CN104531696A - 引物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了引物组合物及其用途，其中该引物组合物包含：第一引物组，所述第一引物组的核酸序列如SEQ ID NO:1-2所示；以及第二引物组，所述第二引物组的核酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌特定区域——ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是分支杆菌鉴定技术领域。具体而言，涉及引物组合物及其用途，更具体的，本发明涉及引物组合物、试剂盒及其在对待测分支杆菌进行菌种鉴定中的用途，构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法，对待测分支杆菌进行菌种鉴定的方法、系统，以及同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的方法和系统。
背景技术
分枝杆菌是好氧的细胞内细菌生物类属，其在感染宿主后存活在单核细胞和巨噬细胞的内体区室(endosomal compartments)中。结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)为革兰氏阳性细菌中分枝杆菌属(mycobacterium)的一个成员，而非结核性分枝杆菌(mycobacterium otherthan tuberculosis)是分枝杆菌属中除了结核杆菌以外细菌的统称。其中的鸟型结核菌(Mycobacterium avium complex)广泛的自艾滋病患的检体被分离到后，非结核性分枝杆菌才受到重视。非结核性分枝杆菌在环境中普遍存在且种类繁多，目前超过九十余种。
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)及其复合群传染了世界人口的大约三分之一，约17亿人患结核病(Kochi，A.，结核(Tubercle)72：1-6(1991))，在世界范围内使更多人丧生(每年大约3百万)(发病率与死亡率周报(Morbidity and Mortality Weekly Report)42：961-964(1993))；其它治病性分枝杆菌如鸟分枝杆菌(M.avium)复合体(MAC)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海分枝杆菌(M.marinum)、玛尔摩尔分枝杆菌(M.malmoense)和偶发分枝杆菌复合体也是常见的病原体(参见：Wayne，L.G.，临床微生物学综述(Clin.Micro.Rev.)5：1-25(1992)或Falkinham，J.O.，临床微生物学综述9：177-215(199)关于不同分枝杆菌病原体的综述)，主要易感者是慢性呼吸道疾患(COPD、肺结核残余空洞、矽肺、支气管扩张症、肺囊性纤维化等)和免疫抑制特别是AIDS患者。鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium)在所有晚期AIDS患者的几乎半数中引起传播性疾病(Nightingale，S.D.等人，传染病杂志(Jour.Infect.Dis.)165：1082-1085(1992))。世界卫生组织估计，到2000年为止感染人免疫缺陷病毒(HIV)的人数将超过4千万(世界卫生组织(文件WHO/GPA/CNP/EVA/93.1)全球AIDS计划(1993))。副结核分枝杆菌(鸟分枝杆菌的一个亚种)在反刍动物中引起副结核病，引起农产品加工业(例如，牛奶和牛肉)每年损失，耗费了大量的社会费用。
人类分枝杆菌疾病包括结核病(由结核分枝杆菌M.tuberculosis引起)、麻疯病(由麻疯分枝杆菌M.leprae引起)、Bairnsdale溃疡病(由溃疡分枝杆菌M.ulcerans引起)和由海分枝杆菌(Emarinum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、瘰病分枝杆菌(M.scrofulaceum)、苏尔加分枝杆菌(M.szulgai)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分支杆菌(M.chelonei)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)和胞内分枝杆菌(M.intracellulare)引起的各种感染。证据显示，非结核性分枝杆菌所引发的院内传染正逐步增加，且所导致的状况已由无害的移生转变成具侵害性的感染。此外，非结核性分枝杆菌亦可造成微生物检体的污染而导致不必要的治疗及可能有害的诊断步骤。分析菌株的种类及检体来源可协助确认菌群的重要性，一旦怀疑发生突发(out-break)或假性群突发，分析技术应可迅速确认来源及确定适当的控制措施。
因此，目前结核分枝杆菌鉴定、与非结核分枝杆菌的鉴别，受到广泛关注，成为研究热点，越来越多的从基因层面，采用分子生物学技术进行研究及产品研发，不仅突破了结核与非结核自身生长时间长、条件苛刻的局限，甚至比优化过的液体培养时间更短。
然而，目前的分枝杆菌鉴定方法仍有待改进。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
现今比较常见的针对某特定区域的Q-PCR鉴定菌种技术，基因芯片核酸探针杂交技术等等分子生物学技术都已得到广泛运用，但是同时由于芯片杂交技术原理及荧光信号对Q-PCR技术的限制，两者成本都不低，一次反应检测的种类非常有限。
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种成本低、效率高、敏感度高、方便快捷且一次反应能够鉴别多种菌种的分支杆菌菌种鉴定方法。具体地，发明人发现，基于基因层面，分枝杆菌16S-23SrRNA转录间隔区，即分支杆菌的ITS区域，高度保守，其序列和长度依菌种不同差异较大，因而，发明人采用该分枝杆菌特定区域——ITS区域，进行对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，具体地，其通过设计获得在不同分枝杆菌之间的同源性非常高的特异性引物(SEQ ID NO:1-4)，对待测样本的分枝杆菌特定区域进行扩增并测序，经比对一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，具有敏感度高、方便全面、快速的优点。
因而，根据本发明的一个方面，本发明首先提供了一种引物组合物。根据本发明的实施例，该引物组合物包含：第一引物组，所述第一引物组的核酸序列如SEQ ID NO:1-2所示；以及第二引物组，所述第二引物组的核酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。发明人惊奇地发现，本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌特定区域——ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别。进而，利用本发明的引物组合物对包含ITS区域的待测分支杆菌核酸样本进行两轮PCR扩增，一步即能够实现分支杆菌ITS区域核酸的富集，进而测序后，能够有效获得待测分支杆菌核酸样本ITS区域的核酸序列，经过比对分析即可容易地实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，而并不受待测分支杆菌菌种的限制，并且，一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的引物组合物。如前所述，本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，因而，本发明的试剂盒能够有效用于分支杆菌菌种鉴定尤其是结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，并且，利用本发明的试剂盒，通过对待测分支杆菌样本进行扩增、测序和比对分析，一次即能够实现待测分支杆菌ITS区域核酸的富集并有效获得待测分支杆菌核酸样本ITS区域的核酸序列，实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，而并不受待测分支杆菌菌种的限制，并且，一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
如前所述，本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，因而，本发明的引物组合物和包含该引物组合物的试剂盒，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定尤其是结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别。因而，根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的引物组合物或者试剂盒，在待测分支杆菌菌种鉴定中的用途。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用第一引物组对包含ITS区域的待测分支杆菌核酸样本进行第一PCR扩增，以便获得第一扩增产物；以及利用第二引物组对所述第一扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二扩增产物，所述第二扩增产物构成所述待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库，其中，所述第一引物组的核酸序列如SEQ IDNO:1-2所示，所述第二引物组的核酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。根据本发明的实施例，利用本发明的构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法，一步即能够实现待测分支杆菌ITS区域核酸的富集及文库的构建，操作简单，需时少，并且，本发明的方法适用于各种分支杆菌的菌种鉴定。进而，将利用本发明的方法获得的待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库，用于测序和比对分析后，即可容易地确定待测分支杆菌ITS区域核酸序列、以及其菌种信息，实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，而并不受待测分支杆菌菌种的限制，并且，一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种对待测分支杆菌进行菌种鉴定的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法，构建待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库；对所述待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列；以及基于所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列，确定所述待测分支杆菌的菌种信息。发明人发现，利用本发明的方法能够方便地确定待测分支杆菌的菌种信息，实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，并且操作简单，需时少，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。此外，基于其采用的本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，因而，同样地，本发明的方法适用于各种分支杆菌菌种的鉴定，即不受待测分支杆菌菌种的限制。并且，利用本发明的方法一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：针对所述多个待测分支杆菌样本中的每一个，分别独立地根据前面所述的构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法，构建ITS区域核酸测序文库，其中，所述第一引物组，和/或所述第二引物组，进一步包含标签序列，且所述多个待测分支杆菌样本的标签序列相互不同，所述多个为至少2个；将所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库混合，以便获得混合文库；对所述混合文库进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果包括所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列和所述标签序列；基于所述标签序列对所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列进行区分，并确定所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列；以及基于所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列，分别确定所述多个待测分支杆菌样本的菌种信息。发明人发现，利用本发明的方法能够同时确定多个待测分支杆菌样本的菌种信息，实现对多个待测分支杆菌样本的菌种鉴定，并且操作简单，需时少，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。此外，本发明的方法适用于各种分支杆菌菌种的鉴定，即待测分支杆菌样本的菌种不受限制。并且，针对同一样本中存在多种分枝杆菌的情形，利用本发明的方法一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种对待测分支杆菌进行菌种鉴定的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：文库构建装置，所述文库构建装置中设置有前面所述的引物组合物，用于根据前面所述的构建待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库的方法，构建待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库；第一测序装置，所述第一测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果；第一核酸序列确定装置，所述第一核酸序列确定装置与所述第一测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列；以及第一菌种鉴定装置，所述第一菌种鉴定装置与所述第一核酸序列确定装置相连，用于基于所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列，确定所述待测分支杆菌的菌种信息。根据本发明的实施例，利用本发明的系统能够方便地确定待测分支杆菌的菌种信息，实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，并且操作简单，需时少，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。此外，本发明的系统适用于各种分支杆菌菌种的鉴定，即不受待测分支杆菌菌种的限制。并且，利用本发明的系统一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：文库构建及混合装置，所述文库构建及混合装置用于针对所述多个待测分支杆菌样本中的每一个，分别独立地根据前面所述的构建待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的方法，构建ITS区域核酸测序文库，并将所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库混合，以便获得混合文库，其中，所述第一引物组，和/或所述第二引物组，进一步包含标签序列，且所述多个待测分支杆菌样本的标签序列相互不同，所述多个为至少2个；第二测序装置，所述第二测序装置与所述文库构建及混合装置相连，用于对所述混合文库进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果包括所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列和所述标签序列；第二核酸序列确定装置，所述第二核酸序列确定装置与所述第二测序装置相连，用于基于所述标签序列对所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列进行区分，并确定所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列；以及第二菌种鉴定装置，所述第二菌种鉴定装置与所述第二核酸序列确定装置相连，用于基于所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列，分别确定所述多个待测分支杆菌样本的菌种信息。根据本发明的实施例，利用本发明的系统能够同时确定多个待测分支杆菌样本的菌种信息，实现对多个待测分支杆菌样本的菌种鉴定，并且操作简单，需时少，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。此外，本发明的系统适用于各种分支杆菌菌种的鉴定，即待测分支杆菌样本的菌种不受限制。并且，针对同一样本中存在多种分枝杆菌的情形，利用本发明的系统一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
此外，需要说明的是，本发明提供的引物组合物、对待测分支杆菌进行菌种鉴定的方法和系统，可实现一次实验就可鉴别待测分支杆菌为结核或非结核分枝杆菌，并且可以实现对同一样本中的多种分支杆菌的鉴定，甚至能够精确到亚种，大大减少了工作量；并且，利用本发明的方法，通过序列比对、数据库搜索，可以鉴定出一些不太常见的分枝杆菌，有利于对样本中分支杆菌的种类全面了解。另外，随着测序技术的推广和成本的降低，采用本发明的方法性价比高，且相对便捷，适合大规模运用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的对待测分支杆菌进行菌种鉴定的方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的方法的流程示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的对待测分支杆菌进行菌种鉴定的系统的结构示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的系统的结构示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例，各样本的第二轮扩增产物的电泳检测结果；
图6显示了根据本发明一个实施例，巢氏PCR引物SEQ ID NO:1-4的使用示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
引物组合物、试剂盒
首先，需要说明的是，分枝杆菌16S-23S rRNA转录间隔区(ITS)序列位16S rRNA基因与23S rRNA基因之间，rRNA基因被称为细菌的“活化石”，为高度保守基因。该基因进化速度十分缓慢，据推算1％碱基的取代需要大约50X106年，因而使其具有“分子进化钟"的特点，是目前细菌系统发育分类与鉴定的最常用靶基因。且大部分分枝杆菌只含有一个拷贝ITS序列，不编码最终产物，也不含tRNA基因，序列及长度依菌种不同差异较大。由于缺失了螺旋4(helix 4)、螺旋5(helix 5)缓慢生长分枝杆菌比快速生长分枝杆菌ITS约短75个核苷酸。发明人发现，16S-23S rRNA ITS两端是高度保守的16S rRNA基因和23S rRNA基因序列，可依其设计分枝杆菌属特异性通用引物，中间包括2个分枝杆菌属特异片段和数个高度变异的种特异片段，含有足够的种内多态性及种间保守性的遗传信息，能将难以鉴别的分枝杆菌鉴别开，是分枝杆菌分类和菌株鉴定的良好的靶基因。
因而，根据本发明的一个方面，本发明首先提供了一种引物组合物。根据本发明的实施例，该引物组合物包含：第一引物组，所述第一引物组的核酸序列如SEQ ID NO:1-2所示；以及第二引物组，所述第二引物组的核酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。发明人惊奇地发现，本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌特定区域——ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别。进而，利用本发明的引物组合物对包含ITS区域的待测分支杆菌核酸样本进行两轮PCR扩增，一步即能够实现分支杆菌ITS区域核酸的富集，进而测序后，能够有效获得待测分支杆菌核酸样本ITS区域的核酸序列，经过比对分析即可容易地实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，而并不受待测分支杆菌菌种的限制，并且，一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
需要说明的是，本发明的引物组合物，在使用时，首先要利用SEQ ID NO:1-2所示的第一引物组对待测分支杆菌核酸样本优选DNA进行第一PCR扩增，以便获得第一扩增产物；然后，以第一扩增产物为模板，利用SEQ ID NO:3-4所示的第二引物组进行第二PCR扩增，第二扩增产物即为待测分支杆菌ITS区域核酸，由此，实现对待测分支杆菌ITS区域核酸的富集，进而测序后，能够有效获得待测分支杆菌核酸样本ITS区域的核酸序列，经过比对分析即可容易地实现对待测分支杆菌的菌种鉴定。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的引物组合物。如前所述，本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，因而，本发明的试剂盒能够有效用于分支杆菌菌种鉴定尤其是结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，并且，利用本发明的试剂盒，通过对待测分支杆菌样本进行扩增、测序和比对分析，一次即能够实现待测分支杆菌ITS区域核酸的富集并有效获得待测分支杆菌核酸样本ITS区域的核酸序列，实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，而并不受待测分支杆菌菌种的限制，并且，一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
用途
如前所述，本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，因而，本发明的引物组合物和包含该引物组合物的试剂盒，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定尤其是结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别。因而，根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的引物组合物或者试剂盒，在待测分支杆菌菌种鉴定中的用途。
进而，根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：利用第一引物组对包含ITS区域的待测分支杆菌核酸样本进行第一PCR扩增，以便获得第一扩增产物；以及利用第二引物组对所述第一扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二扩增产物，所述第二扩增产物构成所述待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库，其中，所述第一引物组的核酸序列如SEQID NO:1-2所示，所述第二引物组的核酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。根据本发明的实施例，利用本发明的构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法，一步即能够实现待测分支杆菌ITS区域核酸的富集及文库的构建，操作简单，需时少，并且，基于其采用的本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，因而，同样地，本发明的方法适用于各种分支杆菌的菌种鉴定。进而，将利用本发明的方法获得的待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库，用于测序和比对分析后，即可容易地确定待测分支杆菌ITS区域核酸序列、以及其菌种信息，实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，而并不受待测分支杆菌菌种的限制，并且，一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
根据本发明的实施例，按照25μl反应体系计算，所述第一PCR扩增的反应体系为：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 10×buffer | 2.5 |
| dNTP Mixture | 2.0 |
| 第一引物组(10μM) | 1.0 |
| rTaq聚合酶(5U/μl) | 0.15 |
| 待测分支杆菌DNA | 1.0-3.0(>5ng) |
| ddH2O | 补至25 |
根据本发明的实施例，所述第一PCR扩增的反应程序为：
根据本发明的实施例，按照25μl反应体系计算，所述第二PCR扩增的反应体系为：
| 试剂 | 体积(μl) |
| 10×buffer | 2.5 |
| dNTP Mixture | 2.0 |
| 第二引物组(10μM) | 1.0 |
| rTaq聚合酶(5U/μl) | 0.15 |
| 第一扩增产物 | 1.0(>20ng) |
| ddH2O | 18.35 |
根据本发明的实施例，所述第二PCR扩增的反应程序为：
根据本发明的实施例，进一步包括，从生物样本优选动物痰液中提取所述包含ITS区域的待测分支杆菌核酸样本的步骤，所述待测分支杆菌核酸样本中包含至少一种分支杆菌。根据本发明的一些具体示例，所述生物样本为动物体液，优选为选自动物胸水、脑脊液、血液和痰液的至少一种。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种对待测分支杆菌进行菌种鉴定的方法。发明人发现，利用本发明的方法能够方便地确定待测分支杆菌的菌种信息，实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，并且操作简单，需时少，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。此外，基于其采用的本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，因而，同样地，本发明的方法适用于各种分支杆菌菌种的鉴定，即不受待测分支杆菌菌种的限制。并且，利用本发明的方法一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
具体地，根据本发明的实施例，参照图1，本发明的对待测分支杆菌进行菌种鉴定的方法包括以下步骤：
S101：构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库
根据前面所述的构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法，构建待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库。
S102：对待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库进行测序
对所述待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果。根据本发明的实施例，利用Sanger测序平台进行所述测序。由此，测序结果准确、可靠，可重复性好。
其中，需要说明的是，Sanger法又称为双脱氧链终止法，其原理是DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时，在四管反应体系中分别按一定的比例引入四种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基。经放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷酸，便可获得合成片段的碱基排列顺序。Sanger测序平台测序读段较长，尤其适用于本发明这种扩增片段较长的扩增产物的测序。
S103：确定待测分支杆菌ITS区域核酸序列
基于所述测序结果，确定所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列。
S104：确定待测分支杆菌的菌种信息
基于所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列，确定所述待测分支杆菌的菌种信息。根据本发明的实施例，通过以下步骤确定所述待测分支杆菌的菌种信息：将所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列与参考序列进行比对；以及基于比对结果，确定所述待测分支杆菌的种和亚种信息。根据本发明的实施例，所述参考序列包括各种分支杆菌的ITS区域核酸序列，优选所述参考序列包含结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、溃疡分支杆菌(M.ulcerans)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、卡氏分枝杆菌(M.canettii)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、海分枝杆菌(M.marinum)、马尔摩尔分枝杆菌(M.malmoense)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、喜鲑分支杆菌(M.salmoniphilum)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、楚布分枝杆菌(M.chubuense)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(Mycobacterium avium subsp.hominissuis)、鸟分枝杆菌鸟型亚种(M.avium subsp.avium)以及鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosi)的基因组标准序列
。根据本发明的实施例，所述参考序列来源于NCBI。由此，比对及鉴定结果准确、可靠。
需要说明的是，本发明所使用的术语“比对”即为序列比对，是指将两个或多个序列排列在一起，标明其相似之处。序列比对的计算方法一般分为两类：一类全局性比对(globalalignments)和局部比对(local alignments)。计算一个全局性的路线，是一个全局优化的形式，其强制按照整个长度的所有查询序列对齐。与此相反，局部比对只确定局部的相似而整个长序列却往往大相径庭。局部比对往往是可取的，但可能更难以计算的，因为还有来自确定其他相似区域的挑战。根据本发明的一些实施例，发明人采用NCBI开发的BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool)进行序列比对。其中，本发明所述的“NCBI”即美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information)，“BLAST”是一个序列相似搜索程序，其也可作为鉴别基因和遗传特点的手段。BLAST能够在小于15秒的时间内对整个DNA数据库执行序列搜索。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的方法。发明人发现，利用本发明的方法能够同时确定多个待测分支杆菌样本的菌种信息，实现对多个待测分支杆菌样本的菌种鉴定，并且操作简单，需时少，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。此外，基于该方法采用的本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，因而，同样地，本发明的方法适用于各种分支杆菌菌种的鉴定，即待测分支杆菌样本的菌种不受限制。并且，针对同一样本中存在多种分枝杆菌的情形，利用本发明的方法一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
具体地，根据本发明的实施例，参照图2，本发明的同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的方法包括以下步骤：
S201：分别独立地构建多个待测分支杆菌样本中的每一个的ITS区域核酸测序文库
针对所述多个待测分支杆菌样本中的每一个，分别独立地根据前面所述的构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法，构建ITS区域核酸测序文库，其中，所述第一引物组，和/或所述第二引物组，进一步包含标签序列，且所述多个待测分支杆菌样本的标签序列相互不同，所述多个为至少2个。
S202：将多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库混合
将所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库混合，以便获得混合文库。
S203：对混合文库进行测序
对所述混合文库进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果包括所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列和所述标签序列。根据本发明的实施例，利用Sanger测序平台进行所述测序，由此，能够显著提高测序成功率，且测序结果准确、可靠，测序效率高。
S204：确定多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列
基于所述标签序列对所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列进行区分，并确定所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列。
S205：确定多个待测分支杆菌样本的每一个的菌种信息
基于所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列，分别确定所述多个待测分支杆菌样本的菌种信息。根据本发明的实施例，通过以下步骤分别确定所述多个待测分支杆菌样本的菌种信息：将所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列分别与参考序列进行比对；以及基于比对结果，分别确定所述多个待测分支杆菌的种和亚种信息，其中，所述参考序列包括各种分支杆菌的ITS区域核酸序列，优选所述参考序列包含：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、溃疡分支杆菌(M.ulcerans)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、卡氏分枝杆菌(M.canettii)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、海分枝杆菌(M.marinum)、马尔摩尔分枝杆菌(M.malmoense)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、喜鲑分支杆菌(M.salmoniphilum)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、楚布分枝杆菌(M.chubuense)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(Mycobacterium aviumsubsp.hominissuis)、鸟分枝杆菌鸟型亚种(M.avium subsp.avium)以及鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosi)的基因组标准序列。根据本发明的实施例，所述参考序列来源于NCBI。由此，比对、鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种对待测分支杆菌进行菌种鉴定的系统。根据本发明的实施例，参照图3，该系统100包括：文库构建装置101、第一测序装置102、第一核酸序列确定装置103和第一菌种鉴定装置104。根据本发明的实施例，利用本发明的系统能够方便地确定待测分支杆菌的菌种信息，实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，并且操作简单，需时少，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。此外，基于其采用的本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，因而，同样地，本发明的系统适用于各种分支杆菌菌种的鉴定，即不受待测分支杆菌菌种的限制。并且，利用本发明的系统一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
具体地，根据本发明的实施例，参照图3，在本发明的对待测分支杆菌进行菌种鉴定的系统100中：
文库构建装置101中设置有前面所述的引物组合物，用于根据前面所述的构建待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库的方法，构建待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库。
第一测序装置102与文库构建装置101相连，用于对所述待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果。根据本发明的实施例，所述第一测序装置102为Sanger测序平台。由此，测序结果准确、可靠，可重复性好。
第一核酸序列确定装置103与第一测序装置102相连，用于基于所述测序结果，确定所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列。
第一菌种鉴定装置104与第一核酸序列确定装置103相连，用于基于所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列，确定所述待测分支杆菌的菌种信息。根据本发明的实施例，第一菌种鉴定装置104适于通过以下步骤确定所述待测分支杆菌的菌种信息：将所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列与参考序列进行比对；以及基于比对结果，确定所述待测分支杆菌的种和亚种信息，其中，所述参考序列包括各种分支杆菌的ITS区域核酸序列，优选所述参考序列包含：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、溃疡分支杆菌(M.ulcerans)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、卡氏分枝杆菌(M.canettii)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、海分枝杆菌(M.marinum)、马尔摩尔分枝杆菌(M.malmoense)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、喜鲑分支杆菌(M.salmoniphilum)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、楚布分枝杆菌(M.chubuense)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(Mycobacterium avium subsp.hominissuis)、鸟分枝杆菌鸟型亚种(M.avium subsp.avium)以及鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosi)的基因组标准序列。根据本发明的实施例，所述参考序列来源于NCBI。由此，比对、鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的系统。根据本发明的实施例，参照图4，该系统200包括：文库构建及混合装置201、第二测序装置202、第二核酸序列确定装置203和第二菌种鉴定装置204。根据本发明的实施例，利用本发明的系统能够同时确定多个待测分支杆菌样本的菌种信息，实现对多个待测分支杆菌样本的菌种鉴定，并且操作简单，需时少，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。此外，基于该系统采用的本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别，因而，同样地，本发明的系统适用于各种分支杆菌菌种的鉴定，即待测分支杆菌样本的菌种不受限制。并且，针对同一样本中存在多种分枝杆菌的情形，利用本发明的系统一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
具体地，根据本发明的实施例，参照图4，在本发明的同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的系统200中：
文库构建及混合装置201用于针对所述多个待测分支杆菌样本中的每一个，分别独立地根据前面所述的构建待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的方法，构建ITS区域核酸测序文库，并将所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库混合，以便获得混合文库，其中，所述第一引物组，和所述第二引物组，进一步包含标签序列，且所述多个待测分支杆菌样本的标签序列相互不同，所述多个为至少2个。
第二测序装置202与文库构建及混合装置201相连，用于对所述混合文库进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果包括所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列和所述标签序列。根据本发明的实施例，所述第二测序装置202为Sanger测序平台。由此，测序结果准确、可靠，可重复性好。
第二核酸序列确定装置203与第二测序装置202相连，用于基于所述标签序列对所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列进行区分，并确定所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列。
第二菌种鉴定装置204与第二核酸序列确定装置203相连，用于基于所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列，分别确定所述多个待测分支杆菌样本的菌种信息。根据本发明的实施例，第二菌种鉴定装置204适于通过以下步骤分别确定所述多个待测分支杆菌样本的菌种信息：将所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列分别与参考序列进行比对；以及基于比对结果，分别确定所述多个待测分支杆菌的种和亚种信息，其中，所述参考序列包括各种分支杆菌的ITS区域核酸序列，优选所述参考序列包含：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、溃疡分支杆菌(M.ulcerans)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、卡氏分枝杆菌(M.canettii)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、海分枝杆菌(M.marinum)、马尔摩尔分枝杆菌(M.malmoense)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、喜鲑分支杆菌(M.salmoniphilum)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、楚布分枝杆菌(M.chubuense)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(Mycobacterium aviumsubsp.hominissuis)、鸟分枝杆菌鸟型亚种(M.avium subsp.avium)以及鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosi)的基因组标准序列。根据本发明的实施例，所述参考序列来源于NCBI。由此，比对、鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
需要说明的是，本发明的引物组合物、对待测分支杆菌进行菌种鉴定的方法和系统，尤其适用于下列分枝杆菌的菌种鉴定：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、溃疡分支杆菌(M.ulcerans)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、卡氏分枝杆菌(M.canettii)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、海分枝杆菌(M.marinum)、马尔摩尔分枝杆菌(M.malmoense)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、喜鲑分支杆菌(M.salmoniphilum)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、楚布分枝杆菌(M.chubuense)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(Mycobacterium avium subsp.hominissuis)、鸟分枝杆菌鸟型亚种(M.aviumsubsp.avium)以及鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosi)。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
参照图1和图2，根据本发明的对待测分支杆菌进行菌种鉴定的方法，利用Sanger测序平台，对14份临床痰液样本进行菌种鉴定(该样本由菌种培养的方法已经鉴定出感染的分枝杆菌类型)具体如下：
针对多种分枝杆菌的ITS区域保守位置设计内外两对引物，进而对多个临床样本的提取的细菌DNA样本进行试验，具体操作如下：
1、样本DNA提取
本实施例中，样本来源于均由深圳第三人民医院提供的病人痰液样本，由医院依据“全国结核病诊断细菌学检验规程”进行分支杆菌标准株培养和菌种鉴定，确定14份痰液样本中，有9份为结核分枝杆菌(A组)、5份为非结核分枝杆菌(B组)(包括脓肿分支杆菌、鸟分支杆菌、戈登分枝杆菌)。
取适量被检测物(1-3mL)，加入等量N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化液，震荡30秒，置于室温下15分钟，如果标本粘稠可适当延长消化时间。检测物中加入PBS缓冲液5mL混匀，3000g离心20分钟。去除上清，加入PBS缓冲液1mL重悬沉淀，3000g离心3分钟。去上清，沉淀重悬于50μL无菌水，后95度水浴5分钟。再次12000g离心分离，取上清即为结核杆菌DNA溶液，即可作为PCR模板，长期保存于-20℃；若为培养液，可直接2000rpm/min离心30mins去上清收集菌体，加入50μL无菌水离心清洗，加50μL水，95度煮沸5mins。离心取上清作为PCR模板。
2、ITS区域基因的巢氏PCR扩增
1)引物设计
首先，如图6所示，基于分枝杆菌ITS基因区域在保守位置设计能与之配对的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，其能同时与结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌结核ITS基因序列结合，进行第一轮PCR扩增，是巢式PCR的外引物，即SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2是匹配在各种分枝杆菌共有的ITS区域的保守序列位置；然后，设计第二轮PCR扩增引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，其结合在第一轮PCR产物上，是巢式PCR的内引物。
具体地，各引物序列为：
SEQ ID NO.1：5’-ACGTCATGAAAGTCGGTAACA-3’；
SEQ ID NO.2：5’-TCCTCGGATCAAAGCTCGGTT-3’；
SEQ ID NO.3：5’-ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC-3’；
SEQ ID NO.4：5’-GATGCTCGCAACCACTATYCA-3’。
下表中为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2在NCBI Primer-BLAST程序中各项指标：
同时在覆盖NCBI所有的物种的Nr数据库中验证SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，得出PCR目的产物与多种分枝杆菌相匹配，与其他物种匹配较少，与其匹配的多种分枝杆菌包括：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、溃疡分支杆菌(M.ulcerans)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、卡氏分枝杆菌(M.canettii)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、海分枝杆菌(M.marinum)、马尔摩尔分枝杆菌(M.malmoense)、范巴伦分枝杆菌(M.vanbaalenii)、喜鲑分支杆菌(M.salmoniphilum)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、楚布分枝杆菌(M.chubuense)、鸟分枝杆菌人和猪亚种(Mycobacterium avium subsp.hominissuis)、鸟分枝杆菌鸟型亚种(M.avium subsp.avium)以及鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosi)。详细信息见以下网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi？ctg_time＝1418629370&job_key＝vKdQq-ShTYVyqHamF4hE2AyldskfumvM。其中对健康有害的常见分枝杆菌有：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛型分枝杆菌卡介苗(M.bovis BCG)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、溃疡分支杆菌(M.ulcerans)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、海分枝杆菌(M.marinum)、玛尔摩尔分枝杆菌(M.malmoense)等。
其中，如采用Ion torrent、Hiseq等二代测序平台测序，可在第二轮PCR引物SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4的5’端添加标签序列(tag序列，为6-8个随机碱基，tag序列可以为ACAGCGCT，AGCTCTCG，AGTACTAG，AGTAGACA，TCACGACA等随机序列)，然后通过将不同样本的产物混合后再进行测序，并通过标签序列对测序结果进行区分，由此能够在满足检测要求的同时节约成本；若采用sanger平台测序，则不需加入标签序列，则每一个样本单独进行sanger平台测序及后续鉴定。
2)巢氏PCR
巢氏PCR：将所需试剂置于冰上融化，充分混匀后轻微离心，按下表配置溶液，分装置PCR管，混匀短暂离心。在25μL反应体系中，第一轮模板为被检测物提取的DNA溶液，上下游引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，用量1.0μl(浓度10μM)，反应程序退火温度为58℃，32个循环，以便获得的第一扩增产物；第二轮PCR扩增，在25μL反应体系中，取以上1μL第一扩增产物为模板，上下游引物分别为1.0μl(浓度10μM)的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，反应程序退火温度为58℃，32个循环，以便获得第二扩增产物。反应管置于PCR仪按以下程序进行反应。
电泳检测：取2μL的第二扩增产物进行凝胶电泳检测，采用1.5-2％(m/v)浓度琼脂糖凝胶，120V恒定电压电泳20分钟，染色后在紫外灯下检查扩增效果。图5为PCR扩增结果，其中图A为A组样本结果，M为标准带，1-9为样本编号A-1至A-9，N是模板为去离子水阴性对照；图B为B组样本结果，M为标准带，1-5为样本编号B-1至B-5，N1-N5是模板为去离子水阴性对照。从图5中可以看到存在一条单一信号较强的条带，大小与理论值一致，没有其他非特异的条带存在。其中，由于非结核分枝杆菌在环境中亦存在，为保障结果可靠性，实验及阴性对照设计较为严格；图中电泳条带单一，大小约250左右，与理论值大致相符，由于各样本的浓度存在差异，产物条带亮度不一。
然后，对第二扩增产物进行纯化，去除反应液中残留的引物、dNTPs、盐分、非特异PCR产物。其中，使用酒精/NaAc法对第二扩增产物进行纯化，最终满足200-500bp，3-10ng，DNA纯度：OD260/OD280＝1.6-2.0。
3、sanger测序
采用BigDye Terminator v3.1测序试剂盒，将所需试剂置于冰上融化，充分混匀后轻微离心，按下表比例配置溶液，混匀短暂离心，具体测序反应体系及程序如下：
依次完成以下步骤：关闭加热炉门、样本板栈门和前门；再打开仪器电源开关等待仪器初始化完成；登陆3730Data Collection Software；进一步准备仪器,包括：安装毛细管、更换POP胶、准备缓冲液、毛细管空间定位、光谱校正；设置DNA测序程序，包括：Result Group设置(结果文件的名称、存储位置等)、Protocol Manager(Run Module无特殊要求，选择默认、所采用试剂和仪器)及Plate Manager设置板信息；将组装好的样本板放入样本板栈，运行测序程序。96℃进行预热1分钟；再96℃保持10秒进行变性、50℃保持5秒进行退火、60℃保持4分钟进行延伸，循环该过程25次；最后在4℃下保温。反应完毕，反应产物采用酒精/EDTA/NaAc法纯化。由此，获得下机数据。
4、信息分析
将下机数据Sequence Scanner软件打开，进入“Sequence”栏，将碱基序列背景为蓝色的部分与NCBI数据库进行比对(Pure Base QV“High”表示测序质量高)，复制此部分序列，点击进入http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，点击“nucleotide blast”，或http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome，将复制序列黏贴进Enter Query Sequence文本框中，比对其他条件选择“others”，“Highly similar sequences(megablast)”，最后点击“BLAST”，最后数据以相似度得分从高到低排列。
结果，确定各样本的ITS区域核酸序列如下：
A-1测序结果：
GCCGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGCCGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACTG(SEQ ID NO.5)；
A-2测序结果：
GGGCGTAGGCCGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGCCGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACTGAATAGTGGTTGCGAG(SEQ ID NO.6)；
A-3测序结果：
CGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGCCGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACTGGATAGTGGTTGCGAGC(SEQ ID NO.7)；
A-4测序结果：
GCCGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGCCGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACTGAATAGTGGTTGCGAGC(SEQID NO.8)；
A-5测序结果：
CCGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGCCGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACTGGATAGTGGTTGCGAGCATC(SEQID NO.9)；
A-6测序结果：
GCCGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGCCGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACTGAATAGTGGTTGCGAGC(SEQID NO.10)；
A-7测序结果：
CCGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGCCGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACTGAATAGTGGTTGCGAGCATC(SEQID NO.11)；
A-8测序结果：
GCCGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGCCGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACTGAATAGTGGTTGCGA(SEQ IDNO.12)；
A-9测序结果：
GCGTAGGCCGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGCCGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACTGAATAGTGGTTGCGAGC(SEQ ID NO.13)。
B-1测序结果：
AAAGTAGGCATCTGTAGTGGATATCTACTTGGTGAATATGTTTTGTAAATCCTGTCCACCCCGTGGATGGGTAGTCGGCAAAACGTCGGACTGTCATAAGAATTGAAACGCTGGCACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACGTTGTGTTGTCACCCTGCTTGGTGGTGGGGTGTGGACTTTGACT(SEQ ID NO.14)；
B-2测序结果：
GCGAGCCGTGAGGGGTTCCCGTCTGTAGTGGACGGGGGCCGGGTGCGCAACAGCAAATGATTGCCAGACACACTATTGGGCCCTGAGACAACACTCGGTCCGTCCGTGTGGAGTCCCTCCATCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGTATTGAATAGTGGTTGCGAGCAT(SEQ ID NO.15)；
B-3测序结果：
GTGCAGCCGTGAGGGGTCATCGTCTGTAGTGGACGAAGACCGGGTGCACGACAACAAGCAAAGCCAGACACACTATTGGGTCCTGAGGCAACACCCTCGGGTGCTGTCCCCCCATCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGAACTGAATAGTGGTTGCGAG(SEQ ID NO.16)；
B-4测序结果：
AAAGTAGGCATCTGTAGTGGATATCTACTTGGTGAATATGTTTTGTAAATCCTGTCCACCCCGTGGATGGGTAGTCGGCAAAACGTCGGACTGTCATAAGAATTGAAACGCTGGCACACTGTTGGGTCCTGAGGCAACACGTTGTGTTGTCACCCTGCTTGGTGGTGGGGTGTGGACTTTGACTTC(SEQ ID NO.17)；
B-5测序结果：
GCGAGCCGTGAGGGGTTCCCGTCTGTAGTGGACGGGGGCCGGGTGCGCAACAGCAAATGATTGCCAGACACACTATTGGGCCCTGAGACAACACTCGGTCCGTCCGTGTGGAGTCCCTCCATCTTGGTGGTGGGGTGTGGTGTTTGAGTATTGAATAGTGGTTGCGAGCATCA(SEQ ID NO.18)；
鉴定获得的各样本的分支杆菌菌种信息如下：
上表显示了9例感染结核分枝杆菌病人的样本与5例感染非结核分枝杆菌病人样本的两种鉴定方法结果的比较，两者结果完全一致。其中，B-2、B-5样本采用本方法可鉴定至亚种，更为精确。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种引物组合物，其特征在于，包含：
第一引物组，所述第一引物组的核酸序列如SEQ ID NO:1-2所示；以及
第二引物组，所述第二引物组的核酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。
2.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组合物。
3.权利要求1所述的引物组合物，或者权利要求2所述的试剂盒，在待测分支杆菌菌种鉴定中的用途。
4.一种构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用第一引物组对包含ITS区域的待测分支杆菌核酸样本进行第一PCR扩增，以便获得第一扩增产物；以及
利用第二引物组对所述第一扩增产物进行第二PCR扩增，以便获得第二扩增产物，所述第二扩增产物构成所述待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库，
其中，所述第一引物组的核酸序列如SEQ ID NO:1-2所示，所述第二引物组的核酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，按照25μl反应体系计算，所述第一PCR扩增的反应体系为：
任选地，所述第一PCR扩增的反应程序为：
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，按照25μl反应体系计算，所述第二PCR扩增的反应体系为：
任选地，所述第二PCR扩增的反应程序为：
任选地，进一步包括，从生物样本中提取所述包含ITS区域的待测分支杆菌核酸样本的步骤，所述待测分支杆菌核酸样本中包含至少一种分支杆菌，
优选地，所述生物样本为选自动物胸水、脑脊液、血液和痰液的至少一种。
7.一种对待测分支杆菌进行菌种鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
根据权利要求4-6任一项所述的方法，构建待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库；
对所述待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果；
基于所述测序结果，确定所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列；以及
基于所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列，确定所述待测分支杆菌的菌种信息，
任选地，利用Sanger测序平台进行所述测序，
任选地，通过以下步骤确定所述待测分支杆菌的菌种信息：
将所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列与参考序列进行比对；以及
基于比对结果，确定所述待测分支杆菌的种和亚种信息，
其中，所述参考序列包括各种分支杆菌的ITS区域核酸序列，
任选地，所述参考序列来源于NCBI。
8.一种同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
针对所述多个待测分支杆菌样本中的每一个，分别独立地根据权利要求4-6任一项所述的方法，构建ITS区域核酸测序文库，其中，所述第一引物组，和/或所述第二引物组，包含待测样本中分枝杆菌的ITS区域核酸序列；
对所述文库进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果包括所述待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列；
基于所述待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列，分别确定所述待测分支杆菌样本的菌种信息，
任选地，利用Sanger测序平台进行所述测序，
任选地，通过以下步骤分别确定所述多个待测分支杆菌样本的菌种信息：
将所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列分别与参考序列进行比对；以及
基于比对结果，分别确定所述多个待测分支杆菌的种和亚种信息，
其中，所所述参考序列包括各种分支杆菌的ITS区域核酸序列，
任选地，所述参考序列来源于NCBI。
9.一种对待测分支杆菌进行菌种鉴定的系统，其特征在于，包括：
文库构建装置，所述文库构建装置中设置有权利要求1所述的引物组合物，用于根据权利要求4-6任一项所述的方法，构建待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库；
第一测序装置，所述第一测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述待测分支杆菌的ITS区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果；
第一核酸序列确定装置，所述第一核酸序列确定装置与所述第一测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列；以及
第一菌种鉴定装置，所述第一菌种鉴定装置与所述第一核酸序列确定装置相连，用于基于所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列，确定所述待测分支杆菌的菌种信息，
任选地，所述第一测序装置为Sanger测序平台，
任选地，所述第一菌种鉴定装置适于通过以下步骤确定所述待测分支杆菌的菌种信息：
将所述待测分支杆菌ITS区域的核酸序列与参考序列进行比对；以及
基于比对结果，确定所述待测分支杆菌的种和亚种信息，
其中，所述参考序列包括各种分支杆菌的ITS区域核酸序列，
任选地，所述参考序列来源于NCBI。
10.一种同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的系统，其特征在于，包括：
文库构建及混合装置，所述文库构建及混合装置用于针对所述多个待测分支杆菌样本中的每一个，分别独立地根据权利要求4-6任一项所述的方法，构建ITS区域核酸测序文库，并将所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库混合，以便获得混合文库，其中，所述第一引物组，和/或所述第二引物组，可在第二组引物的5’端加入标签序列(为6-8个随机碱基)，混合文库进一步包含标签序列，且所述多个待测分支杆菌样本的标签序列相互不同，所述多个为至少2个；
第二测序装置，所述第二测序装置与所述文库构建及混合装置相连，用于对所述混合文库进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果包括所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列和所述标签序列；
第二核酸序列确定装置，所述第二核酸序列确定装置与所述第二测序装置相连，用于基于所述标签序列对所述多个待测分支杆菌样本的ITS区域核酸测序文库的序列进行区分，并确定所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列；以及
第二菌种鉴定装置，所述第二菌种鉴定装置与所述第二核酸序列确定装置相连，用于基于所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列，分别确定所述多个待测分支杆菌样本的菌种信息，
任选地，所述第二测序装置为新一代测序平台(如：ion torrent、Hiseq等二代测序平台)，
任选地，所述第二菌种鉴定装置适于通过以下步骤分别确定所述多个待测分支杆菌样本的菌种信息：
将所述多个待测分支杆菌样本的每一个的ITS区域核酸序列分别与参考序列进行比对；以及
基于比对结果，分别确定所述多个待测分支杆菌的种和亚种信息，
其中，所述参考序列包括各种分支杆菌的ITS区域核酸序列，
任选地，所述参考序列来源于NCBI。
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