CN109680084A - 一种用于荧光定量pcr检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法 - Google Patents

一种用于荧光定量pcr检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109680084A
CN109680084A CN201910060901.2A CN201910060901A CN109680084A CN 109680084 A CN109680084 A CN 109680084A CN 201910060901 A CN201910060901 A CN 201910060901A CN 109680084 A CN109680084 A CN 109680084A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycobacterium tuberculosis
seq
probe
primer
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910060901.2A
Other languages
English (en)
Inventor
马彩霞
畅志强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Daimei Instruments Co Ltd
Original Assignee
Beijing Daimei Instruments Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Daimei Instruments Co Ltd filed Critical Beijing Daimei Instruments Co Ltd
Priority to CN201910060901.2A priority Critical patent/CN109680084A/zh
Publication of CN109680084A publication Critical patent/CN109680084A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明发明了一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法，所述引物探针包括两套上下游引物及探针，其序列分别如IS‑F1(SEQ ID NO：1)、IS‑F2(SEQ IDNO：3)、IS‑R1(SEQ ID NO：2)和IS‑R2(SEQ ID NO：4)；探针IS‑FAM1(SEQ ID NO：5)和IS‑FAM2(SEQ ID NO：6)；利用所述检测试剂荧光定量PCR扩增检测结核分枝杆菌复合群的方法，包括以下步骤：将待测基因样本与所述检测试剂混合，放置在荧光定量PCR仪中，采用touchdown循环程序，在退火阶段检测荧光值，根据有无荧光值，判断待检测基因样本是否属于结核分枝杆菌复合群。相对于现有技术，本发明通过检测结核分枝杆菌中的基因组，更加灵敏特异地检测结核分枝杆菌基因，有效区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。

Description

一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的引物探针 及方法
技术领域
本发明涉及一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法，属于结核 分枝杆菌检测试剂技术领域。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌等引起的慢性传染性疾病， 可累及全身各个器官，以肺结核最为多见。其中，结核病的病原菌主要是结核分枝杆菌，牛 结核分枝杆菌次之。结核分枝杆菌主要是经空气传播，大多数人在感染结核分枝杆菌后并无 症状，称为潜伏感染。潜伏感染可持续几十年，仅有5％-10％的潜伏感染者发展为活动性肺 结核。
在结核病的细菌学检验中，通常将分枝杆菌分为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex)和非结核分枝杆菌(Nontuberculosismycobacteria，NTM)。结核 分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛结核分枝杆菌(M.bovis)、非洲分 枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.microti)。在结核分枝杆菌复合群内各种中，除 田鼠分枝杆菌对人无致病力外，其他三种菌均可对人致病，产生大致相同的临床表现。因此， 临床上往往只做结核分枝杆菌复合群的鉴定而不进行亚种水平的鉴定，用于结核辅助诊断的 核酸检测试剂也常采用结核分枝杆菌复合群共有的核酸序列作为靶标来进行检测。
核酸检测是肺结核病原学诊断的重要参考。与其他实验室检查方法比较，核酸检测的价 值在于：(1)可快速鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌，提高涂片阳性肺结核的诊 断特异性；(2)与涂片比较，灵敏度较高，可提高涂片阴性肺结核的检出率；(3)与培养相 比，操作快速，可及早进行正确的医疗处置。
目前的分子生物学方法针对的靶基因多数为结核分枝杆菌的重复序列，IS6110由于其 在结核分枝杆菌复合群中的拷贝数为10-20，因此它从90年代以来一直作为结核分枝杆菌复 合群诊断的极好靶标，如在结核分枝杆菌AP018035.1菌株中有高达二十二个拷贝，在田鼠分 枝杆菌CP010333.1菌株中有八个拷贝，山羊分枝杆菌CP016401.1中有三个拷贝，在非洲分 枝杆菌CP014517.1、牛分枝杆菌CP015773.2株和牛分枝杆菌BCG株中有一个拷贝。有报道 称IS6110在一些地区的检测效果不佳(如东南亚地区和越南)，主要原因是因为部分菌株基 因组中仅含1个拷贝IS6110。鉴于此，我们同时选择只存在于结核分枝杆菌复合群中的IS1081 基因，该基因在结核分枝杆菌基因组中的拷贝数为5-7，在结核分枝杆菌基因检测中，同时 扩增这两基因，并且都使用同一荧光染料FAM进行标记，这样不但能提高检测的特异性，而
目前绝大部分定量PCR扩增都采用变性、复性和延伸三步的循环过程，而我们采用降落 PCR(touchdown PCR)，将退火温度的起始温度高于计算的Tm10度左右，在接下来的循环中， 退火温度每个循环降低1度，直到达到正常退火温度，一共进行10个循环，使用该方法增加 了PCR反应的特异性，降低非特异性产物的出现。
发明内容
发明目的：为了提高结核分枝杆菌复合群检测的灵敏性和特异性，本发明提供了一种用于荧 光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明提供了一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复 合群的引物，包括两套上游引物和下游引物，其序列分别如下：
上游引物IS-F1 5’-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物IS-R1：5’-CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG-3’(SEQ ID NO：2)
上游引物IS-F2：5’-GCCGAACAACACGACGAATGGA-3’(SEQ ID NO：3)
下游引物IS-R2：5’-GGTGGCAGTCTAGGTGGTCAGT-3’(SEQ ID NO：4)
本发明还提供了包含所述引物的结核分枝杆菌复合群的荧光定量PCR检测试剂，包括如下组 分：
上游引物IS-F1、IS-F2，下游引物IS-R1、IS-R2和探针IS-FAM1及IS-FAM2；
所述探针IS-FAM1和IS-FAM2的序列如下所示：
探针IS-FAM1：5’-F-AGGCCACGTAGGCGAACCCTGCCC-Q-3’(SEQ ID NO：5)
探针IS-FAM2：5’-F-ACGGCGCTACCTGGGCCTCGAGG-Q-3’(SEQ ID NO：6)
其中F＝FAM Q＝BQ1
所述的结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR检测试剂，所述25μL检测试剂中，含有10μM上游 引物IS-F1，10μM上游引物IS-F2，10μM下游引物IS-F3，10μM下游引物IS-F4，8μM探针IS-FAM1，8μM探针IS-FAM2。
本发明最后还提供了利用所述检测试剂荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的方法，包 括以下步骤：
将待检测基因样本与PCR Mix以及所述检测试剂混合，放置在荧光定量PCR仪器中，PCR 扩增程序采用touchdown的程序，具体为：
Touchdown循环程序：94℃10S，71℃15S(每个循环下降1℃)，72℃15S，共10个 循环；接着40个循环，94℃10S，61℃30S(进行荧光检测)，72℃15S。
所述仪器为荧光定量PCR仪。
技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：
1)常规检测方法：
传统的结核病实验室检测主要是涂片抗酸染色检测和结核分枝杆菌(MTB)培养法。抗酸 染色检查敏感性差，细菌量至少要大于5×106/L才能检测到阳性结果，而且无法区分MTB和 非MTB感染。MTB培养阳性是TB诊断的金标准，但报告周期过长(2～8周)，很难满足临床需 要。
2)分子生物学检测方法：
目前的分子生物学方法针对的靶基因多数为单一的结核分枝杆菌复合群的重复序列 IS6110，由于该序列存在于大多数结核分枝杆菌复合群中，且拷贝数较高，一直作为结核分 枝杆菌复合群检测的目标基因，但是新近发现的菌株的该重复序列的拷贝数很低。如在结核 分枝杆菌AP018035.1菌株中有高达二十二个拷贝，在田鼠分枝杆菌CP010333.1菌株中有八 个拷贝，山羊分枝杆菌CP016401.1中有三个拷贝，在非洲分枝杆菌CP014517.1、牛分枝杆 菌CP015773.2株和牛分枝杆菌BCG株中有一个拷贝，从而使得对结核分枝杆菌复合群的检测 灵敏性和特异性低。本发明以结核分枝杆菌复合群特异的IS6110和IS1081基因同时作为检 测靶目标，IS1081在所有结核分枝杆菌复合群中都存在，该基因在结核分枝杆菌基因组中的 拷贝数为5-7，将IS6110和IS1081两基因同时检测，可以提高对结核分枝杆菌复合群检测 的灵敏性和特异性，避免假阴性的发生。经分析得到如SEQ No.1和SEQ No.2所示碱基序列 的IS6110和IS1081基因的保守序列，经NCBI-Blast分析，IS6110和IS1081基因的保守序 列在结核分枝杆菌复合群中具有高度同源性，且与其它微生物无同源性序列。分别根据该结 核分枝杆菌复合群的IS6110和IS1081基因的保守序列设计引物和探针，这些引物和探针对 结核分枝杆菌复合群的检测具有良好的准确性、特异性和灵敏度。通过实验证实，以本发明 提供的引物对和探针对结核分枝杆菌复合群的检测准确率可达100％，对其他非结核分枝杆菌 菌种进行检测，未见荧光信号。
3)目前绝大部分定量PCR扩增都采用变性、复性和延伸三步的循环过程，对于检测模板数少 的样本，不能进行有效扩增。而我们采用降落PCR(touchdown PCR)，将退火温度的起始温 度高于计算的Tm 10度左右，在接下来的循环中，退火温度每个循环降低1度，直到达到正 常退火温度，一共进行10个循环，使用touchdown方法先对检测丰度低的目标模板先进行富 集，然后再使用正常PCR扩增程序进行扩增，这样增加了PCR反应的特异性，降低非特异性 产物的出现。
附图说明
图1为本发明IS6110引物和探针的具体设计思路；(IS6110引物和探针序列图如图1所示)
图2为本发明IS1081引物和探针的具体设计思路；(IS1081引物和探针序列图如图2所示)
图3为本发明选取的IS6110(SEQ No.1)和IS1081(SEQ No.2)的保守序列；(IS6110(SEQ No.1) 和IS1081(SEQ No.2)在结核分枝杆菌复合群中的保守序列如图3所示)
图4为本发明实施例中对结核分枝杆菌PCR检测试剂国家参考品中的最低检出量参考品进行 检测；(本发明检测结核分枝杆菌PCR检测试剂国家参考品中的最低检出量参考品如图4所示)
曲线S1：结核分枝杆菌单细胞悬液，浓度1×103个菌/mL
曲线S2：结核分枝杆菌单细胞悬液，浓度1×102个菌/mL
曲线S3：结核分枝杆菌单细胞悬液，浓度1×101个菌/mL
曲线S4：结核分枝杆菌单细胞悬液，浓度1×100个菌/mL
曲线水：阴性对照
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例 所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的两套引物，包括上游引物和下游引物，其 序列分别如下：
上游引物IS-F1：5’-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物IS-R1：5’-CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG-3’(SEQ ID NO：2)
上游引物IS-F2：5’-GCCGAACAACACGACGAATGGA-3’(SEQ ID NO：3)
下游引物IS-R2：5’-GGTGGCAGTCTAGGTGGTCAGT-3’(SEQ ID NO：4)
实施例2
包含所述引物的结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR扩增检测试剂，包括如下组分：
上游引物IS-F1、IS-F2，下游引物IS-R1、IS-R2和探针IS-FAM1及IS-FAM2；
所述探针IS-FAM1和IS-FAM2的序列和结构如下所示：
探针IS-FAM1 5’-F-AGGCCACGTAGGCGAACCCTGCCC-Q-3’(SEQ ID NO：5)
探针IS-FAM2：5’-F-ACGGCGCTACCTGGGCCTCGAGG-Q-3’(SEQ ID NO：6)
其中F＝FAM Q＝BQ1
所述25μL检测试剂中，含有10μM上游引物IS-F1，10μM上游引物IS-F2，10μM下游引物 IS-R1，10μM下游引物IS-R2，8μM探针IS-FAM1，8μM探针IS-FAM2。
实施例3利用所述检测试剂荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的方法
(一)DNA的提取
1、痰液的液化：将痰液样品加到50mL带螺旋盖子的试管中。视样品性状，加1～2倍体积4％NaOH消化液于痰管中，拧紧螺旋盖，涡旋振荡器上振荡1分钟，使痰液充分匀化，室温放置 于生物安全柜内，约15-20分钟，期间震荡数次，以保证痰液完全液化。将上述液化的痰液， 离心13000rpm/15分钟，收集沉淀，在沉淀中加入1mL去离子纯化水洗涤，离心，留沉淀备 用。
2、DNA的提取：在上述沉淀中，加入50μL核酸提取液，(10mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA， pH8.0，1.0％TritonX-100)混合100℃煮沸15分钟后，离心13000rpm/15分钟，转移上清到 新的1.5mL离心管中，上清液即为PCR扩增的DNA模板。
(二)检测方法
PCR扩增体系25μL：12.5μL 2×扩增缓冲液，1μL IS-F1，1μL IS-F2，1μL IS-R1，1μL IS-R2，0.8μL IS-FAM1，0.8μL IS-FAM2，1.9μL水，5.0μL样本DNA。将该体系放置 在荧光定量PCR仪器中，PCR程序设置如下：50℃120S，94℃600S，然后94℃10S，71℃15S(每 个循环下降1℃)，72℃15S，共10个循环，接着94℃10s，61℃30S(FAM通道进行荧光 检测)，72℃15S，共40个循环。实验设置阳性对照和阴性对照。
(三)检出最低检出量参考品
从中国食品药品检定研究院购买了一套结核分枝杆菌PCR检测试剂国家参考品，对最低检 出量参考品进行了DNA的提取及检测，结果可以检出1×100个菌/mL的结核分枝杆菌细胞悬 液，而阴性样本没有扩增，如图4所示。
(四)结核分枝杆菌复合群检测实例
1、对结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品中的结核分枝杆菌复合群和十五种阴性参考 品(即非结核分枝杆菌)进行DNA提取，实时荧光PCR检测，结果显示结核分枝杆菌复合群 有阳性扩增，而十五种非结核分枝杆菌和阴性对照无扩增。
2、对临床痰标本提取核酸，进行荧光定量PCR检测。与分离培养结果相比，结核分枝杆菌分 离株有阳性扩增反应，而非结核分枝杆菌分离株和阴性对照无阳性扩增反应。

Claims (5)

1.一种用于荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的引物，其特征在于，包括两套上游引物和下游引物，其序列分别如下：
上游引物IS-F1：5’-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物IS-R1：5’-CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG-3’(SEQ ID NO：2)
上游引物IS-F2：5’-GCCGAACAACACGACGAATGGA-3’(SEQ ID NO：3)
下游引物IS-R2：5’-GGTGGCAGTCTAGGTGGTCAGT-3’(SEQ ID NO：4) 。
2.包含权利要求1所述引物的结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，包括如下组分：
上游引物IS-F1、IS-F2，下游引物IS-R1、IS-R2和探针IS-FAM1、IS-FAM2；
所述探针的序列如下：
探针IS-FAM1：5’-F-AGGCCACGTAGGCGAACCCTGCCC-Q-3’(SEQ ID NO：5)
探针IS-FAM2：5’-F-ACGGCGCTACCTGGGCCTCGAGG-Q-3’(SEQ ID NO：6)
其中F＝FAM Q＝BQ1 。
3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述25μL检测试剂中，含有10μM上游引物IS-F1，10μM上游引物IS-F2，10μM下游引物IS-R1，10μM下游引物IS-R2，8μM探针IS-FAM1，8μM探针IS-FAM2。
4.根据权利要求2-3任一项所述检测试剂荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待检测基因样本与PCR Mix以及所述检测试剂混合，放置在荧光定量PCR仪器中，PCR扩增程序采用touchdown的程序，具体为：
Touchdown循环程序：94℃ 10S，71℃ 15S(每个循环下降1℃)，72℃ 15S，共10个循环，接着40个循环，94℃ 10S，61℃ 30S(进行FAM荧光检测)，72℃ 15S。
5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR检测结核分枝杆菌复合群的方法，其特征在于，所述仪器为荧光定量PCR仪器。
CN201910060901.2A 2019-01-23 2019-01-23 一种用于荧光定量pcr检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法 Pending CN109680084A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910060901.2A CN109680084A (zh) 2019-01-23 2019-01-23 一种用于荧光定量pcr检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910060901.2A CN109680084A (zh) 2019-01-23 2019-01-23 一种用于荧光定量pcr检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109680084A true CN109680084A (zh) 2019-04-26

Family

ID=66193876

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910060901.2A Pending CN109680084A (zh) 2019-01-23 2019-01-23 一种用于荧光定量pcr检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109680084A (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109811072A (zh) * 2019-02-28 2019-05-28 广州微远基因科技有限公司 用于结核分枝杆菌复合群的crispr检测引物组及其用途
CN110438205A (zh) * 2019-07-31 2019-11-12 天津市泌尿外科研究所 联合多重pcr巢式pcr和降落pcr用于致病性结核分枝杆菌检测的试剂盒
CN110541022A (zh) * 2019-08-09 2019-12-06 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) 基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒
CN112725486A (zh) * 2021-02-03 2021-04-30 四川大学华西医院 一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒及制备方法
CN113957161A (zh) * 2020-07-21 2022-01-21 台达电子工业股份有限公司 结核分枝杆菌的检测方法及检测试剂盒
CN114657271A (zh) * 2022-03-15 2022-06-24 中国动物卫生与流行病学中心 一种快速检测牛结核病的方法
CN117904334A (zh) * 2024-01-29 2024-04-19 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物组合物、试剂盒及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103882130A (zh) * 2014-03-24 2014-06-25 中国科学院微生物研究所 一种检测结核分枝杆菌复合群的引物对及其应用
CN106811529A (zh) * 2017-02-27 2017-06-09 苏州百源基因技术有限公司 结核分枝杆菌的荧光定量pcr检测试剂盒及引物、探针

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103882130A (zh) * 2014-03-24 2014-06-25 中国科学院微生物研究所 一种检测结核分枝杆菌复合群的引物对及其应用
CN106811529A (zh) * 2017-02-27 2017-06-09 苏州百源基因技术有限公司 结核分枝杆菌的荧光定量pcr检测试剂盒及引物、探针

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTI´N J. ZUMA´RRAGA等: "Use of touch-down polymerase chain reaction to enhance the sensitivity of Mycobacterium bovis detection", 《J VET DIAGN INVEST》 *
RYOTA USHIO等: "Digital PCR assay detectio n of circulat ing Mycobacterium tuberculosis DNA in pulmonary tuberculosis patie nt plasma", 《TUBERCULOSIS》 *
李自慧等: "结核分枝杆菌IS6110和IS1081微滴数字PCR检测体系的建立和应用", 《北京医学》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109811072A (zh) * 2019-02-28 2019-05-28 广州微远基因科技有限公司 用于结核分枝杆菌复合群的crispr检测引物组及其用途
CN109811072B (zh) * 2019-02-28 2022-05-06 广州微远医疗器械有限公司 用于结核分枝杆菌复合群的crispr检测引物组及其用途
CN110438205A (zh) * 2019-07-31 2019-11-12 天津市泌尿外科研究所 联合多重pcr巢式pcr和降落pcr用于致病性结核分枝杆菌检测的试剂盒
CN110541022A (zh) * 2019-08-09 2019-12-06 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) 基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒
CN110541022B (zh) * 2019-08-09 2022-11-04 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) 基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒
CN113957161A (zh) * 2020-07-21 2022-01-21 台达电子工业股份有限公司 结核分枝杆菌的检测方法及检测试剂盒
CN112725486A (zh) * 2021-02-03 2021-04-30 四川大学华西医院 一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒及制备方法
CN114657271A (zh) * 2022-03-15 2022-06-24 中国动物卫生与流行病学中心 一种快速检测牛结核病的方法
CN117904334A (zh) * 2024-01-29 2024-04-19 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种用于检测结核分枝杆菌复合群的引物组合物、试剂盒及检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109680084A (zh) 一种用于荧光定量pcr检测结核分枝杆菌复合群的引物探针及方法
CN109811072B (zh) 用于结核分枝杆菌复合群的crispr检测引物组及其用途
CN106222248A (zh) 一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性基因的引物、探针、方法及试剂盒
CN108048584A (zh) Raa荧光法检测布鲁氏杆菌的探针及试剂盒
CN106868224A (zh) 检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和nadc‑30毒株的rt‑pcr方法
CN106987626A (zh) 用于快速检测多种真菌并鉴定菌种的引物和探针及其应用
CN109234419A (zh) 炭疽杆菌双重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN104232783B (zh) 牛种布氏菌弱毒疫苗株a19的快速检测方法
CN101736078A (zh) 一种核酸等温扩增检测结核分枝杆菌活菌的方法及试剂盒
CN101676405A (zh) 结核分枝杆菌荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
CN110079621A (zh) 用于分枝杆菌菌种鉴定的寡核苷酸组合、方法及试剂盒
CN106119421B (zh) 猪蓝耳病qyyz株的荧光定量检测引物、探针及试剂盒
CN109402276A (zh) 一种用于多重耐药鲍曼不动杆菌lamp检测的引物组、试剂盒及应用
CN113265452A (zh) 一种基于Nanopore宏基因组RNA-seq的生物信息学检测病原体的方法
CN108411014A (zh) 鉴别a型和b型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量pcr的引物和探针以及检测方法
CN106011296B (zh) 一种结核分枝杆菌Rv1768基因微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒
CN111793703A (zh) 一种酶切探针恒温检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒
CN106755346A (zh) 一种快速鉴别诺卡氏菌的试剂盒及其使用方法
CN105969861A (zh) 一种用于结核杆菌异烟肼耐药性快速检测的引物及其试剂盒
CN115747361A (zh) 检测海豚链球菌的实时荧光mira和mira-lfd引物组及检测方法
CN109880923A (zh) 用于快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法
CN108315451A (zh) 用于检测产气荚膜梭菌的引物和探针及其应用
CN114480682A (zh) 一种检测结核分枝杆菌的组合物、试剂盒及其应用
CN107523620A (zh) 包含产ndm耐药菌的pcr检测试剂盒及其应用
CN106755567B (zh) 猴srv病毒实时荧光定量pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190426

RJ01 Rejection of invention patent application after publication