CN106636407A - 基于特异序列的沙门菌检测引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

基于特异序列的沙门菌检测引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN106636407A CN201611221521.5A CN201611221521A CN106636407A CN 106636407 A CN106636407 A CN 106636407A CN 201611221521 A CN201611221521 A CN 201611221521A CN 106636407 A CN106636407 A CN 106636407A
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陈帅印
张荣光
杨海燕
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Abstract

本发明公开了一种基于特异序列的沙门菌检测引物、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。该引物针对沙门菌的一段特异序列或其同源性达99％以上的同源序列设计合成，具体如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。本发明中检测方法以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增产物与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性，回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，与SEQ ID NO.3所示序列相同或同源性达99％以上的判定为沙门菌阳性。该检测方法操作简单，敏感性和特异性高，与沙门菌的种属结果一致，检测费用低，具有良好的推广应用价值。

Description

基于特异序列的沙门菌检测引物、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于特异序列的沙门菌检测引物，同时还涉及包含该引物的试剂盒以及沙门菌检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
沙门菌(Salmonellosis)是一种人畜共患病的肠道致病菌，不仅严重危害人类健康，也给畜禽养殖业带来了巨大的经济损失。沙门菌在自然界中广泛存在，而人沙门菌病的感染源主要是受污染的动物肉类、蛋类和奶制品等。沙门菌病在全年均可发病，夏季是感染高峰。由于沙门菌的血清型多、抗原复杂，可引起人类胃肠炎、败血症伤寒、副伤寒、食物中毒等病症，是目前世界上食源性腹泻最常见的病原菌之一(朱超.沙门菌属血清型诊断[M].上海:同济大学出版社,2009:1,52)。吕素玲等研究表明在广西地区由沙门菌引起的食源性疾病数量仅次于副溶血性弧菌，位居第2位(吕素玲,韦程媛,李秀桂.2011年广西沙门菌血清型分布及耐药分析.中国卫生检验,2014,24:127-132)。因此，快速鉴定和追溯感染源防治沙门菌病的首要任务。
目前，沙门菌的检测方法主要有常规检测法和分子生物学检测法，常规检测法又包括形态学鉴定和生化试验鉴定，其中形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要意义，但是该方法也存在一些缺点，比如重现率低，辨识能力低，相似的表型特征无法等同于相似或者关系密切的基因型等。所以对于那些通过表型特征难以区别的菌种，常规的检测方法就不能准确鉴定到种，并且该方法操作繁琐，实验周期长(邓梅葵,孙迎,韩雯晴.细菌鉴定方法[J].生物医学工程学进展,2014(02):84-88)。分子生物学检测法包括DNA(G+C)mol％、核酸杂交、16S rRNA序列分析、MLST(多位点序列分型，Multi LocusSequenceTyping)、全基因组测序以及核酸指纹图谱等(-Sánchez B,Priego-Capote F,de Castro M L.Metabolomics analysis I.Selection of biologicalsamples and practical aspects preceding sample preparation[J].TrAC Trends inAnalytical Chemistry,2010,29(2):111-119.)，具有快速、简便等特点，且能从本质上阐明细菌间的亲缘关系。如公布号CN105936935A的发明专利公开的一种快速鉴定特定血清型沙门菌的方法，包括：以样品基因组DNA为模板，利用引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2进行PCR扩增，凝胶电泳检测有目的条带且测序结果与tcpS基因核苷酸相似性达100％的确定为肠炎沙门菌、鸡白痢/伤寒沙门菌或都柏林沙门菌。但是，该方法仅是针对3种具体血清型的沙门菌进行检测，没有涵盖多种血清型的沙门菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于特异序列的沙门菌检测引物。
同时，本发明还提供一种包含上述引物的检测试剂盒。
最后，本发明再提供一种基于特异序列的沙门菌检测方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
沙门菌检测引物，根据特异序列或者与该序列同源性达99％以上的同源序列设计合成，特异序列如SEQ ID NO.3所示，同源序列如SEQ ID NO.4所示。引物设计遵循本领域通用准则，采用常规引物设计软件完成。
具体的，沙门菌检测引物如下所示：
上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；
下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。
基于特异序列的沙门菌检测试剂盒，包含以下引物：
上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；
下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。
所述试剂盒还可以包括：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)、灭菌超纯水、阳性对照(沙门菌基因组DNA或甘油保存菌液)、10×PCR菌落增强剂以及DNA Marker DL 2000等。
基于特异序列的沙门菌检测方法，包括以下步骤：
1)以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性；
2)回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，与SEQ ID NO.3(287bp)所示序列相同或同源性达99％以上的判定为细菌阳性；
步骤1)中引物如下所示：
上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；
下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。
步骤1)中待测样本基因组DNA可采用煮沸法或DNA提取试剂盒提取。
步骤1)中PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，10～20ng/μL待测样本基因组DNA 2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL。
或者，PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，单菌落，1×PCR菌落增强剂2.5μL，灭菌超纯水补足至25μL。
步骤1)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸10min。
步骤1)中阳性对照为沙门菌。
本发明的有益效果：
本发明通过对CRISPR database数据库中沙门菌全基因组测序结果进行分析及对实验室保存的沙门菌检测发现，其具有一段共同的特异序列。针对该特异序列设计上、下游引物，PCR扩增后进行电泳分析，与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性，回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，与SEQ ID NO.3所示序列相同或同源性达99％以上的判定为沙门菌阳性。该检测方法操作简单，敏感性和特异性高，与沙门菌的种属结果一致，检测费用低，具有良好的推广应用价值。
附图说明
图1为试验例1中沙门菌扩增产物的电泳图；
图2为试验例2中扩增产物的电泳图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例中基于特异序列的沙门菌检测引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
实施例2
本实施例中基于特异序列的沙门菌检测试剂盒，包含：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)20mL，灭菌超纯水30mL，阳性对照DNA(沙门菌)100μL，8μmol/L上、下游引物各5mL，DNA Marker DL 2000(250μL)及试剂盒说明书一份；
所述上、下游引物为：
上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'，
下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。
检测原理：试剂盒中含有聚合酶链式反应所需的各种试剂组分，如引物、dNTPs、缓冲液、Taq酶等，在PCR反应液中加入检测样品，进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析出现与阳性对照相同条带的判定为疑似阳性，胶回收扩增产物，进行测序分析，与SEQ ID NO.3所示序列相同或同源性达99％以上的判定为沙门菌阳性。可用于获知各种待检测样本(如粪便、食物等)中沙门菌菌株的污染状况。
操作说明：
1)提取待检测样本的基因组DNA或者挑取单菌落；
2)利用上、下游引物进行PCR扩增，配制如下反应体系：
2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，待测样本基因组DNA 2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL；
或者，2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，单菌落，1×PCR菌落增强剂(市售商品，主要成分为甜菜碱，为10倍浓度，使用时需稀释为1倍浓度)2.5μL，灭菌超纯水补足至25μL；
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸10min；
3)PCR产物凝胶电泳分析，条件：2.0％琼脂糖凝胶，电压5V/cm，时间20min；在紫外灯下观察结果，若出现与阳性对照相同的条带即为疑似阳性，阴性对照没有特异性扩增条带或者条带不一致；
4)回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，与SEQ ID NO.3(287bp)所示序列相同或同源性达99％以上的判定为沙门菌阳性。
实施例3
本实施例中基于特异序列的的沙门菌检测方法，包括以下步骤：
(1)样本的收集和预处理
将500μL待检测样本(食物)加入到10mL增菌液中，37℃增菌5h(4～6h均可)，台式高速离心机12000rpm/min离心5分钟，弃上清，沉淀用作检测模板；
(2)PCR扩增
利用上、下游引物进行PCR扩增，引物如下所示：
上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'，
下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'；
PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，增菌沉淀2μL，1×PCR菌落增强剂2.5μL，无菌超纯水补足至25μL；
PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸10min；
(3)检测结果
取5μL PCR扩增产物，于20g/L琼脂糖凝胶中电泳，用DNA Marker DL 2000作分子量标记，电压5V/cm，电泳20min后，在紫外灯下观察结果，出现与阳性对照相同的条带，也即疑似阳性；
回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，结果显示与SEQ ID NO.3所示序列相同，判定样本受到沙门菌菌株感染。
试验例1
一、试验中使用的细菌菌株
沙门菌2014001，2015001分别分离于河南睢县和河南新乡。
二、试验中使用的试剂及仪器
(1)LB培养基
LB液体培养基：称取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1.0g氯化钠，溶于100mL蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20min，置4℃保存备用。
LB固体培养基：称取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1.0g氯化钠、1.5g琼脂粉，溶于100mL蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20min，冷却至约50℃时倾注平板，保存备用。
(2)PCR反应试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，琼脂糖为BIOWEST公司进口分装，酵母浸粉、胰蛋白胨购自英国Oxoid公司，琼脂粉购自Sigma公司，其他常用试剂均为国产分析纯级试剂。
PTC-100型基因体外扩增仪购自MJRESEARCH公司，DYY-8C型稳压稳流定时电泳仪购自北京六一仪器厂，Gene snap图像扫描仪购自美国Syngene公司。
未作特别说明的试验材料和方法均为公知技术，可在常用工具书包括《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克、D.W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002)等中查找。
三、沙门菌特异序列的检测
(1)DNA模板的制备
采用煮沸法从沙门菌菌液中提取全基因组DNA，具体操作为：从-80℃冰箱内取出沙门菌冻存保种管，置于4℃冰箱复温5小时(4～6小时均可)，超净台中用无菌接种环快速取菌液，以分段划线法转种于LB固体培养基平板上，37℃恒温箱孵育21小时(18～24小时均可)，挑取LB琼脂平板上单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养7小时(6～8小时均可)，取1mL菌液于1.5mL的Eppdorf管中，转速14000r/min下离心1分钟，弃上清，加入超纯水100μL，震荡混匀，煮沸10min，转速14000r/min下再次离心10分钟，取上清，即得沙门菌基因组DNA，置于-20℃贮存备用。
(2)PCR引物设计与合成
根据沙门菌的特异序列设计引物，如下所示：
上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；
下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。
引物由上海生工生物工程有限责任公司合成，预期扩增产物长度为287bp。
(3)PCR扩增
参照PCR反应试剂盒(上海生工生物工程有限责任公司)产品说明，配制25μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mMdNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，沙门菌基因组DNA模板2μL，加灭菌超纯水至25μL。
反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸10min。
(4)PCR扩增产物分析
取5μL PCR扩增产物，于20g/L琼脂糖凝胶中电泳，用DNA Marker DL2000作分子量标记，电压5V/cm，电泳20min后，用凝胶图像扫描仪进行分析，电泳结果见图1(图中M:DL2000marker，1:沙门菌sa2014001，2:沙门菌sa2015001)。
从图1中可以看出，PCR扩增产物的长度与预期长度(287bp)符合，证实PCR扩增特异序列成功。
(5)PCR扩增产物测序鉴定
将PCR扩增产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果如SEQID NO.3所示。
试验例2
模拟样品的的检测，包括以下步骤：
1)模拟样品的制备
将10g全脂奶粉溶于90mL生理盐水中，灭菌，然后分别加入8种细菌的菌液(8中细菌分别为：1:沙门菌sa2014001，2:沙门菌sa2015001，3:沙门菌sa2014030，4:沙门菌sa2014002，5:大肠埃希菌e2014001，6:志贺菌sh2014001，7:肺炎克雷伯杆菌kl2015001，8:铜绿假单胞菌pa2014002，混匀作为样品原液，放置2h；再吸取5mL混合液加入到45mL营养肉汤中，于37℃温箱中培养，设置两组平行对照，一组阴性对照，8h后各取10mL混合液进行检测；
2)提取待检测样本的基因组DNA，利用上、下游引物进行PCR扩增，引物如下所示：
上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'，
下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'；
PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix(0.1U/μL Taq DNA Polymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mM dNTP，4mM MgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，10～20ng/μL细菌基因组DNA模板2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL；
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸10min；
3)PCR产物凝胶电泳分析，条件：2.0％琼脂糖凝胶，电压5V/cm，时间20min；在紫外灯下观察结果(见图2，图中M:DL2000marker；1:沙门菌sa2014001；2:沙门菌sa2015001；3:沙门菌sa2014030；4:沙门菌sa2014002；5:大肠埃希菌e2014001；6:志贺菌sh2014001；7:肺炎克雷伯杆菌kl2015001；8:铜绿假单胞菌pa2014002)；
结果显示：1～4出现与阳性对照相同的条带，为疑似阳性，其他没有出现特异性条带或者条带不一致；
4)回收疑似阳性的扩增产物，经测序均与SEQ ID NO.3所示序列相同。
对比例
本对比例采用API生化鉴定各种细菌，原理为：每种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用于区别和鉴定细菌的种类。
具体操作如下：
1)细菌分离和培养：在无菌操作台中用灼烧过的无菌接种环蘸取少量样本(同试验例2)，以三步划线法接种在伊红美蓝培养皿上，放入隔水恒温式培养箱中37℃过夜培养21小时(18～24小时均可)，目标菌株为伊红美蓝培养基上显示为黑色带有金属光泽或者只为黑色的单菌落；
2)革兰染色：挑取疑似菌落进行革兰染色，镜下可见为红色或粉红色的杆状细菌；
3)氧化酶试验：在洁净的载玻片上放置无菌滤纸片，移液器吸取少量灭菌生理盐水，滴一滴至滤纸上，用灼烧过的接种环挑取单菌落涂在滤纸上，加一滴氧化酶试剂，迅速观察滤纸的变化，如果1～2min内呈现深紫色为阳性反应，无变化为阴性，并将结果记录于试纸条上；
4)API20E生化鉴定
a.分别准备一个培养盘和培养盖，移液器转移5mL灭菌生理盐水于培养盘的蜂窝小凹中，将试纸条放入培养盘中，在培养盘侧面记录菌株编号；
b.用灼烧过的接种环挑取同一个菌落，加入试剂盒中配套的0.85％NaCl中，仔细研磨以得到均匀的细菌悬液；
c.用1mL移液器吸取细菌悬液加入并充满CIT、VP、GEL管中，其余管中液体仅充满管部即可，向ADH、LDC、URE、ODC、H2S中加入矿物油覆盖，盖上培养盖，置于隔水恒温培养箱中37℃培养21小时(18～24小时均可)；
d.根据参考说明表判读其结果；
e.在配套软件中输入结果即可得出细菌鉴定结果。
结果显示为：1～4均为沙门菌，5～8依次为大肠埃希菌、志贺菌、肺炎克雷伯杆菌和铜绿假单胞菌，与试验例2的检测结果相一致。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学、新乡医学院
<120> 基于特异序列的沙门菌检测引物、试剂盒及检测方法
<170> PatentIn version 3.5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 上游引物
<222> (1)..(20)
<400> 1
AAAGGAACGG GTTGCTGTAA 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 下游引物
<222> (1)..(20)
<400> 2
TATCAGGACG TTTTTTCCGC 20
<211> 287
<212> DNA
<213> 序列
<221> 特异序列
<222> (1)..(287)
<400> 3
AAAGGAACGG GTTGCTGTAA TGATGCGGAG GTTTTCGATA AAGCGGGAAT ATCGGTGCTT 60
TCTGTTGAGG CGACGAACTG GAATCTGGGT AAAAAAGACG GATACCAGCA ACGCGTGAAA 120
AATGCCTCCT TCCCGAACGG CAATAGCTGG CACGACGTAC GGCTTGATAA TCAACAGCAT 180
ATTGACAAGG CGCTGCCAGG GCGAATTGAG CGCCGTAGCC GCGATGTAGT ACGGATAATG 240
CTGCCGTTGG TAAAAGAGCT GGCGAAGGCG GAAAAAACGT CCTGATA 287
<211> 287
<212> DNA
<213> 序列
<221> 同源序列
<222> (1)..(287)
<400> 4
AAAGGAACGG GTTGCTGTAA TGATGCGGAG GTTTTCGATA AAGCGGGAAT ATCTGTGCTT 60
TCTGTTGAGG CGACGAACTG GAATCTGGGT AAAAAAGACG GATACCAGCA ACGCGTGAAA 120
AATGCCTCCT TCCCGAACGG TAATAGCTGG CACGACGTAC GGCTTGATAA TCAACAGCAT 180
ATTGACAAGG CGCTGCCAGG GCGGATTGAG CGCCGTAGCC GCGATGTAGT GCGGATAATG 240
CTGCCGTTGG TAAAAGAGCT GGCGAAGGCG GAAAAAACGT CCTGATA 287

Claims (9)

1.沙门菌检测引物，其特征在于：所述引物根据特异序列或者与该序列同源性达99％以上的同源序列设计合成，特异序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：所述同源序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1或2所述的检测引物，其特征在于：该引物如下所示：
上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；
下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。
4.基于特异序列的沙门菌检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含以下引物：
上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；
下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包含：2×Taq PCR Master Mix、阳性对照及10×PCR菌落增强剂。
6.基于特异序列的沙门菌检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性；
2)回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，与SEQ ID NO.3所示序列相同或同源性达99％以上的判定为细菌阳性；
步骤1)中引物如下所示：
上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；
下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤1)中PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，10～20ng/μL待测样本基因组DNA 2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤1)中PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，单菌落，1×PCR菌落增强剂2.5μL，灭菌超纯水补足至25μL。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于：步骤1)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸10min。
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