CN101586156A - 用于寡核苷酸微阵列的定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于寡核苷酸微阵列的定量方法。具体地说，本发明提供了能够实时、同时量化测量来源于样品中一种或多种病原体的多种核酸的方法和设备。通过与已预先确定的二维模式排列并束缚在基质表面的靶核酸探针和内部核酸对照探针杂交将靶核酸和内部核酸对照的荧光标记的扩增子定位到基质表面。这些杂交的扩增子可以通过应用合适波长光的衰逝波激发它们的荧光标签得以检测。通过测量在基质表面不同位置上的荧光强度，可以确定每一个靶核酸和内部核酸对照的杂交扩增子的丰度。

Description

用于寡核苷酸微阵列的定量方法

发明领域

本发明涉及核酸定量测量的系统和方法，尤其是涉及实时、同时定量分析来自一种或多种病原体的多种核酸的系统和方法。

发明背景

核酸的定量分析在基础生物学研究和诸如临床微生物领域中非常重要。定量分析典型地在两个阶段完成。首先将样品中的靶核酸扩增以产生可检测量的核酸供定量工具应用。将检测到的靶核酸的量用于计算最初存在于样品中的核酸量。

聚合酶链式反应(PCR)是扩增核酸，尤其是脱氧核糖核酸(DNA)的有力方法。实践PCR的关键是应用耐热的DNA聚合酶，即能够催化DNA复制且在用于将DNA螺旋分离为两条核酸单链的升高温度下不会变性的蛋白。

通过将靶标双链DNA置于提供有与靶标DNA互补的小序列单链DNA(称为引物)和耐热DNA聚合酶的核苷酸缓冲液中启动PCR。通过将混合物的温度循环通过三个阶段，能够指数地扩增靶标DNA。第一阶段是高温(94℃)变性阶段，其中将双链DNA分离为两条单链。第二阶段是低温(60℃)退火阶段，其中引物结合至单链DNA。最后，延伸阶段发生在中间温度(72-78℃)。在延伸阶段，DNA聚合酶催化退火至靶标DNA的引物地延伸，添加合适的核苷酸直到形成完整的双链DNA螺旋。在每一个PCR循环中，靶标DNA的拷贝数大约翻番了，使得靶标DNA快速积累。

原则上，在PCR循环系列终点所产生的靶标DNA的量(也称为“终产物”)与在最初样品中靶标DNA的拷贝数成比例。然而，实际上，扩增的指数性质、启始扩增的引物退火的细微差别导致了饱和及其它影响，使得PCR终产物是最初样品中靶标DNA量的非常不可靠的估计。

在90年代中期发展了实时聚合酶链式反应(实时PCR)方法，以改进最初的PCR方法，避免了这些困难，提供了样品中任意靶标DNA拷贝数的可靠、精确的测量。在实时PCR中，将只有当结合至靶标DNA才会有活性的荧光探针加入到PCR缓冲溶液中。这些荧光探针是单链DNA，其中间部分具有与靶标DNA互补的核苷酸序列。在这一中间部分的任一侧是与彼此互补的延伸核苷酸序列，因此，没有结合的探针将自己折叠为发夹结构。荧光探针在一端具有荧光分子，以及在另一端具有荧光淬灭分子。未结合的，折叠的探针具有彼此相邻的发荧光和淬灭分子，并且因此当照射未结合的探针时不会发射出荧光。然而，当荧光探针结合至其靶标DNA时，其是展开的，发荧光和淬灭分子彼此分离。当用合适波长的光照射结合的探针时，荧光分子发射出荧光。

通过为特定靶标DNA提供足够的荧光探针，并且在PCR的每一个阶段测量来自结合探针的荧光，可以测量每一个反应阶段扩增子的数量。这一方法可以用于非常精确地确定最初样品中DNA的拷贝数，因为使扩增子数目达到预先确定的阈值的部分循环数与最初样本中拷贝数的对数之间是线性关系。

这样，可以用实时PCR来确定样品中靶标DNA的量，在超过9个数量级的范围具有少于2％的误差，即其可以计数最初样本中少至5，以及多达50亿条靶标DNA拷贝。

然而，实时PCR技术具有局限性，其最显著的是实时PCR只能在一个反应管中测量小数量的核酸，因为具有合适的相应荧光发射光源的合适的荧光染料数量是有限的。

对于许多应用来说，同时量化一种以上种类的核酸是非常期望的。需要的是允许用实时PCR应用小数量的荧光染料，以及优选只用一种荧光染料同时量化来自不同病原体的数百种不同的核酸的装置和方法。

发明概述

本发明提供了同时量化测量来源于样品中一种或多种病原体的多种核酸的方法和设备。

在一个示范性实施方案中，用聚合酶链式反应(PCR)、逆转录PCR、滚动循环复制或T7转录线性扩增在单个反应孔中扩增所有的样品中的核酸和一种或多种内部核酸对照，其中扩增缓冲溶液附加含有荧光标记的核苷酸或，优选地荧光标记的引物，因此靶核酸和内部核酸对照的扩增子本身是荧光标记的。典型地，一种或多种内部核酸对照以不同的拷贝数量和不同的浓度存在，例如，内部核酸对照A以低浓度存在，以及内部核酸对照B以高浓度存在。低浓度的内部核酸对照和高浓度的另一个内部核酸对照的存在扩大了方法的检测范围。此外，从低至中等至高的不同浓度的两个以上(例如，三、四、五等)内部核酸对照的存在可以允许在很宽的浓度范围中的非常精确的检测。

在扩增程序的退火或延伸阶段过程中，通过与已以预先确定的二维模式排列并束缚在基质表面的靶核酸探针和内部核酸对照探针杂交将靶核酸或内部核酸对照的荧光标记的扩增子定位到基质表面。靶核酸探针和内部核酸对照探针分别具有与靶核酸和内部核酸对照相同的互补的核苷酸序列，并且可以通过应用商业可获得的微阵列技术的自动印刷排列。

当它们的荧光标签通过合适波长光的衰逝波激发时，可以通过发射的荧光检测杂交的荧光标记的靶扩增子。由于当其进入反应孔中时衰逝波指数衰退，具有大约100-300nm的有效范围，其只能穿过足够远进入反应孔中以激活非常靠近基质表面的荧光标签，即与束缚至表面的靶核酸探针和内部核酸对照探针杂交的荧光标记的靶扩增子。因此，衰逝波不会激活在反应孔剩余物中的荧光标记的核苷酸。

通过监测在基质表面不同位置上的荧光强度，可以确定每一个靶核酸和内部核酸对照的杂交扩增子的当前丰度。这可以在PCR反应过程中实时完成，并且可以用实时PCR分析技术得到在最初样品中每一个靶核酸和内部核酸对照丰度的精确量化测量。

在一个实施方案中，用于分析靶核酸的定量方法包括将一种或多种荧光标记的靶扩增子退火至两种或多种靶核酸探针；将一种或多种荧光标记的内部对照扩增子退火至一种或多种内部核酸对照探针；激活来自杂交至两种或多种靶核酸探针的一种或多种荧光标记的靶扩增子的第一荧光应答；激活来自杂交至一种或多种内部核酸对照探针的一种或多种荧光标记的内部对照扩增子的第二荧光应答；检测第一和第二荧光应答，用于定量分析一种或多种靶核酸和一种或多种内部核酸对照，其中两种或多种靶核酸探针和一种或多种内部核酸对照探针非常接近基质的上表面，以及其中通过应用预先确定波长的衰逝波激活第一和第二荧光应答。

在另一实施方案中，退火发生在聚合酶链式反应过程中。在再另一个实施方案中，第一和第二荧光应答的检测发生在聚合酶链式反应的退火步骤或延伸步骤过程中。

在一个实施方案中，应用微阵列印刷机将两种或多种靶核酸探针和一种或多种内部核酸对照探针印在基质上，并将其固定在基质的表面。在另一个实施方案中，用选自硅烷、抗生物素蛋白、聚-L-赖氨酸、抗生蛋白链菌素、多糖、硫醇或其组合的试剂化学修饰基质。在再另一个实施方案中，聚合酶链式反应是实时聚合酶链式反应。

在一个实施方案中，一种或多种内部核酸对照是线性双链脱氧核糖核酸、环状双链脱氧核糖核酸或其组合。在另一实施方案中，一种或多种内部核酸对照具有与两个或多个靶核酸相同的引物结合区域。

在再另一个实施方案中，退火至一种或多种内部核酸对照探针的荧光标记的扩增子的序列长度小于退火至两种或多种靶核酸的荧光标记的扩增子序列长度的约百分之一千、优选小于约百分之五百，以及更有选小于约百分之两百。

在一个实施方案中，一种或多种内部核酸对照序列具有约百分之二十以下，优选约百分之十以下，以及最优选约百分之五以下的交叉反应。在另一个实施方案中，如果存在两种或多种内部核酸对照，两种或多种内部核酸对照以不同的浓度存在。在再另一个实施方案中，如果存在两种或多种内部核酸对照探针，两种或多种内部核酸对照探针以与两种或多种靶核酸探针相同的浓度存在。

在一个实施方案中，两种或多种内部核酸对照具有约百分之二十以下，优选约百分之十以下，以及最优选约百分之五以下的与两种或多种靶核酸的交叉反应。在另一个实施方案中，在达到杂交平顶之前检测第一和第二荧光应答。在再另一个实施方案中，两种或多种靶核酸衍生自一种或多种病原体，其中一种或多种病原体是病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒(prion)、寄生生物或其组合。

在一个实施方案中，一种或多种病原体是立克次氏体(Rickellsia)、衣原体(Chlamydia)、枝原体(Mycoplasma)、螺旋体(Spirochete)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、单核细胞增多性李司忒菌(L.monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitides)、大肠杆菌(E.coli)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、钩端螺旋体(Leptospira)、变形杆菌(proteus)、厌氧杆菌(Anaerobacter)、沙门氏菌(Salmonella)、结核分支杆菌(M.tuberculosis)、肠球菌(Enterococcus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、肠病毒(Enterovirus)、柯萨基病毒(Coxsackievirus)、HSV-1、HSV-2或其组合。在另一实施方案中，两种或多种靶核酸探针选自SEQ ID NO：13-52。在再另一实施方案中，靶核酸是大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(Salmonella)，以及两种或多种靶核酸探针选自SEQ IDNO：14-17和22-26。

在另一个实施方案中，一种或多种病原体包含在组织、细胞、血液、血清、脑脊髓液、尿、细胞裂解物、血浆、排泄物、唾液、血细胞、细针活检样品、腹膜液、胸膜液或其组合中。

在一个实施方案中，方法还包括为两种或多种靶核酸的每一种和为一种或多种内部核酸对照的每一种建立系列标准品扩增曲线，其中每一标准品扩增曲线是剂量效应曲线，其中剂量是扩增循环的数量，效应是杂交信号。在另一个实施方案中，方法还包括通过减去一种或多种内部核酸对照的检测浓度和一种或多种内部核酸对照的预先确定浓度的差异校正两种或多种靶核酸的每一种的检测浓度。

本发明提供了分析靶核酸的定量方法，包括将一种或多种荧光标记的靶扩增子退火至两种或多种靶核酸探针；将一种或多种荧光标记的内部对照扩增子退火至一种或多种内部核酸对照探针；激活来自杂交至两种或多种靶核酸探针的一种或多种荧光标记的靶扩增子的第一荧光应答；激活来自杂交至一种或多种内部核酸对照探针的一种或多种荧光标记的内部对照扩增子的第二荧光应答；以及检测第一和第二荧光应答，用于定量分析一种或多种靶核酸和一种或多种内部核酸对照，其中两种或多种靶核酸探针和一种或多种内部核酸对照探针非常接近基质的上表面，以及其中通过应用预先确定波长的衰逝波激活第一和第二荧光应答；为两种或多种靶核酸的每一种和为一种或多种内部核酸对照的每一种建立系列标准品扩增曲线，其中每一标准品扩增曲线是剂量效应曲线，其中剂量是扩增循环的数量，效应是杂交信号；通过减去一种或多种内部核酸对照的检测浓度和一种或多种内部核酸对照的预先确定浓度的差异校正两种或多种靶核酸的每一种的检测浓度。

本发明也提供了用于定量分析靶核酸的装置，包括：具有上和底表的基质，且其折射率大于水的折射率；基本上与基质上表面接触的缓冲溶液，缓冲溶液能够维持扩增反应和核苷酸杂交反应并含有一种或多种荧光标记的引物、一种或多种任选地荧光标记的dNTPs、两种或多种靶核酸、以及一种或多种内部核酸对照；非常接近于基质上表面并在缓冲液溶液内部的两种或多种靶核酸探针，该两种或多种靶核酸探针具有与两种或多种靶核酸的核苷酸序列对应或互补的核苷酸序列；非常接近于基质上表面并在缓冲液溶液内部的一种或多种内部核酸对照探针，该一种或多种内部核酸对照探针具有与一种或多种内部核酸的核苷酸序列对应或互补的核苷酸序列；光线，其具有选择以激活一种或多种荧光标记的靶扩增子以及一种或多种荧光标记的内对照扩增子的波长，以所选择的角度在基质和缓冲溶液的界面入射，从而使衰逝波传播进入缓冲溶液；能够检测由一种或多种荧光标记的靶扩增子和一种或多种荧光标记的靶内部对照扩增子发射的荧光的检测器。

在另一实施方案中，设备还包含能够循环缓冲溶液温度的加热元件，因此能够进行扩增反应。在再另一个实施方案中，扩增反应是实时聚合物链式反应。

通过参考以下附图将能更完全地理解这些和其它特征。

附图简述

通过以下的说明书和解释实施方案的附图将更好的理解发明的实施方案。在附图中：

图1阐明了能够在PCR过程最初阶段衰逝波检测微阵列PCR反应中荧光标记的扩增子的示范性设备的横面图；

图2阐明了能够在PCR过程退火和延伸阶段的终点衰逝波检测微阵列PCR反应中荧光标记的扩增子的示范性设备的横面图；

图3阐明了能够在PCR过程变性阶段衰逝波检测微阵列PCR反应中荧光标记的扩增子的示范性设备的横面图；

图4阐明了显示在PCR过程检测阶段衰逝波检测微阵列PCR反应中荧光标记扩增子的示范性设备的横面图；

图5阐明了荧光密度对PCR循环的示范性标绘图；

图6是在最初样品中靶核酸链拷贝数的对数(log[N])对靶核酸阈循环(CT)的示范性标绘图；

图7是循环数(X轴)对内部扩增子数(Y轴)的示范性标绘图。

图8显示含有5’端用荧光分子标记的引物的扩增子。

图9显示含有5’端用荧光分子标记的引物的扩增子。

定义

本文所使用的某些术语具有以下含义。所有在本说明书中使用的其它术语或短语具有本领域技术人员所理解的它们的通常含义。此类通常含义可以通过参考科技词典，诸如Hawley’s Condensed Chemical Dictionary第11版，Sax和Lewis，Van Nostrand Reinhold，New York，N.Y.，1987，以及The Merck Index，第11版，Merck&Co.Rahway N.J.1989而获得。

本文所使用的术语“和/或”是指与这一术语相联系的项目的任一项、项目的任意组合，或所有项目。

本文所使用的单数形式“一”(“a”、“an”和“the”)包括复数关系，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种制剂”包括此类制剂的复数，因此化合物X的制剂包括化合物X制剂的复数形式。

本文所使用的术语“约”是指特定值百分之十的偏差，例如，约50％包含从45％至55％的变化。对于整数范围，术语约可以包括比所述整数大和小的一个或两个整数。

本文所使用的术语“周围条件”是指周围环境的条件(例如，实验在其中发生的室内或室外环境的温度)。

本文所使用的术语“扩增子”是指聚合物链式反应(PCR)的产物。扩增子是用扩增技术合成的DNA片段(例如，带有两条引物的双链DNA)。扩增子例如可以含有5’端用荧光分子标记的引物，如图9的方案1所示。

本文所使用的术语“水性的”是指在其它成分以外含有水的液体混合物。

本文所使用的“阵列(array)”和“组成图案的阵列”是指元件(即实体)在材料或装置上的排列。在另一意义上，术语“阵列”是指在基质上的两个或多个检测区域的整齐排列(例如，行和列)。

本文所使用的术语“细菌”(bacteria)和“细菌”(bacterium)是指所有的原核生物，包括在原核生物界中所有门之内的那些。该术语意图包含所有被认为是细菌的微生物，包括支原体、衣原体、放线菌、链霉菌和立克次氏体。所有的细菌形式都包括在这一定义之内，包括球菌、杆菌、螺旋体、球形体、原生质体等。这一术语也包括革兰氏阴性和革兰氏阳性的原核生物。“革兰氏阴性”和“革兰氏阳性”是指用本领域公知的革兰氏染色方法的染色样式。“革兰氏阳性细菌”是保留了在革兰氏染色中所使用的初级染料，使得染色的细胞在显微镜下显示出暗蓝色至紫色的细菌。“革兰氏阴性细菌”不保留在革兰氏染色中所使用的初级染料，而是通过复染染色。因此，革兰氏阴性细菌显示出红色。

本文所使用的术语“生物学惰性的”是指材料的性质，该材料不会与生物材料发生化学反应。

本文所使用的术语“互补的”或“互补”是指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸(即，核酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补可以是“部分地”，其中只有一部分核酸的碱基是根据碱基配对规则匹配的。或者，在核酸之间可以存在“完全”或“全部的”互补。核酸链之间的互补度对核酸链之间的杂交效率和强度有显著的影响。

本文所使用的术语“临界角”是指入射角，高于这一角度时发生完全的内反射。

本文所使用的术语“诊断的”是指通过其信号和症状(例如，对常规治疗的耐性)、或基因分析、病例分析、组织分析等对疾病的识别。

本文所使用的术语“疾病”是指病理学或有害状态，诸如感染、炎症反应、癌、自身免疫以及基因疾病。

本文所使用的术语“衰逝(evanescent)”是指表现出随距离指数衰减的近场驻波。在光学中使用时，当正弦波以大于临界角的角度在界面进行内部反射并因此发生完全内部反射时，即形成了衰逝波。

本文所使用的术语“真菌”是指诸如霉菌和酵母的真核生物。

本文所使用的术语“同源”是指互补度。可以有部分同源或完全同源(即同一的)。部分互补序列是指至少部分地抑制完全互补序列与靶序列杂交的序列，用功能术语“基本同源”描述。对完全互补序列与靶序列杂交的抑制可以应用在低严格度条件下的杂交分析(DNA或RNA印迹，溶液杂交等)来检验。基本同源序列或探针在低严格度条件下会竞争或抑制完全同源序列与靶序列的结合(即，杂交)。这不是说低严格度条件是允许非特性结合的；低严格度条件需要两条序列相互的结合是特异(即，选择性的)相互作用。可以用甚至缺乏部分互补度(即30％同一性以下)的第二靶来测试没有非特异性结合；没有非特异性结合的情况下，探针将不会与第二非互补靶杂交。本领域技术人员公知可以应用许多等效的条件以包含低严格度条件；诸如探针长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液或固定的等)以及盐浓度和其它成分(存在或不存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)等因素是要考虑的，并且杂交溶液可以不同以产生与上面所列条件将不同但等效的低严格杂交条件。此外，本领域技术人员已知在高严格条件下(例如，增加杂交和/或洗涤步骤的温度，在杂交溶液中应用甲酰胺等)(参见以下“严格度”的定义)促进杂交的条件。

当提及双链核酸序列，诸如cDNA或基因组克隆时使用的术语“基本上同源的”是指能在如上面所述的低严格条件下与双链核酸序列的任意链或两条链杂交的任意探针。

当提及单链核酸序列时用的术语“基本上同源的”是指能在如上面所述的低严格条件下与单链链核酸序列杂交的任意探针(即，它是单链核酸序列的互补)。

本文所使用的术语“杂交”是指互补核酸的配对。杂交和杂交的强度(即，核酸之间联系的强度)受到此类因素的影响：如核酸之间的互补度、所涉及条件的严格度、形成的杂交体的解链温度(T_m)、以及核酸中的G∶C比值。在其结构内含有互补核酸配对的单链分子称为“自杂交的”。

本文所使用的术语“固定”是指材料与另一实体(例如，固相支持物)的化学或其他连接或截留，其限制了材料的运动。

本文所所用的术语“抑制剂”是指妨碍或阻止化学反应的物质、样品或底物。

本文所使用的术语“反应工具(means)抑制剂”是指能够妨碍或阻止给定反应工具(例如，酶)的作用或活性的抑制剂。

本文所使用的术语“内部核酸对照”是指以已知浓度加入到样品中的多核苷酸。

本文所使用的术语“内部核酸对照探针”是指与内部核酸对照互补的多核苷酸。

本文所使用的术语“体外”是指人工环境，以及指在人工环境中发生的过程或反应。体外环境包括但不限于试管和细胞培养物。

本文所使用的术语“体内”是指自然环境(例如，动物和细胞)，以及指发生在自然环境中的过程或反应。

本文所使用的术语“分离物”是指从含所述核酸与至少一种其他成分的核酸自然来源中分离出来的核酸。在一个实施方案中，核酸在只有溶剂、缓冲液、离子或正常存在于溶液中的其它组分存在(如果有的话)的情况下存在。术语“分离的”和“纯化的”不包含在它们自然来源中存在的核酸。

本文所使用的术语“材料”(material)和“材料”(materials)在最广泛的意义上是指物质的任何成分。

本文所使用的术语“硫醇”是指硫醇类(即RSH)化合物。

本文所使用的术语“微阵列”是指在固相支持物表面上形成的离散区域的线性或二维微阵列，每一个离散区域都具有清晰的区域。将与靶核酸序列或其子序列互补的寡核苷酸探针用下述的展示策略固定在固相支持物上。本发明的方法应用了包含显示出与一种或多种靶核酸序列互补的靶核酸探针的寡核苷酸微阵列。典型地，这些靶核酸探针是DNA并以高密度微阵列(即，“DNA芯片”)固定在固相表面。

本文所使用的术语“微生物”是指微生物的任何物种或类别，包括但不限于细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体和寄生生物。本发明认为其中所包括的大量微生物也是对受试者致病的。

本文所使用的术语“核酸分子”是指任何含有核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。术语包含例如包括DNA或RNA的任何已知碱基类似物的序列，所述碱基类似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、乙烯亚氨基胞嘧啶、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二羟基尿嘧啶、次黄嘌呤核苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤核苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、βD-甘露糖基Q核苷(queosine)、5’-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。

本文所使用的术语“寡核苷酸”是指短长度的单链多核苷酸链。寡核苷酸典型地是100个残基长度以下(例如，15至50)，然而，在本文中使用时，该术语也包括更长的多核苷酸链。寡核苷酸通常通过它们的长度提及。例如，24个残基的寡核苷酸称为“24-基体”。寡核苷酸可以通过自杂交或通过与其它多核苷酸杂交形成二级或三级结构。此类结构可以包括但不限于双螺旋、发夹、十字形、弯曲或三体。

本文所使用的术语“有机溶剂”是指能够溶解其它物质的任何有机分子。示例包括但不限于氯仿、醇、酚、醚或其组合。

本文所使用的术语“病原体”是指在宿主中引起疾病状态(例如，感染、癌等)的生物剂。病原体例如包括病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。特定的病原体可以包括例如立克次氏体(Rickellsia)、衣原体(Chlamydia)、枝原体(Mycoplasma)、螺旋体(Spirochete)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、单核细胞增多性李司忒菌(L.monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitides)、大肠杆菌(E.coli)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、钩端螺旋体(Leptospira)、变形杆菌(proteus)、厌氧杆菌(Anaerobacter)、结核分支杆菌(M.tuberculosis)、肠球菌(Enterococcus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、肠病毒(Enterovirus)、柯萨基病毒(Coxsackievirus)、HSV-1、HSV-2。

本文所使用的术语“聚合酶链式反应”(PCR)是指K.B.Mullis美国专利号4,683,195、4,683,202和4,695,188中的方法，其描述了在没有克隆或纯化的基因组DNA混合物中增加靶序列片段浓度的方法。这一用于扩增靶序列的方法包括将大量过量的两条寡核苷酸引物加入到含有期望靶序列的DNA混合物中，随后在有DNA聚合酶存在的情况下进行精确的序列热循环反应。两条引物与双链靶序列分别的链互补。为产生扩增，将混合物变性，并将引物退火至在靶分子中的它们的互补序列。退火后，用聚合酶延伸引物，因此形成了新的一对互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸步骤可以重复很多次(即，变性、引物退火和延伸组成一个“循环”，可有很多“循环”)以得到高浓度的期望靶序列的扩增片段。期望靶序列扩增片段的长度由引物相互之间的相对位置确定，并且因此这一长度是可控制的参数。由于这一方法的重复方面的有点，这一方法被称为“聚合酶链式反应”(此后称为“PCR”)。由于靶序列的期望扩增片段变成为混合物中的主要序列(就浓度而言)，因此将它们称为“PCR扩增的”。

用PCR可以将基因组DNA中单拷贝的特定靶序列扩增至可以通过数种不同方法(例如，与标记的探针杂交；掺入生物素标记的引物，随后通过抗生物素蛋白-酶缀合检测；将³²P标记的脱氧核苷酸三磷酸，诸如dCTP或dATP掺入到扩增片段中)检测得到的水平。除了基因组DNA之外，用合适的引物分子组还可以扩增任意的寡核苷酸或多核苷酸序列。特别地，通过PCR过程产生的扩增片段本身是随后PCR扩增的高效模板。

本文所使用的术语“PCR产物”、“PCR片段”和“扩增产物”是指在完成两个或多个变性、退火和延伸步骤的PCR循环后化合物的结果混合物。这一术语包括这样的情况，即扩增了两个或多个靶序列的一个或多个片段。

本文所使用的术语“多糖”是指能通过水解分解为两个或多个单糖分子的碳水化合物。

本文所使用的术语“优选”和“优选地”是指在某些情况下可以产生某些益处的本发明的实施方案。然而，其它实施方案在相同的或其它情况下也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的详述不是暗示其它的实施方案没有用处，也并非意图将其它实施方案从本发明的范围内排除。

本文所使用的术语“纯化的”或“基本上纯化的”意思是所述材料基本上没有其它生物大分子(例如，多核苷酸、蛋白、碳水化合物等)存在。

本文使用的术语“反应”是指其中物质(例如，分子、膜和分子集合)与其它物质结合、与其它物质交换组成、分解、重排或其它化学改变的任何变化或转变。

本文所使用的术语“室温”在技术上是指约20至25℃的温度。然而，通常它是指在其中进行实验的一般区域内的周围温度。

本文所使用的术语“样品”以其最广的意义使用。怀疑指示特征是凋亡功能失调的病症的样品可以包括细胞、组织、或液体、从细胞中分离的染色体(例如，延伸的分裂中期染色体)、基因组DNA(在溶液中，或结合至固相支持物上诸如用于DNA印迹分析)、RNA(在溶液中，或结合至固相支持物上诸如用于RNA印迹分析)、cDNA(在溶液中或结合至固相支持物上)等。怀疑含有蛋白的样品可以包括细胞、部分组织、含有一种或多种蛋白的提取物等。

本文所使用的术语“抗生蛋白链菌素”是指从细菌Streptomyces avidinii中纯化的60,000道尔顿的四聚体蛋白。

本文所使用的术语“固相支持物”或“固体支持物”以它们最广的意义使用，是指本领域技术人员可获得并公知的许多支持物。固相支持物包括但不限于硅胶、树脂、衍生的塑料膜、玻璃珠、棉、塑料珠、铝胶等。

本文所使用的术语“光谱”是指以波长的顺序排列的光能量的分布。

本文所使用的术语“稳定性”是指材料抵抗变质或移位以及提供可靠性和可依赖性的能力。

本文所使用的术语“严格度”是指在其中进行核酸杂交的温度、离子强度和其它化合物(诸如有机溶剂)存在的条件。在“高严格度”条件下，核酸碱基配对将只发生在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间。因此，“弱”或“低”严格度通常用于衍生自遗传上不同的生物的核酸，因为互补序列的频率通常很小。

本文所使用的术语“受试者”是指待用本发明的方法处理的生物。此类生物优选包括但不限于哺乳动物(诸如，鼠科、猿、马、牛、猪、猫等)，以及最有选地包括人类。

本文所使用的术语“基质”是指能够支持相关分析成分(例如，分析区域、细胞、测试化合物等)的材料。例如，在一些实施方案中，基质包括平面(即，二维)玻璃、金属、复合材料、塑料、硅土或其它生物相容性或生物不反应(或生物反应)性组合物。可以应用许多基质。基质可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或其组合，以颗粒、链、沉淀物、凝胶、薄片、管、球形、容器、毛细管、衬垫、切片、软片、盘、载波片等存在。基质可以具有任意的常规形状，诸如盘、方形、球形、圆形等。基质一般是平的，但也可以呈现不同的其它表面结构。例如，基质可以含有在其中发生合成的升高的或压低的区域。基质和其表面可以形成刚性支持，在其上进行本文描述的反应。基质及其表面也可以选择以提供合适的光吸收性质。例如，基质可以是聚合的Langmuir Blogett胶片、机能化玻璃、Si、Ge、G_AA_S、GaP、SiO₂、SiN₄、改良的硅，或各种凝胶或聚合物之一，例如(聚)四氟乙烯、(聚)亚乙烯基二氟化物、聚苯乙烯、聚碳酸酯或其组合。在阅读了本发明后，其他基质材料对于本领域技术人员是显而易见的。在一个实施方案中，基质是平面玻璃。

本文所使用的术语“基本上相同的”或“基本上类似的”是指通过一个或多个替换、缺失、或添加而与参照序列不同的核苷酸序列，其总的效果没有导致参照和对象序列之间的相反功能。典型地，该基本上相同的序列的变化不超过35％(即，与相应的参照序列序列相比在基本相同的序列中单个核苷酸替换、增加和/或缺失的数目除以基本相同的序列中总核苷酸数目是约0.35或更少)。该序列被称为与所列的序列有65％的序列同一性。

在一个实施方案中，基本上相同的序列与参照序列的不同不超过30％(70％序列同一性)；在这一实施方案的变形中，不超过25％(75％序列同一性)；在这一实施方案的其它变形中，不超过20％(80％序列同一性)；在这一实施方案的其它变形中，不超过10％(90％序列同一性)；以及在这一实施方案的其它变形中，不超过5％(95％序列同一性)。在一个实施方案中，核酸序列具有至少约65％同一性。在其它实施方案中，核酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％的同一性。

本文所使用的术语“靶核酸”是指待检测病原体固有的多核苷酸。多核苷酸是遗传材料，例如包括DNA/RNA、线粒体DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA以及质粒DNA。通过检测病原体特有的靶核酸的存在，可以推断病原体的存在。类似地，对于病原体属特异的靶核酸的存在表明该属成员的存在。应用标准技术将靶核酸从生物样品和测试样品中分离。该技术将由待分离的多核苷酸类型(例如DNA或RNA)确定。可以根据进行研究的病原体类型和生物或测试样品的量对分离技术进行修改。

本文所使用的术语“靶核酸探针”是指与靶核酸互补的多核苷酸。

本文所使用的术语“T_m”是指“解链温度”。解链温度是这样的温度，在这温度下一群双链核酸分子的半数解离成单链。计算核酸T_m的公式是本领域公知的。如通过标准参考所指出的那样，当核酸在1M NaCl水溶液中时，可以通过公式T_m＝81.5+0.41(％G+C)来计算简单估计的T_m值(例如，参见，Anderson和Young，Quanlitative Filter Hybridization，Nucleric Acid Hybridization(1985))。其它参考例如包括考虑结构和序列特征进行T_m计算的复杂计算法。

本文所使用的术语“病毒”是指微小的感染剂，除了某些例外之外，其不能被光学显微镜观察到，缺乏独立的代谢，并且只有在活宿主细胞内才能复制。单个的颗粒(即病毒粒子)典型地由核酸和蛋白外壳或包膜组成，一些病毒粒子还具有含有脂类的膜。术语“病毒”包括所有类型的病毒，包括动物、植物、噬菌体和其它病毒。

本文所使用的术语“可见光谱”是指含有从约360nm至约800nm波长的光辐射。

发明详述

本发明提供了能够实时、同时量化测量来源于样品中一种或多种病原体的多种核酸的方法和设备。

在一个示范性实施方案中，用聚合酶链式反应(PCR)扩增样品中的靶核酸和内部核酸对照。PCR是公知的扩增一条或多条脱氧核糖核酸(DNA)链方法。通过将靶核酸和内部核酸对照置于含核苷酸腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)(总称为dNTPs)、DNA聚合物和引物的缓冲液中启始PCR。引物是短链DNA，其序列与待扩增的靶核酸和内部核酸对照互补。引物起始靶核酸和内部核酸对照的复制。

在一个实施方案中，用荧光分子在靶核酸引物和内部核酸对照引物两者的5’端进行荧光标记。在另一个实施方案中，用荧光分子在靶核酸引物或内部核酸对照引物之一的5’端进行荧光标记。在再另一个实施方案中，dNTPs是荧光标记的。

PCR过程具有三个主要步骤：变性、退火和延伸。在变性阶段，将混合物加热至约94℃，在这一点将靶和内部对照DNA分离为单链。将混合物快速冷却。当温度降至60℃时，退火步骤发生，其中引物(优选荧光标记的)杂交或结合至它们在靶核酸和内部核酸对照上的互补序列。延伸步骤可以在约60℃或可以升高至72-78℃进行。在这一步骤中，DNA聚合酶利用溶液中的dNTPs延伸退火的引物(优选荧光标记的)并形成被称为扩增子的DNA新链。简而言之，将混合物再加热至约94℃以将新产生的双螺旋链分离为核酸单链，其开始另一个PCR循环。在PCR过程的每一个循环中，最初靶核酸和最初内部核酸对照的拷贝数大体上翻倍。

在一个实施方案中，PCR缓冲液还含有荧光标记的引物，即引物具有与它们连接的荧光染料分子，因此在完成每一个PCR循环后，产生的扩增子是荧光标记的。分别用称为靶核酸探针和内部核酸对照探针的探针DNA链将靶核酸和内部核酸对照的扩增子定位。靶核酸探针和内部核酸对照探针具有与靶核酸和内部核酸对照相同的互补核苷酸序列。以已知的、两维模式将靶核酸探针和内部核酸对照探针束缚在基质表面，并且基质表面形成含有PCR组分的反应孔部分。

在PCR过程的退火和延伸过程中，靶扩增子杂交至它们相应的核酸探针以及内部核酸对照探针上。用合适波长光的衰逝波激活荧光标记的引物或荧光标记的dNTPs的荧光染料分子可以使杂交的荧光染料标记的扩增子发光。在通过靶核酸探针和内部核酸对照探针束缚至其上的基质表面进入反应孔后，这一衰逝波在能量上指数衰退，具有约300nm的有效穿透范围。这意味着衰逝波穿透得足够远至反应孔中以激活杂交至那些靶核酸探针和内部核酸对照探针的荧光标记的扩增子，但是其不会激活在反应孔主体中的溶液中的荧光标记的分子(例如，荧光标记的引物或荧光标记的dNTP)。通过监测在基质表面不同位置上的荧光强度，可以确定相应靶核酸和内部核酸对照扩增子的当前丰度。这可以在PCR过程中实时完成。结果可以用于以类似于实时PCR计算的方法得到在最初样品中特定靶丰度的量化测量。

在一个实施方案中，PCR利用包括选自SEQ ID NO：1-12(表1)的多核苷酸的引物。一些引物的组合例如包括SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：1和4、SEQ IDNO：1和6、SEQ ID NO：3和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：3和6、SEQ IDNO：5和2、SEQ ID NO：5和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ IDNO：9和10、和/或SEQ ID NO：11和12。

表1

引物来源	序列(5′→3′)	SEO ID NO
			细菌(革兰氏+)	actcctacgggaggcagcag	1
细菌(革兰氏-)	attaccgcggctgctggcac	2
			细菌(革兰氏+)	ccagactcctacgggaggcagcag(353)	3
细菌(革兰氏-)	gattaccgcggctgctggcac(553)	4
			细菌(革兰氏+)	ccatactcctacgggaggcagcag(353)	5
细菌(革兰氏-)	tattaccgcggctgctggcac(553)	6
			肠病毒	ctccggcccctgaatgcgg(372)	7
肠病毒	acccaaagtagtcggttccg(478)	8
			HSVs	ggaactcctccaccgccca(74869)	9
HSVs	gtaccagggcgtcctgggc(75086)	10
			真菌	ggccgttcttagttggtggagt	11
真菌	atgctctatccccagcacgac	12

在另一个实施方案中，将靶核酸探针设计为与分离自病原体的多核苷酸互补，所述病原体选自细菌、病毒、真菌、原生动物。在再另一个实施方案中，靶核酸探针设计为与分离自立克次氏体(Rickellsia)、衣原体(Chlamydia)、枝原体(Mycoplasma)、螺旋体(Spirochete)、链球菌(Streptococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、单核细胞增多性李司忒菌(L.monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitides)、大肠杆菌(E.coli)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、钩端螺旋体(Leptospira)、变形杆菌(proteus)、厌氧杆菌(Anaerobacter)、结核分支杆菌(M.tuberculosis)、肠球菌(Enterococcus)、人类脊髓灰质炎病毒1(H.Poliovirus 1)、人类肠病毒71(H.enterovirus 71)、人类肠病毒70(H.enterovirus 70)、人类伊科病毒2(H.echovirus 2)、人类伊科病毒4(H.echovirus 4)、人类伊科病毒6(H.echovirus 6)、人类伊科病毒9(H.echovirus 9)、人类伊科病毒11(H.echovirus 11)、人类伊科病毒12(H.echovirus 12)、人类伊科病毒26(H.echovirus 26)、人类柯萨基病毒A13(H.coxsackievirus A13)、人类柯萨基病毒A15(H.coxsackievirus A15)、人类柯萨基病毒A18(H.coxsackievirusA18)、人类柯萨基病毒A20(H.coxsackievirus A20)、人类柯萨基病毒A21(H.coxsackievirus A21)、人类柯萨基病毒B3-A(H.coxsackievirus B3-A)、人类柯萨基病毒B3-C(H.coxsackievirus B3-C)、HSV-1、HSV-2的多核苷酸互补。在另一个实施方案中，靶核酸探针选自SEQ ID NO：13-52(表2)。

表2

探针来源	序列(5′→3′)	SEO ID NO
			链球菌	ccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatc	13
沙门氏菌	tgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggtt	14
			沙门氏菌	tttttccccggggaggaaggtgttgtggttaata	15
沙门氏菌	tttttccccgtgttgtggttaataaccgcagcaa	16
			沙门氏菌	cccccgtactttcagcggggaggaaggtgttgtggttaat	17
葡萄球菌	cggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggtcttcggatc	18
			支原体	tgaagcaatgccgcgtgagtgatgacggccttcgggtt	19
单核细胞增多性李司忒菌	cggagcaacgccgcgtgtatgaagaaggttttcggatc	20
			脑膜炎奈瑟氏菌	tccagccatgccgcgtgtctgaagaaggccttcgggtt	21
大肠杆菌	tgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggtt	22
			大肠杆菌	gaagggagtaaagttaatacctttgctcattgacg	23
大肠杆菌	tttttcccccggggaggaagggagtaaagttaata	24
			大肠杆菌	cgtcaatgagcaaaggtattaactttactccctt	25
大肠杆菌	ccccccgtcaatgagcaaaggtattaactttactccctt	26
			流感嗜血杆菌	cgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggtt	27
伯氏疏螺旋体	cggagcgacactgcgtgaatgaagaaggtcgaaagatt	28
			钩端螺旋体	agcagcgacgccgcgtgaacgatgaaggtcttcggatt	29
变形杆菌	tgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttagggtt	30
			Anaercbacter	tgcagcaacgccgcgtgagtgataaggcttcgggttgt	31
结核分支杆菌	tgcagcgacgccgcgtgggggatgacggccttcgggtt	32
			肠球菌	ccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatc	33

脊髓灰质炎病毒1	ccacggagcaagtgccctcaatccagagggtggctt	34
			肠病毒71	ctgcggagcacatgctcacaaaccagtgggtggtgt	35
肠病毒70	ccatggagcaaatgctcacaatccagtgagtggttt	36
			伊科病毒2	ctgcggagcaggtacccacgagccagtgggcagcct	37
伊科病毒4	ctgcggagcacacgctcacaagccagtgagtggtgt	38
			伊科病毒6	ctgcggagcaggtgctcacaatccagtgggtggcct	39
伊科病毒9	ctgtggagcacatgcccctaatccaaggggtagtgt	40
			伊科病毒11	ctgcggagcacatacccctaatccaaggggcagtgt	41
伊科病毒12	ctgtggagcaagtgcccacaacccagtgggtggctt	42
			伊科病毒26	ctgcggagcaggcacccacaagccagtgggcagcct	43
柯萨基病毒A13	ccatggagcaagtgatcacaatccagtgatattctt	44
			柯萨基病毒A15	ccacggagcaggtgacttcaagccagaagttggcct	45
柯萨基病毒A18	ccacggagcaagtgctcacgaaccagtgagtggctt	46
			柯萨基病毒A20	ccatggagcaggcggtcacagaccagtgactagctt	47
柯萨基病毒A21	ccacggagcaaccgctcacaacccagtgagtaggtt	48
			柯萨基病毒B3-A	ctgtggatcatgcgccctcaaaccagagggaagcgt	49
柯萨基病毒B3-C	ctgcggagcatgcacccacaagccagtgggtagcga	50
			HSV-1	gttgggccacgcgccccccgagctggtggacggccccgg	51
HSV-2	gcttggtgacgcgcgcgcccagctcctccacggcctccg	52

图1是能够衰逝波检测微阵列PCR反应中荧光标记的扩增子的示范性设备的横面图，包括反应盒10、具有基质表面13的基质12、第一核酸靶探针14、第二核酸靶探针15、第一内部核酸对照探针14A、第二内部核酸对照15A、缓冲溶液16、第一靶核酸链18、第二靶核酸链20、第一内部核酸对照18A、第二内部核酸对照20A、dNTPs22、任选地荧光标记的dNTPs24、荧光标记的引物26、热稳定DNA聚合酶28、加热元件30和冷却元件31。

在一个实施方案中，基质12由比缓冲溶液16更稠密的材料组成，因此可以如以下更详细描述地那样应用衰逝波。基质12例如可以是玻璃，或适当地包被的塑料或聚合物。

第一和第二靶核酸探针14和15以及第一和第二内部核酸对照探针14A和15A是DNA链，每一个分别具有靶DNA链18和20以及内部核酸对照18A和20A之一的特异核苷酸序列。在一个实施方案中，这些靶核酸探针和内部核酸对照探针是不可延伸的。换而言之，不能将核苷酸添加至靶核酸探针和内部核酸对照探针的任一端。靶核酸探针14和15以及内部核酸对照探针14A和15A可以是天然的或合成制造的多核苷酸，应用商业可获得的寡核苷酸合成仪(例如可从Genomic Solutions，Inc.of Ann Arbor，Mich获得的POLYPLEX合成仪)构建的有人造碱基和/或人造碳水化合物、肽核酸(PNAs)、二环核酸(BNAs)、或其它核酸类似物的多核苷酸。或者，探针可以是但不限于选自DNA序列文库，诸如已知具有一些生物学意义的表达序列标签(EST)文库的序列。

将靶核酸探针14和15以及内部核酸对照探针14A和15A排列在基质表面13上。在一个实施方案中，通过应用商业可获得的微阵列技术(例如可从GenomicSolutions，Inc.of Ann Arbor，Mich获得的OMNIGRID微阵列仪)的自动印刷将靶核酸探针14和15以及内部核酸对照探针14A和15A作为小点排列在基质表面上。

可通过公知的技术，诸如但不限于共价缀合活性甲硅烷基与靶核酸探针和内部核酸对照探针，将第一和第二靶核酸探针14和15以及第一和第二内部核酸对照探针14A和15A固定在基质表面13上。在手工或自动放置后，该硅烷化的分子立即被固定在玻璃表面上。或者，可通过合适地电学充电该表面，优选通过应用合适的涂层，例如，硅烷、聚-L-赖氨酸、多糖、硫醇或其组合，固定第一和第二靶核酸探针14和15以及第一和第二内部核酸对照探针14A和15A。

荧光标记的引物26或任选的荧光标记的dNTPs 24是可以用荧光染料标记的核苷酸，所述荧光染料例如是萤光黄或若丹明绿染料，或类似的、具有类似荧光特性的相关化合物，诸如功能化或插入染料和发光的功能化的纳米粒子(量子点)。任选荧光标记的dNTPs 24可以具有荧光标记的四种碱基核苷酸dGTP、dCTP、dATP和dTTP的一种、两种、三种或四种。

加热元件30可以是任何合适的当电流通过它时提供热量的电阻材料，例如碳。加热元件30需要能够在几分钟内将反应盒10加热至94℃。冷却元件31可以是任何合适的固态冷却元件，例如，公知的作为热泵的Peltier固态装置。加热元件30和冷却元件31也可以位于反应盒10的外部。

图2是能够在PCR过程退火和/或延伸阶段的终点衰逝波检测微阵列PCR反应中荧光标记的扩增子的示范性反应盒10的横面图，还分别包括第一、第二、第三和第四荧光标记的扩增子32、34、32A和34A。第一荧光标记的扩增子32是具有这样的核苷酸序列的DNA链，所述核苷酸序列是第一靶核酸链18的互补拷贝，也就是说，对于每一个在第一靶核酸链18中的腺嘌呤(A)核苷酸，在第一荧光标记的靶扩增子32中有胸腺嘧啶(T)核苷酸，反之亦然。类似地，对于每一个在第一靶核酸链18中的胞嘧啶(C)核苷酸，在第一荧光标记的靶扩增子32中有鸟嘌呤(G)核苷酸。

第二荧光标记的扩增子34是具有这样的核苷酸序列的DNA链，所述核苷酸序列是第二靶核酸链20的互补拷贝，也就是说，对于每一个在第一靶核酸链20中的腺嘌呤(A)核苷酸，在第二荧光标记的靶扩增子34中有胸腺嘧啶(T)核苷酸，反之亦然。类似地，对于每一个在第一靶核酸链20中的胞嘧啶(C)核苷酸，在第二荧光标记的靶扩增子34中有鸟嘌呤(G)核苷酸。

第三荧光标记的扩增子32A是具有这样的核苷酸序列的DNA链，所述核苷酸序列是第三靶核酸链18A的互补拷贝，也就是说，对于每一个在第三靶核酸链18A中的腺嘌呤(A)核苷酸，在第三荧光标记的靶扩增子32A中有胸腺嘧啶(T)核苷酸，反之亦然。类似地，对于每一个在第三靶核酸链18A中的胞嘧啶(C)核苷酸，在第三荧光标记的靶扩增子32A中有鸟嘌呤(G)核苷酸。

第四荧光标记的扩增子34A是具有这样的核苷酸序列的DNA链，所述核苷酸序列是第四靶核酸链20A的互补拷贝，也就是说，对于每一个在第四靶核酸链20A中的腺嘌呤(A)核苷酸，在第四荧光标记的靶扩增子34A中有胸腺嘧啶(T)核苷酸，反之亦然。类似地，对于每一个在第四靶核酸链20A中的胞嘧啶(C)核苷酸，在第四荧光标记的靶扩增子34A中有鸟嘌呤(G)核苷酸。

在PCR过程的退火和/或延伸阶段的终点，通过退火的荧光标记的引物26延伸产生的第一、第二、第三和第四荧光标记的扩增子32、34、32A和34A保持杂交至它们相应的第一和第二靶核酸链18和20以及第一和第二内部核酸对照18A和20A上。此外，在之前的PCR循环中产生的扩增子杂交至束缚的第一和一二靶核酸探针14和15以及第一和第二内部核酸对照探针14A和15A上。例如，在表面位点36上，第二荧光标记的扩增子34杂交至第二靶核酸探针15上。类似地，在表面位点38上，第一荧光标记的扩增子32杂交至第一靶核酸探针15上。例如通过由它们的3’端束缚至表面，或通过具有由双脱氧修饰的3’端或具有添加至3’端的稳定基团，或通过其它公知的使得靶核酸探针和内部对照核酸探针在有特定引物存在的情况下不参与PCR反应的方法，将第一和第二靶核酸探针14和15以及第一和第二内部核酸对照探针14A和15A设计为不在PCR过程中被扩增。

图3是能够在PCR过程变性阶段衰逝波检测微阵列PCR反应中荧光标记的扩增子的示范性反应盒10的横面图。在这一阶段，在反应盒10中的混合物已被加热至接近100℃，以及最佳至约94℃。在该温度下，DNA是变性的，也就是说，它分离为单独的单链。当在PCR过程的下一阶段冷却时，第一和第二靶核酸链18和20以及第一和第二内部核酸对照链18A和20A的每一条，以及第一、第二、第三和第四荧光标记的扩增子32、34、32A和34A的每一条将与荧光标记的引物26退火。由于热稳定DNA聚合酶28添加合适的碱基，退火的荧光标记的引物26会得到延伸，直到第一和第二靶核酸链18和20的每一条，第一和第二内部核酸对照链18A和20A的每一条，以及第一、第二、第三和第四荧光标记的扩增子32、34、32A和34A的每一条将杂交至新的扩增子，所述新扩增子是最初的第一和第二靶核酸链18和20以及第一和第二内部核酸对照链18A和20A的拷贝或互补拷贝。

图4是显示在PCR过程检测阶段衰逝波检测微阵列PCR反应中荧光标记扩增子的示范性反应盒10的横面图，进一步包括入射光束40，入射角42、反射光束44、衰逝波46、荧光光束48和荧光检测仪50。检测阶段可以与退火和/或延伸阶段同时发生。

将入射光速40选择为这样的波长，所述波长合适于激发用于荧光标记引物16或任选地荧光标记的dNTPs 24的荧光团。在一个实施方案中，入射光速40是488nm的氩离子激光光谱线，其很接近地匹配荧光黄染料的最大激发(494nm)，所述荧光黄染料被用于标签或标记荧光标记的引物16或任选地荧光标记的dNTPs 24。

选择入射光速40的入射角42大于基质至缓冲液界面的临界角。入射的临界角是这样的角，即在这个角度发生完全的内部反射并且取决于于形成界面的材料的折射率。从Snell’s折射定律，入射的临界角＝sin^-1(n₁/n₂)，其中n₁和n₂是在界面任一侧的材料的折射率。在本发明的一个实施方案中，基质12由玻璃组成并且具有约1.5的折射率，而缓冲溶液16主要由具有约1.3的折射率的水组成，因此，入射临界角是大约61度。

当光以大于临界角读数的入射角42在基质表面13反射并因此发生完全的内部反射时，形成了衰逝波46并且传播通过基质表面13。从基质表面13的距离每增加130nm，衰逝波46的强度通过“e”(即数学常数)因子降低。因此，只有非常接近表面13的对象才能被衰逝波46照射到。在本发明的一个实施方案中，利用这一性质来照射分别杂交至第一和第二靶核酸探针14和15以及第一和第二内部核酸对照探针14A和15A的第一、第二、第三和第四荧光标记的扩增子32、34、32A和34A。可以通过荧光检测仪50检测并分析由荧光标记的扩增子32、34、32A和34A发射的荧光48。荧光检测仪50典型地包括会聚光学，诸如显微镜物镜，其能将光聚焦至检测系统，诸如光电倍增管或电荷耦合器件(CCD)照相机或光电二极管。

收集到的荧光的起源和强度可以用于估计发射荧光分子的数量，并且由此此通过例如应用在实时或动力学PCR分析中采用的公知量化技术估计当前杂交至特定寡类型探针的荧光标记扩增子的数量。在实时或动力学PCR分析中，反应特征是第一次检测PCR产物扩增的时间点是在循环的过程当中，而不是在固定的循环数后积累的PCR产物的量。在最初样品中靶核酸拷贝数目越大，越快观察到荧光的显示增加。

在本发明的其它实施方案中，可以通过监测反射光并确定由荧光标记吸收的光的量来检测荧光信号。

图5显示了荧光对三种靶DNA链循环数的示范性标绘图52，54和56，所述三种靶DNA链在最初样品种具有不同的拷贝数。开始或基线背景荧光信号甚至可以在没有进行PCR循环的时候就检测到。在PCR的最初的循环中，这一荧光信号几乎没有改变。基线之上荧光的增加表明检测到聚集的PCR产物。通过设定在基线之上的固定荧光阈值58，可将阈循环(CT)参数定义为部分循环数目，在这个循环数上，特定寡探针的荧光超过了这一固定的阈值，如通过三个部分值C_r1、C_r2、C_r3所表明的那样。

图6是在最初样品中靶核酸链拷贝数的对数(log[N])对靶核酸阈循环(CT)的示范性标绘图。由于PCR的指数性质，最初靶拷贝数的对数对CT的标绘图是直线60。通过引入数个在最初样品中具有已知拷贝数的内部核酸对照，与它们相应的内部核酸对照探针有关的荧光可以用于产生最初拷贝数对数对CT的直线标定线60。通过测量已知具有特定靶核酸探针的反应孔位置上的CT，可以从标定线推导出对应于该靶核酸探针的靶核酸的拷贝数。

图7是循环数(X轴)对内部扩增子数(Y轴)的示范性标绘图。等式N＝1000×(1+X)ⁿ表示扩增反应的指数期函数，其中N是扩增子数目。如果标准条件下X＝80％，现实条件下X＝75％，为计算达到100,000的标准循环数(n)，n＝log(100)/log(1.8)＝7.83。然而，如果降低了扩增效率，现实循环数(n’)可能是n’＝log(100)/log(1.75)＝8.23。在理想的测试条件中(不考虑不同杂交反应的不同动力学)，在这一等式中可以用杂交信号代替扩增子数。在这种情况下，校准因子是f＝(1+X_现实)/(1+X_标准)。这一校准因子对于每一个内部核酸对照和每一个靶核酸都是普遍适用的。此外，可以用现实和标准杂交曲线计算这一校准因子。例如，从图7的曲线可以计算f为f＝(1+1.75)/(1+0.8)＝0.92。此外，也可以通过这一校准因子将靶分子的杂交信号校准为它的标准信号。如果将靶核酸标准曲线的函数(1)表示为N₁＝N₁₀×(1+X_标准)ⁿ，并且现实杂交信号是N₁’，则标准杂交信号是N₁＝N₁’/fⁿ＝N₁₀×(1+X_标准)ⁿ。因此，N₁₀可以从等式N₁₀＝N₁’/[fⁿ×(1+X_标准)ⁿ]计算得到。如果计算的f超出了对照范围，例如0.9至1.1，可将该测试认为是无效的。

本发明也提供了用于检测来自一种或多种病原体的两种或多种靶核酸的试剂盒。试剂盒包括至少一个引物对和寡核苷酸微阵列，所述寡核苷酸微阵列包括两种或多种靶核酸探针和一种或多种内部核酸对照探针。

尽管之前的讨论利用DNA作为示范性核酸，本领域技术人员应当很清楚可将本文公开的方法用于其它核酸，包括RNA序列或RNA和DNA序列的组合。

尽管之前的讨论利用PCR作为示范性反应，本领域技术人员应当很清楚可以利用任何合适的扩增方法来应用本文公开的方法，所述扩增反应诸如但不限于逆转录PCR、随机引物扩增、滚环扩增或线性扩增“T7”。

尽管之前的讨论利用荧光标记的引物来标记靶核酸和内部核酸对照，本领域技术人员应当明了应用相关结构，诸如但不限于机能化纳米粒子或插入染料来标记靶核酸和内部核酸对照。

尽管为了简明，之前的讨论就两种核酸和两种内部核酸对照进行了讨论，本领域技术人员应当明了利用该方法和设备用于一种靶核酸，或用于多种核酸和多种内部核酸对照的量化评估。

尽管本发明以对结构特征和/或方法行为特定的语言进行了描述，但应当理解所附权利要求中定义的发明不必要用描述的特定特征或行为来限定。而是，所述特定特征和行为作为实现所要求保护的发明的示范性形式而公开。

应当理解，已经将本发明的某些描述简化为只有那些与清楚理解本发明相关的元素和限制，而为了简要，排除了其它元件。本领域技术人员在考虑了本发明的说明书后，将认识到为了实现本发明，其它元件和/或限制也是可期望的。然而，由于本领域技术人员在考虑了本发明的说明书后，能够很容易地确定此类其它元件和/或限制，并且它们对于完全理解本发明不是必需地，因此本文没有提供此类元件和限制的讨论。

实施例

以下的实施例是以上发明的阐述。本领域技术人员将很容易地认识到实施例中描述的技术和试剂启发了许多其它在其中可以实践本发明的方法。应当理解，在本发明的范围之内可以进行许多变化和修改。

除了操作实施例，或除非另外明确地说明，在说明书以下部分的所有数值范围、量、值和百分数，诸如那些材料的量、反应的时间和温度、量的比值以及其它应当读作如同在其前面加有“约”，即使术语“约”没有明确地与值、量或范围一起出现。因此，除非相反的指出，在以下说明书和所附权利要求书中的提出数值参数是近似值，其可以依据本发明所追求得到的期望特性而不同。至少，并非试图限制权利要求范围相等数值的应用。每一个数值参数至少应当具有报道的有效数字位数，其通过普通舍入规则构建。

尽管阐述本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在特定实施例中提出的数值尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地含有某些必然从在它们各自的测试测量中发现的标准偏差得到的误差。此外，当本文阐述不同范围的数值范围时，预期可以应用包含所列举值的这些值的任意组合。

实施例1

十二种细菌的量化微阵列

靶组包括十二种不同种类的细胞与两种内部核酸对照。内部核酸对照A将是已知的低浓度以及内部核酸对照B将是已知的高浓度。引物组包括所有的十二种细菌物种以及内部核酸对照A和B的正向引物和反向引物。探针组将包括所有的十二种细菌物种以及内部核酸对照A和B的探针。例如，靶探针A对靶核酸A是特异的，以及靶探针B对靶核酸B是特异的。

典型地，所有十二种细菌种类的探针和内部核酸对照A和B的探针之间应当没有交叉反应。此外，典型地，内部核酸对照探针A及B和十二种靶核酸之间应当没有交叉反应。特异地设计内部核酸对照A和B以满足与靶核酸相比有相同扩增效率的要求。

可将内部核酸对照设计为线性或环状的双链DNA，例如，以质粒的形式。可将与引物对互补的序列设计在它的分子中。引物结合区域之间的片段将具有合适的序列和长度，以确保适于具有相同PCR效率的最初扩增条件以及适于引物设计，与细菌DNA靶和探针没有交叉反应。可以通过分子生物学技术，诸如PCR、限制性酶消化、DNA连接、转化等设计并克隆内部核酸对照。

内部核酸对照A和B将与在样品中的其它12种细菌DNA共同扩增。如果在核酸样品中存在PCR抑制剂，扩增反应将被抑制。结果，在制定的检测时间(例如，扩增20个循环后)探针A/B的杂交信号将落在对照范围之外。因此，应当认为这一样品的检测结果是无效的。

当存在一些因素将影响扩增/杂交系统时，可以用内部核酸对照来校准最终结果。例如，当样品中所怀疑的细菌浓度很低时，内部核酸对照A可用于校准。另一方面，当所怀疑的细菌浓度很高时，内部核酸对照B可用于校准。

理想地，可以通过恰当地设计分子序列使得细菌核酸靶X和内部核酸对照A和B以相同地扩增和杂交效率共同扩增。虽然它们可以具有相同的扩增效率，但在多数情况下不能达到相等的杂交效率。这可能是因为在固定温度下，不同靶-探针对的杂交动力学是不同的。此外，可以构建对于每一种靶分子的校准曲线系列。例如，如果在杂交之前内部核酸对照的最初拷贝数是10^3.25，应当完成在标准条件下的双份测试，以得到基于每一扩增循环中平均杂交信号的剂量(扩增循环数)-效果(杂交信号)曲线。以类似的方式，可以得到10²、10^2.5、10³、10^3.5、10⁴拷贝的剂量-效果曲线。

典型地，可以得到10²、10^2.5、10³、10^3.5、10⁴、10^4.5、10⁵、10^5.5、10⁶和10^6.5的每一种均靶分子的剂量-效果曲线。如果内部核酸对照在扩增循环n、n+1、n+2的杂交信号在10^2.5和10³的曲线之间，可以将内部核酸对照和所怀疑的细菌DNA都向上校准10^0.5倍。典型地，如果靶核酸X在扩增循环n、n+1、n+2的杂交信号在10^3.5和10⁴的曲线之间，浓度应该是在10⁴和10^4.5之间。

典型地，由于当细菌靶分子具有高浓度，例如10⁸时，靶A的扩增会受到抑制，因此也将使用内部核酸对照B(具有大拷贝数)。也就是说，在内部核酸对照A将落入检测范围之前，PCR材料将大量的消耗掉。相反，内部核酸对照B(具有高浓度，例如10^6.25)将不会受到此类细菌靶分子的抑制。对于靶核酸对照B，应当建立10⁵、10^5.5、10⁶、10^6.5和10⁷拷贝的校准曲线组。每一细菌靶分子的剂量-效果曲线应当建立在10^6.5、10⁷、10^7.5、10⁸、10^8.5、10⁹和10^10.5上。尽管将检测时间改变为循环m、m+1和m+2(m＜n)，但是应当以类似的方式进行校准。通过在设置不同浓度的内部对照，将能扩展系统的检测范围。

所有的出版物、专利、专利文件均在此引入作为参考，就像通过参考单个引入那样。通过提及不同的特定和优选的实施方案和技术对本发明进行了描述。但是，应当理解在本发明的实质和范围内可以进行许多变化和修改。

序列表

<110>霍尼韦尔国际公司

<120>用于寡核苷酸微阵列的定量方法

<210>1

<211>20

<212>DNA

<400>1

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<210>2

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<210>17

<211>40

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<400>17

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<210>18

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<210>21

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<210>22

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<400>22

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<210>23

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<212>DNA

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Claims (20)

1.用于分析靶核酸的定量方法，其包括：

将一种或多种荧光标记的靶扩增子退火至两种或多种靶核酸探针；

将一种或多种荧光标记的内部对照扩增子退火至一种或多种内部核酸对照探针；

激活来自杂交至两种或多种靶核酸探针的一种或多种荧光标记的靶扩增子的第一荧光应答；

激活来自杂交至一种或多种内部核酸对照探针的一种或多种荧光标记的内部对照扩增子的第二荧光应答；

检测第一和第二荧光应答，用于定量分析一种或多种靶核酸和一种或多种内部核酸对照，

其中两种或多种靶核酸探针和一种或多种内部核酸对照探针非常接近基质的上表面，以及其中通过应用预先确定波长的衰逝波激活第一和第二荧光应答。

2.权利要求1的定量方法，其中退火发生在聚合酶链式反应期间。

3.权利要求2的定量方法，其中第一和第二荧光应答的检测发生在聚合酶链式反应的退火步骤或延伸步骤期间。

4.权利要求1的定量方法，其中应用微阵列印刷机将两种或多种靶核酸探针和一种或多种内部核酸对照探针印在并固定在基质的表面。

5.权利要求4的定量方法，其中用选自硅烷、抗生物素蛋白、聚-L-赖氨酸、抗生蛋白链菌素、多糖、硫醇或其组合的试剂化学修饰基质。

6.权利要求1的定量方法，其中聚合酶链式反应是实时聚合酶链式反应。

7.权利要求1的定量方法，其中一种或多种内部核酸对照是线性双链脱氧核糖核酸、环状双链脱氧核糖核酸或其组合。

8.权利要求1的定量方法，其中一种或多种内部核酸对照具有与两个或多个靶核酸相同的引物结合区域。

9.权利要求1的定量方法，其中退火至一种或多种内部核酸对照探针的荧光标记的扩增子的序列长度是退火至两种或多种靶核酸的荧光标记的扩增子序列长度的约百分之五百以下。

10.权利要求1的定量方法，其中一种或多种内部核酸对照序列具有约百分之五以下的交叉反应。

11.权利要求1的定量方法，其中如果存在两种或多种内部核酸对照，两种或多种内部核酸对照以不同的浓度存在。

12.权利要求1的定量方法，其中如果存在两种或多种内部核酸对照探针，两种或多种内部核酸对照探针以与两种或多种靶核酸探针相同的浓度存在。

13.权利要求1的定量方法，其中一种或多种内部核酸对照具有约百分之五以下的与两种或多种靶核酸的交叉反应。

14.权利要求1的定量方法，其中在达到杂交平顶之前检测第一和第二荧光应答。

15.权利要求1的定量方法，其中两种或多种靶核酸衍生自一种或多种病原体，其中一种或多种病原体是病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒、寄生生物或其组合。

16.权利要求15的定量方法，其中一种或多种病原体是立克次氏体(Rickellsia)、衣原体(Chlamydia)、枝原体(Mycoplasma)、螺旋体(Spirochete)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、单核细胞增多性李司忒菌(L.monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitides)、大肠杆菌(E.coli)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、钩端螺旋体(Leptospira)、变形杆菌(Proteus)、厌氧杆菌(Anaerobacter)、沙门氏菌(Salmonella)、结核分支杆菌(M.tuberculosis)、肠球菌(Enterococcus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、肠病毒(Enterovirus)、柯萨基病毒(Coxsackievirus)、HSV-1、HSV-2或其组合。

17.分析靶核酸的定量方法，包括：

将一种或多种荧光标记的靶扩增子退火至两种或多种靶核酸探针；

将一种或多种荧光标记的内部对照扩增子退火至一种或多种内部核酸对照探针；

激活来自杂交至两种或多种靶核酸探针的一种或多种荧光标记的靶扩增子的第一荧光应答；

激活来自杂交至一种或多种内部核酸对照探针的一种或多种荧光标记的内部对照扩增子的第二荧光应答；以及

检测第一和第二荧光应答，用于定量分析一种或多种靶核酸和一种或多种内部核酸对照，其中两种或多种靶核酸探针和一种或多种内部核酸对照探针非常接近基质的上表面，以及其中通过应用预先确定波长的衰逝波激活第一和第二荧光应答；

为两种或多种靶核酸的每一种和为一种或多种内部核酸对照的每一种建立系列标准品扩增曲线，其中每一标准品扩增曲线是剂量-效果曲线，其中剂量是扩增循环的数量以及效果是杂交信号；

通过减去一种或多种内部核酸对照的检测浓度和一种或多种内部核酸对照的预先确定浓度的差异校正两种或多种靶核酸的每一种的检测浓度。

18.用于定量分析靶核酸的装置，包括：

具有上和下表面的基质，且其折射率大于水的折射率；

基本上与基质上表面接触的缓冲溶液，缓冲溶液能够维持扩增反应和核苷酸杂交反应并含有一种或多种荧光标记的引物、一种或多种任选地荧光标记的dNTPs、两种或多种靶核酸、以及一种或多种内部核酸对照；

非常接近于基质上表面并在缓冲溶液内部的两种或多种靶核酸探针，两种或多种靶核酸探针具有与两种或多种靶核酸的核苷酸序列对应或互补的核苷酸序列；

非常接近于基质上表面并在缓冲溶液内部的一种或多种内部核酸对照探针，一种或多种内部核酸对照探针具有与一种或多种内部核酸的核苷酸序列对应或互补的核苷酸序列；

光线，其具有选择以激活一种或多种荧光标记的靶扩增子以及一种或多种荧光标记的内对照扩增子的波长，以选择的角度在基质和缓冲溶液的界面入射，使得衰逝波传播进入缓冲溶液；

能够检测由一种或多种荧光标记的靶扩增子和一种或多种荧光标记的内部对照扩增子发射的荧光的检测器。

19.权利要求18的装置，还包含能够循环缓冲溶液温度的加热元件，由此能够进行扩增反应。

20.权利要求18的装置，其中扩增反应是实时聚合酶链式反应。

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