CN102409103B - 下呼吸道病原菌的多重降落pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
下呼吸道病原菌的多重降落pcr检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102409103B CN102409103B CN 201110401932 CN201110401932A CN102409103B CN 102409103 B CN102409103 B CN 102409103B CN 201110401932 CN201110401932 CN 201110401932 CN 201110401932 A CN201110401932 A CN 201110401932A CN 102409103 B CN102409103 B CN 102409103B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- streptococcus pneumoniae
- mycobacterium tuberculosis
- pcr
- tuberculosis complex
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Abstract
本发明设计了肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群的特异性引物,并建立了可同时检测这些细菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法,采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。所述试剂盒包括:10×PCR缓冲液,MgCl2,dNTP,TaqDNA聚合酶,BSA,肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群阳性对照DNA,肺炎链球菌引物,b型流感嗜血杆菌引物和结核分枝杆菌复合群引物。该试剂盒可同时快速检测下呼吸道标本中肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、b型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzaetypeb)与结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)。本发明建立的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法快速、简便、特异、灵敏,可用于肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群感染的快速诊断与流行病学调查。
Description
技术领域
本发明涉及下呼吸道感染性疾病的分子诊断技术领域,具体涉及多重降落PCR 检测方法在下呼吸道标本中肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b)与结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)检测中的应用。
背景技术
肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌是引起社区获得性肺炎的主要病原菌。肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌疫苗尚未纳入我国的一类免疫规划中。结核分枝杆菌复合群是一群可引起结核的分枝杆菌,包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、卡介苗(Mycobacterium bovis BCG)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、卡耐提分枝杆菌(Mycobacterium canettii)、海豹分枝杆菌(Mycobacterium pinnipedii)与Mycobacterium mungi。WHO报道2009年全球有170万人死于结核。当前肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群的常规检测方法基于培养法,操作耗时且灵敏度低。近来,PCR技术改善了细菌检测的灵敏度。Kim, W.等(Kim, W., et al., Identification of the cpsA gene as a specific marker for the discrimination of Streptococcus pneumoniae from viridans group streptococci. Journal of Medical Microbiology, 2010. 59(10): p. 1146-1152.)发现cpsA基因可作为检测肺炎链球菌的特异性标志物。Marty, A等(Marty, A., et al., Detection of Haemophilus influenzae type b by real-time PCR. J Clin Microbiol, 2004. 42(8): p. 3813-5.)建立了基于荚膜位点II区(region II of the capsulation locus,cap)特异检测b型流感嗜血杆菌的实时定量PCR。Hellyer, T等(Hellyer, T., et al., Specificity of IS6110-based amplification assays for Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin. Microbiol., 1996. 34(11): p. 2843-2846.)发现基于插入序列IS6110的PCR可特异检测结核分枝杆菌复合群。Korbie, D.J.等(Korbie, D.J. and J.S. Mattick, Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3(9): p. 1452-1456.)发现降落PCR可提高PCR的特异性与灵敏度。当前尚无可同时检测肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群的多重PCR报道。本发明建立的多重降落PCR可同时直接检测下呼吸道标本中的肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群,费时少,具高度特异性与灵敏性,有利于肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群感染的快速诊断与流行病学调查。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可同时快速检测下呼吸道标本中肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群的多重PCR检测试剂盒及检测方法。
为了解决上述技术问题,本发明是通过以下技术发案实现的:
一种下呼吸道病原菌多重降落PCR检测试剂盒,包括:10×PCR缓冲液,MgCl2,dNTP,Taq DNA聚合酶,BSA,肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群阳性对照DNA,肺炎链球菌引物,b型流感嗜血杆菌引物和结核分枝杆菌复合群引物;
所述肺炎链球菌引物序列为:5’- AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3’(SEQ ID NO.1)与5’- GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3’ (SEQ ID NO.2);
所述b型流感嗜血杆菌引物序列为:5’- ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3’ (SEQ ID NO.3)与5’- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3’ (SEQ ID NO.4);
所述结核分枝杆菌复合群引物序列为:5’- GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3’ (SEQ ID NO.5)与5’- CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3’ (SEQ ID NO.6)。
本发明还公开了应用上述试剂盒的检测方法:
(一) 提取待检样本DNA
(二) 多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的cpsA、cap基因与IS6110序列,具体步骤如下:
反应体系: 25 μl
H2O 11.55 μl
缓冲液(10×PCR) 2.5 μl
BSA(10 mg/ml) 0.25 μl
Sp_cpsA-F(10 μmol/L) 1 μl
Sp_cpsA-R(10 μmol/L) 1 μl
Hib_cap-F(10 μmol/L) 1 μl
Hib_cap-R(10 μmol/L) 1 μl
TB_IS6110-F(10 μmol/L) 1 μl
TB_IS6110-R(10 μmol/L) 1 μl
MgCl2(25 mM) 2 μl
dNTP(10 mM) 0.5 μl
Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.2 μl
DNA 模板 2 μl
引物:
肺炎链球菌引物为:
Sp_cpsA-F:5’- AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3’ (SEQ ID NO.1)
Sp_cpsA-R:5’- GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3’ (SEQ ID NO.2)
b型流感嗜血杆菌引物为:
Hib_cap-F:5’- ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3’ (SEQ ID NO.3)
Hib_cap-R:5’- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3’ (SEQ ID NO.4)
结核分枝杆菌复合群引物为:
TB_IS6110-F:5’- GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3’ (SEQ ID NO.5)
TB_IS6110-R:5’- CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3’ (SEQ ID NO.6)
(三) PCR反应循环参数如下:
94℃ 5min;94 ℃ 30s, 65℃ (每循环降低0.5℃) 30 s, 72℃ 1 min,20个循环;94 ℃ 30s, 55 ℃ 30s,72℃ 1 min,20 个循环;72℃ 7 min;
(四) 电泳检测鉴定:
对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测,如电泳图中含有653 bp、177 bp、494 bp条带则分别代表检出肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群。
有益效果:本发明所建立的多重降落PCR可克服常规培养的耗时长、灵敏度低等问题,具有快速、简便、特异、灵敏度高等特征。可于当天出检测结果报告,可同时检测肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群,对三者DNA的检测下限分别达6.3pg、0.2 pg与0.02 pg。该多重降落PCR可广泛用于肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群感染的快速诊断与流行病学调查。
附图说明
图1为建立的多重降落PCR的特异性检测结果;M:DL2000 DNA 分子质量标准;泳道1-15模板依次对应为:b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、卡介苗、阴性对照、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、卡它莫拉菌(Moraxella (Branhamella) catarrhalis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)。
具体实施方式
实施例1:
痰标本预处理:痰标本应用生理盐水洗涤2次,加入等量的1%胰酶(当天现配现用)于37℃消化90 min。
提取痰标本中的细菌DNA:取已消化的痰标本1.5 ml用Takara minibest细菌基因组提取试剂盒(Takara,大连宝生)提取痰标本中的细菌DNA。提取的DNA直接用于PCR扩增或置于-20℃保存备用。
PCR扩增总体系25 μl,在200 μl PCR小管内依次加入11.55μl双蒸水,2.5μl缓冲液(10×PCR),BSA(10 mg/ml)0.25μl、引物(10 μmol/L)Sp_cpsA-F、Sp_cpsA-R、Hib_cap-F、Hib_cap-R、TB_IS6110-F、TB_IS6110-R各1 μl,2 μl MgCl2(25 mM),0.5 μl dNTP(10 mM),0.2 μl Taq DNA聚合酶(5U/μl),2 μl 提取的痰标本DNA。同时设肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌阳性模板对照与阴性对照(双蒸水作为模板)。手指轻弹混匀,短暂离心后放入PCR仪。
引物序列如下:
肺炎链球菌引物为:Sp_cpsA-F:5’- AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3’,Sp_cpsA-R:5’- GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3’,扩增片断长度653 bp; b型流感嗜血杆菌引物为: Hib_cap-F:5’- ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3’,Hib_cap-R:5’- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3’,扩增片断长度177 bp;结核分枝杆菌复合群引物为:TB_IS6110-F:5’- GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3’,TB_IS6110-R:5’- CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3’,扩增片断长度494 bp。
设置PCR反应循环参数:94℃ 5min;94 ℃ 30s, 65℃ (每循环降低0.5℃) 30 s, 72℃ 1 min,20个循环;94 ℃ 30s, 55 ℃ 30s,72℃ 1 min,20 个循环;72℃ 7 min。
扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,上样量为5 μl与6×上样缓冲液混匀后加入胶孔中,于1×TAE溶液中,在100V电压下,电泳30 min,电泳后经1 μg/μl的溴化乙锭浸泡染色10-20 min后,于凝胶成像分析系统中分析检测结果如图1。如阴性对照无条带,阳性对照出现对应大小的条带,检测样本出现653 bp大小的条带,则判定检出肺炎链球菌,出现177 bp 大小的条带判定检出b型流感嗜血杆菌,出现494 bp大小的条带判定检出结核分枝杆菌复合群;如阳性对照无对应条带出现或阴性对照出现非特异性条带,则判为实验失败,需重新检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 下呼吸道病原菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtggtaact gcgttagtcc ta 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtggcgttgt ggtcaagag 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgttagatc gtgcggatac tc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcgaggaaca gaaccatcag 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggtagcagac ctcacctatg t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctctggcgtt gagcgtagta 20
Claims (1)
1.一种下呼吸道病原菌多重降落PCR检测试剂盒,包括:10×PCR缓冲液,MgCl2,dNTP,Taq DNA聚合酶,BSA,肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌阳性对照DNA,肺炎链球菌引物,b型流感嗜血杆菌引物和结核分枝杆菌复合群引物;
所述肺炎链球菌引物序列为:5’- AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3’与5’- GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3’;
所述b型流感嗜血杆菌引物序列为:5’- ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3’与5’- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3’;
所述结核分枝杆菌复合群引物序列为:5’- GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3’与5’- CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3’。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110401932 CN102409103B (zh) | 2011-12-07 | 2011-12-07 | 下呼吸道病原菌的多重降落pcr检测试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110401932 CN102409103B (zh) | 2011-12-07 | 2011-12-07 | 下呼吸道病原菌的多重降落pcr检测试剂盒及检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102409103A CN102409103A (zh) | 2012-04-11 |
CN102409103B true CN102409103B (zh) | 2013-03-13 |
Family
ID=45911442
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201110401932 Expired - Fee Related CN102409103B (zh) | 2011-12-07 | 2011-12-07 | 下呼吸道病原菌的多重降落pcr检测试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102409103B (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102660645B (zh) * | 2012-05-07 | 2016-09-28 | 江苏和创生物科技有限公司 | 肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的特异性检测用引物探针组合和试剂盒 |
CN102653793A (zh) * | 2012-05-14 | 2012-09-05 | 江苏大学 | 鲍曼不动杆菌多重降落pcr检测试剂盒 |
CN102808031B (zh) * | 2012-08-24 | 2013-11-20 | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC引物和方法 |
CN102888460B (zh) * | 2012-10-12 | 2013-10-23 | 江苏大学 | 肺炎链球菌多重降落pcr检测试剂盒及检测方法 |
CN108950026A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-12-07 | 镇江德威乐普能源环保科技有限公司 | 水体中三种病原菌多重降落pcr检测试剂盒及检测方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1414112A (zh) * | 2002-08-30 | 2003-04-30 | 南开大学 | 用于鉴定血液中病原菌的基因芯片及其制造方法 |
CN101545010A (zh) * | 2009-05-11 | 2009-09-30 | 北京海康基因芯片开发有限公司 | 一种检测传染病病原体的方法及试剂盒 |
CN101748193A (zh) * | 2008-12-05 | 2010-06-23 | 天津生物芯片技术有限责任公司 | 一种检测下呼吸道致病菌的基因芯片和试剂盒 |
-
2011
- 2011-12-07 CN CN 201110401932 patent/CN102409103B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1414112A (zh) * | 2002-08-30 | 2003-04-30 | 南开大学 | 用于鉴定血液中病原菌的基因芯片及其制造方法 |
CN101748193A (zh) * | 2008-12-05 | 2010-06-23 | 天津生物芯片技术有限责任公司 | 一种检测下呼吸道致病菌的基因芯片和试剂盒 |
CN101545010A (zh) * | 2009-05-11 | 2009-09-30 | 北京海康基因芯片开发有限公司 | 一种检测传染病病原体的方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
四种结核分枝杆菌检测方法的比较;许蕴怡等;《现代医院》;20071031;第7卷(第10期);61-62 * |
许蕴怡等.四种结核分枝杆菌检测方法的比较.《现代医院》.2007,第7卷(第10期),61-62. |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102409103A (zh) | 2012-04-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Meumann et al. | Clinical evaluation of a type III secretion system real-time PCR assay for diagnosing melioidosis | |
CN102409103B (zh) | 下呼吸道病原菌的多重降落pcr检测试剂盒及检测方法 | |
CN105112519A (zh) | 一种基于crispr的大肠杆菌o157:h7菌株检测试剂盒及检测方法 | |
Zbinden et al. | recA-based PCR assay for accurate differentiation of Streptococcus pneumoniae from other viridans streptococci | |
CN104862406A (zh) | 一种用于现场快速检测结核分枝杆菌复合群的引物与探针及其试剂盒 | |
CN102533959A (zh) | 一种鉴别结核分枝杆菌的多重pcr试剂盒 | |
CN104059977B (zh) | 一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒 | |
Reddington et al. | Novel multiplex real-time PCR diagnostic assay for identification and differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium canettii, and Mycobacterium tuberculosis complex strains | |
CN103421898B (zh) | 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 | |
Nagdev et al. | Determination of polymerase chain reaction efficiency for diagnosis of tuberculous meningitis in Chelex-100® extracted DNA samples | |
Favaro et al. | A multi-target real-time PCR assay for rapid identification of meningitis-associated microorganisms | |
CN103468811B (zh) | 小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重pcr检测引物组和试剂盒 | |
CN109680084A (zh) | 一种用于荧光定量pcr检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法 | |
CN102653793A (zh) | 鲍曼不动杆菌多重降落pcr检测试剂盒 | |
Foongladda et al. | Multi-probe real-time PCR identification of four common Candida species in blood culture broth | |
Wang et al. | Identification of Mycobacterium species in direct respiratory specimens using reverse blot hybridisation assay | |
Gal et al. | Application of a polymerase chain reaction to detect Burkholderia pseudomallei in clinical specimens from patients with suspected melioidosis | |
CN102888460B (zh) | 肺炎链球菌多重降落pcr检测试剂盒及检测方法 | |
CN102747144A (zh) | 三种菌的三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 | |
WO2012117431A1 (en) | Method and reagent kit for the identification of biological fluids in a sample | |
Giglio et al. | Legionella confirmation using real-time PCR and SYTO9 is an alternative to current methodology | |
CN103014135A (zh) | 一种鉴定结核分枝杆菌的方法 | |
CN115747361B (zh) | 检测海豚链球菌的实时荧光mira和mira-lfd引物组及检测方法 | |
Ramos et al. | Capilia™ TB-Neo assay: a new tool for rapid distinction between tuberculous and non-tuberculous mycobacteria | |
CN107236812A (zh) | 用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒、检测方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130313 Termination date: 20151207 |
|
EXPY | Termination of patent right or utility model |