KR20100134139A - 반응에서 다중 핵산 서열의 동시 검출 - Google Patents

반응에서 다중 핵산 서열의 동시 검출 Download PDF

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토마스 로트만
홀거 엥겔
토마스 로이
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키아겐 게엠베하
키아겐 함부르크 게엠베하
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Abstract

본 발명은
(i) 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 증폭 반응을 수행하기 위해 4개 이상의, 바람직하게는 5개 이상의, 보다 바람직하게는 6개 이상의 프로브를 포함하는 시약을 제공하며, 여기서
(a) 각각의 프로브는 핵산 서열에 대해 특이적이고;
(b) 2개 이상의, 바람직하게는 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유하며;
(c) 동일한 표지를 보유하는 각각의 프로브는, 가열에 의해 그들의 표적 핵산 서열로부터 해리될 때, 동일한 표지를 가진 다른 프로브와 2℃ 초과만큼 차이나는 융점 (Tm)을 갖는 것인 단계;
(iii) 상기 반응에서 핵산 서열을 증폭시키는 단계;
(iv) 표지된 프로브가 그의 핵산 서열과 결합하였는지 여부를 측정함으로써 증폭된 핵산을 검출하는 단계; 및
(v) 각각의 주어진 표지된 프로브가 그가 결합된 핵산 서열로부터 해리되는 온도를 검출하는 단계
를 포함하는, 반응에서 핵산 서열을 동시에 증폭시키고 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

반응에서 다중 핵산 서열의 동시 검출{SIMULTANEOUS DETECTION OF MULTIPLE NUCLEIC ACID SEQUENCES IN A REACTION}
본 발명의 분야
본 발명은 생물학 및 화학 분야, 보다 특히 분자 생물학 및 인간 유전학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 샘플에서 특정 핵산 서열을 확인하는 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 반응에서 핵산 서열을 동시에 증폭시키고 검출하는 분야에 관한 것이다. 본 발명은 샘플에서 핵산 서열을 검출하기 위한 방법, 키트, 및 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 배경
샘플에서 민감하게, 특이적으로 및 신속히 생물 작용제, 예를 들어 병원체를 검출하는 진단 검정은 질환 및 진단상 바이오 작용제 모니터링 둘 다를 위해 점점 중요하게 되고 있다. 몇몇 검정은 감염성이거나 달리 해로운 작용제의 존재의 조기 검출을 위한 적절한 시간 규모에서 생리학적으로 또는 임상적으로 해당 유기체를 정확하게 검출할 수 있다.
DNA 마이크로어레이는 화학적 매트릭스로의 공유 부착에 의해 고체 표면 상에 정렬되는 단일 유전자를 일반적으로 나타내는 미시적 DNA 스폿의 집합이다. DNA 어레이는 DNA를 측정하거나 그의 검출 시스템의 일부로서 DNA를 이용한다는 점에서 단지 다른 유형의 마이크로어레이와는 상이하다. DNA 마이크로어레이를 이용하는 정성적 또는 정량적 측정은 고-염격성 조건 및 형광단-기재 검출 하에서 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화의 선택적 성질을 이용한다. DNA 어레이는 발현 프로파일링, 즉, 수천개의 유전자의 발현 수준의 동시 모니터링을 위해, 또는 비교 게놈 혼성화를 위해 흔히 사용된다. 이 시스템의 결점은 분석 이전에 다중 단계가 수행될 필요가 있다는 것이다. 또한, 어레이는 민감하지 않는다.
현재까지, 가장 민감한 검출 방법은 PCR을 포함한다. 단일 샘플에서 다수의 생물 작용제의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 다중 검출 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 다중 PCR은 상이한 DNA 서열, 즉, 상이한 트랜스진(transgene)에 특이적인 다양한 크기의 앰플리콘을 생산하기 위해 단일 PCR 반응 내에 독특한 다중 프라이머 세트를 이용한다. 다중 유전자를 동시에 표적화함으로써, 시약을 수회 필요로 하고 더 많이 수행할 필요가 있는 단일 시험 작업으로부터 추가의 정보를 얻을 수 있다. 각각의 프라이머 세트에 대한 어닐링 온도는 단일 반응 내에서 정확하게 작동하도록 최적화되어야 하고, 앰플리콘 크기, 즉 그들의 염기 쌍 길이가 겔 전기영동에 의해 가시화될 때 뚜렷한 밴드를 형성하기에 충분하도록 상이해야 한다. 다중 실시간 PCR은 진단 검정에 사용될 수 있는 한 방법이다. PCR을 기반으로 하는 검정은 비용 효율적인 개수의 반응 시험관에서 다중 작용제를 시험하기 위해 PCR 반응을 최적화하는 복잡성에 의해 제한될 수 있다. 일반적으로, 매우 특이적인 확인 결과를 뒷받침하는데 필요한 프로브의 개수는 2 내지 6개의 서열이다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 여러 상이한 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 PCR 반응을 최적화하는 것은, 검출되기 위한 표적의 개수가 증가함에 따라 점점 다루기 힘들어지는 굉장한 업무일 수 있다. PCR을 기반으로 하는 검정은 또한 결과의 분석에 이용가능한 독특한 표지의 개수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 실시간 PCR 검정은 일반적으로 형광 표지를 사용한다. 단일 반응에 사용될 수 있는 표지의 개수는 사용된 광학 검출 시스템에서 이용가능한 형광 색상 채널의 개수에 의해 제한된다.
1개의 용기에서 다중 핵산 서열을 동시에 증폭시키고 검출하기 위한 방법을 갖는 것이 유리할 것이다.
WO 2005/111243 A2는 2개의 용기에서 작용제를 검출하는 방법에 관한 것이다. WO 2005/111243 A2에 개시된 방법의 결점은 2개의 용기가 필요하다는 사실이다. 이상적으로, 반응은 1개의 용기를 요구할 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은
(i) 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 증폭 반응을 수행하기 위해 4개 이상의, 바람직하게는 5개 이상의, 보다 바람직하게는 6개 이상의 프로브를 포함하는 시약을 제공하며, 여기서,
(a) 각각의 프로브는 핵산 서열에 대해 특이적이고;
(b) 2개 이상의, 바람직하게는 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유하며;
(c) 동일한 표지를 보유하는 각각의 프로브는, 가열에 의해 그들의 표적 핵산 서열로부터 해리될 때, 동일한 표지를 가진 다른 프로브와 2℃ 초과만큼 차이나는 융점 (Tm)을 갖는 것인 단계;
(iii) 상기 반응에서 핵산 서열을 증폭시키는 단계;
(iv) 표지된 프로브가 그의 핵산 서열과 결합하였는지 여부를 측정함으로써 증폭된 핵산을 검출하는 단계; 및
(v) 각각의 주어진 표지된 프로브가 그가 결합된 핵산 서열로부터 해리되는 온도를 검출하는 단계
를 포함하는, 반응에서 핵산 서열을 동시에 증폭시키고 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "핵산 서열"은 본 발명의 문맥에서 핵산에 대한 서열이다. 핵산은 특히 RNA, DNA, cDNA (상보적 DNA), LNA (잠금 핵산), mRNA (메신저 RNA), mtRNA (미토콘드리아), rRNA (리보솜 RNA), tRNA (전달 RNA), nRNA (핵 RNA), siRNA (짧은 간섭 RNA), snRNA (소형 핵 RNA), snoRNA (소형 핵인 RNA), scaRNA (소형 카잘 바디 특이적 RNA), microRNA, dsRNA (이중 가닥 RNA), 리보자임, 리보스위치, 바이러스성 RNA, dsDNA (이중 가닥 DNA), ssDNA (단일 가닥 DNA), 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA, 염색체 DNA, 바이러스성 DNA, mtDNA (미토콘드리아 DNA), nDNA (핵 DNA), snDNA (소형 핵 DNA) 등, 또는 샘플에서 벌크 핵산과 구별가능한 임의의 다른 부류 또는 하위 부류의 핵산일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프로브"는 또다른 핵산과 결합할 수 있는 핵산이다.
본원에 사용된 용어 "조직"은 인간, 동물 또는 식물에서의 임의의 조직 또는 유체, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 유방, 전립선, 혈액, 혈청, 뇌척수액, 간, 신장, 유방, 두경부, 인두, 갑상선, 췌장, 위, 결장, 결장직장, 자궁, 자궁경부, 골, 골수, 고환, 뇌, 신경 조직, 난소, 피부를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "프로브 집합"은 특이적 위치, 즉 서열에서 핵산 분자를 간섭할 수 있는 세가지 이상의 작용제의 집합이다.
본원에서, "표지"는 광학 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출될 수 있는 신호를 발생시킬 수 있는, 프로브에 공유 또는 비-공유 결합된 모이어티이다.
본 발명의 상세한 설명
제1 측면에서, 본 발명은
(i) 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 증폭 반응을 수행하기 위해 4개 이상의, 바람직하게는 5개 이상의, 보다 바람직하게는 6개 이상의 프로브를 포함하는 시약을 제공하며, 여기서
a. 각각의 프로브는 핵산 서열에 대해 특이적이고;
b. 2개 이상의, 바람직하게는 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유하며;
c. 동일한 표지를 보유하는 각각의 프로브는, 가열에 의해 그들의 표적 핵산 서열로부터 해리될 때, 동일한 표지를 가진 다른 프로브와 2℃ 초과만큼 차이나는 융점 (Tm)을 갖는 것인 단계;
(iii) 상기 반응에서 핵산 서열을 증폭시키는 단계;
(iv) 표지된 프로브가 그의 핵산 서열과 결합하였는지 여부를 측정함으로써 증폭된 핵산을 검출하는 단계; 및
(v) 각각의 주어진 표지된 프로브가 그가 결합된 핵산 서열로부터 해리되는 온도를 검출하는 단계
를 포함하는, 반응에서 핵산 서열을 동시에 증폭시키고 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 4개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 4개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 5개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 5개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 5개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 4개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 6개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 6개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 6개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 4개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 7개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 7개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 7개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 4개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 8개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 8개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
본 발명의 방법의 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 시약은 8개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 4개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
프로브의 표지는 바람직하게는 형광 표지이다.
2개 이상의 형광 표지는 그들의 최대 방출 파장이 10 nm 이내, 바람직하게는 5 nm 이내일 때 동일한 표지인 것으로 추정된다. 가장 바람직하게는, 동일한 형광 표지는 동일한 형광 염료이다.
동일한 표지를 보유하는 프로브는 그들이 융점에 의해 구별가능하도록 상이한 융점 (Tm)을 갖는 것이 바람직하다.
상기 언급한 바와 같이, 동일한 표지를 갖는 프로브는 2℃ 이상, 바람직하게는 약 5℃ 이상, 보다 바람직하게는 약 5℃ 내지 10℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 5℃ 내지 8℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 5℃ 내지 7℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 5℃ 내지 6℃만큼 차이나는 융점을 갖는 것이 바람직하다. 본원에서, 온도 값과 관련하여, 용어 "약"은 온도 값의 +/- 10％까지의 편차를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
본 발명은, 특정 실시양태에서,
(i) 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
(ii) 증폭 반응을 수행하기 위해 2개 이상의 프로브 집합을 포함하는 시약을 제공하며, 여기서,
(a) 각각의 프로브 집합은 3개 이상의 프로브로 이루어지고,
(b) 각각의 프로브는 핵산 서열에 대해 특이적이고,
(c) 주어진 프로브 집합에서 각각의 프로브는 상이한 표지를 보유하며,
(d) 주어진 프로브 집합에서 모든 프로브는, 가열에 의해 그들의 표적 핵산 서열로부터 해리될 때, 유사한, 바람직하게는 동일한 융점 (Tm)을 갖는 것인 단계,
(iii) 상기 반응에서 핵산 서열을 증폭시키는 단계,
(iv) 표지된 프로브가 그의 핵산 서열과 결합하였는지 여부를 측정함으로써 증폭된 핵산을 검출하는 단계, 및
(v) 각각의 주어진 표지된 프로브가 그가 결합된 핵산 서열로부터 해리되는 온도를 검출하는 단계
를 포함하는, 반응에서 핵산 서열을 동시에 증폭시키고 검출하는 방법에 관한 것이다.
추가의 실시양태에서, 상기 방법은 3개 이상의 프로브 집합을 포함하고, 여기서 각각의 프로브 집합은 3개 이상의 프로브로 이루어진다.
본 발명을 더욱 명료하게 하기 위해, 도 1을 지적한다. 본 발명에 따른 프로브 집합은 3개 이상의 프로브를 포함한다. 프로브 집합은 공통된 표지를 공유하는 이들 모든 프로브 뿐만 아니라, 공통된 융점 (Tm)을 공유하는 이들 모든 프로브로서 확인될 수 있다. 이상적으로는, 서로 구별되지 않는 동일한 표지 또는 표지들을 갖는 프로브 집합에서 프로브는 상이한 융점을 갖는다. 동일한 또는 매우 유사한 융점을 갖는 프로브 집합에서 프로브는 상이한 표지를 가져야 한다.
당업자는 시약이 보통 예를 들면 증폭을 위한 효소, 완충액, 뉴클레오티드 등을 포함할 것임을 알 것이다. 물론, 이는 증폭의 유형에 따라 좌우된다.
본 발명자들은 예를 들면 20개의 주형을 이용하여 다중 증폭 반응을 수행하는 것을 가능하게 하는 방법을 개발하였다. 일 실시양태에서, 5개의 상이한 표지를 이용하고, 공통된 표지를 공유하는 모든 프로브는 약간 상이한 융점을 갖는다. 한편, 공통된 융점을 공유하는 모든 프로브는 상이한 표지를 갖는다. 증폭시키는 동안 또는 그 후에 표지 및 융점을 검출함으로써, 본 발명자들은 예를 들면 상기 20개의 주형을 하나의 시험관에서 분석 가능하게 하는 수단을 최초로 제공하였다.
전반적인 원리를 더욱 명료하게 하기 위해, 도 1을 참조한다. 여기서, 1열에 있는 모든 프로브는 공통된 표지를 공유한다. 1열에 있는 모든 프로브는 그들의 융점이 상이하다. D행에 있는 모든 프로브는 주어진 융점을 공유한다. 1열에 있는 프로브가 녹색 표지를 갖고, 모두 상이한 표지를 갖는 D행에 있는 프로브가 공통된 융점으로서 55℃를 공유한다는 시나리오를 고려할 때, 프로브 "4"에 대한 주형이 반응에 존재하는지 여부를 측정하는 것이 가능할 것이며, 이는 55℃ 융점에서 녹색 표지로부터의 신호가 검출되는 경우이기 때문이다.
원칙적으로, "표지된 프로브가 그의 핵산 서열과 결합하였는지 여부를 측정함으로써 증폭된 핵산을 검출하는 단계", 및 "각각의 주어진 표지된 프로브가 그가 결합된 핵산 서열로부터 해리되는 온도를 검출하는 단계"는 주어진 반응의 말기에 또는 반응 동안에 수행될 수 있다.
다양한 증폭 방법이 적용될 수 있으며, 이들은 예를 들면, 롤링 서클 증폭 (예컨대, 문헌 [Liu, et al., "Rolling circle DNA synthesis: Small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases," J. Am. Chem. Soc. 118:1587-1594 (1996)]), 등온성 증폭 (예컨대, 문헌 [Walker, et al., "Strand displacement amplification--an isothermal, in vitro DNA amplification technique", Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992)]), 리가제 연쇄 반응 (예컨대, 문헌 [Landegren, et al., "A Ligase-Mediated Gene Detection Technique," Science 241:1077-1080, 1988] 또는 [Wiedmann, et al., "Ligase Chain Reaction (LCR)--Overview and Applications," PCR Methods and Applications (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1994) pp. S51-S64])이다. 그러나, 폴리머라제 연쇄 반응 증폭이 바람직하다.
반응이 폴리머라제 연쇄 반응인 경우, "표지된 프로브가 그의 핵산 서열과 결합하였는지 여부를 측정함으로써 증폭된 핵산을 검출하는 단계", 및 "각각의 주어진 표지된 프로브가 그가 결합된 핵산 서열로부터 해리되는 온도를 검출하는 단계"는 각각의 주기 이후에, 한 주기 이후에, 1 초과의 주기 이후에, 간격을 두고 또는 완전한 PCR 반응의 말기에 수행될 수 있다.
PCR 반응은 DNA 분자의 변성 및 합성의 10 내지 100 "주기"로 이루어질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 열사이클링 증폭 반응에서 변성이 일어나는 온도는 약 90℃ 내지 95℃ 초과, 보다 바람직하게는 92℃ 내지 94℃이다. 바람직한 열사이클링 증폭 방법에는 약 10 내지 약 100 주기, 보다 바람직하게는 약 25 내지 약 50 주기, 및 약 90℃ 내지 95℃ 초과, 보다 바람직하게는 92℃ 내지 94℃의 피크 온도와 관련된 폴리머라제 연쇄 반응이 포함된다. 바람직한 실시양태에서, PCR 반응은 (a) 표적 서열의 말단이 그와 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성할 수 있는 것으로 충분히 상세하게 알려져 있고, (b) 소량의 표적 서열이 연쇄 반응의 개시에 이용가능함을 고려하여, 관련 반응 단계의 개수에 대해 지수적 양으로 1개 이상의 표적 핵산 서열을 생산하기 위해 DNA 폴리머라제 I을 이용하여 수행한다. 연쇄 반응의 생성물은 사용된 특이적 프라이머의 말단에 상응하는 종결부를 가진 구별되는 핵산 듀플렉스일 것이다. 정제된 또는 정제되지 않은 형태인 임의의 핵산 공급원이 목적하는 표적 핵산 서열을 함유하거나 함유하는 것으로 생각되는 경우, 이를 출발 핵산으로 이용할 수 있다. 따라서, 상기 공정은 예를 들면 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 DNA를 이용할 수 있다. 또한, 각각의 한 가닥을 함유하는 DNA-RNA 하이브리드를 이용할 수 있다. 임의의 이들 핵산의 혼합물 또한 이용할 수 있거나, 또는 동일하거나 상이한 프라이머를 사용하여 이전의 증폭 반응으로부터 생산된 핵산을 이용할 수 있다. 증폭된 핵산은 바람직하게는 DNA이다. 증폭되는 표적 핵산 서열은 거대 분자의 분획만일 수 있거나, 또는 초기에 구별되는 분자로서 존재할 수 있어서, 표적 서열이 전체 핵산을 구성한다. 증폭되는 표적 서열이 초기에 순수한 형태로 존재할 필요는 없으며, 이는 유기체가 특정 생물학적 샘플의 매우 소량인 분획만을 구성할 수 있는 특정 동물 때문에 복잡한 혼합물의 소량 분획 또는 핵산 서열의 일부분일 수 있다. 출발 핵산은 동일하거나 상이할 수 있는 하나 초과의 목적하는 표적 핵산 서열을 함유할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 동일하거나 상이한 핵산 분자에 위치하는 다중 표적 핵산 서열을 동시에 증폭시키는데 유용하다. 핵산(들)은 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있고, 플라스미드 및 클로닝된 DNA, 임의 공급원, 예컨대 박테리아, 효모, 바이러스 및 고급 유기체, 예컨대 식물 또는 동물로부터의 DNA를 포함한다. DNA는 예를 들면 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (New York: Cold Spring Harbor Laboratory) pp 280-281 (1982)]에 기재된 것과 같은 다양한 기술에 의해 혈액 또는 다른 유체, 또는 조직 물질, 예컨대 융모막 융모 또는 양막 세포로부터 추출될 수 있다. 추가로, 제나코(Genaco) Tem-PCR 기술과 루미넥스(Luminex) xMAP 기술을 조합한 템플렉스(Templex) 기술을 적용할 수 있다.
검정은 유전자위-특이적 프라이머를 사용한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 임의의 적합한 방법, 예컨대 포스포트리에스테르 및 포스포디에스테르 방법 또는 그의 자동화 실시양태에 의해 제조될 수 있다. 이러한 한 자동화 실시양태에서, 디에틸로포스포르아미다이트를 출발 물질로 사용하고, 문헌 [Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22:1859-1862 (1981)]에 기재된 바와 같이 합성될 수 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 개질된 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한 방법이 미국 특허 제4,458,006호에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 생물학적 공급원으로부터 단리된 프라이머 (예컨대 제한 엔도뉴클레아제 소화)를 이용하는 것 또한 가능하다. 바람직한 프라이머는 약 15-100, 보다 바람직하게는 약 20-50, 가장 바람직하게는 약 20-40 염기의 길이를 갖는다. 상기 방법의 프라이머는 표적 서열을 포함하는 영역에 놓여있는 것이 본질적이다. 표적 핵산 서열은 주형으로서 상기 서열을 함유하는 핵산을 이용하여 증폭될 수 있다. 핵산이 두 가닥을 함유하는 경우, 이를 주형으로서 사용할 수 있기 전에, 프라이머 연장 생성물 합성과는 별도의 단계에서 또는 그와 동시에 핵산의 가닥을 분리할 필요가 있다. 이러한 가닥 분리는 임의의 적합한 변성 방법, 물리적, 화학적, 또는 효소적 수단에 의해 달성될 수 있다. 핵산의 가닥을 분리시키는 한 물리적인 방법은 핵산이 완전히 (>99％) 변성될 때까지 이를 가열하는 것을 포함한다. 전형적인 열 변성은 약 80℃ 내지 105℃, 바람직하게는 약 90℃ 내지 약 98℃, 훨씬 더 바람직하게는 93℃ 내지 95℃ 범위의 온도, 약 1 내지 10 분 범위의 시간과 관련있을 수 있다. 등온성 증폭의 경우, 가닥 분리는 또한 헬리카제로 공지된 부류의 효소, 또는 헬리카제 활성을 가지며 DNA를 변성시키는 것으로 알려진 효소 RecA로부터의 효소에 의해 유도될 수 있다. 헬리카제를 이용하여 헥산의 가닥을 분리시키는데 적합한 반응 조건은 문헌 [Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. XLIII "DNA: Replication and Recombination" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1978)]에 기재되어 있고, RecA를 이용하는 기술은 문헌 [C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16:405-37 (1982)]에서 고찰되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
이 합성은 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 일반적으로, 이는 완충된 수용액 중에서 일어난다. 일부 바람직한 실시양태에서, 완충액 pH는 약 7.5 내지 8.9이다. 바람직하게는, 몰 과량의 (클로닝된 핵산의 경우 보통 약 1000:1 프라이머:주형, 게놈 핵산의 경우 보통 약 106:1 프라이머:주형) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 별도의 주형 가닥을 함유하는 완충액에 첨가한다. 그러나, 이 방법을 일부 적용에 사용하는 경우 상보적 가닥의 양을 알수 없어서, 상보적 가닥의 양에 대한 프라이머의 양을 확실하게 측정할 수 없음을 이해한다. 그러나, 실제적으로, 첨가된 프라이머의 양은 일반적으로, 증폭되는 서열이 복합 장쇄 핵산 가닥의 혼합물에 함유된 경우, 상보적 가닥 (주형)의 양에 대해 몰 과량일 것이다. 공정의 효율을 개선시키기 위해 몰 과량이 클 수록 바람직하다.
뉴클레오시드 트리포스페이트, 바람직하게는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및/또는 dUTP 또한 적절한 양으로 합성 혼합물에 첨가된다. 뉴클레오티드의 바람직한 몰 농도는 0.025 mM 내지 1 mM, 바람직하게는 0.05 내지 0.6 mM, 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.5 mM이다.
본 발명에 따른 폴리머라제가 써무스(Thermus), 아퀴펙스(Aquifex), 써모토가(Thermotoga), 써모크리디스(Thermocridis), 히드로게노박터(Hydrogenobacter), 써모신케코커스(Thermosynchecoccus) 및 써모안아에로박터(Thermoanaerobacter) 속의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 폴리머라제가 아퀴펙스 아에오리쿠스(Aquifex aeolicus), 아퀴펙스 피오게네스(Aquifex pyogenes), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus), 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana), 써무스 파시쿠스(Thermus pacificus), 써무스 에게르트소니이(Thermus eggertssonii), 및 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유기체의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 폴리머라제가 Taq 폴리머라제인 것이 가장 바람직하다. 그러나, 하기에 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 몇몇 실시양태에서는, 폴리머라제가 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 보유하는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서는, 폴리머라제에 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 것이 바람직하다. 가장 실시양태에서는, 폴리머라제에 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 것이 바람직하다.
일 실시양태에서, 우라실 잔기가 PCR 반응 동안에 도입된다. 우라실 DNA 글리코실라제 (우라실-N-글리코실라제)는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) ung-유전자의 생성물이며, 이. 콜라이(E. coli)에서 클로닝, 서열분석 및 발현되었다. 우라실 DNA 글리코실라제 (UDG)는 DNA 당-포스포디에스테르 골격을 파괴하지 않고 DNA (단일- 및 이중 가닥)로부터 이들 우라실 잔기를 제거하며, 따라서 혼성화 표적으로서 또는 DNA 폴리머라제에 대한 주형으로서 그의 사용이 방지된다. 생성된 무염기성 부위는 승온에서 가수분해성 절단에 민감하다. 따라서, 우라실 염기의 제거는 보통 DNA의 분획화에 의해 달성된다. 당업자는 오염을 피하기 위해 우라실 DNA 글리코실라제를 사용하는 방법을 알고 있다. 마찬가지로, 효소 및 우라실 뉴클레오티드 둘 다 본 발명에 따른 키트에 있을 수 있다.
이상적으로, 제1 및 제2 또는 추가의 프로브 집합에서 프로브의 표지는 형광 표지이고, 매우 유사한 방출 파장을 갖는다. 이상적으로, 이는 검출 장치에 의해 검출될 수 있는 파장 조정을 변경시키지 않고도 이들이 검출될 수 있음을 의미한다. 제1, 제2 및 제3 또는 추가의 프로브 집합에서 프로브의 표지가 동일한 것이 바람직하다.
동일한 표지를 보유하는 프로브는, 전형적으로 융점에서 0.1℃, 0.2℃, 0.3℃, 0.4℃, 0.5℃, 1℃, 1.5℃, 2℃, 2.5℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃ 초과의 차이를 갖는, 주어진 기기 상에서 융점에 의해 구별가능하도록 이들이 상이한 융점 (Tm)을 갖는 것이 바람직하다. 1℃, 1.5℃, 2℃, 2.5℃, 3℃, 4℃, 5℃ 초과가 바람직하다.
일 실시양태에서, 이중 가닥 세그먼트의 용융 전이는 이중 가닥 핵산-특이적 (dsNAS) 염료의 형광 강도를 모니터링함으로써 측정할 수 있다. 일 실시양태에서, 이중 가닥 핵산-특이적 염료는 SYBR® 그린 I, SYBR® 골드, 에티듐 브로마이드, 프로피듐 브로마이드, 피코 그린(Pico Green), 훽스트(Hoechst) 33258, YO-PRO-I 및 YO-YO-I, 사이토(Syto®)9, LC 그린®, LC 그린® 플러스+, 에바그린(Evagreen™)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 포화 염료는, PCR의 억제를 최소화하면서, 증폭 동안 또는 이후에 DNA와 관련하여 충분한 포화 조건하에 존재할 수 있다. 예를 들면, 최대 PCR-적합성 농도에서 dsDNA 결합 염료는 50％ 이상의 포화도％를 갖는다. 다른 실시양태에서, 포화도％는 80％ 이상이다. 또다른 실시양태에서, 포화도％는 99％ 이상이다. 포화도％는 포화 농도에서 동일한 염료의 형광과 비교한 형광％임을 이해한다. 포화 농도는 예정된 양의 dsDNA의 존재하에 가능한 최고 형광 강도를 제공하는 농도이다. 이들 염료가 특정 핵산 반응을 유의하게 간섭하지 않고도 유의하게 높은 농도로 존재할 수 있기 때문에, 이들 염료는 단일 가닥 핵산 및 dsDNA의 형태를 모니터링하는데 특히 유용할 수 있다.
바람직한 반응은 폴리머라제 연쇄 반응이다. 프로브가 탁맨(TaqMan) 프로브, 분자 비콘 프로브, 스콜피온 프로브 및 라이트 사이클러 프로브의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 증폭 생성물 자체의 검출은 탁맨 프로브, 분자 비콘 프로브, 스콜피온 프로브, 라이트 사이클러 프로브, 혼성화 프로브, 변위 프로브 및 다른 유형의 서열 특이적 프로브 포맷 중 하나를 이용하여 달성할 수 있다.
탁맨® 검정은 Taq DNA 폴리머라제의 5' 뉴클레아제 활성을 이용하여 형광 표지된 프로브 (FAM™-표지된 MGB)를 절단한다.
분자 비콘은 스템-루프 구조를 형성하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브이다 (도 2). 루프는 표적 서열에 상보적인 프로브 서열을 함유하고, 스템은 프로브 서열의 한 측면에 위치하는 상보적 아암 서열을 어닐링함으로써 형성된다. 형광단은 하나의 아암의 말단에 공유 연결되고, 켄처는 다른 아암의 말단에 공유 연결된다. 분자 비콘은 용액 중에서 유리될 때 형광을 내지 않는다. 그러나, 이들이 표적 서열을 함유하는 핵산 가닥과 혼성화되면, 이들은 밝게 형광을 낼 수 있게 하는 형태적 변화를 겪는다. 표적의 부재하에서는, 스템이 전자를 일시적으로 공유하는 비-형광 켄처에 매우 근접하게 형광단을 두어서, 형광단이 형광을 내는 능력이 제거되기 때문에, 프로브가 어두운 색이다. 프로브가 표적 분자를 만나면, 이는 스템 하이브리드보다 더 길고 더 안정한 프로브-표적 하이브리드를 형성한다. 프로브-표적 하이브리드의 견고성 및 길이는 스템 하이브리드가 동시에 존재하는 것을 배제시킨다. 결과적으로, 분자 비콘은 스템 하이브리드가 해리되고, 형광단과 켄처가 서로 멀리 이동하게 하는 자발적인 형태적 재조직화를 겪는다. 유전자 증폭을 수행하기 전에 분자 비콘을 검정 혼합물에 첨가하고, 형광을 실시간으로 측정한다. 본 발명에 따른 방법을 가능하게 하는, 색상이 상이한 형광단을 가진 분자 비콘을 합성할 수 있다. 생성된 형광 (존재한다면)의 색상은 융점의 측정과 조합되어 병원체를 확인시킨다. 스콜피온 프라이머 (도 3)는 프라이머가 프로브에 공유 연결된 이중관능성 분자이다. 상기 분자 또한 형광단 및 켄처를 함유한다. 표적의 부재하에, 켄처는 형광단에 의해 방출된 형광을 거의 흡수한다. 스콜피온 PCR 반응 동안, 표적의 존재하에서는 형광단 및 켄처가 분리되어, 형광 방출의 증가를 유도한다. 형광은 반응 시험관에서 검출 및 측정될 수 있다.
라이트 사이클러 FRET 프로브 시스템은 단일 가닥 형광-표지된 올리고뉴클레오티드의 쌍이다. 프로브 1 (공여자 프로브)은 그의 3' 말단에서 공여자 형광단 (일반적으로 플루오레세인)으로 표지되고, 프로브 2 (수용자 프로브)는 그의 5' 말단에서 이용가능한 4개의 형광단 (레드 610, 640, 670 또는 705) 중 하나로 표지된다. 프로브 2의 유리 3' 히드록실기는 포스페이트기 (P)로 차단되어 Taq DNA 폴리머라제 연장을 막아야 한다. 두 프로브 상의 공여자 및 수용자 형광단 사이의 임의의 입체적 문제점을 피하기 위해, 1 내지 5 nt (4 내지 25Å 거리)의 스페이서가 존재하여, 두 프로브를 서로 분리시켜야 한다. 임의의 실시간 정량적 PCR 반응이 일어나기 전에, 형광 백그라운드를 시험관 내부에서 관찰할 수 있다. 실시간 정량적 PCR의 어닐링 단계 동안에, PCR 프라이머 및 라이트 사이클러 프로브는 그들의 특이적 표적 영역으로 혼성화되어, 공여자 염료가 수용자 염료에게 근접하게 한다. 공여자 염료가 라이트 사이클러 기기로부터의 빛 (hγ1)에 의해 여기되는 경우, 에너지는 공여자 염료로부터 수용자 염료에게로 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 의해 전달된다. 에너지 전달은 수용자 염료가 기기로부터 방출된 빛 (hγ1)보다 더 긴 파장에서 빛 (hγ2)을 방출하게 한다. 수용자 형광단의 방출 파장은 기기의 광학 장치에 의해 검출된다. 검출된 형광 신호의 증가는 표적 DNA의 축적량에 정비례한다.
다른 대안적인 프로브는 이클립스(Eclipse) 프로브 (에포흐(Epoch), 나노겐(Nanogen)), 변위 프로브 (문헌 [Cheng et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, number 7]), 플레이아데스(pleiades) 프로브 (문헌 [NAR 2007 Vol 35 5 e30]) 및 플렉서 시스템 (프로메가(Promega))이다. 물론, 다른 프로브 시스템 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 탁맨 프로브는 융점 분석에 사용되는 삽입(intercalating) 염료와 조합된다.
또다른 실시양태에서, 탁맨 프로브는 융점 분석에 사용되는 혼성화 프로브와 조합되며, 특별한 실시양태에서, 탁맨 프로브는 혼성화 프로브이다. 또다른 실시양태에서, 탁맨 프로브는 혼성화 프로브가 아니지만, 별도의 올리고뉴클레오티드가 혼성화 프로브로서 기능한다.
도 4는 매우 바람직한 실시양태를 도시한다. 여기서, 반응은 혼성화 프로브 및 탁맨 프로브 둘 다 포함한다. 여기서, (a) 각각의 프로브 집합은 예를 들면 2개 이상의 프로브로 이루어지며, 프로브는 혼성화 프로브이고, (b) 각각의 프로브가 핵산 서열에 대해 특이적이고, (c) 주어진 프로브 집합에서 각각의 혼성화 프로브 (예를 들면, 도 4에서 BHQ 1, BHQ 2, BHQ 3)는 상이한 표지를 보유하고 (예를 들면, 도 1에서 A행 참조), (d) 주어진 프로브 집합에서 모든 프로브는 가열에 의해 그들의 표적 핵산 서열로부터 해리될 때 유사한, 바람직하게는 동일한 융점 (Tm)을 갖는다 (예를 들면, 도 1에서 A행 참조). 반응에서 핵산 서열의 증폭이 수행되고, 증폭된 핵산을 검출하고, 각각의 주어진 표지된 프로브가 그가 결합된 핵산 서열로부터 해리되는 온도를 측정한다. 이 실시양태에서, 혼성화 프로브의 융점이 증폭에 사용된 프라이머의 융점보다 낮은 것이 바람직하지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 한 예가 도 5에 제공된다. PCR 반응 동안 주어진 융점 (혼성화 프로브 Q1에 대한 융점)에서 혼성화 프로브 Q1은 DNA 가닥으로부터 해리될 것이다. 혼성화 프로브는 켄처를 보유한다. 일단 해리되면, 하류 탁맨 프로브가 이제 더이상 켄징되지 않는 형광 표지로부터 나오는 신호를 발생시킬 것이다. 신호 (융점 mp1)로 인해 융점은 기지이다. 표지는 기지이다 (FL1). 따라서, 이 혼성화 프로브가 예를 들면 반응에 존재하는 것으로 알려진 병원균 1 (p1)에 대해 특이적이었음을 측정할 수 있다. 탁맨 프로브는 PCR 반응 동안에 작업중 정량화를 동시에 가능하게 한다.
반응이 이중 가닥 핵산 특이적 염료를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 이중 가닥 특이적 염료가 사용되는 경우, 이 염료는 SYBR® 그린 I, SYBR® 골드, 에티듐 브로마이드, 프로피듐 브로마이드, 피코 그린, 훽스트 33258, YO-PRO-I 및 YO-YO-I의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. SYBR® 그린 I가 매우 바람직하다. 본 발명에 따르면 이상적으로, 이중 가닥 핵산 특이적 염료는 프로브 표지와 스펙트럼적으로 구별가능하다.
이상적으로, 표지는 형광 표지이고, 상기 표지는 FAM (5- 또는 6-카르복시플루오레세인), VIC, NED, 플루오레세인, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, 오레곤 그린(Oregon Green), 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 야키마 옐로우(Yakima Yellow), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) PET, 바이오서치 블루(Biosearch Blue™), 마리나 블루(Marina Blue®), 보텔 블루(Bothell Blue®), 알렉사 플루오르®, 350 FAM™, SYBR® 그린 1, 플루오레세인, 에바그린™, 알렉사 플루오르® 488 JOE™, VIC™, HEX™, TET™, 칼 플루오르® 골드 540, 야키마 옐로우®, ROX™, 칼 플루오르® 레드 610, Cy3.5™, 텍사스 레드®, 알렉사 플루오르®, 568 Cy5™, 쿠아사르(Quasar™) 670, 라이트사이클러 레드640 (LightCycler Red640®), 알렉사 플루오르 633 쿠아사르™ 705, 라이트사이클러 레드705®, 알렉사 플루오르® 680, 사이토®9, LC 그린®, LC 그린® 플러스+, 에바그린™의 군으로부터 선택된다.
상기 방법은 대안적으로 단일 이중-표지된 프로브가 표적의 구별을 가능하게 하면서 용융 곡선 분석이 PCR 반응의 말기에 수행되는 기본 원칙을 기반으로 한다. 탁맨 실시간 PCR에서 신장 단계 동안에 전형적으로 발생하는 이 프로브의 가수분해를 피하기 위해, 상기 프로브의 융점 (Tm)을 PCR 프라이머의 Tm보다 10℃ 낮도록 선택하였다. PCR 반응의 말기에, 프로브를 혼성화시키고, 형광을 계속해서 모니터링하면서 혼합물의 온도를 단계적으로 증가시킨다. 전형적인 탁-맨 실시간 PCR에서, 프로브에 의한 형광 신호의 생성은 푀스터(Foester) 공명 에너지 전달 (FRET) 현상을 기반으로 한다. 그러나, 탁맨 실시간 PCR에서 일어나는 것과는 대조적으로, 이 실시양태에서는 Taq 폴리머라제에 의해 이용가능한 프로프 분자가 전혀 가수분해되지 않거나 일부만이 가수분해된다. 오히려, 상기 절차는 랜덤 단일 가닥 형태를 달성하기 위해 프로브를 그의 표적으로부터 탈착시킬 때 관찰되는 FRET의 감소에 따라 좌우된다. 수용체와 이중-표지된 프로브의 켄처 분자 사이의 평균 거리는, 프로브가 표적 서열과의 하이브리드로부터 유리될 때 더욱 짧아질 것이다. FRET 효과가 이 거리의 제6 힘과 역비례하기 때문에, 프로브의 혼성화된 형태와 용융된 형태 사이의 형광 방출에서의 차이는 용이하게 검출될 수 있을 것이다. 도 6에 개략도가 도시된다. 여기서, 형광에서의 변화는 상이한 반응 온도에 대한 주기마다 도시된다. 이 방법의 바람직한 실시양태에서, 사용된 폴리머라제에는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 비대칭 프라이머 농도가 이용된다. 이는 프로브와 결합하는 DNA 가닥을 생성하는 프라이머가 다른 프라이머보다 높은 농도로 첨가되는 방식으로, 각각의 표적에 대한 두 프라이머의 비를 변경시킴으로써 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 대안적인 한 실시양태에서, (a) 표지된 프로브는 혼성화 프로브 및 탁맨 프로브로 이루어진 군이고, (b) 탁맨 프로브는 상기 표지를 보유하고, (c) 상기 표지는 형광 표지이고, (d) 탁맨 프로브는 켄처를 추가로 포함하고, (e) 임의로 혼성화 프로브를 탁맨 프로브에 부착된 표지의 형광을 켄칭시킬 수 있는 추가의 켄처를 보유하고, (f) 상기 탁맨 프로브 및 상기 혼성화 프로브 둘 다 그들 각각의 서열에 결합할 때 혼성화 프로브 상에 존재하는 켄처가 적어도 부분적으로 상기 탁맨 프로브 상의 상기 표지의 형광을 켄칭시키는 방식으로 두 프로브가 상기 핵산 서열과 인접하게 결합할 수 있다. 그러나, 혼성화 프로브가 탁맨 프로브에 부착된 표지의 형광을 켄칭시킬 수 있는 추가의 켄처를 보유하는 것이 바람직하다.
이 실시양태에서 동일한 표지를 갖는 프로브는 이들이 구별될 수 있도록 융점 (Tm)이 예를 들면 적어도 0.1℃, 0.5℃, 1℃, 1.5℃, 2℃, 2.5℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃만큼 차이나는 혼성화 프로브를 가진 군을 형성한다. 0.5℃, 1℃, 1.5℃, 2℃, 2.5℃, 3℃, 4℃, 5℃ 초과가 바람직하다. 약 5℃가 가장 바람직하다. 이 실시양태에서, 혼성화 프로브의 융점 (Tm)이 탁맨 프로브의 융점 (Tm)보다 낮은 것 또한 바람직하다. 따라서, 반응에서 어닐링시에 온도가 상승되면, 혼성화 프로브는 Tm에 도달하였을 때 그의 상보적 가닥으로부터 해리되어 제1 신호를 생성한다. 이어서, 폴리머라제는 탁맨 프로브에 접근하여, 제2 탁맨 신호를 생성할 것이다.
이 실시양태에서, 혼성화 프로브는 폴리머라제가 그의 최적 활성을 나타내는 온도보다 낮은 융점 (Tm)을 갖는 것 또한 바람직하다. 이는 혼성화 프로브가 해리되어, 탁맨 프로브로의 폴리머라제의 진로가 주어짐을 제공한다. 상기 방법은 이상적으로 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 폴리머라제를 사용함이 명백하다.
실시간 PCR은 열 사이클러, 컴퓨터, 형광 여기 및 방출 수집을 위한 광학, 및 데이타 획득 및 분석 소프트웨어로 이루어진 기기 플랫폼을 필요로 한다. 이들 장비는 몇몇 제조자로부터 입수가능하며, 샘플 용량 (일부는 96-웰 또는 384-웰 표준 플레이트 포맷이고, 다른 것은 더 적은 샘플을 갖거나, 특별한 유리 모세 시험관을 필요로 하고, 일부는 블록 포맷이고, 다른 것은 캐루젤임), 여기 방법 (일부는 레이저를 이용하고, 다른 것은 조정가능한 필터 또는 하나 이상의 다이오드를 구비한 넓은 스펙트럼 광원을 이용함), 검출 (일부는 카메라를 이용하고, 다른 것은 광전증배관, 또는 광 검출 시스템 유형을 이용함) 및 전반적인 감도가 상이하다. 또한, 소프트웨어가 데이타를 가공하는 방법에서 플랫폼-특이적 차이가 있다. 원칙적으로 2개 이상의 검출 채널을 가진 입수가능한 장비가 본 발명에 따른 방법에 적합하다.
본 발명은 또한 엄격한 조건하에 하나 이상의 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 4개 이상의, 바람직하게는 5개 이상의, 보다 바람직하게는 6개 이상의 프로브를 포함하며, 여기서,
a. 각각의 프로브가 핵산 서열에 대해 특이적이고;
b. 2개 이상의, 바람직하게는 3개 이상의 프로브 동일한 표지를 보유하며;
c. 동일한 표지를 보유하는 각각의 프로브는, 가열에 의해 그들의 표적 핵산 서열로부터 해리될 때, 동일한 표지를 가진 다른 프로브와 2℃ 초과만큼 차이나는 융점 (Tm)을 갖는 것인, 키트에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 4개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 4개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 5개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 5개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 5개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 4개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 6개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 6개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 6개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 4개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 7개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 7개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 7개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 4개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 8개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 8개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 3개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 키트는 8개 이상의 프로브를 포함하고, 여기서 4개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유한다.
2개 이상의 형광 표지는 그들의 최대 방출 파장이 10 nm 이내, 바람직하게는 5 nm 이내일 때 동일한 표지인 것으로 추정된다. 가장 바람직하게는 동일한 형광 표지는 동일한 형광 염료이다.
상기 언급한 바와 같이, 동일한 표지를 갖는 프로브가 2℃ 이상, 바람직하게는 약 5℃ 이상, 보다 바람직하게는 약 5℃ 내지 10℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 5℃ 내지 8℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 5℃ 내지 7℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 5℃ 내지 6℃만큼 차이나는 융점을 갖는 것이 바람직하다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 엄격한 조건하에 하나 이상의 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 6개 이상의 프로브를 포함하며, 여기서,
a) 3개 이상의 프로브의 제1 군이 제1 표지를 보유하고, 이 군에서 모든 프로브는 그들의 융점이 상이하고,
b) 3개 이상의 프로브의 제2 군이 제2 표지를 보유하고, 이 군에서 모든 프로브는 그들의 융점이 상이한 것인, 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 엄격한 조건하에 하나 이상의 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 9개 이상의 프로브를 포함하며, 여기서,
(a) 2개 이상의 프로브의 제1 군이 제1 표지를 보유하고, 이 군에서 모든 프로브는 그들의 융점이 상이하고,
(b) 2개 이상의 프로브의 제2 군이 제2 표지를 보유하고,
(c) 2개 이상의 프로브의 제3 군이 제3 표지를 보유하고, 이 군에서 모든 프로브는 그들의 융점이 상이하고, 적어도 2개 이상의 프로브의 제3 군이 제3 표지를 보유하고, 이 군에서 모든 프로브가 그들의 융점이 상이한 것인, 키트에 관한 것이다. 물론, 본 발명은 또한 더 많은 프로브 집합 및/또는 더 많은 프로브를 가진 키트에 관한 것이다.
융점 (Tm)이 상이한 프로브는 적어도 0.5℃, 1℃, 1.5℃, 2℃, 2.5℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃만큼 상이하다. 1℃, 1.5℃, 2℃, 2.5℃, 3℃, 4℃, 5℃ 초과가 바람직하다. 이상적으로, 프로브는 약 5℃만큼 상이하다. 이상적으로, 동일한 표지를 갖는 프로브는 용융 분석에 의해 신뢰할만하게 구별가능한 방식으로 선택된 고정된 간격의 융점 (Tm)의 차이, 예컨대 5℃를 갖는다. 이러한 실시양태에서, 예를 들면 표지된 플루오레세인인 프로브는 예를 들면 40℃, 45℃, 50℃ 및 55℃의 융점 (Tm)을 가질 것이다. 본 발명에 따른 키트는 완충액, 뉴클레오티드 및 효소, 예컨대 폴리머라제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 프리믹스로서 적합화될 수 있고, 사용자는 프로브를 첨가하기만 하면된다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브는 다양한 표적, 예컨대 질환 마커, 병원균, 법의학적 마커, 또는 증폭에 의해 다룰 수 있는 임의의 다른 표적에 대해 특이적일 수 있다. 본 발명은 특히 병원균의 분석에 적합하다. 가장 흔한 박테리아 질환은 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 유발되는 결핵이며, 이는 대부분 사하라 사막 이남의 아프리카에서 년간 약 2백만명을 사망시킨다. 병원균 박테리아는 전세계적으로 중요한 다른 질환, 예컨대 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 슈도모나스(Pseudo monas)와 같은 박테리아에 의해 유발되는 폐렴, 및 시겔라(Shigella), 캄필로박터(Campylobacter) 및 살모넬라(Salmonella)와 같은 박테리아에 의해 유발될 수 있는 음식물에 의한 질병의 원인이다. 병원균 박테리아는 또한 감염, 예컨대 파상풍, 장티푸스열, 디프테리아, 매독 및 나병을 유발시킨다. 음식 또는 물이 오염되는 주요 경로 중 하나는 비처리 오수가 음료수 공급으로 또는 농경지로 방출되는 것이며, 그 결과 오염된 공급원을 섭취하거나 마신 사람은 감염된다. 개발 도상국에서, 대부분의 오수는 환경 또는 농경지로 폐기된다. 이는 콜레라, A형 간염, 소아마비 및 로타바이러스의 감염제에 대한 전형적인 전달 방식이다. 따라서, 실시양태에서, 프라이머 및 프로브는 하나 이상의 병원성 박테리아에 대해 특이적이다. 상기 키트는 인간 또는 수의학적 진단을 위해, 음식 또는 물을 시험하기 위해, 법의학적 적용을 위해, 또는 과학적 목적을 위해 사용될 수 있다.
도면 설명
도 1
도 1은 본 발명의 원리를 도시한다. 예를 들면 1열에 있는 프로브를 이용하여 수행한 반응은 모두 공통된 표지를 공유한다. 그러나, 프로브의 융점은 상이하다. 따라서, 상이한 융점을 이용하여 각각의 프로브를 확인하는 것이 가능하다. D열에 있는 프로브는 예를 들면 모두 동일한 융점을 갖지만, 표지는 상이하다. 따라서, 상이한 표지를 이용하여 각각의 프로브를 확인하는 것이 가능하다.
도 2
도 2는 분자 비콘 프로브의 원리를 도시한다. 분자 비콘은 예를 들면 진단 검정에서 앰플리콘 검출기 프로브로서 사용될 수 있다. 혼성화되지 않은 분자 비콘은 어두운 색이기 때문에, 검정 동안에 합성된 앰플리콘의 개수를 측정하기 위해 프로브-표적 하이브리드를 단리할 필요가 없다. 따라서, 이들은 본 발명에 이상적으로 적합하다. 유전자 증폭을 수행하기 전에 분자 비콘을 검정 혼합물에 첨가하고, 형광을 실시간으로 측정한다.
도 3
스콜피온 프로브와 관련하여, 서열-특이적 프라이밍 및 PCR 생성물 검출은 단일 올리고뉴클레오티드를 이용하여 달성된다. 스콜피온 프로브는 혼성화되지 않은 상태에서는 스템-루프 형태를 유지한다. 형광단이 5' 말단에 부착되고, 3' 말단에 커플링된 모이어티에 의해 켄칭된다. 스템의 3' 부분은 또한 프라이머의 연장 생성물에 상보적인 서열을 함유한다. 이 서열은 증폭 불가능한 단량체를 통해 특이적 프라이머의 5' 말단에 연결된다. 스콜피온 프라이머의 연장 이후, 특이적 프로브 서열은 연장된 앰플리콘 내에서 그의 상보체에 결합할 수 있으며, 따라서 헤어핀 루프를 개방시킬 수 있다. 이는 형광이 켄칭되는 것을 방지하고, 신호가 관찰된다.
도 4
도 4는 본 발명의 한 바람직한 실시양태를 도시한다. 여기서, 두 프로브는 각각의 표적 서열을 위한 반응에 존재한다. 표지, 예를 들면 인접한 탁맨 프로브에 의해 켄칭되는 형광 표지를 보유하는 제1 혼성화 프로브가 존재한다. 융점에 도달하면, 혼성화 프로브는 그가 결합된 가닥으로부터 해리된다. 이제 형광 표지는 더이상 켄칭되지 않고, 신호가 생성된다.
도 5
도 5는 본 발명의 한 바람직한 실시양태를 도시한다. 융점 mp1에서 형광 신호 FL 1은 반응에서 표적 서열 p1의 존재의 지표이다.
도 6
도 6은 주기에 걸쳐 그리고 PCR에 걸쳐 변화함에 따라 단일 이중-표지된 프로브를 이용한 형광 신호의 강도를 도시한다. 신호는 표적에 결합되었을 때 강하다. 이는 해리되었을 때 더 약하다. 또한, 반응의 말기로 향할수록 주형의 양이 증가하기 때문에 신호가 더욱 강해진다.
도 7
도 7은 본 발명의 작업흐름을 도시한다. 패널 A에서, 도 1에 이미 기재된 본 발명의 바람직한 실시양태가 도시된다. 예를 들면 1열에 있는 프로브를 이용하여 수행한 반응은 모두 공통된 표지를 공유한다. 그러나, 상기 패널 A에 나타낸 바와 같이 프로브의 융점은 약 60℃ 내지 약 80℃의 범위에서 약 5℃만큼 상이하다. 프로브 신호가 또한 실시간 PCR로 검출되는 경우, 약 60℃ (약은 약 +/- 10％ 편차를 의미함) 내지 약 80℃의 주어진 프로브 융점이 바람직한데, 이들 온도가 전형적인 PCR 매개변수에 매우 적합성이기 때문이다. 예를 들어, 표적 22가 샘플에 함유된다. 패널 B에서는, 표적 22 (흑색 원으로 표시함)가 샘플에 함유된 경우에 대해, 이러한 다중 검정에서의 실시간 PCR에 대한 결과를 표적 22에 대한 프로브 상에 함유된 표지를 검출하는 검출 채널에서 증가하는 증폭 플롯에 의해 개략적으로 분명히 도시한다. 실시간 PCR 데이타의 획득은 임의적인 단계이며, 본 발명의 방법을 수행하는데 필수적인 것은 아니다. 도 1C에서, 신호를 생성하는데 충분한 생성물이 존재하는 반응의 단계에서 멀티채널 용융 곡선 실험을 수행하였다. 바람직한 실시양태에서, 이는 반응의 평탄역 상에서 수행한다. 멀티채널 용융 곡선 분석을 수행함으로써, 상이한 융점을 이용하여 각각의 프로브를 확인하는 것이 가능하다. 예를 들면 D행에 있는 프로브는 모두 동일한 융점을 갖지만, 표지는 상이하다. 따라서, 상이한 표지를 이용하여 각각의 프로브를 확인하는 것이 가능하며, 이는 멀티채널 용융 곡선 분석이 본 발명의 중심 요소가 되게 한다. 도시된 용융 피크는 dF/dT 신호를 나타내며, 여기서 최대 피크는 각각의 프로브의 융점과 관련된 것이다.
도 8
도 8은 실시예 1로부터의 멀티채널 용융 곡선 분석의 결과를 도시한다. 표 9로부터의 주형 PCR 조건에 대해 수득한 4중 반응의 형광 용융 곡선을 도시한다. "녹색", "오렌지색" 및 "진홍색"으로 표시한 가로 패널은 표 5에서 구체화된 각각의 검출 채널에서 수득한 신호를 나타낸다. 가로 점선에 의해 분리된 데이타의 집합은 표 9로부터의 6가지 상이한 주형 PCR 조건에 대한 결과를 나타내며, 이는 예상된 검출 채널에서의 예상된 양성 용융 피크 신호 및 예상된 융점만을 명백히 도시하고, 양성 대조군 (내부 대조군)은 항상 신뢰할만하게 양성이다. 수득한 융점은 표 11에 요약되어 있다.
도 9
도 9는 실시예 2로부터의 PCR-후 용융 곡선 분석의 결과를 도시한다. 패널 A에서, 표 20으로부터의 실험 PCR 조건에 대해 수득한 반응을 위한 단일 반응의 형광 용융 피크 (df/dT)를 도시한다. 각각의 네 프로브에 대해 측정된 융점은 각각의 사진 아래에 도시되며, 표 21에 요약되어 있다. 패널 B에서, (좌측에서 우측으로) 첫번째 Ubi 및 HPRT에 대한 2중, 두번째 Ubi, HPRT 및 HSP에 대한 3중, 및 네번째 (흑색 프레임) Ubi, HPRT, HSP 및 Cmyc에 대한 4중 반응에 대한 형광 용융 피크 (df/dT) 를 도시한다. 각각의 네 프로브에 대해 측정된 융점은 각각의 사진 아래에 도시되며, 표 21에 요약되어 있다. 수득한 융점은 표 21에 요약되어 있다. 이들 데이타는, 동일한 표지를 보유하는 몇몇 프로브가 그들의 융점에 의해 확실히 구별될 수 있음을 명백히 증명한다.
<실시예>
실시예 1: 다중 실시간 PCR , 이어서 형광 표지된 프로브를 이용한 용융 곡선 분석을 위한 본 발명의 방법의 기술적 개념의 실시양태
이 실험에서, 도 7에 도시된 기술적 개념의 가능성이 증명될 것이다. 반응은 표 7에 나타낸 바와 같이 구성되었고, 4중으로 설정되었으며, 표 6에 나타낸 프로토콜을 수행하였다. 이 목적을 위해, 표 8의 시약을 사용하였다. 20x 프라이머 믹스 및 50x 프로브 믹스의 조성은 각각 표 2 및 3에 나타내었다. 프라이머 및 프로브의 서열은 표 1에 도시되어 있다. PCR에서 주형 핵산으로서, PCR 생성물을 인간 백혈구로부터의 cDNA, 및 표 1에 도시된 각각의 표적에 대한 각각의 전방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 생성하였고, PCR 생성물을 퀴아퀵(QiaQuick, 퀴아겐(Qiagen)) PCR 정제 키트를 이용하여 정제하고, 1:1000 희석률로 사용하였다. 주형을 표 9에 주어진 개별 반응에 첨가하였다. 첫번째 경우, 내부 양성 대조군으로 기능하는 "IC-단독", Ubi 주형만을 첨가하였다. 두번째 경우, Ubi IC 및 표적 1 Alb를 첨가하였다. 세번째 경우, Ubi IC 및 표적 2 Cmyc를 사용하였다. 네번째 경우, Ubi IC 및 표적 3 TBP를 도입하였다. 다섯번째 경우, Ubi IC 및 표적 4 GAP를 첨가하였다. 여섯번째 경우, Ubi IC 및 표적 5 SRY를 주형으로서 사용하였다.
실시간 PCR을 72 위치 로터를 구비한 로터진(RotorGene) 6000 PCR 시스템 (6-채널) 상에서 수행하였다. 6개의 검출 채널의 상세사항, 예컨대 각각의 채널에서 검출하기에 적합한 형광 염료의 예를 표 5에 나타내었다. PCR 사이클링 및 후속적인 용융 곡선에 대한 매개변수를 표 6에 나타내었다.
후속적으로, 작업 데이타를 적절한 기기 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 내부 대조군 (IC) 및 각각의 표적에 대한 실시간 PCR에서 관찰된 CT 값은 표 10에 제공하였다. 프로브의 융점 (도 8에 도시된 최대 용융 피크)을 측정하여, 결과를 표 11에 제공하였다. 4중 반응을 위한 6가지 상이한 실험 조건 (표 9)에 대해 관찰된 용융 피크를 도 8에 도시하였다. 모든 반응은 예상된 결과를 나타내었으며, 첨가된 표적을 검출하는 각각의 프로브에 대해 정확한 검출 채널에서 CT 값 및 예상된 융점을 가진 용융 피크를 나타내었다.
<표 1>
Figure pct00001
<표 2>
Figure pct00002
<표 3>
Figure pct00003
<표 4>
Figure pct00004
<표 5>
Figure pct00005
<표 6>
Figure pct00006
용융 곡선을 위한 소프르웨어 설정: 각각의 시험관에서 최적화를 달성한다. 소프트웨어는 하나의 검출 채널로부터의 용융 데이타만을 수집하며, 따라서 후속적인 세 용융 곡선은 먼저 녹색, 이어서 오렌지색, 이어서 진홍색 채널로부터 용융 데이타를 검출함으로써 작업하였다.
<표 7>
Figure pct00007
<표 8>
Figure pct00008
<표 9>
Figure pct00009
<표 10>
Figure pct00010
<표 11>
Figure pct00011
실시예 2: 다중 실시간 PCR , 이어서 FAM 검출 채널에서 검출되는 구별가능한 융점 ( T m )을 갖는 상이한 프로브에 대한 용융 곡선 분석을 위한 본 발명의 방법의 기술적 개념의 실현.
이 실험에서, 동일한 검출 채널에서 동일한 표지를 보유하는 몇몇 프로브를 구별하는 능력이 증명된다. 반응은 표 18에 나타낸 바와 같이 구성되었고, 표 17에 나타낸 프로토콜을 수행하였다. 이 목적을 위해, 표 18 및 19의 시약을 사용하였다. 20x 프라이머 믹스 및 10 μM 프로브 믹스의 조성은 각각 표 13 및 14에 나타내었다. 프라이머 및 프로브의 서열은 표 12에 도시되어 있다. 주형으로서, 10ng/RxN cDNA는 인간 백혈구로부터의 RNA, 및 표 12에 도시된 각각의 표적에 대한 각각의 전방향 (for) 및 역방향 (rev) 프라이머로부터 생성되었다. 각각의 네 표적을 위한 단일 반응, 2중 및 3중 및 4중 반응을 제조하고 분석하였다. 7가지 상이한 조건 및 예상된 결과를 표 20에 나타내었다.
실시간 PCR을 72 위치 로터를 구비한 로터진 6000 PCR 시스템 (6-채널) 상에서 수행하였다. 6개의 검출 채널에 대한 상세사항, 예컨대 각각의 채널에서 검출되기에 적합한 형광 염료의 예를 표 16에 나타내었다. PCR 사이클링 및 후속적인 용융 곡선을 위한 매개변수를 표 17에 나타내었다.
후속적으로, 작업 데이타를 적절한 기기 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 프로브의 융점 (도 9에 도시된 최대 용융 피크)을 측정하였고, 결과를 표 21에 제공하였다.
<표 12>
Figure pct00012
<표 13>
Figure pct00013
<표 14>
Figure pct00014
<표 15>
Figure pct00015
<표 16>
Figure pct00016
<표 17>
Figure pct00017
용융 곡선을 위한 소프트웨어 설정: 각각의 시험관에서 최적화를 달성한다. 소프트웨어는 하나의 검출 채널로부터의 용융 데이타만을 수집한다.
<표 18>
Figure pct00018
<표 19>
Figure pct00019
<표 20>
Figure pct00020
<표 21>
Figure pct00021
SEQUENCE LISTING <110> QIAGEN GmbH Qiagen Hamburg GmbH <120> Simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction <130> P1325 PCT BLN <160> 24 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 1 ttccacccat ggcaaat 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 2 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 3 caagcttccc gttctcagcc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 4 tcctcaaaag aaaccgtgca t 21 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 5 agattaatgg ttgctaagga ctggat 26 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 6 caccagcagt aactccccac aacctcttt 29 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 7 tgccctgtgc agaagactat cta 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 8 cgagctcaac aagtgcagtt 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 9 aagtgacaga gtcaccaa 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 10 tcaagaggtg ccacgtctcc 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 11 tcttggcagc aggatagtcc tt 22 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 12 cagcacaact acgcagcgcc tcc 23 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 13 gttaagctgg ctgtcctgaa atatt 25 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 14 ccccagcacc acattcatc 19 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 15 tagtcgcctt cgtcgag 17 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 16 tggaacccac agtcattgat ga 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 17 tgatctcctt gccaatggtg ta 22 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 18 agatgctgcc aataactatg cccgagg 27 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 19 ctcaacttta actggaaaga atgtc 25 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 20 tccttttcac cagcaagct 19 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer and probe <400> 21 ttgctttcct tggtcaggca gtataatc 28 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 22 caagtctggg accaaagcgt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe/primer <400> 23 aaaaccaaca ccgaactggc 20 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer/probe <400> 24 catggaagct ttgcaggctg gtgcaga 27

Claims (14)

  1. (i) 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    (ii) 증폭 반응을 수행하기 위해 4개 이상의 프로브를 포함하는 시약을 제공하며, 여기서,
    a. 각각의 프로브는 핵산 서열에 대해 특이적이고;
    b. 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유하며;
    c. 동일한 표지를 보유하는 각각의 프로브는, 가열에 의해 그들의 표적 핵산 서열로부터 해리될 때, 동일한 표지를 가진 다른 프로브와 2℃ 초과만큼 차이나는 융점 (Tm)을 갖는 것인 단계;
    (iii) 상기 반응에서 핵산 서열을 증폭시키는 단계;
    (iv) 표지된 프로브가 그의 핵산 서열과 결합하였는지 여부를 측정함으로써 증폭된 핵산을 검출하는 단계; 및
    (v) 각각의 주어진 표지된 프로브가 그가 결합된 핵산 서열로부터 해리되는 온도를 검출하는 단계
    를 포함하는, 반응에서 핵산 서열을 동시에 증폭시키고 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브의 표지가 형광 표지인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응이 폴리머라제 연쇄 반응 증폭인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브가 탁맨(TaqMan) 프로브, 분자 비콘 프로브, 스콜피온 프로브 및 라이트 사이클러 프로브, 혼성화 프로브 및 변위 프로브의 군으로부터 선택된 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응이 이중 가닥 핵산 특이적 염료를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 특이적 염료가 상기 프로브 표지와 스펙트럼적으로 구별가능한 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 특이적 염료가 SYBR® 그린 I, SYBR® 골드, 에티듐 브로마이드, 프로피듐 브로마이드, 피코 그린(Pico Green), 훽스트(Hoechst) 33258, YO-PRO-I 및 YO-YO-I, 복스토(Boxto), 에바그린(Evagreen), LC 그린, LC 그린 플러스 및 사이토(Syto) 9의 군으로부터 선택된 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지가 형광 표지이고, 상기 표지가 FAM (5- 또는 6-카르복시플루오레세인), VIC, NED, 플루오레세인, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, 오레곤 그린(Oregon Green), 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 야키마 옐로우(Yakima Yellow), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) PET, 바이오서치 블루(Biosearch Blue™), 마리나 블루(Marina Blue®), 보텔 블루(Bothell Blue®), 알렉사 플루오르®, 350 FAM™, SYBR® 그린 1, 플루오레세인, 에바그린™, 알렉사 플루오르® 488 JOE™, VIC™, HEX™, TET™, 칼 플루오르(CAL Fluor®) 골드 540, 야키마 옐로우®, ROX™, 칼 플루오르® 레드 610, Cy3.5™, 텍사스 레드®, 알렉사 플루오르®, 568 Cy5™, 쿠아사르(Quasar™) 670, 라이트사이클러 레드640 (LightCycler Red640®), 알렉사 플루오르 633 쿠아사르™ 705, 라이트사이클러 레드705®, 알렉사 플루오르® 680, 사이토®9, LC 그린®, LC 그린® 플러스+, 에바그린™의 군으로부터 선택된 것인 방법.
  9. 제3항에 있어서,
    a. 상기 표지된 프로브가 혼성화 프로브 및 탁맨 프로브로 이루어진 군이고,
    b. 상기 탁맨 프로브가 상기 표지를 보유하고,
    c. 상기 표지가 형광 표지이고,
    d. 상기 탁맨 프로브가 켄처를 추가로 포함하고,
    e. 임의로 상기 혼성화 프로브가 탁맨 프로브에 부착된 표지의 형광을 켄칭시킬 수 있는 추가의 켄처를 보유하고,
    f. 상기 탁맨 프로브 및 상기 혼성화 프로브 둘 다 그들 각각의 서열에 결합하는 방식으로 상기 두 프로브가 상기 핵산 서열과 결합할 수 있고, 혼성화 프로브 상에 존재하는 켄처가 적어도 부분적으로 상기 탁맨 프로브 상의 상기 표지의 형광을 켄칭시키는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 동일한 표지를 가진 상기 프로브가 융점 (Tm)이 2℃ 이상 만큼 차이나는 혼성화 프로브를 가진 군을 형성하는 것인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 혼성화 프로브의 융점 (Tm)이 탁맨 프로브의 융점 (Tm)보다 낮은 것인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성화 프로브가 폴리머라제가 그의 최적 활성을 나타내는 온도보다 낮은 융점 (Tm)을 갖는 것인 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머라제가 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 것인 방법.
  14. 엄격한 조건하에 하나 이상의 핵산 분자에 혼성화할 수 있는 4개 이상의 프로브를 포함하며, 여기서,
    a. 각각의 프로브는 핵산 서열에 대해 특이적이고;
    b. 2개 이상의 프로브는 동일한 표지를 보유하며;
    c. 동일한 표지를 보유하는 각각의 프로브는, 가열에 의해 그들의 표적 핵산 서열로부터 해리될 때, 동일한 표지를 가진 다른 프로브와 2℃ 초과만큼 차이나는 융점 (Tm)을 갖는 것인, 키트.
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