为可能。
15.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，所述多个核苷酸杂交反应是实时聚合酶链反应。
16.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，所述检测器是可移动的，并能够顺序检测由与两组或更多组靶核酸探针结合的一个或多个荧光标记靶扩增子发射的荧光。
17.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，底物是可移动的，并能够被检测器顺序定位。
18.一种进行定量聚合酶链反应分析的系统，所述系统包括：
包括固定在底物上表面不同区域内的多组靶核酸探针的DNA微阵列，其中每组靶核酸探针包含具有等同杂交温度的一个或多个靶核酸探针；
与DNA微阵列进行热交流的热循环仪；
提供输出信号的至少一个检测器；其中所述至少一个光敏检测器能够检测由一个或多个荧光标记靶扩增子发射的荧光；
至少一个光源，其中所述光源定位为从其发射的光经过DNA微阵列到所述至少一个光敏检测器；
分析来自检测器的输出信号和确定表示聚合酶链反应分析的定量荧光信息的工具。
19.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，可对所述DNA微阵列、热循环仪、至少一个检测器、至少一个光源和分析输出信号的工具进行编程，以在检测过程中相互协作。
20.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，所述热循环仪包括加热元件和冷却元件，或同时用于加热和冷却的一个元件。
CN200780102357.9A 2007-12-24 2007-12-24 可编程的寡核苷酸微阵列 Active CN101946006B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2007/003754 WO2009079856A1 (en) 2007-12-24 2007-12-24 A programmable oligonucleotme micro array

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101946006A true CN101946006A (zh) 2011-01-12
CN101946006B CN101946006B (zh) 2017-03-29

Family

ID=40800678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200780102357.9A Active CN101946006B (zh) 2007-12-24 2007-12-24 可编程的寡核苷酸微阵列

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9005931B2 (zh)
EP (1) EP2231876B1 (zh)
CN (1) CN101946006B (zh)
WO (1) WO2009079856A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110317861A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 江苏宏微特斯医药科技有限公司 一种检测病原体的试剂盒

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8058005B2 (en) 2008-10-23 2011-11-15 Honeywell International Inc. Method for single nucleotide polymorphism and mutation detection using real time polymerase chain reaction microarray
CN106824315B (zh) * 2017-02-24 2019-03-29 常州工学院 一种阵列式芯片的检测区内微液加热的装置及方法
CN106908430B (zh) * 2017-03-28 2019-07-05 盐城工学院 Co2定量荧光传感材料、制备方法及应用
GB2576304B (en) 2018-07-26 2020-09-09 Evonetix Ltd Accessing data storage provided using double-stranded nucleic acid molecules

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060088844A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Honeywell International Inc. Real-time PCR microarray based on evanescent wave biosensor
WO2006135437A2 (en) * 2004-10-22 2006-12-21 Honeywell International Inc. Real-time pcr microarray based on an evanescent wave biosensor

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) * 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB9119735D0 (en) 1991-09-16 1991-10-30 Secr Defence Gene probe biosensor method
DE10002566A1 (de) * 2000-01-21 2001-08-02 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren und Einrichtung zur Bestimmung des Schmelzpunktes und/oder der Bindungskonstante von Substanzen, wie z. B. DNA-Sequenzen, in einer Probe
WO2009059447A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Honeywell International Inc. A quantitative method for oligonucleotide microarray

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060088844A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Honeywell International Inc. Real-time PCR microarray based on evanescent wave biosensor
WO2006135437A2 (en) * 2004-10-22 2006-12-21 Honeywell International Inc. Real-time pcr microarray based on an evanescent wave biosensor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PATRICE FRANCOIS，ET AL: "Rapid bacterial identification using evanescent-waveguide oligonucleotide microarray classification", 《JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110317861A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 江苏宏微特斯医药科技有限公司 一种检测病原体的试剂盒
CN110317861B (zh) * 2019-07-18 2023-04-07 江苏宏微特斯医药科技有限公司 一种检测病原体的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
EP2231876B1 (en) 2012-08-01
WO2009079856A1 (en) 2009-07-02
EP2231876A4 (en) 2011-10-12
US20110015086A1 (en) 2011-01-20
CN101946006B (zh) 2017-03-29
EP2231876A1 (en) 2010-09-29
US9005931B2 (en) 2015-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8058005B2 (en) Method for single nucleotide polymorphism and mutation detection using real time polymerase chain reaction microarray
CN101657548B (zh) 用于实时pcr多重分析的系统和方法
US20120040853A1 (en) Real time multiplex pcr detection on solid surfaces using double stranded nucleic acid specific dyes
CN101490277B (zh) 多种生物学（微）生物及其组分的鉴定和定量
EP2427570B1 (en) Detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction cartridge
KR20100134139A (ko) 반응에서 다중 핵산 서열의 동시 검출
US10364459B2 (en) Method of quantitatively and qualitatively analyzing biomaterial in real-time
US20040081974A1 (en) Method and equipment to monitor nucleic acid hybridization on a dna chip using four-dimensional parameters
CN101946006A (zh) 可编程的寡核苷酸微阵列
EP2186909A1 (en) Highly sensitive multiplex single nucleotide polymorphism and mutation detection using real time ligase chain reaction microarray
JP4297966B2 (ja) 標識ヌクレオチドを利用することによる核酸の新規測定方法
CN103124797B (zh) 用于在相同反应容器内的细胞裂解和pcr的方法
JP2004187581A (ja) 標的核酸の多型決定方法
CN101586156A (zh) 用于寡核苷酸微阵列的定量方法
WO2009059447A1 (en) A quantitative method for oligonucleotide microarray
WO2010046807A1 (en) Real-time high multiplex detection by primer extension on solid surfaces
CN103124796A (zh) 用于pcr反应缓冲液中的细胞裂解的方法
JP4276897B2 (ja) 標識ヌクレオチドを利用することによる核酸の新規測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant