CN104059977A

CN104059977A - 一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN104059977A
Application number: CN201410293102.7A
Authority: CN
Inventors: 施春雷; 庄孝飞; 周秀娟; 史贤明; 崔妍
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2014-06-25
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2034-06-25
Also published as: CN104059977B

Abstract

本发明提供一种沙门氏菌血清型鉴定方法，包括：1)提取待测样品中的DNA；2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行PCR检测，其中，PCR检测靶标为沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2；3)将步骤2)中的PCR产物进行序列测定；4)借助在线免费软件CRISPRfinder，寻找对应CRISPR的前三个间隔序列，并与各血清型标准间隔序列进行同源比对；5)比对结果的判断，可同时鉴定23种沙门氏菌常见血清型。本发明还提供了一种沙门氏菌血清型的鉴定试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2的引物，并提供23种沙门氏菌常见血清型的标准间隔序列表。

Description

一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于食品安全领域的核酸检测。具体而言，本发明涉及沙门氏菌血清型的鉴定方法及试剂盒。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)为杆状的革兰氏阴性肠道菌，兼性耗氧，大多数菌株可在没有特殊生长因子的合成培养基上生长。沙门氏菌是极其重要的食源性致病菌，对人类和动物都具有极大危害，而且能够在人体与动物体间进行传播。近几十年来，由沙门氏菌引起的食物中毒占世界食物中毒病例的第一或第二位。我国每年发生的细菌性食物中毒事件占食物中毒事件总数的30％-90％，中毒人数占食物中毒总人数的60％-90％，而在细菌性食物中毒的病原中，沙门氏菌约为40％。沙门氏菌血清型的种类繁多，目前已达两千多种，有些沙门氏菌血清型与其致病性息息相关，而有些血清型并不致病。常见的食物中毒主要由一些特定的血清型感染引起，如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔比沙门氏菌等，因此对于研究沙门氏菌的致病机理及流行病学监测，血清型的鉴定是十分必要的。

当前，我国对于沙门氏菌的检测主要是依靠国标(GBT4789.4-2010)的方法，根据沙门氏菌的生化反应，以及抗原抗体反应进行分型鉴定。但是此方法存在一些缺陷，抗原和分型血清的制备比较复杂，另外，沙门氏菌的抗原与血清的凝集反应有时较为迟缓，反应较弱，易造成错误的分型结果。有些分子分型方法如脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)等，其分型结果也可以与不同血清型对应起来，但是PFGE法操作较为繁琐，对于操作者的技术水平要求很高，而MLST法需要同时扩增七个看家基因并进行测序和序列分析，耗时较长，成本较高。

建立一种行之有效的食源性沙门氏菌血清型的鉴定方法，以提高其血清型鉴定的速度和准确度，使受污染的食品得到及时处理，在公共卫生、食品安全和口岸检疫中都有重要意义。

最近发现，在细菌和古菌中广泛存在着成簇规律间隔短回文重复序列，即CRISPR。沙门氏菌通常含有两个CRISPR系统，即CRISPR1和CRISPR2，它可以使细菌对噬菌体或质粒等外源DNA实现免疫，而CRISPR系统中的间隔序列在免疫过程中发挥着重要作用，是用来识别外源DNA的标签，不同的间隔序列与不同噬菌体或质粒上的序列存在高度同源性。同时，在细菌进化过程中间隔序列存在插入和选择性剔除的现象，使其具备多态性，进而在不同菌株间存在特征性的差异。

为此，本发明人经过长期研究，令人意外地研究出了一种基于沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2前三个间隔序列保守性的沙门氏菌血清型快速鉴定方法。

这种沙门氏菌血清型快速鉴定方法针对沙门氏菌血清型CRISPR位点中间隔序列特异性强，可有效区分沙门氏菌不同血清型，快速、灵敏，并可以应用于食源性沙门氏菌不同血清型的鉴定。

发明内容

有鉴于现有技术存在上述的问题，本发明的目的是提供一种快速、灵敏的沙门氏菌血清型鉴定方法。为此，本发明的技术方案为：一种沙门氏菌血清型的鉴定方法，包括以下步骤：

1)提取待检测样品中的DNA；

2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行PCR检测；其中，PCR检测的靶标为沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2；

3)将步骤2)中的PCR产物进行序列测定；

4)借助在线免费软件CRISPRfinder，寻找对应CRISPR位点的前三个间隔序列，并与各血清型标准间隔序列进行同源比对；

5)比对结果的判断：样品的CRISPR1和CRISPR2的间隔序列分别与某一标准血清型的CRISPR1和CRISPR2间隔序列至少有两个一致则判定为对应的血清型。

其中蒙得维亚沙门氏菌和伤寒沙门氏菌由于CRISPR2基因的扩增产物拷贝数过低或扩增产物片段太小，在测序时不能得出正确的序列信息，而通过多次分离株的验证，发现其CRISPR1基因的前三个间隔序列已经具有较强的血清型特异性，能够作为血清型鉴别的依据，故只需比对CRISPR1基因的前三个间隔序列即可。

本发明之所以选CRISPR1和CRISPR2的前三个间隔序列作为检测靶标是通过如下方法筛选得到的：

选取23种不同血清型，每种血清型各有几种不同的标准菌株，利用CRISPR1和CRISPR2的对应的引物CRISPR1-F，CRISPR1-R和CRISPR2-F，CRISPR2-R，进行PCR扩增，可以得到不同大小的CRISPR1和CRISPR2片段，其中同一血清型的片段大小相近，不同血清型的片段大小差异明显，将PCR产物送商业测序公司测序，测得序列利用在线免费软件CRISPRfinder(http://crispr.u-psud.fr/Server/)分析，找出CRISPR1和CRISPR2各自的重复序列和间隔序列，重复序列一般为5’-CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3'，然而间隔序列的差异较大，其中差异主要分为两个方面：第一个方面，在相同沙门氏菌血清型的菌株中，间隔序列的数目有差别，如肠炎沙门氏菌的CRISPR2中普遍含有十个间隔序列，但是有部分的菌株在菌株进化过程中缺失了或者增加了间隔序列，因此造成同一血清型沙门氏菌菌株之间的差异，但是最为重要的一点是，相同沙门氏菌血清型的菌株之间开头的间隔序列的碱基序列是相同的，也是特异的。第二个方面，在不同沙门氏菌血清型的菌株之间，不论在间隔序列的数目上以及在间隔序列的碱基序列上均有很大差异，尤其是间隔序列的碱基序列，在不同血清型的菌株间没有共有的。综上，根据相同沙门氏菌血清型菌株间隔序列的碱基序列的共性，不同沙门氏菌血清型菌株之间间隔序列的碱基序列的差异性，选取CRISPR的前三个间隔序列作为鉴别沙门氏菌不同血清型的靶标序列。

建立不同血清型沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2前三个间隔序列的序列库。待检测的菌株CRISPR1和CRISPR2前三个间隔序列与序列库中前三个间隔序列比对，与某一标准血清型的前三个间隔序列中至少两个一致即判定为对应的血清型。

这种新的沙门氏菌血清型鉴定方法的CRISPR1和CRISPR2的引物是通过公用CRISPR数据库检索下载并海量搜集CRISPR1和CRISPR2的上下游侧翼序列，BLAST比对CRISPR1和CRISPR2的侧翼序列，分别得到保守的上下游的碱基序列，利用primer5.0设计出引物CRISPR1-F和CRISPR1-R，CRISPR2-F和CRISPR2-R。

在本发明中，样品是潜在含有沙门氏菌菌株的离体样品，包括食品、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。由于沙门氏菌是食源性致病菌，检测来自于食品的样品，属食品安全检测领域。提取DNA以及PCR检测中所用的试剂和仪器已经为本领域技术人员所掌握，而且目前有大量商品化的试剂和仪器可供选用。例如，在本发明的具体实施方式中，可以使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒来提取菌体基因组DNA，可以使用普通的PCR仪完成PCR检测。

优选在本发明中，CRISPR1和CRISPR2PCR检测引物为CRISPR1-F(序列为5'-ATAATGCTGCCGTTGGTAA-3')和CRISPR1-R(序列为5'-TTGATGAGTATGGTGGTTGTGGT-3')，CRISPR2-F(序列为5'-CTG TATAAAAGCCTCCCC-3')和CRISPR2-R(序列为5'-GTTGGTAGAATGTG GTGC-3')。

PCR的反应过程是本领域技术人员所能掌握的，一般为五步法，预变性、变性、退火、延伸、再延伸。根据本发明人研究，最优选的CRISPR1和CRISPR2的PCR扩增条件如下：

CRISPR1：95℃预变性10min，95℃变性1min，60.5℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min；

CRISPR2：95℃预变性10min，95℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

本发明还提供了一种沙门氏菌血清型的检测试剂盒，包括：

1)用于扩增沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2的引物。优选地，所述引物为引物CRISPR1-F(序列为5'-ATAATGCTGCCGTTGGTAA-3')和CRISPR1-R(序列为5'-TTGAT GAGTATGGTGGTTGTGGT-3')，CRISPR2-F(序列为5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3')和CRISPR2-R(序列为5'-GTTGGTAGAATGTG GTGC-3')。

2)沙门氏菌常见血清型的CRISPR1和CRISPR2前三个标准间隔序列表。

3)检测试剂盒还可以包括提取DNA和/或PCR检测中所用的试剂。这些试剂都是常用试剂，也可以通过市场渠道购买。

优选地，本发明可鉴定沙门氏菌的血清型为23种，分别为鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、婴儿沙门氏菌(Salmonella Infantis)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)、慕尼黑沙门氏菌(Salmonella Muenchen)、山夫登堡沙门氏菌(Salmonella Senftenberg)、蒙得维亚沙门氏菌(Salmonella Montevideo)、布伦登卢沙门氏菌(Salmonella Braenderup)、斯坦利沙门氏菌(Salmonella Stanly)、汤卜逊沙门氏菌(Salmonella Thompson)、阿贡那沙门氏菌(Salmonella Agona)、鸭沙门氏菌(Salmonella Anatum)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pollorum)、德尔比沙门氏菌(Salmonella Derby)、圣保罗沙门氏菌(Salmonella Saintpaul)、印第安纳沙门氏菌(Salmonella Indiana)、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella Paratyphi A)、田纳西沙门氏菌(Salmonella Tennessee)、火鸡沙门氏菌(Salmonella Meleagridis)、科特布斯沙门氏菌(Salmonella Kottbus)、爪哇那沙门氏菌(Salmonella Javiana)、伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)和塞罗沙门氏菌(Salmonella Cerro)。

本发明取得的有益效果在于：沙门氏菌血清型鉴定的CRISPR间隔序列的特异性强，可有效区分不同沙门氏菌血清型，使得检测结果更能满足实际食品安全检测的需求；检测方法快速、灵敏度高。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

附图说明

图1是采用本发明实施例中PCR体系获得的不同血清型沙门氏菌CRISPR1的扩增电泳图。

图2是采用本发明实施例中PCR体系获得的不同血清型沙门氏菌CRISPR2的扩增电泳图。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例来描述本发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)(科学出版社，北京，中国，2005年)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。

一.主要试剂和仪器

以下描述中提到的QIAamp DNA Mini Kit试剂盒，购自美国Qiagen公司(Cat.No.51304)；ABI9700普通PCR仪，购自ABI公司。

二.菌株以及DNA的抽提

菌株均可以购自于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)、美国典型微生物保藏中心(ATCC)、新西兰环境科学研究所医学部微生物保藏中心(NZRM)，菌株编号如表1所示。培养方法可以按照上述菌株提供单位推荐的方法进行，参照厂商说明，用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒来提取细菌基因组DNA。

表1 沙门氏菌不同血清型标准菌株以及用本发明的PCR方法检测CRISPR的结果

*注：+表示PCR扩增结果为阳性；-表示PCR扩增结果为阴性

三.PCR反应

PCR反应体系(本文中PCR体系均参照此)：

CRISPR1，10xTaq PCR Buffer with Mg²⁺，2.5μL，引物CRISPR1-F(序列为5'-ATAATGCTGCCGTTGGTAA-3')(10μmol/L)，1μL和CRISPR1-R(序列为5'-TTGAT GAGTATGGTGGTTGTGGT-3')(10μmol/L)，1μL；Taq DNAPolymerase(5U/μL)，0.2μL，dNTP(2.5mM/L)1.5μL，模板(即上述各自抽提的菌株DNA)2.5μL，超纯水，16.3μL；

CRISPR2，10xTaq PCR Buffer with Mg²⁺，2.5μL，引物CRISPR2-F(序列为5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3')(10μmol/L)，1μL和CRISPR2-R(序列为5'-GTTGGTAGAATGTG GTGC-3')(10μmol/L)，1μL，Taq DNA Polymerase(5U/μL)，0.2μL，dNTP(2.5mM/L)1.5μL，模板(即上述各自抽提的菌株DNA)2.5μL，超纯水，16.3μL；

在ABI9700普通PCR仪上进行PCR扩增，扩增条件为：CRISPR1，95℃预变性10min，95℃变性1min，60.5℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。CRISPR2，95℃预变性10min，95℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

PCR体系扩增获得不同血清型的沙门氏菌CRISPR1基因和CRISPR2基因，送商业测序公司测序后，运用在线免费软件CRISPRfinder，找出CRISPR1基因和CRISPR2基因的前三个间隔序列，其碱基序列如表2所示。

表2 23种沙门氏菌血清型CRISPR位点前三位间隔序列标准库

四.方法特异性

将表1所列菌株培养后提取总DNA，进行上节所述的PCR扩增。结果如图1和图2所示，其中的样品号与表1中的序号相同，所有沙门氏菌血清型均能得出阳性的检测结果。

五.方法灵敏度

待检沙门氏菌在LB平板上划线后，挑取单克隆接种于1mL LB液体培养基培养6-8小时，培养物10倍梯度稀释，每个稀释梯度取1mL抽提总DNA，按第三节所述方法进行实时荧光定量PCR扩增。另各取1mL进行平板计数。

当沙门氏菌纯培养物稀释后得到的平板计数浓度为10²CFU/mL时，PCR扩增产物依然能够在琼脂糖凝胶电泳中检测到，即检测限为10²CFU/mL。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域的技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种沙门氏菌血清型鉴定方法，其特征在于，包括步骤：

1)提取待检测样品中的DNA；

3)将步骤2)中的PCR产物进行序列测定；

5)比对结果的判断：样品的CRISPR1和CRISPR2的间隔序列分别与某一标准血清型的CRISPR1和CRISPR2间隔序列至少有两个一致则判定为对应的血清型；

其中，蒙得维亚沙门氏菌和伤寒沙门氏菌只需比对CRISPR1基因的前三个间隔序列即可。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR1所用的引物为：CRISPR1-F：5'-ATAATGCTGCCGTTGGTAA-3'和CRISPR1-R：5'-TTGAT GAGTATGGTGGTTGTGGT-3'。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR2所用的引物为：CRISPR2-F：5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3'和CRISPR2-R：5'-GTTGGTAGAATGTGGTGC-3'。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR1所用PCR的扩增条件为：95℃预变性10min，95℃变性1min，60.5℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中检测CRISPR2所用PCR的扩增条件为：95℃预变性10min，95℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沙门氏菌为以下23种中的一种：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、婴儿沙门氏菌(Salmonella Infantis)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)、慕尼黑沙门氏菌(Salmonella Muenchen)、山夫登堡沙门氏菌(Salmonella Senftenberg)、蒙得维亚沙门氏菌(Salmonella Montevideo)、布伦登卢沙门氏菌(SalmonellaBraenderup)、斯坦利沙门氏菌(Salmonella Stanly)、汤卜逊沙门氏菌(SalmonellaThompson)、阿贡那沙门氏菌(Salmonella Agona)、鸭沙门氏菌(Salmonella Anatum)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pollorum)、德尔比沙门氏菌(Salmonella Derby)、圣保罗沙门氏菌(Salmonella Saintpaul)、印第安纳沙门氏菌(Salmonella Indiana)、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella Paratyphi A)、田纳西沙门氏菌(Salmonella Tennessee)、火鸡沙门氏菌(Salmonella Meleagridis)、科特布斯沙门氏菌(Salmonella Kottbus)、爪哇那沙门氏菌(Salmonella Javiana)、伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)和塞罗沙门氏菌(Salmonella Cerro)。

7.一种沙门氏菌血清型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于PCR扩增沙门氏菌CRISPR1和CRISPR2的引物。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为检测CRISPR1所用的PCR引物CRISPR1-F：5'-ATAATGCTGCCGTTGGTAA-3'和CRISPR1-R：5'-TTGAT GAGTATGGTGGTTGTGGT-3'，检测CRISPR2所用的PCR引物CRISPR2-F：5'-CTGTATAAAAGCCTCCCC-3'和CRISPR2-R：5'-GTTGGTAGAATGTGGTGC-3'。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括常见不同血清型沙门氏菌的CRISPR1和CRISPR2前三个间隔序列的序列表。

10.如权利要求7-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括提取DNA和/或PCR检测中所用的试剂。